JPH0227984A - デアセトキシセファロスポリンｃ合成酵素をコードする組換えｄｎａ発現ベクターおよびｄｎａ化合物 - Google Patents
デアセトキシセファロスポリンｃ合成酵素をコードする組換えｄｎａ発現ベクターおよびｄｎａ化合物Info
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Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
- C12N9/0071—Oxidoreductases (1.) acting on paired donors with incorporation of molecular oxygen (1.14)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
産業上の利用分野
本発明は、デアセトキシセファ０スポリンＣ合成酵素活
性をコードする（暗号化した）ＤＮＡ配列に関するもの
である。デアセトキシセファロスポリンＣ合成酵素（Ｄ
ＡＯＣＳ）は、ペニシリンＮからデアセトキシセファロ
スポリンＣ（ＤＡＯＣ）を生成する反応を触媒し、しば
しばエキスパンダーゼの名で呼ばれる。この反応は、セ
ファロスポリウム・アクレモニウム（Ｃｅｐｈａｌｏｓ
ｐｏｒｉｕ＋ｓ ａｃｒｅ＋ｗ。
性をコードする（暗号化した）ＤＮＡ配列に関するもの
である。デアセトキシセファロスポリンＣ合成酵素（Ｄ
ＡＯＣＳ）は、ペニシリンＮからデアセトキシセファロ
スポリンＣ（ＤＡＯＣ）を生成する反応を触媒し、しば
しばエキスパンダーゼの名で呼ばれる。この反応は、セ
ファロスポリウム・アクレモニウム（Ｃｅｐｈａｌｏｓ
ｐｏｒｉｕ＋ｓ ａｃｒｅ＋ｗ。
ｎｉｕ＋＋＋）からセファロスポリン類のような、そし
てストレプトマイセス−クラブリゲルス（Ｓ ｔｒｅｐ
ｔｏｍｙｃｅｓ ｃｌａｖｕｌｉｇｅｒｕｓ）および
ストレプトマイセス・リプマニイ（Ｓ 、ｌｉｐｍａｏ
ｔｉ）から７Ｃ−メトキシセファ０スポリン、即ちセフ
ァマイシン類のような重要な抗生物質を生合成する際の
重要な段階反応である。
てストレプトマイセス−クラブリゲルス（Ｓ ｔｒｅｐ
ｔｏｍｙｃｅｓ ｃｌａｖｕｌｉｇｅｒｕｓ）および
ストレプトマイセス・リプマニイ（Ｓ 、ｌｉｐｍａｏ
ｔｉ）から７Ｃ−メトキシセファ０スポリン、即ちセフ
ァマイシン類のような重要な抗生物質を生合成する際の
重要な段階反応である。
及吸Ω！！
本発明のＤＮＡ化合物は単一の読み取り枠（オープン・
リーディング・７レーム）にＤＡＯＣＳを暗号化してい
る。この読み取り枠を転写し、得られたｍＲＮＡを翻訳
することによってＤＡＯＣ３活性を有する単一ポリペプ
チド鎖が生産される。
リーディング・７レーム）にＤＡＯＣＳを暗号化してい
る。この読み取り枠を転写し、得られたｍＲＮＡを翻訳
することによってＤＡＯＣ３活性を有する単一ポリペプ
チド鎖が生産される。
ＤＡＯＣ３活性を暗号化しているＤＮＡ化合物をストレ
プトマイセス・クラブリゲルスのゲノムＤＮＡから単離
し、組換えＤＮＡ発現ベクター組立て（構築）に使用し
た。これらの発現ベクターのうち下記の４つの型が特に
有用である。その第１の型はエシェリキア・コリ（Ｅ、
ｃｏｌｉ）において、第２の型はセファロスポリウムに
おいて、第３の型はペニシリウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉ
ｕｗ＋）において、そして第４の型はストレプトマイセ
スにおいて高水準のＤＡＯＣＳ活性発現を促進させる。
プトマイセス・クラブリゲルスのゲノムＤＮＡから単離
し、組換えＤＮＡ発現ベクター組立て（構築）に使用し
た。これらの発現ベクターのうち下記の４つの型が特に
有用である。その第１の型はエシェリキア・コリ（Ｅ、
ｃｏｌｉ）において、第２の型はセファロスポリウムに
おいて、第３の型はペニシリウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉ
ｕｗ＋）において、そして第４の型はストレプトマイセ
スにおいて高水準のＤＡＯＣＳ活性発現を促進させる。
エシェリキア・コリＣＥ、コリ）が生産したＤＡＯＣＳ
活性は、ペニシリンＮからのＤＡＯＣ生産を触媒する。
活性は、ペニシリンＮからのＤＡＯＣ生産を触媒する。
本発明によるこれらのＥ、コリ形質転換体の粗製細胞抽
出物はＤＡＯＣ３活性を有する。これらのＥ、コリ発現
ベクターおよび形質転換体は活性ＤＡＯＣ３酵素を多量
に入手し得る有効な手段を提供する。ＤＡＯＣ３酵素は
単にペニシリンＮからのＤＡＯＣ生産に有用であるだけ
でなく、それ以外のペニシリン類にも拡大して・有用で
ある。
出物はＤＡＯＣ３活性を有する。これらのＥ、コリ発現
ベクターおよび形質転換体は活性ＤＡＯＣ３酵素を多量
に入手し得る有効な手段を提供する。ＤＡＯＣ３酵素は
単にペニシリンＮからのＤＡＯＣ生産に有用であるだけ
でなく、それ以外のペニシリン類にも拡大して・有用で
ある。
本発明のセファロスポリウム・ベクター類は、製薬産業
で使用される株の組立ての目的に有用である。セファロ
スポリウムはセファロスポリン抗生物質生産に使用され
る経済的に重要な微生物である。本発明の発現ベクター
でセファロスポリウムを形質転換することによって、形
質転換体内の細胞内ＤＡＯＣＳ濃度が高くなる。これら
の形質転換体は工業的発酵工程における効率および抗生
物質収量を増大するのに使用し得る。機能的なりＡＣ５
／ＤＡＯＣＳ遺伝子を欠いたセファロスポリウム・アク
レモニウム株を本発明のベクターで形質転換すると、セ
ファロスポリンＣの代わりにＤＡＯＣを合成する形質転
換体が生産される。ＤＡＯＣは経口によって吸収され、
臨床上重要な抗生物質の中間生産物として有用である。
で使用される株の組立ての目的に有用である。セファロ
スポリウムはセファロスポリン抗生物質生産に使用され
る経済的に重要な微生物である。本発明の発現ベクター
でセファロスポリウムを形質転換することによって、形
質転換体内の細胞内ＤＡＯＣＳ濃度が高くなる。これら
の形質転換体は工業的発酵工程における効率および抗生
物質収量を増大するのに使用し得る。機能的なりＡＣ５
／ＤＡＯＣＳ遺伝子を欠いたセファロスポリウム・アク
レモニウム株を本発明のベクターで形質転換すると、セ
ファロスポリンＣの代わりにＤＡＯＣを合成する形質転
換体が生産される。ＤＡＯＣは経口によって吸収され、
臨床上重要な抗生物質の中間生産物として有用である。
本発明のペニシリウム・ベクターの最も有用な点は、ペ
ニシリンを高濃度で生産するペニシリウム株ヘセファロ
スポリン合成活性を導入し得ることである。ＤＡＯＣＳ
活性は、単独ないしデアセチルセフ７０スポリンＣ合成
酵素（ＤＡＣ３，本酵素はＤＡＯＣからデアセチルセフ
ァロスポリンＣを生成するヒドロキシル化反応を触媒す
る）またはエピメラーゼのようなその他の活性と組み合
わせて、各種のペニシリンをセファロスポリンへ変換さ
せるのに有用である。例えば、ペニシリウムにイソペニ
シリンＮエピメラーゼ活性とＤＡＯＣＳ活性を同時に発
現させると、これまでペニシリウムでは未知の代謝産物
であるＤＡＯＣを生産するようになる。
ニシリンを高濃度で生産するペニシリウム株ヘセファロ
スポリン合成活性を導入し得ることである。ＤＡＯＣＳ
活性は、単独ないしデアセチルセフ７０スポリンＣ合成
酵素（ＤＡＣ３，本酵素はＤＡＯＣからデアセチルセフ
ァロスポリンＣを生成するヒドロキシル化反応を触媒す
る）またはエピメラーゼのようなその他の活性と組み合
わせて、各種のペニシリンをセファロスポリンへ変換さ
せるのに有用である。例えば、ペニシリウムにイソペニ
シリンＮエピメラーゼ活性とＤＡＯＣＳ活性を同時に発
現させると、これまでペニシリウムでは未知の代謝産物
であるＤＡＯＣを生産するようになる。
ＤＡＯＣＳを暗号化しているＤＮＡ化合物を修飾して、
バエシロマイセス（Ｐ ａｅｃｉｌｏｍｙｃｅｓ）およ
びストレプトマイセス等、特にストレプトマイセス・ク
ラブリゲルス（Ｓ、クラブリゲルス）のような他の微生
物を含んだ発酵の効率および収量を増大させる発現ベク
ターが容易に組み立てられる。
バエシロマイセス（Ｐ ａｅｃｉｌｏｍｙｃｅｓ）およ
びストレプトマイセス等、特にストレプトマイセス・ク
ラブリゲルス（Ｓ、クラブリゲルス）のような他の微生
物を含んだ発酵の効率および収量を増大させる発現ベク
ターが容易に組み立てられる。
ＤＡＯＣ３を暗号化した本発明のＤＮＡはＳ、クラブリ
ゲルスから単離されたが、Ｅ、コリ発現ベクターに関し
て先に説明したように、このＤＮＡはさまざまな宿主細
胞でＤＡＯＣ３を発現させるベクターの組立てに使用で
きる。本発明のＥ、−コリ、セファロスポリウムおよび
ペニシリウムのベクターに利用し得る組立て方策は、必
要ならば好適な調節要素を単に置き換えるだけで他の微
生物のだめの同様なベクターの組立てに適用できる。
ゲルスから単離されたが、Ｅ、コリ発現ベクターに関し
て先に説明したように、このＤＮＡはさまざまな宿主細
胞でＤＡＯＣ３を発現させるベクターの組立てに使用で
きる。本発明のＥ、−コリ、セファロスポリウムおよび
ペニシリウムのベクターに利用し得る組立て方策は、必
要ならば好適な調節要素を単に置き換えるだけで他の微
生物のだめの同様なベクターの組立てに適用できる。
セファロスポリンを生産する大多数の微生物は、ＤＡＯ
ＣＳの基質である共通の前駆物質ペニシリンＮを利用す
る。ＤＡＯＣＳを暗号化した本発明のＤＮＡ化合物は、
ペニシリンおよびセファロスポリン抗生物質を生産する
各種微生物を含んだ発酵の効率および収量を改善するの
に有用な発現ベクターの組立てに使用することができる
。
ＣＳの基質である共通の前駆物質ペニシリンＮを利用す
る。ＤＡＯＣＳを暗号化した本発明のＤＮＡ化合物は、
ペニシリンおよびセファロスポリン抗生物質を生産する
各種微生物を含んだ発酵の効率および収量を改善するの
に有用な発現ベクターの組立てに使用することができる
。
以下、本発明に関してさらに詳細に説明する。
本明細書の開示内容を明確にし、本発明の理解を深める
目的のため以下の事項に関して下記の通り定義する。
目的のため以下の事項に関して下記の通り定義する。
ａｍｄ Ｓ−アセトアミダーゼ遺伝子。図面ではアスペ
ルギルス・ニズランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎ
１ｄｕｌａｎｓ）・アセトアミダーゼ遺伝子を示すのに
用いる。
ルギルス・ニズランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎ
１ｄｕｌａｎｓ）・アセトアミダーゼ遺伝子を示すのに
用いる。
ａｍｄｓｐ−ａｎ＋ｄｓ遺伝子のプロモーターＡｍＲ−
アブラマイシン耐性を付与する遺伝子。
アブラマイシン耐性を付与する遺伝子。
またアンピシリン耐性表現型を示すのに用いる。
抗生物質−微生物によって生産され、天然のまま、また
は限定的な修飾を加えて、他の微生物または真核細胞の
発育を阻止し、あるいは殺減し得る物質。
は限定的な修飾を加えて、他の微生物または真核細胞の
発育を阻止し、あるいは殺減し得る物質。
抗生物質生合成遺伝子−一次代謝産物を抗生物質へ変換
し、または一つの抗生物質化合物を異なった抗生物質化
合物へ変換する過程における酵素反応に必要な活性を暗
号化しているＤＮＡ断片。
し、または一つの抗生物質化合物を異なった抗生物質化
合物へ変換する過程における酵素反応に必要な活性を暗
号化しているＤＮＡ断片。
抗生物質産生微生物−ストレプトマイセス、バシラス（
Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、モノスポラ（Ｍｏｎｏｓｐｏｒａ
）、セファロスポリウム、バエシロマイセス、ポドスボ
ラ（Ｐ ｏｄｏｓｐｏｒａ）、ペニシリウムおよびノカ
ルジア（Ｎｏｃａｒｄｉａ）等の微生物であって、抗生
物質を産生するか、あるいは、発現されたとき、抗生物
質が生産されるような遺伝子を含有している微生物。
Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、モノスポラ（Ｍｏｎｏｓｐｏｒａ
）、セファロスポリウム、バエシロマイセス、ポドスボ
ラ（Ｐ ｏｄｏｓｐｏｒａ）、ペニシリウムおよびノカ
ルジア（Ｎｏｃａｒｄｉａ）等の微生物であって、抗生
物質を産生するか、あるいは、発現されたとき、抗生物
質が生産されるような遺伝子を含有している微生物。
抗生物質耐性を付与する遺伝子−ある抗生物質耐性を付
与する活性を暗号化しているＤＮＡ断片。
与する活性を暗号化しているＤＮＡ断片。
ＡｐＲ−アンピシリン耐性を付与する遺伝子。
またアンピシリン耐性表現型を示すのに用いる。
二機能性クローニング・シャトル・ベクター−異なった
二つの分類の微生物内で複製および／または組み込みが
可能な組換えＤＮＡクローニングベクター ｂＧＨ−ウシ成長ホルモン、またはそれを暗号化してい
るＤＮＡ。
二つの分類の微生物内で複製および／または組み込みが
可能な組換えＤＮＡクローニングベクター ｂＧＨ−ウシ成長ホルモン、またはそれを暗号化してい
るＤＮＡ。
ｂｐ−２本鎖ＤＮＡの塩基対。
ＣＡＴ−クロラムフェニコール耐性遺伝子。アセチルト
ランスフェラーゼを暗号化している。
ランスフェラーゼを暗号化している。
ｃＤＡｃｓ／ＤＡＯＣ３−セファロスポリウム・アクレ
モニウムのエキスパンダーゼ（ＤＡＯＣ３）／ヒドロキ
シラーゼ（ＤＡＣ３）遺伝子。
モニウムのエキスパンダーゼ（ＤＡＯＣ３）／ヒドロキ
シラーゼ（ＤＡＣ３）遺伝子。
ｃ１８５７−λｐＬプロモーターの温度感受性リプレッ
サーを暗号化している遺伝子。
サーを暗号化している遺伝子。
ｃｌＰｓ−セファロスポリウム・アクレモニウムに由来
するイソペニシリンＮ合成酵素またはイソペニシリンＮ
合成酵素を暗号化しているＤＮＡ。
するイソペニシリンＮ合成酵素またはイソペニシリンＮ
合成酵素を暗号化しているＤＮＡ。
クローニング−ＤＮＡ断片（セグメント）を組換えＤＮ
Ａクローニングベクターへ組み込むプロセス。
Ａクローニングベクターへ組み込むプロセス。
暗号配列−遺伝子中、その遺伝子によって発現される蛋
白質のアミノ酸残基配列を暗号化しているＤＮＡ配列、
またはｒＲＮＡまたはｔＲＮＡ遺伝子の場合、その遺伝
子によって発現されるｒＲＮＡまたはｔＲＮＡのＲＮＡ
配列を暗号化しているＤＮＡ配列。
白質のアミノ酸残基配列を暗号化しているＤＮＡ配列、
またはｒＲＮＡまたはｔＲＮＡ遺伝子の場合、その遺伝
子によって発現されるｒＲＮＡまたはｔＲＮＡのＲＮＡ
配列を暗号化しているＤＮＡ配列。
暗号鋼−「アンチセンス鎖」と相補的な２本鎖暗号配列
のうちの１本鎖。アンチセンス鎖はＲＮＡポリメラーゼ
によって「センス鎖」転写される。
のうちの１本鎖。アンチセンス鎖はＲＮＡポリメラーゼ
によって「センス鎖」転写される。
ＣＯ５−７ア一ジλ付着末端配列。
コスミドープラスミドと同様に宿主細胞内で複製可能で
あり、ファージ頭部へのバッキングも可能な組換えＤＮ
ＡクローニングベクターＤＡＣ−下記の式： で表される構造を有するデアセチルセファロスポリンＣ
０ ＤＡＣ５−デアセチルセファロスポリンＣ合成酵素。Ｄ
ＡＯＣのＤＡＣへの変換を触媒する酵素活性。
あり、ファージ頭部へのバッキングも可能な組換えＤＮ
ＡクローニングベクターＤＡＣ−下記の式： で表される構造を有するデアセチルセファロスポリンＣ
０ ＤＡＣ５−デアセチルセファロスポリンＣ合成酵素。Ｄ
ＡＯＣのＤＡＣへの変換を触媒する酵素活性。
ＤＡＯＣ−下記の式：
で表される構造を有するデアセトキシセファロスポリン
Ｃ０ ＤＡＯＣ３−デアセトキシセファロスポリンＣ合成酵素
。ＤＡＯＣＳ遺伝子によって暗号化され、ペニシリンＮ
のＤＡＯＣへの変換を触媒する酵素活性。
Ｃ０ ＤＡＯＣ３−デアセトキシセファロスポリンＣ合成酵素
。ＤＡＯＣＳ遺伝子によって暗号化され、ペニシリンＮ
のＤＡＯＣへの変換を触媒する酵素活性。
遺伝子−プロモーター、翻訳活性化配列、暗号配列と、
蛋白質（および、必然的にｍＲＮＡ）、ｔＲＮＡまたは
ｒＲＮＡのうちいずれかの遺伝子産物を発現させるため
に配置された３′調節配列からなるＤＮＡ断片。
蛋白質（および、必然的にｍＲＮＡ）、ｔＲＮＡまたは
ｒＲＮＡのうちいずれかの遺伝子産物を発現させるため
に配置された３′調節配列からなるＤＮＡ断片。
ゲノム・ライブラリー−実質上、特定の微生物の完全な
ゲノムに相当するＤＮＡ断片をクローン化して含んでい
る１組の組換えＤＮＡクローニングベクター ｈＧＨ−ヒト成長ホルモン、またはそれを暗号化してい
るＤＮＡ。
ゲノムに相当するＤＮＡ断片をクローン化して含んでい
る１組の組換えＤＮＡクローニングベクター ｈＧＨ−ヒト成長ホルモン、またはそれを暗号化してい
るＤＮＡ。
Ｈ＋ｏＲ−ヒグロマイシン耐性を付与する遺伝子。
またヒグロマイシン耐性表現型を示すのに用いる。
ハイブリダイゼーション−２個の１本鎖ＤＮＡ分子また
はＲＮＡ分子、またはＤＮＡ分子とＲＮＡ分子をアニー
リングして完全に塩基対合し、または完全には塩基対合
しない２本鎖分子を生成するプロセス。
はＲＮＡ分子、またはＤＮＡ分子とＲＮＡ分子をアニー
リングして完全に塩基対合し、または完全には塩基対合
しない２本鎖分子を生成するプロセス。
ＩＰＳまたはＩ ＰＮＳ−イソペニシリンＮ合成酵素。
イソペニシリンＮ合成酵素−シクラーゼとしても知られ
ているδ−（Ｌ−σ−アミノアジピル）−Ｌ−システイ
ニル−Ｄ−バリンからのイソペニシリンＮの生成を触媒
する酵素。
ているδ−（Ｌ−σ−アミノアジピル）−Ｌ−システイ
ニル−Ｄ−バリンからのイソペニシリンＮの生成を触媒
する酵素。
Ｋ＋＊Ｒ−カナマイシン耐性を付与する遺伝子。
またカナマイシン耐性表現型を示すのに用いる。
Ｉａｃ Ｉ −Ｅ 、コリｌａｃ Ｉ遺伝子。
Ｉａｃ Ｚσ−Ｅ、コリｌａｃオペロンから誘導された
プロモーターおよびβ−ガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ）
σ−断片。
プロモーターおよびβ−ガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ）
σ−断片。
１ｐｐＴ −Ｅ 、コリｔｐｐ遺伝子の転写ターミネー
タ１ｐｐＰ −Ｅ 、コ１月ｐｐ遺伝子のプロモーター
Ｍ１３０ＲＩ−ｙチー９Ｍ１３の複製起源。
タ１ｐｐＰ −Ｅ 、コ１月ｐｐ遺伝子のプロモーター
Ｍ１３０ＲＩ−ｙチー９Ｍ１３の複製起源。
ｍｅｌ−タイロシナーゼ遺伝子。
ＭＣ５−多重クローニング部位。
謹ＲＮＡ−メツセンジャーリポ核酸。
０ＲＩ−プラスミドまたはベクターの複製起源。
ＤＮＡポリメラーゼのための付着部位または開始部位と
して働＜ＤＮＡ配列。
して働＜ＤＮＡ配列。
ＰｅｎＤＮＡ−ペニシリウム・クリソゲヌムに由来する
ＤＮＡ。
ＤＮＡ。
ｐＩＰＳ−ペニシリウム・クリソゲヌムの！ＰＳ遺伝子
またはＩＰＳ暗号配列。
またはＩＰＳ暗号配列。
ｐｌＰｓｐ−ペニシリウム・クリソゲヌムＩＰＳ遺伝子
のプロモーター ｐｌＰｓｔ−ペニシリウム・クリソゲヌムＩＰＳ遺伝子
の転写ターミネータ− ｐＬ−バクテリオファージ・ラムダの左側プロモーター プロモーター−隣接した下流ＤＮＡの転写を促進するＤ
ＮＡ配列。
のプロモーター ｐｌＰｓｔ−ペニシリウム・クリソゲヌムＩＰＳ遺伝子
の転写ターミネータ− ｐＬ−バクテリオファージ・ラムダの左側プロモーター プロモーター−隣接した下流ＤＮＡの転写を促進するＤ
ＮＡ配列。
ｒｂｓ−リポソーム結合部位。翻訳活性化配列によって
暗号化されており、リポソームが結合し得る＋ｍＲＮＡ
分子の５′末端上の配列。
暗号化されており、リポソームが結合し得る＋ｍＲＮＡ
分子の５′末端上の配列。
組換えＤＮＡクローニングベクター−１またはそれ以上
の付加的なりＮＡ分子を付加し得る、もしくは付加した
ＤＮＡ分子からなる自律的に複製または組込み可能な物
質であって、プラスミドを含むがそれに限定されない。
の付加的なりＮＡ分子を付加し得る、もしくは付加した
ＤＮＡ分子からなる自律的に複製または組込み可能な物
質であって、プラスミドを含むがそれに限定されない。
組換えＤＮＡ発現ベクター−研究または経済的に重要な
ポリペプチドまたはＲＮＡを暗号化したＤＮＡ断片の発
現させるために配置されたプロモーターおよびその他の
５′調節配列を含有する自律的に複製または組込み可能
な物質であって、プラスミド等を含むが、それだけに限
定されない。
ポリペプチドまたはＲＮＡを暗号化したＤＮＡ断片の発
現させるために配置されたプロモーターおよびその他の
５′調節配列を含有する自律的に複製または組込み可能
な物質であって、プラスミド等を含むが、それだけに限
定されない。
組換えＤＮＡベクター−任意の組換えＤＮＡクローニン
グベクターまたは発現ベクター制限断片＝１またはそれ
以上の酵素の作用によって生じた任意の直鎖状ＤＮＡ分
子。
グベクターまたは発現ベクター制限断片＝１またはそれ
以上の酵素の作用によって生じた任意の直鎖状ＤＮＡ分
子。
ｒＲＮＡ−リポソーム性リポ核酸。
感受性宿主細胞−抗生物質の耐性を付与するＤＮＡ断片
の存在なしにはその抗生物質の存在下に増殖できない宿
主細胞。
の存在なしにはその抗生物質の存在下に増殖できない宿
主細胞。
ＴｃＲ−テトラサイクリン耐性を付与する遺伝子。また
テトラサイクリン耐性表現型を示すのに用いる。
テトラサイクリン耐性表現型を示すのに用いる。
転写ターミネーター−ＲＮＡポリメラーゼによるＤＮＡ
転写を終了させるのに作用するＤＮＡ配列。
転写を終了させるのに作用するＤＮＡ配列。
トランス７エクタントー７アージＤＮＡまｊこはファー
ジ粒子に詰め込まれたＤＮＡによって形質転換をうけた
受容宿主細胞。
ジ粒子に詰め込まれたＤＮＡによって形質転換をうけた
受容宿主細胞。
形質転換体−形質転換をうけた受容宿主細胞。
形質転換−遺伝子型を変化させ、それによって受容細胞
内に変化を起こさせるＤＮＡの受容宿主細胞への導入。
内に変化を起こさせるＤＮＡの受容宿主細胞への導入。
翻訳活性化配列−ｍＲＮＡへ転写されると、＋ａＲＮＡ
の蛋白質への翻訳を促進する５″調節ＤＮＡ配列。
の蛋白質への翻訳を促進する５″調節ＤＮＡ配列。
ｔＲＮＡ−トランスファーリボ核酸。
ｔｒｐ−Ｅ、コリのトリプトファン・オペロンのプロモ
ーターおよび翻訳活性化配列。
ーターおよび翻訳活性化配列。
添付図面に提供した制限酵素切断部位（制限酵素部位）
および機能地図は本明細書で説明する組換えＤＮＡベク
ターの概略を示したものである。
および機能地図は本明細書で説明する組換えＤＮＡベク
ターの概略を示したものである。
制限酵素部位に関する情報は限りがなく、したがって実
際に地図に示したベクター上の特定の部位の他にも、さ
らに制限酵素部位があるかもしれない。
際に地図に示したベクター上の特定の部位の他にも、さ
らに制限酵素部位があるかもしれない。
第１図はプラスミドｐｏｗ３８０の制限酵素部位および
機能地図、第２図はプラスミドｐｃ Ｚ Ｒ３３６の制
限酵素部位および機能地図、第３図はプラスミドｐｏｗ
３８２の制限酵素部位および機能地図、第４図はプラス
ミドｐＣＺＲ１１１の制限酵素部位および機能地図、第
５図はプラスミドｐｐ Ｓ ６５の制限酵素部位および
機能地図、第６図はプラスミドｐＰ Ｓ ６７の制限酵
素部位および機能地図、第７図はプラスミドｐｐ Ｓ
６９の制限酵素部位および機能地図、第８図はグラスミ
ドｐＰＳ６０の制限酵素部位および機能地図、第９図は
プラスミドｐＰ Ｓ ６３の制限酵素部位および機能地
図、第１０図はプラスミドｐＰＳ６４の制限酵素部位お
よび機能地図、第１１図はプラスミドｐＭＬｃ１２の制
限酵素部位および機能地図、第１２図はプラスミドｐ３
Ｓ Ｒ２の制限酵素部位および機能地図、第１３図は
プラスミドｐＰＳ５１の制限酵素部位および機能地図、
第１４図はプラスミド、）ＰＳ７１の制限酵素部位およ
び機能地図、第１５図はプラスミドｐＬＣ２の制限酵素
部位および機能地図、第１６図はプラスミドｐＰ５６８
の制限酵素部位および機能地図である。
機能地図、第２図はプラスミドｐｃ Ｚ Ｒ３３６の制
限酵素部位および機能地図、第３図はプラスミドｐｏｗ
３８２の制限酵素部位および機能地図、第４図はプラス
ミドｐＣＺＲ１１１の制限酵素部位および機能地図、第
５図はプラスミドｐｐ Ｓ ６５の制限酵素部位および
機能地図、第６図はプラスミドｐＰ Ｓ ６７の制限酵
素部位および機能地図、第７図はプラスミドｐｐ Ｓ
６９の制限酵素部位および機能地図、第８図はグラスミ
ドｐＰＳ６０の制限酵素部位および機能地図、第９図は
プラスミドｐＰ Ｓ ６３の制限酵素部位および機能地
図、第１０図はプラスミドｐＰＳ６４の制限酵素部位お
よび機能地図、第１１図はプラスミドｐＭＬｃ１２の制
限酵素部位および機能地図、第１２図はプラスミドｐ３
Ｓ Ｒ２の制限酵素部位および機能地図、第１３図は
プラスミドｐＰＳ５１の制限酵素部位および機能地図、
第１４図はプラスミド、）ＰＳ７１の制限酵素部位およ
び機能地図、第１５図はプラスミドｐＬＣ２の制限酵素
部位および機能地図、第１６図はプラスミドｐＰ５６８
の制限酵素部位および機能地図である。
本発明は、ストレグトマイセス・クラブリゲルスのエキ
スパンダーゼ活性を暗号化しｆ−Ｄ Ｎ Ａ化合物およ
び組換えＤＮＡクローニングベクターならびに発現ベク
ターからなる。以下に、Ｓ２クラブリゲルスのエキスパ
ンダーゼを暗号化したＤＮＡ配列をＳ、クラブリゲルス
のゲノムの暗号領域の３′および５″末端に続＜ＤＮＡ
の一部とともに示す。ここでは２本鎖ＤＮＡ分子の「セ
ンス」鎖、即ち暗号鋼だけを示し、ＤＮＡは５゛から３
″の方向へと順次左から右へ記載した。ヌクレオチド配
列の番号をＤＮＡ配列の上に示した。ＤＮＡ配列の下に
、ＤＮＡによって暗号化されているエキスパンダーゼの
アミノ酸残基配列をアミノ末端からカルボキン末端方向
へと左から右へ各列毎に併記して示した。各アミノ酸残
基は、その残基を暗号化しているＤＮＡの下に示した。
スパンダーゼ活性を暗号化しｆ−Ｄ Ｎ Ａ化合物およ
び組換えＤＮＡクローニングベクターならびに発現ベク
ターからなる。以下に、Ｓ２クラブリゲルスのエキスパ
ンダーゼを暗号化したＤＮＡ配列をＳ、クラブリゲルス
のゲノムの暗号領域の３′および５″末端に続＜ＤＮＡ
の一部とともに示す。ここでは２本鎖ＤＮＡ分子の「セ
ンス」鎖、即ち暗号鋼だけを示し、ＤＮＡは５゛から３
″の方向へと順次左から右へ記載した。ヌクレオチド配
列の番号をＤＮＡ配列の上に示した。ＤＮＡ配列の下に
、ＤＮＡによって暗号化されているエキスパンダーゼの
アミノ酸残基配列をアミノ末端からカルボキン末端方向
へと左から右へ各列毎に併記して示した。各アミノ酸残
基は、その残基を暗号化しているＤＮＡの下に示した。
アミノ酸残基配列の下にその残基配列の番号を付した。
（ここで、Ａはデオキシアデニル、Ｇはデオキシグアニ
ル、Ｃはデオキシシチジル、Ｔはチミジル、Ａｌａはア
ラニン残基、Ａｒｇはアルギニン残基、Ａｓｎはアスパ
ラギン残基、Ａｓｐはアスパラギン酸残基、Ｃｙｓはシ
スティン残基、Ｇｌｎはグルタミン残基、Ｇｌｕはグル
タミン酸残基、Ｇｌｙはグリシン残基、Ｈ４ｓはヒスチ
ジン残基、ＩＩｓはイソロイシン残基、Ｌｅｕはロイシ
ン残基、Ｌｙｓはリシン残基、Ｍｅｔはメチオニン残基
、Ｐｈｅはフェニルアラニン残基、Ｐｒｏはプロリン残
基、Ｓｅ「はセリン残基、Ｔｈｒはスレオニン残基、Ｔ
ｒｐはトリプトファン残基、Ｔｙｒはチロシン残基、Ｖ
ａｌはバリン残基である。） 上記のＤＮＡ配列は、Ｇ−Ｃ含量約７０％を示し、計算
分子量３４５１９ダルトン、実測分子量約３４０００ダ
ルトンのポリペプチドを暗号化している。当業者ならば
ここに示したＤＮＡ配列が本発明の重要な部分であるこ
とを理解し得よう。
ル、Ｃはデオキシシチジル、Ｔはチミジル、Ａｌａはア
ラニン残基、Ａｒｇはアルギニン残基、Ａｓｎはアスパ
ラギン残基、Ａｓｐはアスパラギン酸残基、Ｃｙｓはシ
スティン残基、Ｇｌｎはグルタミン残基、Ｇｌｕはグル
タミン酸残基、Ｇｌｙはグリシン残基、Ｈ４ｓはヒスチ
ジン残基、ＩＩｓはイソロイシン残基、Ｌｅｕはロイシ
ン残基、Ｌｙｓはリシン残基、Ｍｅｔはメチオニン残基
、Ｐｈｅはフェニルアラニン残基、Ｐｒｏはプロリン残
基、Ｓｅ「はセリン残基、Ｔｈｒはスレオニン残基、Ｔ
ｒｐはトリプトファン残基、Ｔｙｒはチロシン残基、Ｖ
ａｌはバリン残基である。） 上記のＤＮＡ配列は、Ｇ−Ｃ含量約７０％を示し、計算
分子量３４５１９ダルトン、実測分子量約３４０００ダ
ルトンのポリペプチドを暗号化している。当業者ならば
ここに示したＤＮＡ配列が本発明の重要な部分であるこ
とを理解し得よう。
上記の配列は、完全に保護されたデオキシヌクレオチド
構築ブロックを使用する改良ホスホトリエステル法によ
って普通に合成することができる。
構築ブロックを使用する改良ホスホトリエステル法によ
って普通に合成することができる。
そのような合成方法は当技術周知のものであり、実質上
、イタクラ（Ｉ ｔａｋｕｒａ）ら［サイエンス（Ｓｃ
ｉｅｎｃｅ）、１９８巻、１０５６頁（１９７７年）〕
およびクフレアＣｒｅａ）ら〔プロシーディングズ・オ
プ・ザ・ナショナル・アカデミ−・オブ・サイエンシズ
・オプ・Ｕ Ｓ Ａ（Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ、Ａｃａｄ、Ｓ
ｃｉ、Ｕ ＳＡ）、７５巻、５７６５頁（１９７８年）
の方法にしたがい実施し得る。また特に好ましい方法が
、フシラング（Ｈｓｉｕｎｇ）ら［ヌクレイツク・アシ
ッド・リサーチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃ１ｄ Ｒｅ
５ｅａｒｃｈ）、１１巻、３２２７頁（１９８３年）］
およびナラング（Ｎ ａｒａｎｇ）ら［メソッズ・イン
・エンジモロジー（Ｍｅｔｈｏｄｓｉｎ Ｅ ｎｚｙ
ｍｏｌｏｇｙ）、６８巻、９０頁（１９８０年）１によ
って報告されている。また上記の手動的な方法に加えて
、シスチック（Ｓｙｓｔｅｃ） １４５０ＡまたはＡＢ
Ｓ［アプライド・バイオシステムズ（Ａｐｐｌ ｉｅｄ
Ｂ １ｏｓｙｓｔｅ＊ｓ） ８５０、リンカーンφ
センター・ドライブ（Ｌ １ｎｃｏｌｎ Ｃｅｎｔｒ
ｅ Ｄｒｉｖｅ）、ホスター・シテ４−（Ｆｏｓｔｅ
ｒ Ｃ１ｔｙ）、ＣＡ、９４４０４］３８０Ａ Ｄ
ＮＡシンセサイザーのような自動ＤＮＡ合成装置を使用
してＤＮＡ配列を合成することができる。
、イタクラ（Ｉ ｔａｋｕｒａ）ら［サイエンス（Ｓｃ
ｉｅｎｃｅ）、１９８巻、１０５６頁（１９７７年）〕
およびクフレアＣｒｅａ）ら〔プロシーディングズ・オ
プ・ザ・ナショナル・アカデミ−・オブ・サイエンシズ
・オプ・Ｕ Ｓ Ａ（Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ、Ａｃａｄ、Ｓ
ｃｉ、Ｕ ＳＡ）、７５巻、５７６５頁（１９７８年）
の方法にしたがい実施し得る。また特に好ましい方法が
、フシラング（Ｈｓｉｕｎｇ）ら［ヌクレイツク・アシ
ッド・リサーチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃ１ｄ Ｒｅ
５ｅａｒｃｈ）、１１巻、３２２７頁（１９８３年）］
およびナラング（Ｎ ａｒａｎｇ）ら［メソッズ・イン
・エンジモロジー（Ｍｅｔｈｏｄｓｉｎ Ｅ ｎｚｙ
ｍｏｌｏｇｙ）、６８巻、９０頁（１９８０年）１によ
って報告されている。また上記の手動的な方法に加えて
、シスチック（Ｓｙｓｔｅｃ） １４５０ＡまたはＡＢ
Ｓ［アプライド・バイオシステムズ（Ａｐｐｌ ｉｅｄ
Ｂ １ｏｓｙｓｔｅ＊ｓ） ８５０、リンカーンφ
センター・ドライブ（Ｌ １ｎｃｏｌｎ Ｃｅｎｔｒ
ｅ Ｄｒｉｖｅ）、ホスター・シテ４−（Ｆｏｓｔｅ
ｒ Ｃ１ｔｙ）、ＣＡ、９４４０４］３８０Ａ Ｄ
ＮＡシンセサイザーのような自動ＤＮＡ合成装置を使用
してＤＮＡ配列を合成することができる。
上に掲げたＤＡＯＣＳ酵素のアミノ酸残基配列は、はと
んどのアミノ酸残基および翻訳停止信号に対し１個以上
のコドンが対応していることに由来する遺伝暗号の同義
性のため、多数の異なったＤＮＡ配列によって暗号化さ
れ得る。これらの他のＤＮＡ配列も本発明の同一のアミ
ノ酸残基配列を暗号化しているので、本発明はこれらの
他の配列をも包含する。
んどのアミノ酸残基および翻訳停止信号に対し１個以上
のコドンが対応していることに由来する遺伝暗号の同義
性のため、多数の異なったＤＮＡ配列によって暗号化さ
れ得る。これらの他のＤＮＡ配列も本発明の同一のアミ
ノ酸残基配列を暗号化しているので、本発明はこれらの
他の配列をも包含する。
本発明のＤＡＯＣ３暗号化ＤＮＡ化合物は、ストレプト
マイセス・クラブリゲルスの株から単離された。そのＳ
、クラブリゲルス株の全ゲノムＤＮＡのゲノムライブラ
リーを組立て、デオキシリボオリゴヌクレオチド・プロ
ーブと相同（ホモローガス）な配列の存在を検討した。
マイセス・クラブリゲルスの株から単離された。そのＳ
、クラブリゲルス株の全ゲノムＤＮＡのゲノムライブラ
リーを組立て、デオキシリボオリゴヌクレオチド・プロ
ーブと相同（ホモローガス）な配列の存在を検討した。
このプローブは該Ｓ９クラブリゲルスのアミノ末端アミ
ノ酸配列について得た情報にしたがい、遺伝暗号に関す
る知識およびストレプトマイセスのコドン利用優先度に
関する知識をもとにして組立てた。ＤＮＡの配列決定を
行った結果、どのベクターがＳ、クラブリゲルスＤＡＯ
Ｃ３を暗号化しているかが判明した。
ノ酸配列について得た情報にしたがい、遺伝暗号に関す
る知識およびストレプトマイセスのコドン利用優先度に
関する知識をもとにして組立てた。ＤＮＡの配列決定を
行った結果、どのベクターがＳ、クラブリゲルスＤＡＯ
Ｃ３を暗号化しているかが判明した。
ＤＡＯＣ３酵素を暗号化しているベクターを同定したの
ち、ＤＡＯＣＳ遺伝子を含んでいる〜３゜ＯｋｂのＢａ
ｍＨＩ制限酵素断片（制限断片）を単離し、商業的に入
手可能なプラスミドｐＵＣ８へ挿入してプラスミドｐＯ
Ｗ３８０を作成し、ついでこれをＥ、コリＫ１２ＲＲ１
ΔＭ１５宿主細胞に導入した。Ｅ、コリに１２ＲＲＩＡ
Ｍｉ ５／ｐＯＷ３８０形質転換体はザ・ノーザン・レ
ジオナル・リサーチ・ラボラトリーズ（Ｔｈｅ Ｎｏ
ｒｔｈｅｒｎ Ｒｅｇｉ。
ち、ＤＡＯＣＳ遺伝子を含んでいる〜３゜ＯｋｂのＢａ
ｍＨＩ制限酵素断片（制限断片）を単離し、商業的に入
手可能なプラスミドｐＵＣ８へ挿入してプラスミドｐＯ
Ｗ３８０を作成し、ついでこれをＥ、コリＫ１２ＲＲ１
ΔＭ１５宿主細胞に導入した。Ｅ、コリに１２ＲＲＩＡ
Ｍｉ ５／ｐＯＷ３８０形質転換体はザ・ノーザン・レ
ジオナル・リサーチ・ラボラトリーズ（Ｔｈｅ Ｎｏ
ｒｔｈｅｒｎ Ｒｅｇｉ。
ｎａｌ Ｒｅ５ｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ
（ＮＲＲＬ）、ベオリア（Ｐｅｏｒｉａ）、ＩＬ６１６
０４）に寄託され、ＮＲＲＬ Ｂ−１８２６４の受託
番号のもとにその保存株の一つとして貯蔵された（寄託
口、１９８７年１１月２０日）。添付図面第１図にプラ
スミドｐｏｗ３ａｏの制限酵素部位および機能地図を示
す。
（ＮＲＲＬ）、ベオリア（Ｐｅｏｒｉａ）、ＩＬ６１６
０４）に寄託され、ＮＲＲＬ Ｂ−１８２６４の受託
番号のもとにその保存株の一つとして貯蔵された（寄託
口、１９８７年１１月２０日）。添付図面第１図にプラ
スミドｐｏｗ３ａｏの制限酵素部位および機能地図を示
す。
プラスミドｐＯＷ３８０は本発明のその他の発現ベクタ
ー組立ての有用な出発物質として使用し得る。これらの
ベクターは、特に（ｌ Ｘａ）プロモーターおよび翻訳
活性化配列と、（ｂ）そのプロモーターから発現される
よう配置されたＤＡＯＣ３活性を暗号化しているＤＮＡ
とを含んでいる組換えＤＮＡ発現ベクターで宿主細胞を
形質転換し、（２）段階（１）で形質転換させた宿主細
胞がＤＡＯＣＳ活性を発現し得る条件下で、これを培養
することからなる。ＤＡＯＣＳ活性を組換え宿主細胞で
生産する方法に有用である。
ー組立ての有用な出発物質として使用し得る。これらの
ベクターは、特に（ｌ Ｘａ）プロモーターおよび翻訳
活性化配列と、（ｂ）そのプロモーターから発現される
よう配置されたＤＡＯＣ３活性を暗号化しているＤＮＡ
とを含んでいる組換えＤＮＡ発現ベクターで宿主細胞を
形質転換し、（２）段階（１）で形質転換させた宿主細
胞がＤＡＯＣＳ活性を発現し得る条件下で、これを培養
することからなる。ＤＡＯＣＳ活性を組換え宿主細胞で
生産する方法に有用である。
実施例１に記載した方法により、Ｅ、コリＫ１２ＲＲ１
ΔＭｌ ５／ｐＯＷ３８０からプラスミドｐｏｗ３８０
を単離できる。プラスミドｐＯＷ３８０は本発明のベク
ターの有用な出発物質である。
ΔＭｌ ５／ｐＯＷ３８０からプラスミドｐｏｗ３８０
を単離できる。プラスミドｐＯＷ３８０は本発明のベク
ターの有用な出発物質である。
プラスミドｐＯＷ３８０はストレプトマイセス・クラブ
リゲルスＤＡＯＣ３の完全な遺伝子を含んでおり、例え
ば〜３．Ｏｋｂ Ｂａ耐目制限酵素断片上にプラスミ
ドから単離できる。Ｅ、コリで高水準のＤＡＯＣ３を発
現させるプラスミド（ｐＯＷ３８２と命名）を組立てる
出発物質としてプラスミドｐＯＷ３８０を使用した。Ｓ
、クラブリゲルスＤＡＯＣ３暗号配列の操作を容易にす
るため、制限酵素ＮｄｅＩ認識配列をＳ、クラブリゲル
スＤＡＯＣ８暗号配列の−３〜＋３の位置に設けた。
リゲルスＤＡＯＣ３の完全な遺伝子を含んでおり、例え
ば〜３．Ｏｋｂ Ｂａ耐目制限酵素断片上にプラスミ
ドから単離できる。Ｅ、コリで高水準のＤＡＯＣ３を発
現させるプラスミド（ｐＯＷ３８２と命名）を組立てる
出発物質としてプラスミドｐＯＷ３８０を使用した。Ｓ
、クラブリゲルスＤＡＯＣ３暗号配列の操作を容易にす
るため、制限酵素ＮｄｅＩ認識配列をＳ、クラブリゲル
スＤＡＯＣ８暗号配列の−３〜＋３の位置に設けた。
ＮｄｅＩ部位の作成はＭ１３部位特異的突然変異変異法
によって行い、ＤＡＯＣＳ遺伝子開始コドンに直接隣接
している５°非暗号化部分にＧＣＣからＣＡＴへのＤＮ
Ａ塩基変化を生じさせる。当業者ならば、ＤＮＡ突然変
異誘発法が制限酵素認識部位をＤＮＡ配列に導入するの
に一般に使用されており、この場合、暗号化されたアミ
ノ酸配列が変化しないことを理解し得よう。実施例２で
突然変異および中間組立て物についてさらに詳細に説明
する。得られたプラスミドはｐｏｗ：３８１と命名され
、実施例２でさらに完全に説明するが制限酵素ＮｄｅＩ
部位が存在している点だけがｐＯＷ、３８０と異なって
いる。ついで中間体プラスミドｐＯＷ３８１を使用して
発現プラスミドｐＯＷ３８２を組立てた。
によって行い、ＤＡＯＣＳ遺伝子開始コドンに直接隣接
している５°非暗号化部分にＧＣＣからＣＡＴへのＤＮ
Ａ塩基変化を生じさせる。当業者ならば、ＤＮＡ突然変
異誘発法が制限酵素認識部位をＤＮＡ配列に導入するの
に一般に使用されており、この場合、暗号化されたアミ
ノ酸配列が変化しないことを理解し得よう。実施例２で
突然変異および中間組立て物についてさらに詳細に説明
する。得られたプラスミドはｐｏｗ：３８１と命名され
、実施例２でさらに完全に説明するが制限酵素ＮｄｅＩ
部位が存在している点だけがｐＯＷ、３８０と異なって
いる。ついで中間体プラスミドｐＯＷ３８１を使用して
発現プラスミドｐＯＷ３８２を組立てた。
プラスミドｐＣＺＲ３３６（−７ムダｐＬＣＡｐＬ）プ
ロモーターおよび翻訳活性化配列、ｃ１８５７１度感受
性リプレッサー遺伝子、テトラサイクリン耐性を付与す
る遺伝子およびベクターの複製機能を暗号化しているＤ
ＮＡ配列を含有する発現ベクター）にストレプトマイセ
ス・クラブリゲルスのＤＡＯＣＳ暗号配列を挿入するこ
とによって、プラスミドｐｏｗ３８２を組み立てること
ができる。
ロモーターおよび翻訳活性化配列、ｃ１８５７１度感受
性リプレッサー遺伝子、テトラサイクリン耐性を付与す
る遺伝子およびベクターの複製機能を暗号化しているＤ
ＮＡ配列を含有する発現ベクター）にストレプトマイセ
ス・クラブリゲルスのＤＡＯＣＳ暗号配列を挿入するこ
とによって、プラスミドｐｏｗ３８２を組み立てること
ができる。
興味ある遺伝子を挿入し、λｐＬプロモーターの制御下
で発現させ得る部位の上流にある短いペグチドを暗号化
した第１「シストロン」を発現させるような位置にプラ
スミドｐｃ Ｚ Ｒ３３６のλｐＬ誘導プロモーターが
配される。プラスミドｐＣ２Ｒ３３６またはその誘導体
に暗号化されたｃ１８５７蛋白質は約３０°Ｃの低温で
活性であり、λｐＬグロモーター活性を抑制できるが、
温度が約４２°Ｃに上昇するとｃ１８５７蛋白質は失活
し、λｐＬグロモーターは興味ある遺伝子生産物を暗号
化した多量のｍＲＮＡの転写を開始する。添付図面第２
図にプラスミドｐＣＺＲ３３６の制限酵素部位および機
能地図を示す。
で発現させ得る部位の上流にある短いペグチドを暗号化
した第１「シストロン」を発現させるような位置にプラ
スミドｐｃ Ｚ Ｒ３３６のλｐＬ誘導プロモーターが
配される。プラスミドｐＣ２Ｒ３３６またはその誘導体
に暗号化されたｃ１８５７蛋白質は約３０°Ｃの低温で
活性であり、λｐＬグロモーター活性を抑制できるが、
温度が約４２°Ｃに上昇するとｃ１８５７蛋白質は失活
し、λｐＬグロモーターは興味ある遺伝子生産物を暗号
化した多量のｍＲＮＡの転写を開始する。添付図面第２
図にプラスミドｐＣＺＲ３３６の制限酵素部位および機
能地図を示す。
プラスミドｐＯＷ３８２は、プラスミドｐＣＺＲ３３６
と同一の第１シストロン、ｃＩ８５７遺伝子、λｐＬプ
ロモーター、翻訳活性化配列を含んでいるが、ざらにλ
ｐＬプロモーターから構成される装置にプラスミドｐｏ
ｗ３８１由来のＤＡＯＣＳ遺伝子暗号配列を含んでいる
。プラスミドｐＯＷ３８１の＝２．４ｋｂ Ｎｄｅｌ
−ＢａｍＨＩ制限酵素断片はＤＡＯＣ３の完全な暗号配
列を含んでいる。プラスミドｐｏｗ３８２は、プラスミ
ドｐＣＺＲ３３６のλｐ、Ｌプロモーターおよび翻訳活
性化配列を、ＤＡＯＣ３暗号化ＤＮＡを発現させるよう
に配置して組立てる。添付図面第３図にプラスミドｐＯ
Ｗ３８２の制限酵素部位および機能地図を示す。実施例
３にプラスミドｐＯＷ３８２の組み立てについてさらに
詳細に説明する。
と同一の第１シストロン、ｃＩ８５７遺伝子、λｐＬプ
ロモーター、翻訳活性化配列を含んでいるが、ざらにλ
ｐＬプロモーターから構成される装置にプラスミドｐｏ
ｗ３８１由来のＤＡＯＣＳ遺伝子暗号配列を含んでいる
。プラスミドｐＯＷ３８１の＝２．４ｋｂ Ｎｄｅｌ
−ＢａｍＨＩ制限酵素断片はＤＡＯＣ３の完全な暗号配
列を含んでいる。プラスミドｐｏｗ３８２は、プラスミ
ドｐＣＺＲ３３６のλｐ、Ｌプロモーターおよび翻訳活
性化配列を、ＤＡＯＣ３暗号化ＤＮＡを発現させるよう
に配置して組立てる。添付図面第３図にプラスミドｐＯ
Ｗ３８２の制限酵素部位および機能地図を示す。実施例
３にプラスミドｐＯＷ３８２の組み立てについてさらに
詳細に説明する。
約４２℃の温度でＥ、コリＫ１２ＪＭ１０９／ｐｏｗ３
８２は、細胞蛋白質合計のほぼ〜１５％に近い高水準で
ＤＡＯＣＳ活性を発現する。これらのＥ、コリＫ１２Ｊ
Ｍ１０９／ｐＯＷ３８２形質転換体から得た粗製細胞抽
出物はペニシリンＮのＤＡＯＣへの変換を触媒すること
ができるが、形質転換されていないＥ、コリＫ１２ＪＭ
１０９細胞から得た細胞抽出物はこの変換を触媒できな
い。
８２は、細胞蛋白質合計のほぼ〜１５％に近い高水準で
ＤＡＯＣＳ活性を発現する。これらのＥ、コリＫ１２Ｊ
Ｍ１０９／ｐＯＷ３８２形質転換体から得た粗製細胞抽
出物はペニシリンＮのＤＡＯＣへの変換を触媒すること
ができるが、形質転換されていないＥ、コリＫ１２ＪＭ
１０９細胞から得た細胞抽出物はこの変換を触媒できな
い。
変換反応のための測定方法および測定結果を実施例４に
示す。
示す。
多数のＥ、コリＫ１２株は、恐ら（ａｍｐｃ遺伝子座に
よって暗号化された内在性のベニシリナーゼ活性を含有
する。したがって最適なりＡＯＣ５活性を観察し得るよ
う、ＤＡＯＣＳポリペプチドを部分精製するのが望まし
い。この目的のためには、この酵素の精製を用いて内在
性Ｅ、コリ・ペニシリナーゼ活性を所望のＤＡＯＣ３活
性から分離することができる。ペニシリナーゼの有害効
果を解消するための部分精製の別法として、この活性の
生産を欠いている株を使用する方法がある。そのような
株の一つであるＥ、コリＫ１２Ａ８５８９２は、ザ・ノ
ーザン・レジオナル・リサーチ・センター（ｔｈｅ
Ｎｏｒｔｈｅｒｎ Ｒｅｇｉｏｎａｌ Ｒｅ５ｅａ
ｒｃｈＣｅｎｔｅｒ）から受託番号ＮＲＲＬ Ｂ−１８
０９６（寄託日、１９８６年８月８日）のもとに入手で
きる。
よって暗号化された内在性のベニシリナーゼ活性を含有
する。したがって最適なりＡＯＣ５活性を観察し得るよ
う、ＤＡＯＣＳポリペプチドを部分精製するのが望まし
い。この目的のためには、この酵素の精製を用いて内在
性Ｅ、コリ・ペニシリナーゼ活性を所望のＤＡＯＣ３活
性から分離することができる。ペニシリナーゼの有害効
果を解消するための部分精製の別法として、この活性の
生産を欠いている株を使用する方法がある。そのような
株の一つであるＥ、コリＫ１２Ａ８５８９２は、ザ・ノ
ーザン・レジオナル・リサーチ・センター（ｔｈｅ
Ｎｏｒｔｈｅｒｎ Ｒｅｇｉｏｎａｌ Ｒｅ５ｅａ
ｒｃｈＣｅｎｔｅｒ）から受託番号ＮＲＲＬ Ｂ−１８
０９６（寄託日、１９８６年８月８日）のもとに入手で
きる。
プラスミドｐＯＷ３８２はＥ、コリで多量のＤＡＯＣ３
を生産する効果的な手段を提供する。Ｅ。
を生産する効果的な手段を提供する。Ｅ。
コリ／ｐＯＷ３８２は細胞蛋白質合計のほぼ１５％に近
い水準でＤＡＯＣ３を発現し、またＥ、コリの培養は、
天然にＤＡＯＣＳを産生する微生物の培養よりも複雑で
ないから、Ｅ、コリ／ｐＯＷ３８２形質転換体は、非組
換え体ないし「天然ＪＤＡ０Ｃ５産生微生物よりも一層
効率的で、−層経済的な組換えＤＡＯＣＳの生産に使用
できる。
い水準でＤＡＯＣ３を発現し、またＥ、コリの培養は、
天然にＤＡＯＣＳを産生する微生物の培養よりも複雑で
ないから、Ｅ、コリ／ｐＯＷ３８２形質転換体は、非組
換え体ないし「天然ＪＤＡ０Ｃ５産生微生物よりも一層
効率的で、−層経済的な組換えＤＡＯＣＳの生産に使用
できる。
実施例３に記載したように、ＤＡＯＣ３は細胞不含系で
ペニシリンＮからＤＡＯＣを生産するのに使用できる。
ペニシリンＮからＤＡＯＣを生産するのに使用できる。
ＤＡＯＣは有用な抗生物質であるばかりでなく、セファ
レキシンやその他のセファロスポリン類のような重要な
抗生物質生産の出発物質として使用できる（米国特許第
４３０７１９２号参照）。恐ら＜ＤＡＯＣ３の最も重要
な用途は、ペニシリンＮ以外のペニシリン類を新規セフ
ァロスポリン誘導体へ変換するのにこの酵素を使用する
用途である。
レキシンやその他のセファロスポリン類のような重要な
抗生物質生産の出発物質として使用できる（米国特許第
４３０７１９２号参照）。恐ら＜ＤＡＯＣ３の最も重要
な用途は、ペニシリンＮ以外のペニシリン類を新規セフ
ァロスポリン誘導体へ変換するのにこの酵素を使用する
用途である。
ペニシリンおよびセファロスポリン産生微生物の細胞不
合抽出物を非天然型（天然に生産されない）β−ラクタ
ムの合成に使用することができる。
合抽出物を非天然型（天然に生産されない）β−ラクタ
ムの合成に使用することができる。
本発明のＥ、コリ発現ベクターは、自然界で天然に起こ
らない、ペニシリンをイン・ビトロで転換し、新規抗生
物質または抗生物質骨格構造を生成するのに使用できる
ＤＡＯＣ３を得る安価で効率のよい方法を提供する。
らない、ペニシリンをイン・ビトロで転換し、新規抗生
物質または抗生物質骨格構造を生成するのに使用できる
ＤＡＯＣ３を得る安価で効率のよい方法を提供する。
Ｅ、コリでＤＡＯＣＳを発現させるのにプラスミドｐＯ
Ｗ３８２が特に好ましいのは、このプラスミドの使用に
よって高水準の発現が達成されるからだけでなく、プラ
スミドに存在する選択可能なマーカーのためでもある。
Ｗ３８２が特に好ましいのは、このプラスミドの使用に
よって高水準の発現が達成されるからだけでなく、プラ
スミドに存在する選択可能なマーカーのためでもある。
多数の組換えＤＮＡベクターはβ−ラクタマーゼを暗号
化しているので、そのベクターを含んだ細胞はアンピシ
リンのようなβ−ラクタム抗生物質の存在下で発育でき
る。然しβ−ラクタムの組み立てを目的としてＤＡＯＣ
３を含んだ細胞不含抽出物を使用することを望む場合、
β−ラクタマーゼ活性を含んだ抽出物は必要でない。そ
のような場合、プラスミドｐＯＷ３８２はβ−ラクタマ
ーゼを選択マーカーとして暗号化せず、むしろβ−ラク
タムと反応しない蛋白質を暗号化しているテトラサイク
リン耐性付与遺伝子を使用する。
化しているので、そのベクターを含んだ細胞はアンピシ
リンのようなβ−ラクタム抗生物質の存在下で発育でき
る。然しβ−ラクタムの組み立てを目的としてＤＡＯＣ
３を含んだ細胞不含抽出物を使用することを望む場合、
β−ラクタマーゼ活性を含んだ抽出物は必要でない。そ
のような場合、プラスミドｐＯＷ３８２はβ−ラクタマ
ーゼを選択マーカーとして暗号化せず、むしろβ−ラク
タムと反応しない蛋白質を暗号化しているテトラサイク
リン耐性付与遺伝子を使用する。
ただし本発明のＤＡＯＣ３発現ベクターは特定の選択マ
ーカーに限定されるものではない。当業者ならば多数の
選択マーカーがＤＡＯＣＳ発現ベクターに使用するのに
好適であることが理解されよう。そのような選択マーカ
ーとして、カナマイシン耐性を付与する遺伝子、クロラ
ムフェニコール耐性を付与する遺伝子まｔ；はその他の
抗生物質耐性を付与する遺伝子等が挙げられる。
ーカーに限定されるものではない。当業者ならば多数の
選択マーカーがＤＡＯＣＳ発現ベクターに使用するのに
好適であることが理解されよう。そのような選択マーカ
ーとして、カナマイシン耐性を付与する遺伝子、クロラ
ムフェニコール耐性を付与する遺伝子まｔ；はその他の
抗生物質耐性を付与する遺伝子等が挙げられる。
ＤＡＯＣＳの基質として使用し得る非天然型ペニシリン
の探索は、ペニシリンＮ以外のペニシリンを基質として
受は容れる突然変異体ＤＡＯＣ３酵素の探索によって補
うことができる。本発明はそのような突然変異体ＤＡＯ
ＣＳ探索のための出発物質を提供し、ＤＡＯＣ３暗号配
列の突然変異を介して誘導されたＤＮＡ化合物を包含す
る。Ｅ。
の探索は、ペニシリンＮ以外のペニシリンを基質として
受は容れる突然変異体ＤＡＯＣ３酵素の探索によって補
うことができる。本発明はそのような突然変異体ＤＡＯ
ＣＳ探索のための出発物質を提供し、ＤＡＯＣ３暗号配
列の突然変異を介して誘導されたＤＮＡ化合物を包含す
る。Ｅ。
コリは変異クローニング実験の好ましい宿主であり、本
発明のＥ、コリ発現ベクターは、例えば放射線処理（Ｘ
線またはＵＶ）または化学的突然変異剤（エチルメタン
スルホナート、ニトロソグアニジン、またはメチルメタ
ンスルホナート等）または部位特異的突然変異のような
当該技術周知の方法によって容易に突然変異をうけ、非
天然型ペニシリンを基質として認識し、それらの通常で
ないおよび／ま！；は非天然型ペニシリンの通常でない
セファロスポリン類への変換を触媒する。
発明のＥ、コリ発現ベクターは、例えば放射線処理（Ｘ
線またはＵＶ）または化学的突然変異剤（エチルメタン
スルホナート、ニトロソグアニジン、またはメチルメタ
ンスルホナート等）または部位特異的突然変異のような
当該技術周知の方法によって容易に突然変異をうけ、非
天然型ペニシリンを基質として認識し、それらの通常で
ないおよび／ま！；は非天然型ペニシリンの通常でない
セファロスポリン類への変換を触媒する。
当業者にとって明らかなように、本発明によってＤＡＯ
ＣＳ遺伝子コドンを意のままに変化させることができる
。ＤＡＯＣ３遺伝子のＤＮＡ配列が与えられれば、天然
のＤＡＯＣ３酵素からアミノ酸残基の任意の位置で変化
させた突然変異体ＤＡＯＣ３酵素を生成するには単に通
常の方法を必要とするだけである。そのような突然変異
体酵素は、アミノ酸コドンを天然のＤＡＯＣＳ配列から
欠失し、または挿入した配列を含んだ突然変異体ＤＡＯ
Ｃ３暗号配列によって暗号化されｔ；ものである。また
特定の突然変異によって、暗号化したＤＡＯＣＳ活性が
破壊されるかどうかを完全に予知できないとしても、Ｄ
ＡＯＣＳ活性に対する効果を確かめるには突然変異体配
列を発現してみるだけでよいのだからそのようなりＡＯ
Ｃ３酵素も本発明の権利範囲に含まれる。
ＣＳ遺伝子コドンを意のままに変化させることができる
。ＤＡＯＣ３遺伝子のＤＮＡ配列が与えられれば、天然
のＤＡＯＣ３酵素からアミノ酸残基の任意の位置で変化
させた突然変異体ＤＡＯＣ３酵素を生成するには単に通
常の方法を必要とするだけである。そのような突然変異
体酵素は、アミノ酸コドンを天然のＤＡＯＣＳ配列から
欠失し、または挿入した配列を含んだ突然変異体ＤＡＯ
Ｃ３暗号配列によって暗号化されｔ；ものである。また
特定の突然変異によって、暗号化したＤＡＯＣＳ活性が
破壊されるかどうかを完全に予知できないとしても、Ｄ
ＡＯＣＳ活性に対する効果を確かめるには突然変異体配
列を発現してみるだけでよいのだからそのようなりＡＯ
Ｃ３酵素も本発明の権利範囲に含まれる。
ＤＡＯＣＳ活性に対する特に有用な効果は、ペニシリン
ＧまたはペニシリンＶをセファロスポリンＧまたはセフ
ァロスポリンＶへと環拡張させる基質として使用する基
質特異性の変化である。これらのセファロスポリン抗生
物質は、セファロスポリンＣのＤ−ａ−アミノアジポイ
ル側鎖の代わりにフェニル酢酸またはフェノキシ酢酸側
鎖を有し、経口で吸収され、臨床上有用なセファロスポ
リン類の製造における重要な中間体である７−アミツブ
アセトキシセファロスボラン酸へと極めて容易に加工さ
れる。
ＧまたはペニシリンＶをセファロスポリンＧまたはセフ
ァロスポリンＶへと環拡張させる基質として使用する基
質特異性の変化である。これらのセファロスポリン抗生
物質は、セファロスポリンＣのＤ−ａ−アミノアジポイ
ル側鎖の代わりにフェニル酢酸またはフェノキシ酢酸側
鎖を有し、経口で吸収され、臨床上有用なセファロスポ
リン類の製造における重要な中間体である７−アミツブ
アセトキシセファロスボラン酸へと極めて容易に加工さ
れる。
本発明はここに例示した特定のベクターだけに限定され
ない。本発明はストレプトマイセス・クラブリゲルスの
ＤＡＯＣＳ活性を暗号化したＤＮＡ化合物を包含する。
ない。本発明はストレプトマイセス・クラブリゲルスの
ＤＡＯＣＳ活性を暗号化したＤＮＡ化合物を包含する。
本発明のＤＮＡ化合物は発現ベクターが複製し、または
組み込み可能であって、プロモーターおよび翻訳活性化
配列を用いてＤＡＯＣＳ活性を発現させることができる
任意の宿主細胞内でＤＡＯＣＳ活性を発現させるための
発現ベクターの組立てに使用できる。
組み込み可能であって、プロモーターおよび翻訳活性化
配列を用いてＤＡＯＣＳ活性を発現させることができる
任意の宿主細胞内でＤＡＯＣＳ活性を発現させるための
発現ベクターの組立てに使用できる。
したがってここに例示したＥ、コリ発現ベクターは、λ
ｐｔ、によってＥ、コリ内で転写される２シストロン構
築物を利用しているが、本発明はＥ。
ｐｔ、によってＥ、コリ内で転写される２シストロン構
築物を利用しているが、本発明はＥ。
コリでＤＡＯＣＳを発現させる任意のＥ、コリ発現グラ
スミドまたはベクターを包含する。このように本発明は
、例えばｐＢＲ３２２、ｐＡｃＹｃ１８４、Ｆ％Ｃｏ１
Ｖ−に’９４、ＲＩＳＲ６−５、またはＲ１００のよう
なプラスミド由来のレプリコンのようにＥ、コリでレプ
リコン機能を利用してＤＡＯＣ３を発現させる発現ベク
ターを包含する。
スミドまたはベクターを包含する。このように本発明は
、例えばｐＢＲ３２２、ｐＡｃＹｃ１８４、Ｆ％Ｃｏ１
Ｖ−に’９４、ＲＩＳＲ６−５、またはＲ１００のよう
なプラスミド由来のレプリコンのようにＥ、コリでレプ
リコン機能を利用してＤＡＯＣ３を発現させる発現ベク
ターを包含する。
本発明は単にプラスミドベクターだけに限らず、さらに
宿主細胞でＤＡＯＣＳ活性を発現し、組込みまたはウィ
ルス複製を利用して複製および維持を提供する発現ベク
ターをも包含する。
宿主細胞でＤＡＯＣＳ活性を発現し、組込みまたはウィ
ルス複製を利用して複製および維持を提供する発現ベク
ターをも包含する。
本発明はＤＡＯＣＳ合成酵素活性を暗号化したＤＮＡを
発現させる特定のプロモーターおよび翻訳活性化配列だ
けに限定するものではない。本発明はＥ、コリ内で機能
し、Ｅ、コリ内でＤＡＯＣ３の発現に使用され得る任意
のプロモーターおよび翻訳活性化配列の利用を包含する
。Ｅ、コリ内で機能する多数のプロモーターおよび翻訳
活性化配列が知られており、これらはＤＡＯＣ３をＥ、
コリで発現させるのに好適である。そのような転写活性
化および翻訳活性化配列はｌｐｐ％ｌａｃ、 ｔｒｐ、
ｔａｃｌ λｐＬおよびλｐｒのプロモーターおよび
翻訳活性化配列であるが、それだけに限定されない。
発現させる特定のプロモーターおよび翻訳活性化配列だ
けに限定するものではない。本発明はＥ、コリ内で機能
し、Ｅ、コリ内でＤＡＯＣ３の発現に使用され得る任意
のプロモーターおよび翻訳活性化配列の利用を包含する
。Ｅ、コリ内で機能する多数のプロモーターおよび翻訳
活性化配列が知られており、これらはＤＡＯＣ３をＥ、
コリで発現させるのに好適である。そのような転写活性
化および翻訳活性化配列はｌｐｐ％ｌａｃ、 ｔｒｐ、
ｔａｃｌ λｐＬおよびλｐｒのプロモーターおよび
翻訳活性化配列であるが、それだけに限定されない。
上記に例示しｔ；各種のＥ、コリ転写活性化および翻訳
活性化配列以外にも、他の微生物由来の転写活性化およ
び翻訳活性化配列をこのＤＡＯＣ合成酵素暗号化ＤＮＡ
化合物ヘライゲーシッンし、その活性化配列が機能する
宿主細胞内でＤＡＯＣ合成酵素活性を発現させ得る発現
ベクターを生成することができる。ＤＡＯＣＳの生産お
よびそれに続くインビトロ使用のための精製にとってＥ
。
活性化配列以外にも、他の微生物由来の転写活性化およ
び翻訳活性化配列をこのＤＡＯＣ合成酵素暗号化ＤＮＡ
化合物ヘライゲーシッンし、その活性化配列が機能する
宿主細胞内でＤＡＯＣ合成酵素活性を発現させ得る発現
ベクターを生成することができる。ＤＡＯＣＳの生産お
よびそれに続くインビトロ使用のための精製にとってＥ
。
コリは最適な宿主であるが、Ｅ、コリ以外の微生物でＤ
ＡＯＣ３合成酵素活性を発現させるベクターも、特定の
微生物のセファロスポリン抗生物質生産能および効率を
増大させる目的に特に有用である。
ＡＯＣ３合成酵素活性を発現させるベクターも、特定の
微生物のセファロスポリン抗生物質生産能および効率を
増大させる目的に特に有用である。
多数の微生物がβ−ラクタム抗生物質を生産する。下記
の表はβ−ラクタム抗生物質を生産する微生物の一部を
示したものである。
の表はβ−ラクタム抗生物質を生産する微生物の一部を
示したものである。
ＬＬ！！：β−ラクタム抗生物質生産微生物微生物
抗生物質
（Ａｎｉｘｉｏｐｓｉｓ ｐｅｒｕｖｉａｎａ）アクレ
モニウム ププラフセンス （Ｃ、ｐｕｐｕｒａｓｃｅｎｓ） ポリアレウルム （Ｃ，ｐｏｌｙａｌｅｕｒｕＩＩＩ） クリソゲヌム （Ｃ、ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕ＋ｅ） クルチペス （Ｃ、ｃｕｒｔｉｐｅｓ） （Ｅ 、 ｔｅｒｒｉｃｏｌａ） ミニマ （Ｅ 、 ｍｉｎｉｍａ） ストレゾトマイセス・ シンネマチコラ （Ｅ 、 ｓｙｎｎｅｍａｔｉｃｏｌａ）グラブラ ＣＥ −ｇｌａｂｒａ） ミラビリス （Ｅ 、 ｍ１ｒａｂｉｌｉｓ） （Ｓ 、 ｃａｔｔｌｅｙａ） （Ｎ 、 ｕｎｉｆｏｒｍｉｓ） フラバム （Ｐ 、 ｃａｒｎｅｕｓ） セラチア（Ｓｅｒａｔｉａ） 各種のβ−ラクタム スビロイジウム・フスクム （Ｓ ｐｉｒｏｉｄｉｕｍ ｆｕｓｃｕｍ）ペニシリ
ンおよびセ ファロスポリン （Ｓ 、 ｇｒｉｓｅｕｓ） よひＢ１刀ルヘデマ イシンへおよびＢ ハルステジ （Ｓ 、 ｈａｌｓｔｓｄｉ） セファマイシンＡお よびＢ （Ｓ 、 ｗａｄａｙａｍｅｎｓｉｓ）（Ｓ 、 ｒｏ
ｃｈｅｉ） ＯＡ−６１２９ ＫＣ−６６４３ トクノメンシス （Ｓ、 ｔｏｋｕｎｏｍｅｎｓｉｓ） ＭＭ ｌ ３９０２ よびＢ ＯＡ−６１２９Ａ カルペチマイシンＡ アスパレノマイシン 以上列記した多数のβ−ラクタム抗生物質産生微生物は
製薬産業における抗生物質生産の目的に使用される。こ
れらの微生物の抗生物質産生能は、発酵中の抗生物質生
合成酵素の細胞内濃度を増大させることによって増大し
、−層効率を挙げることができる。本発明のＤＡＯＣ３
を暗号化したＤＮＡ化合物を用い、宿主細胞が、ＤＡＯ
Ｃ３活性が関与する中間反応を介してβ−ラクタム抗生
物質を生産する場合には好適な宿主細胞へ導入されたと
き、形質転換された宿主細胞の細胞内ＤＡＯＣ３活性濃
度を増大させ、それによって細胞の抗生物質産生能およ
び効率を増大する発現ベクターを組立てることができる
。
モニウム ププラフセンス （Ｃ、ｐｕｐｕｒａｓｃｅｎｓ） ポリアレウルム （Ｃ，ｐｏｌｙａｌｅｕｒｕＩＩＩ） クリソゲヌム （Ｃ、ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕ＋ｅ） クルチペス （Ｃ、ｃｕｒｔｉｐｅｓ） （Ｅ 、 ｔｅｒｒｉｃｏｌａ） ミニマ （Ｅ 、 ｍｉｎｉｍａ） ストレゾトマイセス・ シンネマチコラ （Ｅ 、 ｓｙｎｎｅｍａｔｉｃｏｌａ）グラブラ ＣＥ −ｇｌａｂｒａ） ミラビリス （Ｅ 、 ｍ１ｒａｂｉｌｉｓ） （Ｓ 、 ｃａｔｔｌｅｙａ） （Ｎ 、 ｕｎｉｆｏｒｍｉｓ） フラバム （Ｐ 、 ｃａｒｎｅｕｓ） セラチア（Ｓｅｒａｔｉａ） 各種のβ−ラクタム スビロイジウム・フスクム （Ｓ ｐｉｒｏｉｄｉｕｍ ｆｕｓｃｕｍ）ペニシリ
ンおよびセ ファロスポリン （Ｓ 、 ｇｒｉｓｅｕｓ） よひＢ１刀ルヘデマ イシンへおよびＢ ハルステジ （Ｓ 、 ｈａｌｓｔｓｄｉ） セファマイシンＡお よびＢ （Ｓ 、 ｗａｄａｙａｍｅｎｓｉｓ）（Ｓ 、 ｒｏ
ｃｈｅｉ） ＯＡ−６１２９ ＫＣ−６６４３ トクノメンシス （Ｓ、 ｔｏｋｕｎｏｍｅｎｓｉｓ） ＭＭ ｌ ３９０２ よびＢ ＯＡ−６１２９Ａ カルペチマイシンＡ アスパレノマイシン 以上列記した多数のβ−ラクタム抗生物質産生微生物は
製薬産業における抗生物質生産の目的に使用される。こ
れらの微生物の抗生物質産生能は、発酵中の抗生物質生
合成酵素の細胞内濃度を増大させることによって増大し
、−層効率を挙げることができる。本発明のＤＡＯＣ３
を暗号化したＤＮＡ化合物を用い、宿主細胞が、ＤＡＯ
Ｃ３活性が関与する中間反応を介してβ−ラクタム抗生
物質を生産する場合には好適な宿主細胞へ導入されたと
き、形質転換された宿主細胞の細胞内ＤＡＯＣ３活性濃
度を増大させ、それによって細胞の抗生物質産生能およ
び効率を増大する発現ベクターを組立てることができる
。
宿主細胞へ導入して細胞内ＤＡＯＣ３活性濃度を増大さ
せ得るベクターは、下記の要素、（１）本発明のＤＡＯ
ＣＳ活性を暗号化しているＤＮＡ化金物および（２）宿
主細胞内で作用するだけでなく、ＤＡＯＣＳ活性を暗号
化したＤＮＡを発現させ得る正しい方向および位置に配
置されたプロモーターおよび翻訳活性化配列を必要とす
る。安定な形質転換体は、いうまでもなく宿主細胞でベ
クターが染色体外要素またはゲノムＤＮＡへ組み込まれ
た要素のいずれかとして複製された場合にのみ得られる
。このように好ましいベクターは、宿主細胞でベクター
の複製または組み込みを特異的に指示する配列を含んで
いる。然しＤＮＡを宿主細胞へ導入すると、ときに非特
異的な組み込みが起こることがあるので、そのような特
異的な複製または組み込み配列が絶対必要というわけで
はない。
せ得るベクターは、下記の要素、（１）本発明のＤＡＯ
ＣＳ活性を暗号化しているＤＮＡ化金物および（２）宿
主細胞内で作用するだけでなく、ＤＡＯＣＳ活性を暗号
化したＤＮＡを発現させ得る正しい方向および位置に配
置されたプロモーターおよび翻訳活性化配列を必要とす
る。安定な形質転換体は、いうまでもなく宿主細胞でベ
クターが染色体外要素またはゲノムＤＮＡへ組み込まれ
た要素のいずれかとして複製された場合にのみ得られる
。このように好ましいベクターは、宿主細胞でベクター
の複製または組み込みを特異的に指示する配列を含んで
いる。然しＤＮＡを宿主細胞へ導入すると、ときに非特
異的な組み込みが起こることがあるので、そのような特
異的な複製または組み込み配列が絶対必要というわけで
はない。
またＤＡＯＣ３発現ベクターは、抗生物質耐性を付与す
る遺伝子またはその他の、該ベクターを含んだ宿主細胞
を選び出す手段を提供するなんらかの要素をも含んでい
るが、ベクターが宿主細胞の染色体ＤＮＡに組み込まれ
る場合には、そのような選択可能な要素は必要なく、ま
た望ましくない。
る遺伝子またはその他の、該ベクターを含んだ宿主細胞
を選び出す手段を提供するなんらかの要素をも含んでい
るが、ベクターが宿主細胞の染色体ＤＮＡに組み込まれ
る場合には、そのような選択可能な要素は必要なく、ま
た望ましくない。
ストレプトマイセス・クラブリゲルスのＤＡＯＣＳ遺伝
子暗号配列を提供することによって、本発明は形質転換
感受性の任意の微生物のためのＤＡＯＣＳ発現ベクター
を提供する。上に挙げたＥ。
子暗号配列を提供することによって、本発明は形質転換
感受性の任意の微生物のためのＤＡＯＣＳ発現ベクター
を提供する。上に挙げたＥ。
コリＤＡＯＣＳ発現ベクターは本発明のさまざまな発現
ベクターを例示したものである。ただし本発明の好まし
いベクターの多数は、β−ラクタム抗生物質（ペニシリ
ンおよびセファロスポリン等）を生産する細胞内でＤＡ
ＯＣＳを発現させるように設計されている。
ベクターを例示したものである。ただし本発明の好まし
いベクターの多数は、β−ラクタム抗生物質（ペニシリ
ンおよびセファロスポリン等）を生産する細胞内でＤＡ
ＯＣＳを発現させるように設計されている。
本発明のペニシリウムベクター類は、そのようなβ−ラ
クタム抗生物質産生細胞からの抗生物質生産量を増大さ
せ、あるいは細胞が正常に産生ずる抗生物質を変えるの
に使用可能な、本発明によって提供されるベクターを例
示したものである。そのような例示ベクターの一つであ
るｐｐ Ｓ ６５と命名されたベクターは、本発明のＤ
ＡＯＣＳ暗号配列を発現をさせる位置にあるペニシリウ
ムのイソペニシリンＮ合成酵素（Ｉ ＰＮＳ）遺伝子の
プロモーターを含んでいる。添付図面第５図にプラスミ
ドｐｐ Ｓ ６５の制限酵素部位および機能地図を提供
し、プラスミドｐＰ Ｓ ６５のための組立て方法およ
び有用な各種中間体を実施例５で説明する。
クタム抗生物質産生細胞からの抗生物質生産量を増大さ
せ、あるいは細胞が正常に産生ずる抗生物質を変えるの
に使用可能な、本発明によって提供されるベクターを例
示したものである。そのような例示ベクターの一つであ
るｐｐ Ｓ ６５と命名されたベクターは、本発明のＤ
ＡＯＣＳ暗号配列を発現をさせる位置にあるペニシリウ
ムのイソペニシリンＮ合成酵素（Ｉ ＰＮＳ）遺伝子の
プロモーターを含んでいる。添付図面第５図にプラスミ
ドｐｐ Ｓ ６５の制限酵素部位および機能地図を提供
し、プラスミドｐＰ Ｓ ６５のための組立て方法およ
び有用な各種中間体を実施例５で説明する。
プラスミドｐＰＳ６７と命名されたもう一つの例示のＤ
ＡＯＣＳ発現ベクターは、ペニシリウム、アスペルギル
スおよび近縁宿主細胞に使用できる。
ＡＯＣＳ発現ベクターは、ペニシリウム、アスペルギル
スおよび近縁宿主細胞に使用できる。
プラスミドｐＰＳ６７はストレプトマイセス・クラブリ
ゲルスＤＡＯＣＳ遺伝子の暗号配列を発現させる位置に
あって、ペニシリウムでも同様に機能するアスペルギル
スａｍｄ Ｓ遺伝子のプロモーターを含んでいる。添付
図面第６図にプラスミドｐＰＳ６７の制限酵素部位およ
び機能地図を示す。
ゲルスＤＡＯＣＳ遺伝子の暗号配列を発現させる位置に
あって、ペニシリウムでも同様に機能するアスペルギル
スａｍｄ Ｓ遺伝子のプロモーターを含んでいる。添付
図面第６図にプラスミドｐＰＳ６７の制限酵素部位およ
び機能地図を示す。
プラスミドｐＰＳ６７は、例えば選択可能なａｍｄＳ遺
伝子を含んだｐＰＳ７１およびｐｐ Ｓ ７２のように
、容易に修飾してペニシリウムおよびアスペルギルスに
使用し得る、選択可能なマーカーを含ますことができる
。グラスミドｐＰＳ６７、ｐＰＳ７１８よびｐＰ Ｓ
７２の組立て方法を実施例６で説明する。
伝子を含んだｐＰＳ７１およびｐｐ Ｓ ７２のように
、容易に修飾してペニシリウムおよびアスペルギルスに
使用し得る、選択可能なマーカーを含ますことができる
。グラスミドｐＰＳ６７、ｐＰＳ７１８よびｐＰ Ｓ
７２の組立て方法を実施例６で説明する。
本発明のプラスミドｐＰ Ｓ ６９は、本発明のＤＡＯ
ＣＳ暗号配列発現のＩ；め配置されたペニシリウムＴ
ＰＮＳ遺伝子プロモーターを、ＤＡＯＣ３暗号配列の３
′末端に配置され、ペニシリウム■ＰＮＳ遺伝子の３′
非暗号領域由来の調節シグナルを含んでいるＤＮＡとと
もに含んでいる。これらの３′調節シグナルは、そのシ
グナルを利用する宿主細胞内で組換え生産物の発現を増
大させるのに使用し得る。添付図面第７図にプラスミド
ｐＰＳ６９の制限酵素部位および機能地図を示す。
ＣＳ暗号配列発現のＩ；め配置されたペニシリウムＴ
ＰＮＳ遺伝子プロモーターを、ＤＡＯＣ３暗号配列の３
′末端に配置され、ペニシリウム■ＰＮＳ遺伝子の３′
非暗号領域由来の調節シグナルを含んでいるＤＮＡとと
もに含んでいる。これらの３′調節シグナルは、そのシ
グナルを利用する宿主細胞内で組換え生産物の発現を増
大させるのに使用し得る。添付図面第７図にプラスミド
ｐＰＳ６９の制限酵素部位および機能地図を示す。
プラスミドｐｐ Ｓ ６９の組立て方法を実施例７で説
明する。上記のＤＡＯＣ３発現ベクター類を導入する方
法については実施例８で説明する。
明する。上記のＤＡＯＣ３発現ベクター類を導入する方
法については実施例８で説明する。
上記のベクター類および以下に示す実施例は、本発明に
よって提供される多くのＤＡＯＣ３発現ベクターを単に
例示するだけのものである。即ち、本発明の説明のため
、セファロスポリウム・アクレモニウム・エキスパンダ
ーゼ−ヒドロキシラーゼ遺伝子の５′および３′調節シ
グナルについて報告した米国特許出願第０７１０２１８
３６号（１９８７年３月４日出願）を引用する。これら
のシグナルは本発明のＤＡＯＣＳ暗号配列と組合わせて
、ことにセファロスポリウムで好適な本発明のＤＡＯＣ
Ｓ発現ベクターを生産するのに使用できる。まｔ；本発
明の説明のために引用した欧州特許公開第０２００４２
５号（１９８６年１２月ｌＯ日公開）にはセファロスポ
リウム・アクレモニウムＩ ＰＮＳ遺伝子の転写および
翻訳活性化配列が開示されているが、これらの配列は本
発明のストレプトマイセス・クラブリゲルスのＤＡＯＣ
Ｓ暗号配列と融合させて、セファロスポリウム内でＳ。
よって提供される多くのＤＡＯＣ３発現ベクターを単に
例示するだけのものである。即ち、本発明の説明のため
、セファロスポリウム・アクレモニウム・エキスパンダ
ーゼ−ヒドロキシラーゼ遺伝子の５′および３′調節シ
グナルについて報告した米国特許出願第０７１０２１８
３６号（１９８７年３月４日出願）を引用する。これら
のシグナルは本発明のＤＡＯＣＳ暗号配列と組合わせて
、ことにセファロスポリウムで好適な本発明のＤＡＯＣ
Ｓ発現ベクターを生産するのに使用できる。まｔ；本発
明の説明のために引用した欧州特許公開第０２００４２
５号（１９８６年１２月ｌＯ日公開）にはセファロスポ
リウム・アクレモニウムＩ ＰＮＳ遺伝子の転写および
翻訳活性化配列が開示されているが、これらの配列は本
発明のストレプトマイセス・クラブリゲルスのＤＡＯＣ
Ｓ暗号配列と融合させて、セファロスポリウム内でＳ。
クラブリゲルスＤＡＯＣＳの暗号配列を発現させる（発
現ベクターへ挿入し、そのベクターをセファロスポリウ
ムへ導入しＩ；とき）組換えＤＡＯＣＳ遺伝子を作り出
すことができる。
現ベクターへ挿入し、そのベクターをセファロスポリウ
ムへ導入しＩ；とき）組換えＤＡＯＣＳ遺伝子を作り出
すことができる。
本発明のＤＡＯＣＳ発現ベクターは、任意の細胞でＤＡ
ＯＣＳ酵素の細胞内濃度を増大させるのに有用であり、
特にβ−ラクタム抗生物質を産生する細胞で有用である
。グラスミドｐＯＷ３８０はストレプトマイセス・クラ
ブリゲルスのＤＡＯＣＳ遺伝子暗号配列を含んでいるの
で、プラスミドｐＯＷ３８０はＤＡＯＣＳ遺伝子のコピ
ー数を増大させ、したがって該酵素の細胞内濃度を増大
させるベクターを組立てるのに使用できる。本発明のＤ
ＡＯＣ３暗号配列はストレプトマイセス宿主細胞から単
離されたのであるから、ＤＡＯＣＳ暗号配列は、ストレ
プトマイセス宿主細胞で高濃度のＤＡＯＣ３を発現させ
るよう設計された発現ベクターに使用するのに特に好都
合である。文献上、ストレプトマイセス発現ベクターの
組立ておよびストレプトマイセス宿主細胞の形質転換技
術については多数の報告がある［例えばガルシアードミ
ングエツツ（Ｇａｒｃｉａ −Ｄｏｍｉｎｇｕｅｚ）ら
、アプライド・アンド・エンピロンメンタル・マイクロ
バイオロジー（Ａｐｐｌｉｅｄ ａｎｄ Ｅｎｖｉ
ｒｏｎｍｅｎｔａｌＭ １ｃｒｏｂｉ １ｏｇｙ）、５
３巻（６）、１３７６〜１３８１頁（１９８７年）参照
〕。本発明のＤＡＯＣＳ暗号配列はストレプトマイセス
・プロモーターおよびレプリコンを含んだ発現ベクター
へ容易に挿入でき、そのような用途のために多数の既知
のストレプトマイセス・プロモーターおよびレプリコン
が入手できる。網羅的なものではないが、第■表にスト
レプトマイセス・レプリコンを得ることが可能なストレ
プトマイセス・プラスミドの例を列挙した。当業者は、
レプリコン機能が破壊されない限り、この表に列挙した
プラスミドのすべてまたは一部が本発明のＤＡＯＣＳ遺
伝子を含んだベクター組立てに利用できることを認める
であろう。
ＯＣＳ酵素の細胞内濃度を増大させるのに有用であり、
特にβ−ラクタム抗生物質を産生する細胞で有用である
。グラスミドｐＯＷ３８０はストレプトマイセス・クラ
ブリゲルスのＤＡＯＣＳ遺伝子暗号配列を含んでいるの
で、プラスミドｐＯＷ３８０はＤＡＯＣＳ遺伝子のコピ
ー数を増大させ、したがって該酵素の細胞内濃度を増大
させるベクターを組立てるのに使用できる。本発明のＤ
ＡＯＣ３暗号配列はストレプトマイセス宿主細胞から単
離されたのであるから、ＤＡＯＣＳ暗号配列は、ストレ
プトマイセス宿主細胞で高濃度のＤＡＯＣ３を発現させ
るよう設計された発現ベクターに使用するのに特に好都
合である。文献上、ストレプトマイセス発現ベクターの
組立ておよびストレプトマイセス宿主細胞の形質転換技
術については多数の報告がある［例えばガルシアードミ
ングエツツ（Ｇａｒｃｉａ −Ｄｏｍｉｎｇｕｅｚ）ら
、アプライド・アンド・エンピロンメンタル・マイクロ
バイオロジー（Ａｐｐｌｉｅｄ ａｎｄ Ｅｎｖｉ
ｒｏｎｍｅｎｔａｌＭ １ｃｒｏｂｉ １ｏｇｙ）、５
３巻（６）、１３７６〜１３８１頁（１９８７年）参照
〕。本発明のＤＡＯＣＳ暗号配列はストレプトマイセス
・プロモーターおよびレプリコンを含んだ発現ベクター
へ容易に挿入でき、そのような用途のために多数の既知
のストレプトマイセス・プロモーターおよびレプリコン
が入手できる。網羅的なものではないが、第■表にスト
レプトマイセス・レプリコンを得ることが可能なストレ
プトマイセス・プラスミドの例を列挙した。当業者は、
レプリコン機能が破壊されない限り、この表に列挙した
プラスミドのすべてまたは一部が本発明のＤＡＯＣＳ遺
伝子を含んだベクター組立てに利用できることを認める
であろう。
また第■表にプラスミドを含有する宿主および受託番号
を示しＩ；。
を示しＩ；。
１ナシヨナル・コレクション・オブ・インダストリアル
・バクテリア（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏ
ｎｏｆ Ｉ ｎｄｕｓｔｒｉａｌ Ｂａｃｔｅｒｉａ
）（Ｎ ＣＩ Ｂ）、トリー・リサーチ・ステーション
（Ｔｏｒｒｙ Ｒｅ５ｓａｒｃｈ ５ｔａｔｉｏｎ）、
ポスト・オフィス・ボックス（ＰｏｓｔＯｆｆｉｃｅ
Ｂｏｘ）３１％１３５アベイ・ロード（Ａｂｂｅｙ Ｒ
ｏａｄ）、アバディーン（Ａｂｅｒｄｅｅｎ）Ａ Ｂ
９８ＤＧ、スコツトランド（Ｓ ｃｏｔ １ａｎｄ）、
ユナイテッド・キングダム（Ｕｎｉｔｅｄ Ｋｉｎｇｄ
ｏｍ）。
・バクテリア（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏ
ｎｏｆ Ｉ ｎｄｕｓｔｒｉａｌ Ｂａｃｔｅｒｉａ
）（Ｎ ＣＩ Ｂ）、トリー・リサーチ・ステーション
（Ｔｏｒｒｙ Ｒｅ５ｓａｒｃｈ ５ｔａｔｉｏｎ）、
ポスト・オフィス・ボックス（ＰｏｓｔＯｆｆｉｃｅ
Ｂｏｘ）３１％１３５アベイ・ロード（Ａｂｂｅｙ Ｒ
ｏａｄ）、アバディーン（Ａｂｅｒｄｅｅｎ）Ａ Ｂ
９８ＤＧ、スコツトランド（Ｓ ｃｏｔ １ａｎｄ）、
ユナイテッド・キングダム（Ｕｎｉｔｅｄ Ｋｉｎｇｄ
ｏｍ）。
２アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクシコン（Ａ
ｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕ１ｔｕｒｅ Ｃｏ１１
ｅｃｔｉｏｎ）、０−／クビル（Ｒｏｃｋｖｉ Ｉ ｌ
ｅ）、ＭＤ２０８５２゜また本発明のストレプトマイセ
ス・クラブリゲルスＤＡＯＣ３暗号配列を、ストレプト
マイセスの他の株およびペニシリウム、セファロスポリ
ウムまたは任意の他の宿主細胞から誘導された転写およ
び翻訳活性化配列の制御下に置き、特定の微生物に使用
するための組換えＤＡＯＣ３遺伝子を組立てることがで
きる。
ｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕ１ｔｕｒｅ Ｃｏ１１
ｅｃｔｉｏｎ）、０−／クビル（Ｒｏｃｋｖｉ Ｉ ｌ
ｅ）、ＭＤ２０８５２゜また本発明のストレプトマイセ
ス・クラブリゲルスＤＡＯＣ３暗号配列を、ストレプト
マイセスの他の株およびペニシリウム、セファロスポリ
ウムまたは任意の他の宿主細胞から誘導された転写およ
び翻訳活性化配列の制御下に置き、特定の微生物に使用
するための組換えＤＡＯＣ３遺伝子を組立てることがで
きる。
以下に実施例をあげて本発明をさらに詳細に説明する。
実施例は単に発明を説明するためのものであって、これ
によって発明の範囲を限定するもものではない。
によって発明の範囲を限定するもものではない。
実施例１
Ａ、Ｅ、コリＫ１２ ＲＲＩΔＭ１５／ｐＯＷ３８０
の培養 Ｅ、コリＫ１２ ＲＲＩΔＭｌ ５／ｐＯＷ３８０の
凍結乾燥品はザ・ノーザン・レジオナル・リサーチ・ラ
ボラトリーズ（ＮＲＲＬＸペオリア、■Ｌ６１６０４）
から受託番号ＮＲＲＬ Ｂ−１８２６４（寄託臼、１
９８７年１１月２０日）のもとに入手でき、これを下記
のプロセスに、「培養物」として直接使用する。
の培養 Ｅ、コリＫ１２ ＲＲＩΔＭｌ ５／ｐＯＷ３８０の
凍結乾燥品はザ・ノーザン・レジオナル・リサーチ・ラ
ボラトリーズ（ＮＲＲＬＸペオリア、■Ｌ６１６０４）
から受託番号ＮＲＲＬ Ｂ−１８２６４（寄託臼、１
９８７年１１月２０日）のもとに入手でき、これを下記
のプロセスに、「培養物」として直接使用する。
アンピシリン１００μｇ／ｒｘＱを含有するＴＹブロス
（１リットル当り、トリプトファン８ｇ、ＮａＣ（１５
９および酵母抽出物５９）１リツトルにＥ、コリＫ１２
ＲＲＩΔＭｌ ５／ｐＯＷ３８０の培養物を接種し
、３７℃で通気しながら１夜インキユベートした（１５
〜１８時間）。得られた培養をプラスミドｐＯＷ３８０
の出発物質として使用した。
（１リットル当り、トリプトファン８ｇ、ＮａＣ（１５
９および酵母抽出物５９）１リツトルにＥ、コリＫ１２
ＲＲＩΔＭｌ ５／ｐＯＷ３８０の培養物を接種し
、３７℃で通気しながら１夜インキユベートした（１５
〜１８時間）。得られた培養をプラスミドｐＯＷ３８０
の出発物質として使用した。
Ｂ、プラスミドｐｏｗ：３８０の単離
実施例ＩＡで作成した培養を４℃、５２０Ｏｒｐｍで１
０分間遠心して細胞をペレット化した。生じた上溝は棄
てた。細胞ベレットを、２５％スクロースおよび５０ｍ
Ｍ ＥＤＴＡからなる溶液２８ｒａＱに再浮遊した。
０分間遠心して細胞をペレット化した。生じた上溝は棄
てた。細胞ベレットを、２５％スクロースおよび５０ｍ
Ｍ ＥＤＴＡからなる溶液２８ｒａＱに再浮遊した。
５０％グリセリンおよび０゜２５ＭトリトリＨ（１（ｐ
Ｈ８，０）に２０ｖｘｇ／ａＱリゾチームを溶解した溶
液的１ｍ１２および０．５ＭＥＤＴＡ約１．５顧（ｐＨ
８，０）を細胞浮遊液へ添加し、混合した。得られた混
合物を氷上で１５分間インキュベートした。リゾチーム
で地理した細胞に溶解液（１０％トリトン−ＸＩＯｏ
３顧、０．２５Ｍ ＥＤＴＡ（ｐＨ８，０）７５＋
ｍＱおよび水７ｍＱから調製）３＋ｘｆ２を静かに混合
しながら添加した。得られた溶液を氷上でさらに１５分
間インキュベートした。
Ｈ８，０）に２０ｖｘｇ／ａＱリゾチームを溶解した溶
液的１ｍ１２および０．５ＭＥＤＴＡ約１．５顧（ｐＨ
８，０）を細胞浮遊液へ添加し、混合した。得られた混
合物を氷上で１５分間インキュベートした。リゾチーム
で地理した細胞に溶解液（１０％トリトン−ＸＩＯｏ
３顧、０．２５Ｍ ＥＤＴＡ（ｐＨ８，０）７５＋
ｍＱおよび水７ｍＱから調製）３＋ｘｆ２を静かに混合
しながら添加した。得られた溶液を氷上でさらに１５分
間インキュベートした。
４℃、１７０００ ｒｐｍで約４５分間の遠心ニヨり細
胞残層を溶液から除去した。〜３０蛯の上清へＣ３ＣＱ
約２８．６ｇおよび５＋ｚｇ／ｍｆｆの臭化エチジウム
溶液〜ＬｒａＱを添加した。ついで容量を水で４ＯｍＱ
に調節し、溶液を超遠心用試験管ヘデカントした。試験
管を密閉し、４９５００ｒｐ１１で〜１８時間遠心した
。紫外線で観察して、生じたプラスミド・バンドを単離
し、塩飽和インプロパツールで抽出して臭化エチジウム
を除き、ＴＥ緩衝液（ｌＯｒａＭトリス−ＨＣＱ（ｐＨ
７，５）ｊ；よび１ｍＭ ＥＤＴＡ）〜２０容量で透
析し、透析液を３回とり替えて行った。透析物を集め、
ついでエタノール２容量および３Ｍ酢酸ナトリウム溶液
０．０５容量を添加した。エタノール混合物を一２０°
Ｃに冷却し、−１０℃、１１００００ｒｐで３０分間遠
心によりプラスミドＤＮＡをペレット化した。得られた
ベレットをＴＥ緩衝液〜ｌ＋ｍＱに再浮遊し、これを等
容量のフェノール：クロロホルム混合液（ｌ：１．ｖ／
ｖ）で抽出した。３Ｍ Ｎａ０ＡｃＯ，ｌ容量および
エタノール２容量を添加することによって水層のＤＮＡ
を回収し、これを−２０℃で〜３０分間インキュベート
し、１５０００ ｒｐｌｌｌで２０分間遠心した。得ら
れたＤＮＡベレットをまず７０％のエタノール、ついで
１００％のエタノールで洗浄し乾燥した。
胞残層を溶液から除去した。〜３０蛯の上清へＣ３ＣＱ
約２８．６ｇおよび５＋ｚｇ／ｍｆｆの臭化エチジウム
溶液〜ＬｒａＱを添加した。ついで容量を水で４ＯｍＱ
に調節し、溶液を超遠心用試験管ヘデカントした。試験
管を密閉し、４９５００ｒｐ１１で〜１８時間遠心した
。紫外線で観察して、生じたプラスミド・バンドを単離
し、塩飽和インプロパツールで抽出して臭化エチジウム
を除き、ＴＥ緩衝液（ｌＯｒａＭトリス−ＨＣＱ（ｐＨ
７，５）ｊ；よび１ｍＭ ＥＤＴＡ）〜２０容量で透
析し、透析液を３回とり替えて行った。透析物を集め、
ついでエタノール２容量および３Ｍ酢酸ナトリウム溶液
０．０５容量を添加した。エタノール混合物を一２０°
Ｃに冷却し、−１０℃、１１００００ｒｐで３０分間遠
心によりプラスミドＤＮＡをペレット化した。得られた
ベレットをＴＥ緩衝液〜ｌ＋ｍＱに再浮遊し、これを等
容量のフェノール：クロロホルム混合液（ｌ：１．ｖ／
ｖ）で抽出した。３Ｍ Ｎａ０ＡｃＯ，ｌ容量および
エタノール２容量を添加することによって水層のＤＮＡ
を回収し、これを−２０℃で〜３０分間インキュベート
し、１５０００ ｒｐｌｌｌで２０分間遠心した。得ら
れたＤＮＡベレットをまず７０％のエタノール、ついで
１００％のエタノールで洗浄し乾燥した。
この方法によって得られｌ；プラスミドｐＯＷ３８０
ＤＮＡの−１，５１＋！９を０．１ＸＴＥ緩衝液１゜
５ｍＱに浮遊し、−２０°Ｃで貯蔵した。添付図面第１
図にプラスミドｐＯＷ３８０の制限酵素部位および機能
地図を示す。
ＤＮＡの−１，５１＋！９を０．１ＸＴＥ緩衝液１゜
５ｍＱに浮遊し、−２０°Ｃで貯蔵した。添付図面第１
図にプラスミドｐＯＷ３８０の制限酵素部位および機能
地図を示す。
実施例２ ファージｍ０Ｗ３８０の組立て種々の方法お
よび遺伝子配列供給源を使用して同一のプラスミド組立
てを達成することができる。
よび遺伝子配列供給源を使用して同一のプラスミド組立
てを達成することができる。
ＤＡＯＣＳ遺伝子を含んだコスミドｐＯＷ３７９の一３
ｋｂ ＢａｍＨＩ制限酵素断片を、ＢａｍＨＩで消化
した復製型（ＲＦ）Ｍ１３ベクターとライゲーションす
ることによってファージｍ０Ｗ３８０を組立てた。スト
レプトマイセス・クラブリゲルスのゲノムコスミド・ラ
イブラリーからコスミドｐＯＷ３７９クローンを得、こ
れをＳ、リプマニイのＩＰＮＳ遺伝子だけでなく、精製
したＳ、クラブリゲルス・エキスパンダーゼのアミノ末
端アミノ酸残基配列および種コドンー利用偏りに基づい
て設計された「ゲスマーＣｇｕｅｓｓｍｅｒ）ノＤＮＡ
プローブ全使用するハイブリダイゼーションによって同
定しｔ；。所望の７ア一ジＭ１３クローンは「グエスマ
ー」グローブを使用するグラークハイブリダイゼーショ
ン法により、または制限酵素分析によって同定できる。
ｋｂ ＢａｍＨＩ制限酵素断片を、ＢａｍＨＩで消化
した復製型（ＲＦ）Ｍ１３ベクターとライゲーションす
ることによってファージｍ０Ｗ３８０を組立てた。スト
レプトマイセス・クラブリゲルスのゲノムコスミド・ラ
イブラリーからコスミドｐＯＷ３７９クローンを得、こ
れをＳ、リプマニイのＩＰＮＳ遺伝子だけでなく、精製
したＳ、クラブリゲルス・エキスパンダーゼのアミノ末
端アミノ酸残基配列および種コドンー利用偏りに基づい
て設計された「ゲスマーＣｇｕｅｓｓｍｅｒ）ノＤＮＡ
プローブ全使用するハイブリダイゼーションによって同
定しｔ；。所望の７ア一ジＭ１３クローンは「グエスマ
ー」グローブを使用するグラークハイブリダイゼーショ
ン法により、または制限酵素分析によって同定できる。
しかしながら本発明によって、主としてプラスミドｐＯ
Ｗ３８０をＳ、クラブリゲルスＤＡＯＣＳ遺伝子の供給
源として使用し得るので、１０Ｗ３８０の組立てが極め
て筒車となる。
Ｗ３８０をＳ、クラブリゲルスＤＡＯＣＳ遺伝子の供給
源として使用し得るので、１０Ｗ３８０の組立てが極め
て筒車となる。
Ｍ１３で誘導された７ア一ジｍ０Ｗ３８０は、Ｓ。
クラブリゲルス・エキスパンダーゼ暗号配列の５′末端
にＮｄｅｌ制限酵素認識部位を作り出すため実施される
部位特異的突然変異の際の有用な中間体である。
にＮｄｅｌ制限酵素認識部位を作り出すため実施される
部位特異的突然変異の際の有用な中間体である。
実施例ｔｂで作成したプラスミドｐＯＷ３８ＣＩＤＮＡ
約２５μ９の０．１ ｘＴＥ緩衝液２５μＱ浮遊液を１
ＱＸＢａｌｌｌＨＩ緩衝液（１，０Ｍ ＮａＣｌ２，
１００ｍＭトリス−ＭＣＩ２（ｐＨ７，５）および１０
０ｎ＋ＭＭｇｃ １２り ４０μＱ１ガラス蒸留水３３
５μαおよび制限酵素ＢａｒｉＨＩ ５μａ（〜５０単
位）に添加して混合する。特に記載しない限り、制限酵
素は二ニー・イングランド・バイオラプズ［（Ｎｅｗ
Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）、３２トザー・ロ
ード（Ｔ ｏｚｅｒＲｏａｄ）、ビバリー（Ｂｅｖｅｒ
１３１）、ＭＡＯ１９１５］がら入手しｌ；。単位の定
義はそれぞれの製造業者の単位の定義に対応する。生じ
た反応物を３７°Ｃで９０分間インキュベートする。つ
いでフェノールおよびクロロホルムで反応を抽出し、Ｂ
ａＩＩＨ工で消化したプラスミドｐＯＷ３８０ ＤＮ
ＡをＮａ０Ａｃおよびエタノールで沈澱させ、これをＨ
！０９μＱに再浮遊させる。負荷緩衝液（２５％、Ｖ／
Ｖグリセリン、０．０５％Ｗ／Ｖブロムフェノールブル
ーおよび０．０５％キシレンシアツール）約１μＱをＤ
ＮＡ溶液へ添加し、ついで所望の〜３ｋｂＢａｍＨＩ制
限酵素断片が他の消化生産物から明らかに分離されるま
で１％アガロースゲル上で電気泳動する。
約２５μ９の０．１ ｘＴＥ緩衝液２５μＱ浮遊液を１
ＱＸＢａｌｌｌＨＩ緩衝液（１，０Ｍ ＮａＣｌ２，
１００ｍＭトリス−ＭＣＩ２（ｐＨ７，５）および１０
０ｎ＋ＭＭｇｃ １２り ４０μＱ１ガラス蒸留水３３
５μαおよび制限酵素ＢａｒｉＨＩ ５μａ（〜５０単
位）に添加して混合する。特に記載しない限り、制限酵
素は二ニー・イングランド・バイオラプズ［（Ｎｅｗ
Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）、３２トザー・ロ
ード（Ｔ ｏｚｅｒＲｏａｄ）、ビバリー（Ｂｅｖｅｒ
１３１）、ＭＡＯ１９１５］がら入手しｌ；。単位の定
義はそれぞれの製造業者の単位の定義に対応する。生じ
た反応物を３７°Ｃで９０分間インキュベートする。つ
いでフェノールおよびクロロホルムで反応を抽出し、Ｂ
ａＩＩＨ工で消化したプラスミドｐＯＷ３８０ ＤＮ
ＡをＮａ０Ａｃおよびエタノールで沈澱させ、これをＨ
！０９μＱに再浮遊させる。負荷緩衝液（２５％、Ｖ／
Ｖグリセリン、０．０５％Ｗ／Ｖブロムフェノールブル
ーおよび０．０５％キシレンシアツール）約１μＱをＤ
ＮＡ溶液へ添加し、ついで所望の〜３ｋｂＢａｍＨＩ制
限酵素断片が他の消化生産物から明らかに分離されるま
で１％アガロースゲル上で電気泳動する。
ゲルを臭化エチジウムの希釈溶液（０，５μｇ／ｍＱ）
で染色し、染色したゲルを長波長紫外線で照射すること
によって電気泳動されたＤＮＡを可視化した。断片の位
置を確かめたのち〜３ｋｂ断片の前でゲルに小切り込み
を作り、切り込みにシュライヒャ−（Ｓｃｈｌｅｉｃｈ
ｅｒ）およびシ２エル（Ｓｃｈｕｅｌｌ）［キ＋ ７
（Ｋ ｅｅｎｅ）、ＮＨＯ３４３１］のＤＥＡＥ膜を置
いたつさらに電気泳動すると、ＤＮＡは非共有結合的に
ＤＥＡＥ膜に結合した。所望の断片をＤＥＡＥ膜に結合
させたのち、膜を取り、低塩緩衝液（１００ａ＋Ｍ
ＮａＣＱ、Ｏ，１ｍＭ ＥＤＴＡ、、２０ｍＭトリス
−ＨＣＱ（ｐＨ８））で洗浄した。つぎに膜を小試験管
に入れて、高置緩衝液（ＬＭ ＮａＣＱ、０．１ｍＭ
ＥＤＴＡｌ ２０ｍＭ）リス−ＨＣＬｌ（ｐＨ８）
）に浸漬させ、６５°Ｃで１０分間インキュベートして
ＤＮＡをＤＥＡＥペーパーから遊離させた。、６５℃で
インキュベーション後、インキュベーション緩衝液を集
め、膜を高置緩衝液で洗浄した。所望のＤＮＡ断片を採
取する前に洗浄液とインキュベーション緩衝液をプール
しＩ；。
で染色し、染色したゲルを長波長紫外線で照射すること
によって電気泳動されたＤＮＡを可視化した。断片の位
置を確かめたのち〜３ｋｂ断片の前でゲルに小切り込み
を作り、切り込みにシュライヒャ−（Ｓｃｈｌｅｉｃｈ
ｅｒ）およびシ２エル（Ｓｃｈｕｅｌｌ）［キ＋ ７
（Ｋ ｅｅｎｅ）、ＮＨＯ３４３１］のＤＥＡＥ膜を置
いたつさらに電気泳動すると、ＤＮＡは非共有結合的に
ＤＥＡＥ膜に結合した。所望の断片をＤＥＡＥ膜に結合
させたのち、膜を取り、低塩緩衝液（１００ａ＋Ｍ
ＮａＣＱ、Ｏ，１ｍＭ ＥＤＴＡ、、２０ｍＭトリス
−ＨＣＱ（ｐＨ８））で洗浄した。つぎに膜を小試験管
に入れて、高置緩衝液（ＬＭ ＮａＣＱ、０．１ｍＭ
ＥＤＴＡｌ ２０ｍＭ）リス−ＨＣＬｌ（ｐＨ８）
）に浸漬させ、６５°Ｃで１０分間インキュベートして
ＤＮＡをＤＥＡＥペーパーから遊離させた。、６５℃で
インキュベーション後、インキュベーション緩衝液を集
め、膜を高置緩衝液で洗浄した。所望のＤＮＡ断片を採
取する前に洗浄液とインキュベーション緩衝液をプール
しＩ；。
ＮａＣＱ濃度が０．２５Ｍとなるように高置−ＤＮＡ溶
液の容量を調節し、ついで冷無水エタノール３容量を溶
液に添加した。得られた溶液を混合し、氷上で１０〜２
０分間放置した。ついで溶液を１５００ｏｒｐｍで１５
分間遠心した。もう−度沈澱させたのち、残りの塩を除
去し、ＤＮＡペレットを７゛０％エタノールで洗浄し、
乾燥し、ＴＥ緩衝液２０μａに再浮遊させて、所望の制
限酵素断片を構成した。〜３ｋｂの断片的０６μ９が得
られＩこ。
液の容量を調節し、ついで冷無水エタノール３容量を溶
液に添加した。得られた溶液を混合し、氷上で１０〜２
０分間放置した。ついで溶液を１５００ｏｒｐｍで１５
分間遠心した。もう−度沈澱させたのち、残りの塩を除
去し、ＤＮＡペレットを７゛０％エタノールで洗浄し、
乾燥し、ＴＥ緩衝液２０μａに再浮遊させて、所望の制
限酵素断片を構成した。〜３ｋｂの断片的０６μ９が得
られＩこ。
組立て
Ｍ１３ｍｐ１９ＲＦ ＤＮＡ（二ニー・イングランド
・バイオラブズ（ＮＥＢ）から入手できる）約２．５μ
９を、制限酵素ＢａｍＨＩ １ ｐ（Ｉｃ〜２０単位）
によりＢａｍＨＩ緩衝液１００μＱ中、３７℃で９０分
間消化した。反応混合物をフェノール：クロロホルムで
抽出し、水層のＤＮＡをエタノール沈澱により濃縮した
。ＤＮＡペレットを０．Ｉ ＸＴＥ緩衝液２０μＱに再
浮遊させて、所望のＢａｍＨＩ−消化Ｍ１３ｍｐ１９ベ
クター〜２μ９を構成した。得られたベクターＤＮＡを
一２０℃で貯蔵した。
・バイオラブズ（ＮＥＢ）から入手できる）約２．５μ
９を、制限酵素ＢａｍＨＩ １ ｐ（Ｉｃ〜２０単位）
によりＢａｍＨＩ緩衝液１００μＱ中、３７℃で９０分
間消化した。反応混合物をフェノール：クロロホルムで
抽出し、水層のＤＮＡをエタノール沈澱により濃縮した
。ＤＮＡペレットを０．Ｉ ＸＴＥ緩衝液２０μＱに再
浮遊させて、所望のＢａｍＨＩ−消化Ｍ１３ｍｐ１９ベ
クター〜２μ９を構成した。得られたベクターＤＮＡを
一２０℃で貯蔵した。
プラスミドｐＯＷ３８０の〜３ｋｂ ＢａｍＨＩ制限
酵素断片２μａとＢａｍＨＩ消化ベクターＭ１３ｍｐ１
９１μＱを２０ｐＱの反応混合物［Ｄ Ｎ Ａ断片、１
０Ｘリガーゼ緩衝液（０，５Ｍ１−リス−ＨＣＱＣｐＨ
７，５）およびｌ ００ｍＭ ＭｇＣ１１ｔ ２ｍ
Ｌ ５ｍＭ ＡＴＰ２ｉ、 ６ｔｇ／ｐ（ＩＢＳＡ １
ｐ（１，ガラス蒸留水１２μＱおよびＴ４ ＤＮＡリ
ガーゼ（ＮＥＢ）ｌμＱ（Ｉワイス単位）を含有］中で
ライゲーションする。反応を１５℃で１８時間インキュ
ベートする。ライゲーションしｆ＝ＤＮＡは他のライゲ
ーション生産物とともに所望のファージｍ０Ｗ３８０を
構成している。
酵素断片２μａとＢａｍＨＩ消化ベクターＭ１３ｍｐ１
９１μＱを２０ｐＱの反応混合物［Ｄ Ｎ Ａ断片、１
０Ｘリガーゼ緩衝液（０，５Ｍ１−リス−ＨＣＱＣｐＨ
７，５）およびｌ ００ｍＭ ＭｇＣ１１ｔ ２ｍ
Ｌ ５ｍＭ ＡＴＰ２ｉ、 ６ｔｇ／ｐ（ＩＢＳＡ １
ｐ（１，ガラス蒸留水１２μＱおよびＴ４ ＤＮＡリ
ガーゼ（ＮＥＢ）ｌμＱ（Ｉワイス単位）を含有］中で
ライゲーションする。反応を１５℃で１８時間インキュ
ベートする。ライゲーションしｆ＝ＤＮＡは他のライゲ
ーション生産物とともに所望のファージｍ０Ｗ３８０を
構成している。
コンピテントなＥ、コリＫ１２ ＪＭ１０９（ｒエピ
キュリアン・コリ（Ｅｐｉｃｕｒｅａｎ Ｃｏ１１）
Ｊ（商標））をストラタジーン社［Ｓ ｔｒａＬａｇ６
ｎｅ％ ３７７０タンシー・ストリート（”ｌ” Ｈｌ
ｓｙ Ｓ ｔｒｅｅｔ）、サン・ジエゴ（Ｓ ａｎ
Ｄ ｉｅｇｏ）、ＣＡ９２１２１］から購入し、ＤＮ
Ａの容量を２０μＱとし、媒質の希釈や発現時間を必要
としない以外は、実質上、製造業者の指示通り、７ア一
ジｍ０Ｗ３８０を構成するライゲーション反応混合物で
形質転換した。形質転換後、対数増殖期にあるＥ、コリ
Ｋ１２ ＪＭＩ０９を試験管１本当りに０−２５ｍ４
ずつ含有する１３Ｘ１００＋ｌＩ２の滅菌ガラス試験管
へ、細胞をそれぞれ〜１１１０．２０．４０および５０
μαずつ試料として分配した。これらの試験管にトップ
アガー（４５℃で溶融維持させｔ；Ｏ，８％寒天含有し
グロス） ３ ｍＱずつを添加した。ついで細胞−トッ
プアガー混合物を５−ブロモ−４−クロロ−３−インド
リル−β−Ｄ−ガラクトシド（Ｘ−ガル）４０μｇ／ｌ
ａＱおよび０．１Ｍ イソプロピルチオ−β−ガラク
トシド（ＩＰＴＧ）を含有するし一寒天平板上に接種し
、平板を３７℃で１夜インキユベートした。［Ｍ１３法
に関する一層詳細な記述および説明については、Ｍ２Ｓ
・クローニング／ジデオキシ・７−クニンシング・イン
ストラクション・マニュアル（Ｍ ｌ ３ Ｃｔｏｎ
ｉｎｇ／ Ｄ １ｄｅｏｘｙ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ
Ｉ ｎ５ｔｒｕｃｔｉｏｎ Ｍａｎｕａｌ）、ベセスダ
・リサーチ・ラボラトリーズ（Ｂｅｔｈｅｓｄａ Ｒｅ
５ｅａｒｃｈ Ｌａｂ。
キュリアン・コリ（Ｅｐｉｃｕｒｅａｎ Ｃｏ１１）
Ｊ（商標））をストラタジーン社［Ｓ ｔｒａＬａｇ６
ｎｅ％ ３７７０タンシー・ストリート（”ｌ” Ｈｌ
ｓｙ Ｓ ｔｒｅｅｔ）、サン・ジエゴ（Ｓ ａｎ
Ｄ ｉｅｇｏ）、ＣＡ９２１２１］から購入し、ＤＮ
Ａの容量を２０μＱとし、媒質の希釈や発現時間を必要
としない以外は、実質上、製造業者の指示通り、７ア一
ジｍ０Ｗ３８０を構成するライゲーション反応混合物で
形質転換した。形質転換後、対数増殖期にあるＥ、コリ
Ｋ１２ ＪＭＩ０９を試験管１本当りに０−２５ｍ４
ずつ含有する１３Ｘ１００＋ｌＩ２の滅菌ガラス試験管
へ、細胞をそれぞれ〜１１１０．２０．４０および５０
μαずつ試料として分配した。これらの試験管にトップ
アガー（４５℃で溶融維持させｔ；Ｏ，８％寒天含有し
グロス） ３ ｍＱずつを添加した。ついで細胞−トッ
プアガー混合物を５−ブロモ−４−クロロ−３−インド
リル−β−Ｄ−ガラクトシド（Ｘ−ガル）４０μｇ／ｌ
ａＱおよび０．１Ｍ イソプロピルチオ−β−ガラク
トシド（ＩＰＴＧ）を含有するし一寒天平板上に接種し
、平板を３７℃で１夜インキユベートした。［Ｍ１３法
に関する一層詳細な記述および説明については、Ｍ２Ｓ
・クローニング／ジデオキシ・７−クニンシング・イン
ストラクション・マニュアル（Ｍ ｌ ３ Ｃｔｏｎ
ｉｎｇ／ Ｄ １ｄｅｏｘｙ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ
Ｉ ｎ５ｔｒｕｃｔｉｏｎ Ｍａｎｕａｌ）、ベセスダ
・リサーチ・ラボラトリーズ（Ｂｅｔｈｅｓｄａ Ｒｅ
５ｅａｒｃｈ Ｌａｂ。
ｒａｔｏｒｉｅｓ）（Ｂ ＲＬ ）、ライフ・チクノロ
シーズ・インコーホレーテッド（Ｌ ｉｒｅ Ｔｅｃｈ
ｎｏｌｏｇｉｅｓ、 Ｉ ｎｃ、）、ゲイザースバーグ
（Ｇ ａ ｔ ｔｈｅｒｓｂｕｒｇ）、ＭＤ２０８７７
、参照］。形質転換体をβ−ガラクトシダーゼ活性（無
色のプラーク表現型）の挿入失活および複製型（ＲＦ）
ＤＮＡの制限酵素分析によって同定する。スクリーニン
グの目的のため、平板オーバーレイから初期対数場殖期
のＥ、コリＫ１２ＪＭ１０９のｌプラーク当り３顧ずつ
透明なプラークをパスツール・ピペットで充填する。培
養物を通気しなから３７°Ｃで６〜１８時間インキュベ
ートする。
シーズ・インコーホレーテッド（Ｌ ｉｒｅ Ｔｅｃｈ
ｎｏｌｏｇｉｅｓ、 Ｉ ｎｃ、）、ゲイザースバーグ
（Ｇ ａ ｔ ｔｈｅｒｓｂｕｒｇ）、ＭＤ２０８７７
、参照］。形質転換体をβ−ガラクトシダーゼ活性（無
色のプラーク表現型）の挿入失活および複製型（ＲＦ）
ＤＮＡの制限酵素分析によって同定する。スクリーニン
グの目的のため、平板オーバーレイから初期対数場殖期
のＥ、コリＫ１２ＪＭ１０９のｌプラーク当り３顧ずつ
透明なプラークをパスツール・ピペットで充填する。培
養物を通気しなから３７°Ｃで６〜１８時間インキュベ
ートする。
インキニベーション後、培養１．５ｍＭずつを１゜５ｍ
４のエッペンドル７試験管でベレット化する。
４のエッペンドル７試験管でベレット化する。
新しく用意した試験管へ上清をデカントして、これを７
７一ジ接種物の供給源とするため４°Ｃで貯蔵する。下
記の例外を除き、実質上バーンボイムおよびドリーのア
ルカリ性プラスミド調製法〔ヌクレイツク拳アシッド・
リサーチ（Ｎｕｃ、 ＡｃｉｄＲｅｓ、）、７巻（６）
、１５１３−１５２３頁（１９７９年）１の教示にした
がって、細胞ベレットから複製型ＤＮＡを作成する。■
液、■液およびｍ液を１５倍量使用してスケールアップ
し、透明な細胞溶解液を等量のＣＨＣ（ｌｓで一度抽出
する。ついでインプロパツール０．４容量を添加し、室
温で２０分間インキュベートすることによってＤＮＡを
沈澱させる。遠心によってＤＮＡを採取し、ついで０．
３Ｍ Ｎａ０Ａｃからエタノールで沈澱させる。ＲＦ
ＤＮＡの制限パターン分析は、所望の挿入体の存否
を診断するだけでなく、Ｍ１３ベクターの多重（複数）
クローニング部位（ＭＣ３）に対する挿入配列の方向を
きめるのにも使用し得る非対称型５ｃａＩ制限酵素認識
部位の存在によって容易となる。この方法によって、Ｅ
、コリＫ１２ Ｊ Ｍ ｌ ０９／＋＊ＯＷ３８０１
Ｍ胞を同定シタ。ツいでこれらの細胞を、以下に説明す
る部位特異的突然変位のための７ア一ジ＋ｗＯＷ３８０
の供給源として使用した。
７一ジ接種物の供給源とするため４°Ｃで貯蔵する。下
記の例外を除き、実質上バーンボイムおよびドリーのア
ルカリ性プラスミド調製法〔ヌクレイツク拳アシッド・
リサーチ（Ｎｕｃ、 ＡｃｉｄＲｅｓ、）、７巻（６）
、１５１３−１５２３頁（１９７９年）１の教示にした
がって、細胞ベレットから複製型ＤＮＡを作成する。■
液、■液およびｍ液を１５倍量使用してスケールアップ
し、透明な細胞溶解液を等量のＣＨＣ（ｌｓで一度抽出
する。ついでインプロパツール０．４容量を添加し、室
温で２０分間インキュベートすることによってＤＮＡを
沈澱させる。遠心によってＤＮＡを採取し、ついで０．
３Ｍ Ｎａ０Ａｃからエタノールで沈澱させる。ＲＦ
ＤＮＡの制限パターン分析は、所望の挿入体の存否
を診断するだけでなく、Ｍ１３ベクターの多重（複数）
クローニング部位（ＭＣ３）に対する挿入配列の方向を
きめるのにも使用し得る非対称型５ｃａＩ制限酵素認識
部位の存在によって容易となる。この方法によって、Ｅ
、コリＫ１２ Ｊ Ｍ ｌ ０９／＋＊ＯＷ３８０１
Ｍ胞を同定シタ。ツいでこれらの細胞を、以下に説明す
る部位特異的突然変位のための７ア一ジ＋ｗＯＷ３８０
の供給源として使用した。
ｃ、１末鎖ファージ＋＊０Ｗ３８０ ＤＮＡの調製お
よび７ア一ジｍ０Ｗ３８１組立てのための部初期対数増
殖期Ｅ、コリＫ１２ ＪＭ１０９の培養物ｌＯ顧にフ
ァージストック（実施例２Ｂで調製）〜２００μａを接
種し％３７℃で通気しなから〜１８時間インキュベート
した。培養を遠心して、得られた上溝を新しく用意した
試験管へ移して再び遠心した。上溝をもう一度新しい試
験管へデカントした。２５％ポリエチレングリコール（
分子量；３３５０）の３Ｍ ＮａＣｄ溶液ｌｌｌ１１
２を上滑に添加し、これを室温で１５分間インキュベー
トした。得られた混合物を１００００ｒｐ＋１で３０分
間遠心した。遠心Ｉ；よって得たペレットは１本鎖ファ
ージｍ０Ｗ３８０を含有しており、これをＴＥ緩衝液４
００ｐＱに再浮遊した。溶液をまずＣＨ，Ｃα、で、つ
いでＴＥ飽和フェノールで抽出した。フェノールを水層
と接触させて１５分間静置した。つイテ溶液をＴＥ飽和
７エ／−ル：ＣＨＣＱｓ（１：Ｉｓｖ／ｖ）混合液で２
回、さらにＣＨＣＱ、だけで２回抽出した。ついでＤＮ
Ａを０．３Ｍ Ｎａ０Ａｃから沈澱させ、遠心によっ
て採取し、得られたベレットを０．Ｉ ＸＴＥ緩衝液１
００μＱに再浮遊しＩ；。
よび７ア一ジｍ０Ｗ３８１組立てのための部初期対数増
殖期Ｅ、コリＫ１２ ＪＭ１０９の培養物ｌＯ顧にフ
ァージストック（実施例２Ｂで調製）〜２００μａを接
種し％３７℃で通気しなから〜１８時間インキュベート
した。培養を遠心して、得られた上溝を新しく用意した
試験管へ移して再び遠心した。上溝をもう一度新しい試
験管へデカントした。２５％ポリエチレングリコール（
分子量；３３５０）の３Ｍ ＮａＣｄ溶液ｌｌｌ１１
２を上滑に添加し、これを室温で１５分間インキュベー
トした。得られた混合物を１００００ｒｐ＋１で３０分
間遠心した。遠心Ｉ；よって得たペレットは１本鎖ファ
ージｍ０Ｗ３８０を含有しており、これをＴＥ緩衝液４
００ｐＱに再浮遊した。溶液をまずＣＨ，Ｃα、で、つ
いでＴＥ飽和フェノールで抽出した。フェノールを水層
と接触させて１５分間静置した。つイテ溶液をＴＥ飽和
７エ／−ル：ＣＨＣＱｓ（１：Ｉｓｖ／ｖ）混合液で２
回、さらにＣＨＣＱ、だけで２回抽出した。ついでＤＮ
Ａを０．３Ｍ Ｎａ０Ａｃから沈澱させ、遠心によっ
て採取し、得られたベレットを０．Ｉ ＸＴＥ緩衝液１
００μＱに再浮遊しＩ；。
この溶液は１本鎖７アージｍ０Ｗ３８０ ＤＮＡ−５μ
ｇを構成している。
ｇを構成している。
Ｄ−衷邑寒Ａ脛茜
突然変異の誘発（および引き続き所望の７７−ジを検出
するためのハイブリダイゼーシ褒ン）に使用した１本鎖
ＤＮＡ断片は、ＢＲＬ社から購入したＭ１３普遍グライ
マー（１５量体）以外は自動ＤＮＡ合成装置で合成した
。突然変異誘発用断片は、（１）ＳＴＮＤＥ−Ａ１３個
の塩基を除いて７ア一ジｍ０Ｗ３８０のＤＡＯＣＳ暗号
配列と相同な４１ヌクレオチド長さの下記のＤＮＡ配列
：を有する１＊ＭＤＮＡ（その不対合部分（下線で示す
）はＤＡＯＣ３暗号配列のおよそ１位の位置で制限酵素
Ｎｄｅｌ認識配列を作り出す］、および（２）ＳＴＮＤ
Ｅ−Ｂ：単に５ＴＮＤＥ−Ａ断片の亜断片（サブ７ラグ
メント）である下記のＤＮＡ配列：ｄｅＸ ５’−ＴＧＴＣＣＡＴＡ丁ＧＣＴＣＴＣＡＣ−３’を有
する１７ヌクレオチド長さの１本鎖ＤＮＡのように設計
されている。
するためのハイブリダイゼーシ褒ン）に使用した１本鎖
ＤＮＡ断片は、ＢＲＬ社から購入したＭ１３普遍グライ
マー（１５量体）以外は自動ＤＮＡ合成装置で合成した
。突然変異誘発用断片は、（１）ＳＴＮＤＥ−Ａ１３個
の塩基を除いて７ア一ジｍ０Ｗ３８０のＤＡＯＣＳ暗号
配列と相同な４１ヌクレオチド長さの下記のＤＮＡ配列
：を有する１＊ＭＤＮＡ（その不対合部分（下線で示す
）はＤＡＯＣ３暗号配列のおよそ１位の位置で制限酵素
Ｎｄｅｌ認識配列を作り出す］、および（２）ＳＴＮＤ
Ｅ−Ｂ：単に５ＴＮＤＥ−Ａ断片の亜断片（サブ７ラグ
メント）である下記のＤＮＡ配列：ｄｅＸ ５’−ＴＧＴＣＣＡＴＡ丁ＧＣＴＣＴＣＡＣ−３’を有
する１７ヌクレオチド長さの１本鎖ＤＮＡのように設計
されている。
５ＴＮＤＥ−Ａ約１００ピコモルの５゛末端を１ピコモ
ル／μａ濃度の１本鎖ＤＮＡ、ＩＯＸリガーゼ緩衝液ｌ
ＯμＱ、アデノシン三リン酸（ＡＴＰ）１０００ピコモ
ル、０．１Ｍ ＤＴＴｌｏｔｔ（１゜ガラス蒸留水６
５μＱおよびＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ１ｐ１２（
１０リチヤ一ドソン単位）［ベーリンガー・マンハイム
・バイオケミカルス（Ｂ ｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎ
ｈｅｉｍ Ｂ ｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ）、（ＢＭＢ）
、７９４１キヤツスルウエイ・ドライブ（Ｃａｓｔ １
ｅｖａｙＤｒｉｖａ）、Ｐ、０．ボックス５０８４１．
インジアナポリス（Ｉ ｎｄｉａｎａｐｏｌ ｉｓ）、
インジアナ（ｌｎｄｉａｎａ）、４６２５０）］を含有
する反応混合物でリン酸化（キナーゼ化）した。反応混
合物を３７°Ｃでインキュベートして３０分経過後、酵
素１μＱを追加した。
ル／μａ濃度の１本鎖ＤＮＡ、ＩＯＸリガーゼ緩衝液ｌ
ＯμＱ、アデノシン三リン酸（ＡＴＰ）１０００ピコモ
ル、０．１Ｍ ＤＴＴｌｏｔｔ（１゜ガラス蒸留水６
５μＱおよびＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ１ｐ１２（
１０リチヤ一ドソン単位）［ベーリンガー・マンハイム
・バイオケミカルス（Ｂ ｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎ
ｈｅｉｍ Ｂ ｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ）、（ＢＭＢ）
、７９４１キヤツスルウエイ・ドライブ（Ｃａｓｔ １
ｅｖａｙＤｒｉｖａ）、Ｐ、０．ボックス５０８４１．
インジアナポリス（Ｉ ｎｄｉａｎａｐｏｌ ｉｓ）、
インジアナ（ｌｎｄｉａｎａ）、４６２５０）］を含有
する反応混合物でリン酸化（キナーゼ化）した。反応混
合物を３７°Ｃでインキュベートして３０分経過後、酵
素１μＱを追加した。
ついで３７℃でざらに３０分間インキュベートしたのち
、６８°Ｃで５分間インキュベートして反応を終結した
。これと同量の酵素を含有する類似の反応混合物４０μ
ａで、Ｍ１３普遍プライマー約４０ピコモルからなる５
′末端をキナーゼ化した。
、６８°Ｃで５分間インキュベートして反応を終結した
。これと同量の酵素を含有する類似の反応混合物４０μ
ａで、Ｍ１３普遍プライマー約４０ピコモルからなる５
′末端をキナーゼ化した。
１本鎖７アージ＋ａＯＷ３８０ ＤＮＡを、実質上、
アデルマン（Ａｄｅｌｍａｎ）ら［ＤＮＡ、２巻（３）
、１８３〜１９３頁（１９８３年）］の教示にしたがい
下記のように突然変異しｊ；。ＩＯＸアニーリング緩衝
液８ ｐＱｃｌ ００＋＊Ｍ トリス−ＨＣｇ（ｐＨ７
，５）、１ｍＭ ＥＤＴＡおよび５００ｆｌ１Ｍ
ＮａＣ１２）、キナーゼ化ＬＪ：５ＴＮＤＥ−Ａ ４
ｉ（４ピコモル）、キナーゼ化したＭ１３普遍配列決定
プライマー４μＱＣ４ピコモル）および水５０μＱに１
本鎖７アージｍ０Ｗ３８０ ＤＮＡ〜５００ナノグラ
ム（０，１ＸＴＥ緩衝液１５μａ溶液）を添加し、混合
物を８０℃で２分間、５５℃で５分間、最後に室温で５
分間インキュベートすることによりアニーリング反応を
実施した。
アデルマン（Ａｄｅｌｍａｎ）ら［ＤＮＡ、２巻（３）
、１８３〜１９３頁（１９８３年）］の教示にしたがい
下記のように突然変異しｊ；。ＩＯＸアニーリング緩衝
液８ ｐＱｃｌ ００＋＊Ｍ トリス−ＨＣｇ（ｐＨ７
，５）、１ｍＭ ＥＤＴＡおよび５００ｆｌ１Ｍ
ＮａＣ１２）、キナーゼ化ＬＪ：５ＴＮＤＥ−Ａ ４
ｉ（４ピコモル）、キナーゼ化したＭ１３普遍配列決定
プライマー４μＱＣ４ピコモル）および水５０μＱに１
本鎖７アージｍ０Ｗ３８０ ＤＮＡ〜５００ナノグラ
ム（０，１ＸＴＥ緩衝液１５μａ溶液）を添加し、混合
物を８０℃で２分間、５５℃で５分間、最後に室温で５
分間インキュベートすることによりアニーリング反応を
実施した。
１０Ｘクレノー・リガーゼ緩衝液２０μｍ２（ｔ。
０１１Ｍトリス−ＨＣｇ（ｐＨ７，５）、１１Ｍ Ｅ
ＤＴＡ１５００ｍＭ ＮａＣ（１）、０．１Ｍ Ｄ
ＴＴ２０μｍ２．ｄＧＴＰ％ｄＡＴＰ、ＴＴＰおよびｄ
ＣＴＰのそれぞれ６−２５ｍＭずつの溶液２０μ（＋、
５１ＩＩＭＡＴＰ２０μＱ１水１２０μＱおよびクレノ
ー酵素（ＢＭＢ）２．５μｍ２（１２，５単位）からな
る混合物１２０μＱを、アニーリングしたＤＮＡ溶液に
添加して伸長反応を実施した。伸長反応混合物を室温で
１時間、３７℃で４時間、最後に１４℃で〜１８時間イ
ンキュベートした。
ＤＴＡ１５００ｍＭ ＮａＣ（１）、０．１Ｍ Ｄ
ＴＴ２０μｍ２．ｄＧＴＰ％ｄＡＴＰ、ＴＴＰおよびｄ
ＣＴＰのそれぞれ６−２５ｍＭずつの溶液２０μ（＋、
５１ＩＩＭＡＴＰ２０μＱ１水１２０μＱおよびクレノ
ー酵素（ＢＭＢ）２．５μｍ２（１２，５単位）からな
る混合物１２０μＱを、アニーリングしたＤＮＡ溶液に
添加して伸長反応を実施した。伸長反応混合物を室温で
１時間、３７℃で４時間、最後に１４℃で〜１８時間イ
ンキュベートした。
伸長反応混合物をＣＨＣＱｓで一回抽出し、エタノール
およびＮａ０ＡｃでＤＮＡを沈澱させ、遠心により採取
した。ＤＮＡペレットを、ｌＸ５Ｉ緩衝液（０，３Ｍ
ＮａＣＱおよび３ｍＭ Ｚｎ０Ａｃ）４００μＱに
再浮遊させた。このＤＮＡ溶液の半分は一２０℃で保存
し、残りの半分を分け、５本の１．５−試験管へ分配し
た。ｌμａ当り２００（３０−ミニット）単位に希釈し
たＳｌヌクレアーゼ（ＢＭＢ）ｌμａをこれらの試験管
４本へ添加した。反応を室温で、それぞれ５分、１０分
、１５分および２０分インキュベートした。まずｔＲＮ
Ａ ５〜ｌＯμりを反応混合物に添加してキャリヤー
として作用させ、ついでＴＥ飽和フェノール−ＣＨＣα
、混合物（１：１％ｖ／ｖ）で抽出することによって反
応を停止させた。Ｓｌｔ’ｆｉ理しなかった試料（陰性
対照）も同様に抽出した。水層に含まれるＤＮＡをエタ
ノール沈澱により濃縮し、遠心によって採取した。ＤＮ
Ａペレットをそれぞれ２０μａの水に再浮遊させた。
およびＮａ０ＡｃでＤＮＡを沈澱させ、遠心により採取
した。ＤＮＡペレットを、ｌＸ５Ｉ緩衝液（０，３Ｍ
ＮａＣＱおよび３ｍＭ Ｚｎ０Ａｃ）４００μＱに
再浮遊させた。このＤＮＡ溶液の半分は一２０℃で保存
し、残りの半分を分け、５本の１．５−試験管へ分配し
た。ｌμａ当り２００（３０−ミニット）単位に希釈し
たＳｌヌクレアーゼ（ＢＭＢ）ｌμａをこれらの試験管
４本へ添加した。反応を室温で、それぞれ５分、１０分
、１５分および２０分インキュベートした。まずｔＲＮ
Ａ ５〜ｌＯμりを反応混合物に添加してキャリヤー
として作用させ、ついでＴＥ飽和フェノール−ＣＨＣα
、混合物（１：１％ｖ／ｖ）で抽出することによって反
応を停止させた。Ｓｌｔ’ｆｉ理しなかった試料（陰性
対照）も同様に抽出した。水層に含まれるＤＮＡをエタ
ノール沈澱により濃縮し、遠心によって採取した。ＤＮ
Ａペレットをそれぞれ２０μａの水に再浮遊させた。
Ｓｌで処理して得られｆ−Ｄ Ｎ Ａ溶液各ｌＯμＱを
、実質上、実施例２Ｂに記載した方法で、ただし各平板
にＸ−ガルまたはＩ ＰＴＧのどちらかをも含ませず、
Ｅ、コリＫ１２ ＪＭ１０９の形質転換に使用しＩ：
。以下記載のように、放射能標識したオリゴヌクレオチ
ド５ＴＮＤＥ−Ｂをニトロセルロースフィルターにプロ
ットした７アーシＤＮＡハイブリツド化することにより
、所望の突然変異体を同定した。
、実質上、実施例２Ｂに記載した方法で、ただし各平板
にＸ−ガルまたはＩ ＰＴＧのどちらかをも含ませず、
Ｅ、コリＫ１２ ＪＭ１０９の形質転換に使用しＩ：
。以下記載のように、放射能標識したオリゴヌクレオチ
ド５ＴＮＤＥ−Ｂをニトロセルロースフィルターにプロ
ットした７アーシＤＮＡハイブリツド化することにより
、所望の突然変異体を同定した。
プラーク形成後、平板を４°Ｃで〜１時間インキュベー
トしてトップアガーを固化させた。陰性対照、１０分間
５ｔ−ｆｉ理系および２０分間Ｓｌ−処理系からそれぞ
れ〜５０〜２００プラークを含んだ２枚ずつの平板細菌
叢の上方にニトロセルロースフィルターを置いた。フィ
ルターと細菌叢表面の接触を〜１分間保ったのち、直ち
にニトロセルロー スフ ４ ルターを、０．１Ｎ Ｎ
ａＯＨ−１，５ＭＮａＣＱで５分間、ついで０．５Ｍト
トリ、 −ＨＣＱＣｐＨ７，０）−３Ｍ ＮａＣＱで
５分間飽和した３ＭＭＣｈｒフィルターベーパー［ワッ
トマン・ラブセールズ・インコーホレーテッド（Ｗａｔ
ｗａｎ Ｌａｂ −５ａｌｅｓ Ｉ ｎｃ、）、Ｐ、
０．ボックス１３５９、ヒルスボ０（Ｈｉｌｌｓｂｏｒ
ｏ）、オレゴン（Ｏｒｅｇｏｎ）、９７１２３−１３５
９１を使用しても理した。ニトロセルロースフィルター
を空気乾燥し、ついで真空で８０°０１３０分間焼成し
た。
トしてトップアガーを固化させた。陰性対照、１０分間
５ｔ−ｆｉ理系および２０分間Ｓｌ−処理系からそれぞ
れ〜５０〜２００プラークを含んだ２枚ずつの平板細菌
叢の上方にニトロセルロースフィルターを置いた。フィ
ルターと細菌叢表面の接触を〜１分間保ったのち、直ち
にニトロセルロー スフ ４ ルターを、０．１Ｎ Ｎ
ａＯＨ−１，５ＭＮａＣＱで５分間、ついで０．５Ｍト
トリ、 −ＨＣＱＣｐＨ７，０）−３Ｍ ＮａＣＱで
５分間飽和した３ＭＭＣｈｒフィルターベーパー［ワッ
トマン・ラブセールズ・インコーホレーテッド（Ｗａｔ
ｗａｎ Ｌａｂ −５ａｌｅｓ Ｉ ｎｃ、）、Ｐ、
０．ボックス１３５９、ヒルスボ０（Ｈｉｌｌｓｂｏｒ
ｏ）、オレゴン（Ｏｒｅｇｏｎ）、９７１２３−１３５
９１を使用しても理した。ニトロセルロースフィルター
を空気乾燥し、ついで真空で８０°０１３０分間焼成し
た。
ニトロセルロースフィルターを６ｘｓｓｃ溶液（２０Ｘ
ＳＳＣは３Ｍ ＮａＣ４および０．３Ｍクエン酸Ｎａ
）、ＩＯＸデンハート（Ｄｅｎｈａｒｔ’ｓ）溶液（水
１００ｍ１２当りポリビニルピロリドン０．２９、ウシ
血清アルブミン０．２ｇ８よびフィコール０．２ｇ）、
０．１％ＮａＰ Ｐ ｉ、０．１％ＳＤＳおよび変性Ｅ
。
ＳＳＣは３Ｍ ＮａＣ４および０．３Ｍクエン酸Ｎａ
）、ＩＯＸデンハート（Ｄｅｎｈａｒｔ’ｓ）溶液（水
１００ｍ１２当りポリビニルピロリドン０．２９、ウシ
血清アルブミン０．２ｇ８よびフィコール０．２ｇ）、
０．１％ＮａＰ Ｐ ｉ、０．１％ＳＤＳおよび変性Ｅ
。
コリ染色体ＤＮＡ１ Ｏμｇ／ｍＱからなる溶液で室温
で５分間、予備ハイブリッド化（プレハイブリダイゼー
ション）を行つに。ついで６ＸＳＳＣ。
で５分間、予備ハイブリッド化（プレハイブリダイゼー
ション）を行つに。ついで６ＸＳＳＣ。
１０Ｘデンハート溶液、０．１％ＮａＰＰ１および”Ｐ
−５ＴＮＤＥ−Ｂ ｌピッモル１５ｍＱの溶液でフィ
ルターをハイブリッド化した。”Ｐ −Ｓ ＴＮＤＥ−
Ｂは、本実施例で先に記載した方法と実質上同様に、た
だし非放射性ＡＴＰの代わりにγ−”Ｐ−ＡＴＰ（二ニ
ー・イングランド・ヌクレア（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ
Ｎｕｃｌｅａｒ）（Ｎ Ｅ Ｎ）、５４９アルパニー
・ストリート（Ａ １ｂａｎｙ Ｓ ｔｒｅｅｔ）、ボ
ストン（Ｂ ｏｓｔｏｎ）、ＭＡ、０２１１８、カタロ
グ＃ＮＥＧ−００２）〜７０ピコモルを使用して５ＴＮ
ＤＥ−Ｂ １００ピコモルの５′末端をリン酸化する
ことにより作成した。ハイブリダイゼーション後、室温
で過剰の６ＸＳＳＣで１回当り５分間ずつ、ついで５２
℃で過剰の６ｘＳＳＣで１回当り２０分間ずつそれぞれ
２回洗浄した。フィルターを空気乾燥し、クアンタ（Ｑ
ｕａｎｔａ）ｎｌ（商標）増感紙（テュポン（ＤｕＰｏ
ｎＬ）、インスツルメント・プロダクツ（Ｉ ｎｓｔｒ
ｕｇｚｅｎｔ Ｐ ｒｏｄｕｃｔｓ）、バイオメジカル
・デイビジョン（Ｂ ｉｏｎ＋ｅｄｉｃａｌ Ｄ １ｖ
ｉｓｉｏｎ）、ニュータウ７ （Ｎ ｅｉｎ、ｏｗｎ）
、ＣＮ０６４７０）で−７０℃で２時間オートラジオグ
ラフィーを行った。
−５ＴＮＤＥ−Ｂ ｌピッモル１５ｍＱの溶液でフィ
ルターをハイブリッド化した。”Ｐ −Ｓ ＴＮＤＥ−
Ｂは、本実施例で先に記載した方法と実質上同様に、た
だし非放射性ＡＴＰの代わりにγ−”Ｐ−ＡＴＰ（二ニ
ー・イングランド・ヌクレア（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ
Ｎｕｃｌｅａｒ）（Ｎ Ｅ Ｎ）、５４９アルパニー
・ストリート（Ａ １ｂａｎｙ Ｓ ｔｒｅｅｔ）、ボ
ストン（Ｂ ｏｓｔｏｎ）、ＭＡ、０２１１８、カタロ
グ＃ＮＥＧ−００２）〜７０ピコモルを使用して５ＴＮ
ＤＥ−Ｂ １００ピコモルの５′末端をリン酸化する
ことにより作成した。ハイブリダイゼーション後、室温
で過剰の６ＸＳＳＣで１回当り５分間ずつ、ついで５２
℃で過剰の６ｘＳＳＣで１回当り２０分間ずつそれぞれ
２回洗浄した。フィルターを空気乾燥し、クアンタ（Ｑ
ｕａｎｔａ）ｎｌ（商標）増感紙（テュポン（ＤｕＰｏ
ｎＬ）、インスツルメント・プロダクツ（Ｉ ｎｓｔｒ
ｕｇｚｅｎｔ Ｐ ｒｏｄｕｃｔｓ）、バイオメジカル
・デイビジョン（Ｂ ｉｏｎ＋ｅｄｉｃａｌ Ｄ １ｖ
ｉｓｉｏｎ）、ニュータウ７ （Ｎ ｅｉｎ、ｏｗｎ）
、ＣＮ０６４７０）で−７０℃で２時間オートラジオグ
ラフィーを行った。
フィルターへ結合したファージＤＮＡによって放射能標
識オリゴマーが結合するために、５ＴＮＤＥ−Ｂ配列と
相補的な配列を含んだ所望の突然変異体がフィルムに感
光した。実質上実施例２Ｂ記載の方法によって作成した
そのＲＦＤＮＡのｆｔｌ１限酵素分析により、正確な突
然変異体を同定し、ファージｍ０Ｗ３８１と命名した。
識オリゴマーが結合するために、５ＴＮＤＥ−Ｂ配列と
相補的な配列を含んだ所望の突然変異体がフィルムに感
光した。実質上実施例２Ｂ記載の方法によって作成した
そのＲＦＤＮＡのｆｔｌ１限酵素分析により、正確な突
然変異体を同定し、ファージｍ０Ｗ３８１と命名した。
Ｅ、プラスミドｐＯＷ３８０の最終組立てファージ■０
Ｗ３８１のＲＦ ＤＮＡはＥ、コリ発現プラスミドｐ
ｏｗ３８２の組立てに利用するＮｄｅｌ −Ｂａ＋ｍＨ
Ｉ制限酵素断片上にＤＡＯＣＳ暗号配列を含んでいるが
、断片を単離するのに十分量のｍ０Ｗ３８１複製盟を蓄
積することが困難な場合がある。Ｅ、コリ発現プラスミ
ドｐＯＷ３８２の組立てを容易にするｌ；め中間体プラ
スミドｐ。
Ｗ３８１のＲＦ ＤＮＡはＥ、コリ発現プラスミドｐ
ｏｗ３８２の組立てに利用するＮｄｅｌ −Ｂａ＋ｍＨ
Ｉ制限酵素断片上にＤＡＯＣＳ暗号配列を含んでいるが
、断片を単離するのに十分量のｍ０Ｗ３８１複製盟を蓄
積することが困難な場合がある。Ｅ、コリ発現プラスミ
ドｐＯＷ３８２の組立てを容易にするｌ；め中間体プラ
スミドｐ。
Ｗ２Ｂ５を組立てた。
実質上、実施例２Ｂ記載の方法によってファージ＋ｍ０
Ｗ３８１に感染させたＥ、コリに１２℃Ｍ１０９から複
製型ＤＮＡを単離した。７ア一ジｍ。
Ｗ３８１に感染させたＥ、コリに１２℃Ｍ１０９から複
製型ＤＮＡを単離した。７ア一ジｍ。
Ｗ２Ｂ５ ＤＮＡのＲＦ ＤＮＡ約ｌＯμりを、該Ｄ
ＮＡのｌＸＢａｍＨＩ緩衝液溶液を含んだ反応で制限酵
素ＢａｍＨＩ（〜ｌＯ単位）により消化した。
ＮＡのｌＸＢａｍＨＩ緩衝液溶液を含んだ反応で制限酵
素ＢａｍＨＩ（〜ｌＯ単位）により消化した。
３７℃で〜９０分間インキュベーション後、反応混合物
をアガロ−・スゲルミ気泳動に掛け、実質上、実施例２
Ａにしたがい〜３ｋｂ ＢａｔａＨＩ断片を単離した
。
をアガロ−・スゲルミ気泳動に掛け、実質上、実施例２
Ａにしたがい〜３ｋｂ ＢａｔａＨＩ断片を単離した
。
ＢａｍＨＩで消化したプラスミドｐＵＣ８ＤＮＡを実質
上実施例２Ｂにしたがい作成した（プラスミドｐＵｃ８
ＤＮＡはＢＲＬから入手可能である）。
上実施例２Ｂにしたがい作成した（プラスミドｐＵｃ８
ＤＮＡはＢＲＬから入手可能である）。
ファージ１ＩＩＯＷ３８１から単離した一３ｋｂ Ｂ
ａＩＩＨ１断片ＤＮＡ５ｐＱＣ〜ｌＰｇ）とＢａｍＨＩ
で消化したプラスミドｐＵＣ８ＤＮＡ Ｉ ／ＪＱ（
−１００ｎｇ）とを、実質上、実施例２Ｂにしたがいラ
イグー・ンコンしに。ライゲーションしＩこＤＮＡは他
のライゲーション生産物と一緒に所望のプラスミドｐＯ
Ｗ３８１を構成した。シラスミドｐＯＷ３８１は、ＤＡ
ＯＣＳ暗号配列のほぼ最初のコドン位置にある付加した
Ｎｄｅｌ＃限酵素認識配列の存在を除けば、プラスミド
ｐＯＷ３８０と同一の制限酵素部位地図を有する。
ａＩＩＨ１断片ＤＮＡ５ｐＱＣ〜ｌＰｇ）とＢａｍＨＩ
で消化したプラスミドｐＵＣ８ＤＮＡ Ｉ ／ＪＱ（
−１００ｎｇ）とを、実質上、実施例２Ｂにしたがいラ
イグー・ンコンしに。ライゲーションしＩこＤＮＡは他
のライゲーション生産物と一緒に所望のプラスミドｐＯ
Ｗ３８１を構成した。シラスミドｐＯＷ３８１は、ＤＡ
ＯＣＳ暗号配列のほぼ最初のコドン位置にある付加した
Ｎｄｅｌ＃限酵素認識配列の存在を除けば、プラスミド
ｐＯＷ３８０と同一の制限酵素部位地図を有する。
所望のプラスミドｐＯＷ３８１を構成しているライゲー
ジ３ン反応物を、コンピテントなＥ、コリＫ１２ Ｒ
Ｒ１ΔＭ１５（ＮＲＲＬ Ｂ−１５４４０）（寄託臼
、１９８３年５月２７日）へ導入した。アンピシリン（
１００μｇ／酎）、Ｘ〜ガル（４０μｇ／寵Ｑ）および
ＩＰＴＧ（０，１Ｍ）を含有するし一寒天平板へ形質転
換混合物の一部を接種した。
ジ３ン反応物を、コンピテントなＥ、コリＫ１２ Ｒ
Ｒ１ΔＭ１５（ＮＲＲＬ Ｂ−１５４４０）（寄託臼
、１９８３年５月２７日）へ導入した。アンピシリン（
１００μｇ／酎）、Ｘ〜ガル（４０μｇ／寵Ｑ）および
ＩＰＴＧ（０，１Ｍ）を含有するし一寒天平板へ形質転
換混合物の一部を接種した。
平板を３７℃で〜１８時間インキュベートした。
白色のコロニーカラーを示すアンピシリン耐性形質転換
体（プラスミドｐＵｃ８に暗号化されているβ−ガラク
トシダーゼのα−断片の挿入による失活のため）を、そ
のプラスミドＤＮＡの制限酵素分析によってざらにスク
リーニングし、所望のプラスミドｐＯＷ３８１形質転換
体を同定した。フｒ−ジＭ１３に感染させたＥ、コリＫ
１２ ＪＭＩＯ９細胞ベレットからＲＦ ＤＮＡを
作成した前記バーンボイムおよびドリーの方法に実質上
したがい、３＋ｄ培養からプラスミドＤＮＡを作成した
。
体（プラスミドｐＵｃ８に暗号化されているβ−ガラク
トシダーゼのα−断片の挿入による失活のため）を、そ
のプラスミドＤＮＡの制限酵素分析によってざらにスク
リーニングし、所望のプラスミドｐＯＷ３８１形質転換
体を同定した。フｒ−ジＭ１３に感染させたＥ、コリＫ
１２ ＪＭＩＯ９細胞ベレットからＲＦ ＤＮＡを
作成した前記バーンボイムおよびドリーの方法に実質上
したがい、３＋ｄ培養からプラスミドＤＮＡを作成した
。
以下の組立てに使用のため、実施例１記載の方法に実質
上したがい、１個の形質転換体からプラスミドｐＯＷ３
８１ ＤＮＡを作成した。
上したがい、１個の形質転換体からプラスミドｐＯＷ３
８１ ＤＮＡを作成した。
実施例３ プラスミドｐＯＷ３８２の組立てプラスミド
ｐｏｗ３Ｂ２は、ストレプトマイセス・クラブリゲルス
・エキスパンダーゼ（ＤＡＯＣＳ）の暗号配列を含んで
いるプラスミドｐＯＷ３８１からの〜２．４ｋｂ Ｎ
ｄｅｌ −Ｂａｎ＋ＨＩ制限酵素断片と、プラスミドｐ
ＣＺＲ３３６からの〜５゜８ｋｂ ＮｄｅＩ−Ｂａ１
１１）（Ｉ制限酵素断片とを互し・にライゲーションす
ることによって組み立てることができる。ｐＣＺＲ３３
６からの−５，８ｋｂ ＮｄｅＩ−ＢａｍＨＩ制限酵
素断片は、λｐＬ、プロモーター、翻訳活性化配列、ｃ
Ｉ８５７リプレツサープラスミド複製の開始点、および
テトラサイクリン耐性を付与する遺伝子を暗号化してい
るＤＮＡ配列を含んでいる。またプラスミドｐＣＺＲ３
６６はヒト成長ホルモンのための暗号配列を含んでいる
。プラスミドｐｃＺＲ３３６の〜５．８ｋｂ Ｎｄｅ
ｒ−Ｂａｎ＋ＨＩ制限酵素断片は本実施例Ａに記載のよ
うに組立てることができる。添付図面第２図にプラスミ
ドｐｃＺＲ３３６の制限酵素部位および機能地図を示す
。
ｐｏｗ３Ｂ２は、ストレプトマイセス・クラブリゲルス
・エキスパンダーゼ（ＤＡＯＣＳ）の暗号配列を含んで
いるプラスミドｐＯＷ３８１からの〜２．４ｋｂ Ｎ
ｄｅｌ −Ｂａｎ＋ＨＩ制限酵素断片と、プラスミドｐ
ＣＺＲ３３６からの〜５゜８ｋｂ ＮｄｅＩ−Ｂａ１
１１）（Ｉ制限酵素断片とを互し・にライゲーションす
ることによって組み立てることができる。ｐＣＺＲ３３
６からの−５，８ｋｂ ＮｄｅＩ−ＢａｍＨＩ制限酵
素断片は、λｐＬ、プロモーター、翻訳活性化配列、ｃ
Ｉ８５７リプレツサープラスミド複製の開始点、および
テトラサイクリン耐性を付与する遺伝子を暗号化してい
るＤＮＡ配列を含んでいる。またプラスミドｐＣＺＲ３
６６はヒト成長ホルモンのための暗号配列を含んでいる
。プラスミドｐｃＺＲ３３６の〜５．８ｋｂ Ｎｄｅ
ｒ−Ｂａｎ＋ＨＩ制限酵素断片は本実施例Ａに記載のよ
うに組立てることができる。添付図面第２図にプラスミ
ドｐｃＺＲ３３６の制限酵素部位および機能地図を示す
。
プラスミドｐｃ Ｚ Ｒ３６６の〜５．８ｋｂ Ｎｄ
ｅＩ−ＢａＩＩＩＨＩ制限酵素断片にあるＤＮＡの大部
分は、プラスミドｐｃＺＲ１１１から−５，７５ｋｂ
ＸｂａＩ−ＢａｍＨＩ制限酵素断片上に単離できる。
ｅＩ−ＢａＩＩＩＨＩ制限酵素断片にあるＤＮＡの大部
分は、プラスミドｐｃＺＲ１１１から−５，７５ｋｂ
ＸｂａＩ−ＢａｍＨＩ制限酵素断片上に単離できる。
添付図面第４図にプラスミドｐｃＺＲ１１１の制限酵素
部位および機能地図を示す。プラスミドｐＣＺＲ１ｌｌ
は受託番号ＮＲＲＬ Ｂ−１８２４９のちとにＮＲＲ
Ｌから入手可能なＥ、コリに１２ＲＶ３０８／ｐＣＺＲ
１１１（寄託臼、１９８７年８月１１日）から得ること
ができる。プラスミドｐＣＺＲＩＩＩはＩＯμｇ／ａ＋
１テトラサイクリンに対する耐性を付与し、Ｃ１ａＩ制
限酵素部位を欠いている。
部位および機能地図を示す。プラスミドｐＣＺＲ１ｌｌ
は受託番号ＮＲＲＬ Ｂ−１８２４９のちとにＮＲＲ
Ｌから入手可能なＥ、コリに１２ＲＶ３０８／ｐＣＺＲ
１１１（寄託臼、１９８７年８月１１日）から得ること
ができる。プラスミドｐＣＺＲＩＩＩはＩＯμｇ／ａ＋
１テトラサイクリンに対する耐性を付与し、Ｃ１ａＩ制
限酵素部位を欠いている。
またプラスミドｐｃＺＲ１１１をＸｂａＩおよびＢａｎ
＋ＨＩ酵素で消化し、大きいＸｂａｌ −Ｂａ＋＊ＨＩ
断片をアガロースゲルから精製する。ホスホトリエステ
ル法によって合成した２末鎖ＸｂａＩ −Ｎｄｅ■制限
酵素断片と、このグラスミドｐｃＺＲ１１１のＸｂａｌ
−ＢａｍＨＩ制限酵素断片とを互いにライゲージ３ンし
てシラスミドｐｃ Ｚ Ｒ３３６の〜５．８ｋｂ Ｎｄ
ｅ［−Ｂａｎ＋ＨＩ制限酵素断片を得る（第２図）。こ
の２本鎖ＤＮＡ断片は下記の配列：を有する。
＋ＨＩ酵素で消化し、大きいＸｂａｌ −Ｂａ＋＊ＨＩ
断片をアガロースゲルから精製する。ホスホトリエステ
ル法によって合成した２末鎖ＸｂａＩ −Ｎｄｅ■制限
酵素断片と、このグラスミドｐｃＺＲ１１１のＸｂａｌ
−ＢａｍＨＩ制限酵素断片とを互いにライゲージ３ンし
てシラスミドｐｃ Ｚ Ｒ３３６の〜５．８ｋｂ Ｎｄ
ｅ［−Ｂａｎ＋ＨＩ制限酵素断片を得る（第２図）。こ
の２本鎖ＤＮＡ断片は下記の配列：を有する。
プラスミドｐＯＷ３８１ ＤＮＡの約２５μｍ（０゜Ｉ
ＸＴＥ緩衝液２５μｍ溶液）を１０ＸＮｄｅｌ緩衝液
（１００＋ｉＭトリスＨＣＩ（ｐＨ７，８）、７０＋ａ
ＭＭｇＣＩｇ、１．５ｍＭ ＮａＣ１）４μｌ、Ｈ２
Ｏ６７１１と制限酵素Ｎｄｅ１３μＩおよび制限酵素Ｂ
ａｍＨＩ３μｌへ添加し、混合しＩ；。得られＩ；反応
混合物を３７℃で２時間インキニーベートし、引き統い
てアガロースゲル電気泳動にかける。〜２ 、４ ｋｂ
Ｎｄｅ Ｉ −ＢａｍＨＩ断片をアガロースゲルから単
離し、ライゲージジンのために調製する。
ＸＴＥ緩衝液２５μｍ溶液）を１０ＸＮｄｅｌ緩衝液
（１００＋ｉＭトリスＨＣＩ（ｐＨ７，８）、７０＋ａ
ＭＭｇＣＩｇ、１．５ｍＭ ＮａＣ１）４μｌ、Ｈ２
Ｏ６７１１と制限酵素Ｎｄｅ１３μＩおよび制限酵素Ｂ
ａｍＨＩ３μｌへ添加し、混合しＩ；。得られＩ；反応
混合物を３７℃で２時間インキニーベートし、引き統い
てアガロースゲル電気泳動にかける。〜２ 、４ ｋｂ
Ｎｄｅ Ｉ −ＢａｍＨＩ断片をアガロースゲルから単
離し、ライゲージジンのために調製する。
プラスミドｐＣＺＲ３３６ＤＮＡの〜５．８ｋｂＮｄｅ
ｆ −ＢａｍＨＩ １１１＠酵素断片約１ｐｌ（０，
５ｐｇ）とｐＯＷ３８１から単離した−２．４ｋｂ Ｎ
ｄｅＩ −ＢａｍＨＩ制限酵素断片４．ｕｌ（〜０．ｌ
ｐｇ）とを実質上、実施例２に記載の方法によりライゲ
ージ鱈ンした。ライゲーションしたＤＮＡは所望のプラ
スミドｐＯＷ３８２を構成している。添付図面第３図に
プラスミドｐＯＷ３８２の制限酵素部位および機能地図
を示す。製造業者の指示にしたがい、上記のライゲーシ
ョン反応物をコンピテントなＥ。
ｆ −ＢａｍＨＩ １１１＠酵素断片約１ｐｌ（０，
５ｐｇ）とｐＯＷ３８１から単離した−２．４ｋｂ Ｎ
ｄｅＩ −ＢａｍＨＩ制限酵素断片４．ｕｌ（〜０．ｌ
ｐｇ）とを実質上、実施例２に記載の方法によりライゲ
ージ鱈ンした。ライゲーションしたＤＮＡは所望のプラ
スミドｐＯＷ３８２を構成している。添付図面第３図に
プラスミドｐＯＷ３８２の制限酵素部位および機能地図
を示す。製造業者の指示にしたがい、上記のライゲーシ
ョン反応物をコンピテントなＥ。
コリに１２ ＪＭ１０９細胞（ストラタジーン社）へ
導入した。形質転換混合物をテトラサイクリン（１０μ
ｇ／ｍ＋）を含有するＴＹ寒天平板へ接種し、ラムダｐ
Ｌプロモーターによる転写を防止するため、平板を２５
℃〜３０℃でインキュベートした。
導入した。形質転換混合物をテトラサイクリン（１０μ
ｇ／ｍ＋）を含有するＴＹ寒天平板へ接種し、ラムダｐ
Ｌプロモーターによる転写を防止するため、平板を２５
℃〜３０℃でインキュベートした。
所望の形質転換体をテトラサイクリン耐性表現型および
そのプラスミドＤＮＡの制限酵素分析によって同定した
。
そのプラスミドＤＮＡの制限酵素分析によって同定した
。
る。誘導後、遠心によって細胞を回収いＥ、コリ産生Ｄ
ＡＯＣＳ活性の好ましい供給源として使用した。
ＡＯＣＳ活性の好ましい供給源として使用した。
回旋様とう機（２５０ｒｐｍ）中、Ｅ、コリに１２℃Ｍ
１０９／ｐＯＷ３８２形質転換体をＬブロス（テトラサ
イクリンｌＯμｇ／ｍｌを含有）５００■１中で３０″
Ｃで１夜培養した。１夜培養物１０ｍ１を２゜８リツト
ルフラスコで新たに調製したテトラサイクリンｌＯμｇ
／ｍｌ含有培地９９０■１に加えることによって１００
倍に希釈し、前記と同一条件下で３０℃でさらに１時間
インキュベートした。ついで回旋様とう機の温度を４２
℃に上げ、さらに６．５時間インキュベートを続けた。
１０９／ｐＯＷ３８２形質転換体をＬブロス（テトラサ
イクリンｌＯμｇ／ｍｌを含有）５００■１中で３０″
Ｃで１夜培養した。１夜培養物１０ｍ１を２゜８リツト
ルフラスコで新たに調製したテトラサイクリンｌＯμｇ
／ｍｌ含有培地９９０■１に加えることによって１００
倍に希釈し、前記と同一条件下で３０℃でさらに１時間
インキュベートした。ついで回旋様とう機の温度を４２
℃に上げ、さらに６．５時間インキュベートを続けた。
プラスミドｐｏｗ３８２のＤＡＯＣＳ暗号配列を発現さ
せるため配置されたラムダｐＬプロモーターのｃＩ８５
７温度感受性リプレッサーは４２℃で失活するため、宿
主細胞内でのＤＡＯＣ３の発現は４２℃で起こ４２℃で
６時間誘導後、遠心によってＥ、コリ培養２５０ｍ１を
回収し、細胞ペレットをＡ液３゜ｍｌ（１５ｍＭ トリ
ス−ＭＣＩ（ｐＨ７−５）、ｌＯ％エタノーノ呟 １０
％グリセリンおよびｌＯｍＭＤＴＴ）＋１Ｍ ＫＣｔで
洗浄した。ＫＣＩを含有しないＡ液３０１１１で細胞を
もう１度洗浄し、ついで細胞をＡ液７ｍｌ＋ｌＯ■Ｍア
スコルビン酸に再浮遊させた。４℃以下の温度で３０秒
間ずつ全力でバーストする音波処理を３回行い細胞を破
壊した。音波処理の間、フェニルメチルスルホニルフル
オリド（ＰＭＳＦ）を最終濃度２ｍＭとなるまで少量ず
つ分けて添加した。ＤＮＡ分解酵素および硫酸マグネシ
ウムをそれぞれｌμｇ／ｍｌおよび２ｍＭ濃度となるま
で添加した。音波処理をした浮遊液を４０．０００Ｘｇ
で３０分間遠心した。ＤＡＯＣ３酵素の粗製抽出物は上
清に含まれていた。
せるため配置されたラムダｐＬプロモーターのｃＩ８５
７温度感受性リプレッサーは４２℃で失活するため、宿
主細胞内でのＤＡＯＣ３の発現は４２℃で起こ４２℃で
６時間誘導後、遠心によってＥ、コリ培養２５０ｍ１を
回収し、細胞ペレットをＡ液３゜ｍｌ（１５ｍＭ トリ
ス−ＭＣＩ（ｐＨ７−５）、ｌＯ％エタノーノ呟 １０
％グリセリンおよびｌＯｍＭＤＴＴ）＋１Ｍ ＫＣｔで
洗浄した。ＫＣＩを含有しないＡ液３０１１１で細胞を
もう１度洗浄し、ついで細胞をＡ液７ｍｌ＋ｌＯ■Ｍア
スコルビン酸に再浮遊させた。４℃以下の温度で３０秒
間ずつ全力でバーストする音波処理を３回行い細胞を破
壊した。音波処理の間、フェニルメチルスルホニルフル
オリド（ＰＭＳＦ）を最終濃度２ｍＭとなるまで少量ず
つ分けて添加した。ＤＮＡ分解酵素および硫酸マグネシ
ウムをそれぞれｌμｇ／ｍｌおよび２ｍＭ濃度となるま
で添加した。音波処理をした浮遊液を４０．０００Ｘｇ
で３０分間遠心した。ＤＡＯＣ３酵素の粗製抽出物は上
清に含まれていた。
ＨＰＬＣに基づいた検定を用いてＤＡＯＣ３活性を測定
した。エキスパンダーゼの触媒反応は、５０−Ｍトリス
−ＭＣＩ（ｐＨ７，５）１耐中、０．２８■Ｍペニシリ
ンＮ、０．６０−Ｍａ−ケトグルタレート（ｒ−ＫＧ）
、０．０６ｍＭ第１硫酸鉄、０゜６７ｍＭアスコルベー
ト、１．００ｍＭジチオトレイトール、０．０５■Ｍ
ＡＴＰおよび酵素０．０００３〜０．００３単位で３０
℃で１５分間行った。
した。エキスパンダーゼの触媒反応は、５０−Ｍトリス
−ＭＣＩ（ｐＨ７，５）１耐中、０．２８■Ｍペニシリ
ンＮ、０．６０−Ｍａ−ケトグルタレート（ｒ−ＫＧ）
、０．０６ｍＭ第１硫酸鉄、０゜６７ｍＭアスコルベー
ト、１．００ｍＭジチオトレイトール、０．０５■Ｍ
ＡＴＰおよび酵素０．０００３〜０．００３単位で３０
℃で１５分間行った。
エチルアルコール１ｍｌの添加により酵素反応を停止し
た。４００００Ｘｇで５分間遠心により沈澱を分離した
。酵素反応生産物を含有している上溝をＨＰＬＣによっ
て下記のように検定した。エキスパンダーゼ活性はペニ
シリンＮからのＤＡＯＣＳの生成をモニターすることに
より測定した。
た。４００００Ｘｇで５分間遠心により沈澱を分離した
。酵素反応生産物を含有している上溝をＨＰＬＣによっ
て下記のように検定した。エキスパンダーゼ活性はペニ
シリンＮからのＤＡＯＣＳの生成をモニターすることに
より測定した。
外部標準を使用するＨＰＬＣにより上溝液試料（２０〜
１００μｌ）のＤＡＯＣ３を検定した。検定はエキスパ
ンダーゼ触媒反応を２回反復する分析により２％偏差で
再現性を示した。検定結果を下記の表にまとめて示す。
１００μｌ）のＤＡＯＣ３を検定した。検定はエキスパ
ンダーゼ触媒反応を２回反復する分析により２％偏差で
再現性を示した。検定結果を下記の表にまとめて示す。
粗製抽出物 ０．００４ ０．０００２３
組換えＥ、コリ 粗製抽出物 ０．００９ ０顆粒調１１品
０．０５２ａＯ ａエキスパンダーゼ活性の回収率は最適化されなかった
。
組換えＥ、コリ 粗製抽出物 ０．００９ ０顆粒調１１品
０．０５２ａＯ ａエキスパンダーゼ活性の回収率は最適化されなかった
。
実施例５ プラスミドｐｐ Ｓ ６５の組立てこの実施
例では、本発明のＤＡＯＣ３暗号配列を発現させるため
に配置したペニシリウムｒＰＮＳ遺伝子プロモーターを
含んでいる本発明のＤＡＯＣＳ発現ベクター、プラスミ
ドｐＰＳ６５の組立て方法を説明する。ペニシリウムＩ
ＰＮＳ遺伝子のブロモ−ターは、プラスミドｐｐ Ｓ
６０から単離できる。添付図面第８図にプラスミドｐＰ
Ｓ６０の制限酵素部位および機能地図を示す。
例では、本発明のＤＡＯＣ３暗号配列を発現させるため
に配置したペニシリウムｒＰＮＳ遺伝子プロモーターを
含んでいる本発明のＤＡＯＣＳ発現ベクター、プラスミ
ドｐＰＳ６５の組立て方法を説明する。ペニシリウムＩ
ＰＮＳ遺伝子のブロモ−ターは、プラスミドｐｐ Ｓ
６０から単離できる。添付図面第８図にプラスミドｐＰ
Ｓ６０の制限酵素部位および機能地図を示す。
Ａ、中間体プラスミドｐＰＳ６３およびｐＰＳ６４の組
立て プラスミドｐｐ Ｓ ６０を制限酵素ＮｄｅＩおよびＢ
ａｍＨＩで消化して得られた２つのＮｄｅＩ −Ｂａｍ
Ｈ１制限酵素断片の大きい方をアガロースゲルから単離
し、ライゲーション用に調製した。同様にして、プラス
ミドｐＯＷ３ｇ２（実施例３）を制限酵素Ｎｄｅｌおよ
びＢａｍＨＩで消化して得られた２つのＮｄａ Ｉ −
ＢａｍＨＩ制限酵素断片のＤＡＯＣＳを暗号化している
小さい方をアガロースゲルから単離し、ライゲーション
用に調製した。
立て プラスミドｐｐ Ｓ ６０を制限酵素ＮｄｅＩおよびＢ
ａｍＨＩで消化して得られた２つのＮｄｅＩ −Ｂａｍ
Ｈ１制限酵素断片の大きい方をアガロースゲルから単離
し、ライゲーション用に調製した。同様にして、プラス
ミドｐＯＷ３ｇ２（実施例３）を制限酵素Ｎｄｅｌおよ
びＢａｍＨＩで消化して得られた２つのＮｄａ Ｉ −
ＢａｍＨＩ制限酵素断片のＤＡＯＣＳを暗号化している
小さい方をアガロースゲルから単離し、ライゲーション
用に調製した。
ついで単離したプラスミドｐｐｓａｏのＮｄｅＩ−Ｂａ
ｍＨＩ制限酵素断片をプラスミドｐＯＷ３８２のＤＡＯ
ＣＳを暗号化しているＮｄｅＩ −ＢａｍＨ■制限酵素
断片とライゲーションして、プラスミドｐＰＳ６３を作
成した。添付図面第９図にプラスミドｐｉ＞ ５６３の
制限酵素部位および機能地図を示す、プラスミドｐｐ
Ｓ ６３は、ＤＡＯＣＳ暗号配列を発現させるために配
置されたペニシリウムＩＰＮＳ遺伝子のプロモーターを
含んでいるが、プロモーターの３°末端とＤＡＯＣＳ暗
号配列の５°末端との間隔は最適ではない。
ｍＨＩ制限酵素断片をプラスミドｐＯＷ３８２のＤＡＯ
ＣＳを暗号化しているＮｄｅＩ −ＢａｍＨ■制限酵素
断片とライゲーションして、プラスミドｐＰＳ６３を作
成した。添付図面第９図にプラスミドｐｉ＞ ５６３の
制限酵素部位および機能地図を示す、プラスミドｐｐ
Ｓ ６３は、ＤＡＯＣＳ暗号配列を発現させるために配
置されたペニシリウムＩＰＮＳ遺伝子のプロモーターを
含んでいるが、プロモーターの３°末端とＤＡＯＣＳ暗
号配列の５°末端との間隔は最適ではない。
−層最適な間隔を得るため、プラスミドｐＰＳ６３を制
限酵素ＸｂａｌおよびＮｄｅＩで消化し、得られたＮｄ
ｅ Ｉ −Ｘｂａ Ｉ消化プラスミドｐＰＳ６３ＤＮＡ
を下記のリンカ−と混合し、ライゲージコンすることが
できる。このリンカ−は下記の構造：を有する。
限酵素ＸｂａｌおよびＮｄｅＩで消化し、得られたＮｄ
ｅ Ｉ −Ｘｂａ Ｉ消化プラスミドｐＰＳ６３ＤＮＡ
を下記のリンカ−と混合し、ライゲージコンすることが
できる。このリンカ−は下記の構造：を有する。
ライゲーションしたＤＮＡは、ペニシリウム・プロモー
ターの３′末端とプラスミドｐＰＳ６３のＤＡＯＣ３暗
号配列の５″末端との間に位置している短いＸｂａｌ−
ＸｂａＩおよびＸｂａｌ−Ｎｄｅｌ制限酵素断片が上記
のリンカ−配列で置換されたプラスミドを含んでいる。
ターの３′末端とプラスミドｐＰＳ６３のＤＡＯＣ３暗
号配列の５″末端との間に位置している短いＸｂａｌ−
ＸｂａＩおよびＸｂａｌ−Ｎｄｅｌ制限酵素断片が上記
のリンカ−配列で置換されたプラスミドを含んでいる。
制限酵素分析およびＤＮＡ配列決定によってそのような
プラスミドの一つを同定し、プラスミドｐＰＳ６４と命
名した。ＤＮＡ配列決定の結果から１個以上のリンカ−
が挿入されていることが判明したので、プラスミドのＸ
ｂａＩ消化および再うイゲーシッンを行い、余分なリン
カ−を除去した。添付図面第１０図にプラスミドｐＰＳ
６４の制限酵素部位および機能地図を示す。
プラスミドの一つを同定し、プラスミドｐＰＳ６４と命
名した。ＤＮＡ配列決定の結果から１個以上のリンカ−
が挿入されていることが判明したので、プラスミドのＸ
ｂａＩ消化および再うイゲーシッンを行い、余分なリン
カ−を除去した。添付図面第１０図にプラスミドｐＰＳ
６４の制限酵素部位および機能地図を示す。
プラスミドｐＰ Ｓ ６４を使用して、ペニシリウム宿
主細胞内でＤＡＯＣＳ活性を発現させることができる。
主細胞内でＤＡＯＣＳ活性を発現させることができる。
ただしプラスミドｐＰＳ６４は選択可能なマーカーを含
んでいないが、以下に説明するように修飾して選択可能
なマーカーを容易に挿入することができる。アスペルギ
ルス・ニズランスのａＩｌｄ Ｓ遺伝子は本発明のペニ
シリウム・ベクターのための好ましい選択マーカーであ
り、以下に記載するようにプラスミドｐＰＳ５１から単
離することができる。
んでいないが、以下に説明するように修飾して選択可能
なマーカーを容易に挿入することができる。アスペルギ
ルス・ニズランスのａＩｌｄ Ｓ遺伝子は本発明のペニ
シリウム・ベクターのための好ましい選択マーカーであ
り、以下に記載するようにプラスミドｐＰＳ５１から単
離することができる。
Ｂ、（ｉ）プラスミドｐＰＳ５１の組立てプラスミドｐ
ＭＬＣ１２ＤＮＡ（第１１図、ＮＲＲＬ Ｂ−１８０
９７Ｘ寄託日、１９８６年８月８日）約１５ｐｇを１０
ＸＥｃｏＲＩ緩衝液５μ！および水４０μｌに溶解した
。制限酵素ＥｃｏＲＩ約５μｌ（〜５０単位）をＤＮＡ
溶液に添加し、得られた反応混合物を３７℃で３分間イ
ンキュベートして部分消化を行った。緩衝液で飽和した
フェノールで抽出することにより反応を停止し、ついで
クロロホルムで抽出した。プラスミドｐＭＬＣ１２は２
つのＥｃｏＲＩＩｌｌｌ酵素部位を含んでいる。
ＭＬＣ１２ＤＮＡ（第１１図、ＮＲＲＬ Ｂ−１８０
９７Ｘ寄託日、１９８６年８月８日）約１５ｐｇを１０
ＸＥｃｏＲＩ緩衝液５μ！および水４０μｌに溶解した
。制限酵素ＥｃｏＲＩ約５μｌ（〜５０単位）をＤＮＡ
溶液に添加し、得られた反応混合物を３７℃で３分間イ
ンキュベートして部分消化を行った。緩衝液で飽和した
フェノールで抽出することにより反応を停止し、ついで
クロロホルムで抽出した。プラスミドｐＭＬＣ１２は２
つのＥｃｏＲＩＩｌｌｌ酵素部位を含んでいる。
ＥｃｏＲＩ部位の所望の部分切断は１ａｃＺｇ断片内で
起こるものであり、ＣＡＴ遺伝子内で起こるのではない
。このＥｃｏＲＩ−消化は〜２ 、７ ｋｂの完全鎖長
分子より短い断片を生産し、プラスミドｐＭＬＣ１２Ｄ
ＮＡ分子の切断されないもの、所望しない位置で切断さ
れたもの、所望の位置で切断されたもの、双方の位置で
ともに切断されたものからなる混合物を生産した。Ｅｃ
ｏＲＩ−消化プラスミドｐＭＬｃ１２ ＤＮＡを沈澱さ
せ、遠心によって採取し、ＴＥ緩衝液５０μｌに溶解し
、０゜８％調製用アガロースゲルに掛けた。完全鎖長の
直鎖状分子（即ち〜２ 、７ ｋｂ）を単離した。
起こるものであり、ＣＡＴ遺伝子内で起こるのではない
。このＥｃｏＲＩ−消化は〜２ 、７ ｋｂの完全鎖長
分子より短い断片を生産し、プラスミドｐＭＬＣ１２Ｄ
ＮＡ分子の切断されないもの、所望しない位置で切断さ
れたもの、所望の位置で切断されたもの、双方の位置で
ともに切断されたものからなる混合物を生産した。Ｅｃ
ｏＲＩ−消化プラスミドｐＭＬｃ１２ ＤＮＡを沈澱さ
せ、遠心によって採取し、ＴＥ緩衝液５０μｌに溶解し
、０゜８％調製用アガロースゲルに掛けた。完全鎖長の
直鎖状分子（即ち〜２ 、７ ｋｂ）を単離した。
部分的にＥｃｏＲＩ−消化したプラスミドｐＭＬＣＩ
２ＤＮＡを１０Ｘｓａｌｌ緩衝液５μｍおよび水４０μ
ｍに溶解した。ＥｃｏＲＩで直鎖にしたグラスミドｐＭ
ＬＣ１２ＤＮＡに制限酵素５ａｌＩ約５μｍ（〜５０単
位）を添加し、得られた反応混合物を３７℃で２時間イ
ンキュベートした。プラスミドｐＭＬｃ＋２にあるユニ
ークｒｊｓａｌＩ制限酵素部位はプラスミドｐＭＬｃ１
２の１ａｃＺａ断片内のＥｃｏＲＩ部位から２４塩基対
に位置している。
２ＤＮＡを１０Ｘｓａｌｌ緩衝液５μｍおよび水４０μ
ｍに溶解した。ＥｃｏＲＩで直鎖にしたグラスミドｐＭ
ＬＣ１２ＤＮＡに制限酵素５ａｌＩ約５μｍ（〜５０単
位）を添加し、得られた反応混合物を３７℃で２時間イ
ンキュベートした。プラスミドｐＭＬｃ＋２にあるユニ
ークｒｊｓａｌＩ制限酵素部位はプラスミドｐＭＬｃ１
２の１ａｃＺａ断片内のＥｃｏＲＩ部位から２４塩基対
に位置している。
したがって部分的にＥｃｏＲＩ−消化したプラスミドｐ
ＭＬｃ１２ＤＮＡの完全な５ａｌｔ消化により４つのＤ
ＮＡ断片、〜２ 、７ ｋｂ断片（所望の分子）、〜２
４ｂｐ鎖長の断片、〜０ 、６ ｋｂの断片および〜１
．９ｋｂの断片が生産された。これらのＤ Ｎ Ａ分子
を０．８％アガロースゲルでサイズ分画した。
ＭＬｃ１２ＤＮＡの完全な５ａｌｔ消化により４つのＤ
ＮＡ断片、〜２ 、７ ｋｂ断片（所望の分子）、〜２
４ｂｐ鎖長の断片、〜０ 、６ ｋｂの断片および〜１
．９ｋｂの断片が生産された。これらのＤ Ｎ Ａ分子
を０．８％アガロースゲルでサイズ分画した。
はぼ完全鎖長に近い〜２ 、７ ｋｂの直鎖状分子を単
離した。
離した。
アスペルギルス・ニズランスのアセトアミダーゼ遺伝子
はプラスミドｐ３ Ｓ Ｒ２の〜５．ＯｋｂのＥｃｏＲ
Ｉ −Ｓａｔ Ｉ制限酵素断片に単離できる。プラスミ
ドｐ３ｓＲ２（第１２図、ＮＲＲＬ Ｂ−１８１８２
Ｘ寄託ＥＴ１９８７年２月２６日）約１０ｐｇをｌ０Ｘ
ＥｃｏＲＩ緩衝液５μｌおよび水４０．ｕｌｌ：溶解し
た。制限酵素ＥｃｏＲＩ約５μｌ（〜５ｏ単位）をこの
ＤＮＡ溶液に添加し、得られた反応を３７００で２時間
インキュベートした。緩衝液で飽和したフェノールで抽
出することにより反応を停止し、ついでクロロホルムで
抽出した。ＥｃｏＲＩ−消化したｐ３ＳＲ２プラスミド
ＤＮＡを沈澱させ、遠心によって採取し、］ ＯＸ Ｓ
ａｔ Ｉ緩衝液５μｍおよび水４０μｍに浮遊させた。
はプラスミドｐ３ Ｓ Ｒ２の〜５．ＯｋｂのＥｃｏＲ
Ｉ −Ｓａｔ Ｉ制限酵素断片に単離できる。プラスミ
ドｐ３ｓＲ２（第１２図、ＮＲＲＬ Ｂ−１８１８２
Ｘ寄託ＥＴ１９８７年２月２６日）約１０ｐｇをｌ０Ｘ
ＥｃｏＲＩ緩衝液５μｌおよび水４０．ｕｌｌ：溶解し
た。制限酵素ＥｃｏＲＩ約５μｌ（〜５ｏ単位）をこの
ＤＮＡ溶液に添加し、得られた反応を３７００で２時間
インキュベートした。緩衝液で飽和したフェノールで抽
出することにより反応を停止し、ついでクロロホルムで
抽出した。ＥｃｏＲＩ−消化したｐ３ＳＲ２プラスミド
ＤＮＡを沈澱させ、遠心によって採取し、］ ＯＸ Ｓ
ａｔ Ｉ緩衝液５μｍおよび水４０μｍに浮遊させた。
制限酵素５ａｉｌ約５μＩ（〜５０単位）をＤＮＡ溶液
に添加し、得られた反応混合物を３７℃で２時間インキ
ュベートした。これらの消化によって生成した２つのＤ
ＮＡ断片を０．８％調製用アガロースゲルでサイズ分画
に掛けた。〜４ 、３ ｋｂの１断片はｐＢＲ３２２Ｄ
ＮＡを含んでおり、〜５．Ｏｋｂの他の１断片はアスペ
ルギルス・ニズランスに由来するアセトアミダーゼ（ａ
ｌｌｄ Ｓ ）を含んでいた。〜５．ＯｋｂのＥｃ。
に添加し、得られた反応混合物を３７℃で２時間インキ
ュベートした。これらの消化によって生成した２つのＤ
ＮＡ断片を０．８％調製用アガロースゲルでサイズ分画
に掛けた。〜４ 、３ ｋｂの１断片はｐＢＲ３２２Ｄ
ＮＡを含んでおり、〜５．Ｏｋｂの他の１断片はアスペ
ルギルス・ニズランスに由来するアセトアミダーゼ（ａ
ｌｌｄ Ｓ ）を含んでいた。〜５．ＯｋｂのＥｃ。
ＲＩ−３ａｌＩ断片を単離した。 〜５．ＯｋｂのＥｃ
。
。
ＲＩ−３ａｌｌ断片約３μｇを回収し、これを水５μｌ
に溶解した。
に溶解した。
ＥｃｏＲＩ −Ｓａｌ Ｉ−消化プラスミドｐＭＬｃ１
２ ＤＮＡｌ１１１を、ＩＯＸリガーゼ緩衝液２μｌ
。
２ ＤＮＡｌ１１１を、ＩＯＸリガーゼ緩衝液２μｌ
。
Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ２μ！および水１１／７１とと
もに〜５．Ｏｋｂプラスミドｐ３ｓＲ２ＥｃｏＲｌ−５
ａｌＩ制限酵素断片約４μｌへ添加した。得られたライ
ゲージ１ン反応混合物を１５℃で１夜インキユベートし
た。ライゲーションしたＤＮＡは所望のグラスミドｐＰ
３５１および他のライゲーション生産物を構成していた
。
もに〜５．Ｏｋｂプラスミドｐ３ｓＲ２ＥｃｏＲｌ−５
ａｌＩ制限酵素断片約４μｌへ添加した。得られたライ
ゲージ１ン反応混合物を１５℃で１夜インキユベートし
た。ライゲーションしたＤＮＡは所望のグラスミドｐＰ
３５１および他のライゲーション生産物を構成していた
。
このライゲーション混合物をＥ、コリＫ１２Ｃ６００（
ＡＴＣＣ３３５２５）の形質転換に使用した。形質転換
した細胞混合物の一部をクロラムフェニコール２５μｇ
／ｍｌ含有し一寒天平板に接種した。平板を３７℃でｌ
夜インキュベートした。挿入体を有するＥ、コリに１２
Ｃ６００／ｐＰＳ５１のようなプラスミドを含んだ
コロニーから挿入体を有しないＥ、コリＫ１２ Ｃ６
００／ｐＭＬＣ１２のようなプラスミドを含んだコロニ
ーを実質上エラカート（Ｅ ｃｋａｒｄｔ）の方法によ
って選別した。
ＡＴＣＣ３３５２５）の形質転換に使用した。形質転換
した細胞混合物の一部をクロラムフェニコール２５μｇ
／ｍｌ含有し一寒天平板に接種した。平板を３７℃でｌ
夜インキュベートした。挿入体を有するＥ、コリに１２
Ｃ６００／ｐＰＳ５１のようなプラスミドを含んだ
コロニーから挿入体を有しないＥ、コリＫ１２ Ｃ６
００／ｐＭＬＣ１２のようなプラスミドを含んだコロニ
ーを実質上エラカート（Ｅ ｃｋａｒｄｔ）の方法によ
って選別した。
挿入体を有するプラスミドを含んでいるコロニーを同定
した。このコロニーから得たプラスミドＤＮＡを、制限
酵素分析によってアスペルギルス・ニズランスａｍｄ
Ｓ遺伝子を含んだ〜５ 、 ＯｋｂのＥｃ。
した。このコロニーから得たプラスミドＤＮＡを、制限
酵素分析によってアスペルギルス・ニズランスａｍｄ
Ｓ遺伝子を含んだ〜５ 、 ＯｋｂのＥｃ。
Ｒ１−３ａｌｌ制限酵素断片の存在についてスクリニン
グし、所望のプラスミドｐＰＳ５１の正しい構造を有す
ることが判明した。添付図面第１３図にプラスミドｐｐ
ｓｓｔの制限酵素部位および機能地図を示す。
グし、所望のプラスミドｐＰＳ５１の正しい構造を有す
ることが判明した。添付図面第１３図にプラスミドｐｐ
ｓｓｔの制限酵素部位および機能地図を示す。
Ｂ、（ｉｉ）プラスミドｐＰ Ｓ ６５およびｐｐｓａ
ａの最終組立て ａｍｄ Ｓ遺伝子はプラスミドｐＰＳ５１の〜５．６５
ｋｂのＥｃｏＲｆ制限酵素断片上に単離できる。この〜
５．６５ｋｂ断片をプラスミドｐＰＳ６４の大きいＥｃ
ｏＲＩ制限酵素断片とライゲーションすることによって
所望のプラスミドｐＰ Ｓ ６５を作成できる。添付図
面第５図にプラスミドｐＰ Ｓ ６５の制限酵素部位お
よび機能地図を示す。
ａの最終組立て ａｍｄ Ｓ遺伝子はプラスミドｐＰＳ５１の〜５．６５
ｋｂのＥｃｏＲｆ制限酵素断片上に単離できる。この〜
５．６５ｋｂ断片をプラスミドｐＰＳ６４の大きいＥｃ
ｏＲＩ制限酵素断片とライゲーションすることによって
所望のプラスミドｐＰ Ｓ ６５を作成できる。添付図
面第５図にプラスミドｐＰ Ｓ ６５の制限酵素部位お
よび機能地図を示す。
ａｍｄ Ｓを含んでいるプラスミドｐＰＳ５１の〜５゜
６５ｋｂ ＥｃｏＲＩ制限酵素断片はグラスミドｐｐｓ
６４の大きいＥｃｏＲＩｊｔｉｌｌ限酵素断片といずれ
の方向にでもライゲーションし得るので、上記のライゲ
ーションにより本発明のプラスミドｐＰ Ｓ ６６をも
作成し得る。ａｍｄｓを含んだ〜５．６５ｋｂのＥｃｏ
ＲＩ制限酵素断片の方向が異なっている以外、プラスミ
ドｐＰＳ６６はグラスミドｐＰ Ｓ ６５と同じである
。
６５ｋｂ ＥｃｏＲＩ制限酵素断片はグラスミドｐｐｓ
６４の大きいＥｃｏＲＩｊｔｉｌｌ限酵素断片といずれ
の方向にでもライゲーションし得るので、上記のライゲ
ーションにより本発明のプラスミドｐＰ Ｓ ６６をも
作成し得る。ａｍｄｓを含んだ〜５．６５ｋｂのＥｃｏ
ＲＩ制限酵素断片の方向が異なっている以外、プラスミ
ドｐＰＳ６６はグラスミドｐＰ Ｓ ６５と同じである
。
ペニシリウムへプラスミドを導入する方法を実施例８で
説明する。プラスミドｐｐ Ｓ ６３、ｐＰＳ６４、ｐ
ＰＳ６５およびｐＰＳ６６はいずれもべ二ンリウムでＤ
ＡＯＣ３活性を発現させるのに使用できるが、後者の二
つだけがａｍｄｓ選択マーカーを有している。
説明する。プラスミドｐｐ Ｓ ６３、ｐＰＳ６４、ｐ
ＰＳ６５およびｐＰＳ６６はいずれもべ二ンリウムでＤ
ＡＯＣ３活性を発現させるのに使用できるが、後者の二
つだけがａｍｄｓ選択マーカーを有している。
ＤＡＯＣＳ暗号配列を発現させるのに任意のプロモータ
ーを使用することができるから、当業者はペニシリウム
ＩＰＮＳ遺伝子のプロモーターが本発明の詳細な説明に
過ぎないことを理解し得よう。プラスミドｐＰ Ｓ ６
７はアスペルギルス・ニズランスのａｍｄ Ｓ遺伝子の
プロモーターが、プロモーターの機能し得るペニシリウ
ム、アスペルギルスおよび任意の他の微生物でＤＡＯＣ
Ｓ遺伝子を発現するのに使用できることを例示している
。
ーを使用することができるから、当業者はペニシリウム
ＩＰＮＳ遺伝子のプロモーターが本発明の詳細な説明に
過ぎないことを理解し得よう。プラスミドｐＰ Ｓ ６
７はアスペルギルス・ニズランスのａｍｄ Ｓ遺伝子の
プロモーターが、プロモーターの機能し得るペニシリウ
ム、アスペルギルスおよび任意の他の微生物でＤＡＯＣ
Ｓ遺伝子を発現するのに使用できることを例示している
。
プラスミドｐＰＳ６７は、Ｎｄｅｌ−消化グラスミドｐ
ＯＷ３８２（７４５ｂｐ）を、ａｎ＋ｄｓプロモーター
を含んでいるプラスミドｐＰＳ５１の制限酵素断片およ
び下記のりシカｍ： とライゲージ目ンすることによって組立てられる。
ＯＷ３８２（７４５ｂｐ）を、ａｎ＋ｄｓプロモーター
を含んでいるプラスミドｐＰＳ５１の制限酵素断片およ
び下記のりシカｍ： とライゲージ目ンすることによって組立てられる。
添付図面第６図にプラスミドｐｐ Ｓ ６７の制限酵素
部位およびＩＩ！能地図を示す。
部位およびＩＩ！能地図を示す。
プラスミドｐＰＳ６７を修飾して、ペニシリウムおよび
アスペルギルス宿主細胞で用いられる選択可能なマーカ
ーを容易に含ませることができる。
アスペルギルス宿主細胞で用いられる選択可能なマーカ
ーを容易に含ませることができる。
即ち、プラスミドｐＰＳ６７を制限酵素ＥｃｏＲＩで消
化して、プラスミドｐＰＳ５１のａｍｄｓを含んだ〜５
．６５ｋｂのＥｃｏＲＩｆｌ！ｌｌ＠酵素断片とライゲ
ージ町ンすることによってプラスミドｐＰＳ７１および
プラスミドｐｐ Ｓ ７２を作成することができる。プ
ラスミドｐＰＳ７１およびｐＰ Ｓ ７２はともにａｌ
ｌｄ Ｓ遺伝子を含んでおり、事実上、〜５．６５ｋｂ
のａｍｄ Ｓを含んだＥｃｏＲＩ制限酵素断片の方向だ
けが異なっている。添付図面第１４図にプラスミドｐＰ
Ｓ７１の制限酵素部位および機能地図を示す。本発明の
ベクターでペニシリウムを形質転換する方法を実施例８
で説明する。
化して、プラスミドｐＰＳ５１のａｍｄｓを含んだ〜５
．６５ｋｂのＥｃｏＲＩｆｌ！ｌｌ＠酵素断片とライゲ
ージ町ンすることによってプラスミドｐＰＳ７１および
プラスミドｐｐ Ｓ ７２を作成することができる。プ
ラスミドｐＰＳ７１およびｐＰ Ｓ ７２はともにａｌ
ｌｄ Ｓ遺伝子を含んでおり、事実上、〜５．６５ｋｂ
のａｍｄ Ｓを含んだＥｃｏＲＩ制限酵素断片の方向だ
けが異なっている。添付図面第１４図にプラスミドｐＰ
Ｓ７１の制限酵素部位および機能地図を示す。本発明の
ベクターでペニシリウムを形質転換する方法を実施例８
で説明する。
実施例７ プラスミドｐＰＳ６９の組立て組換え蛋白質
の暗号配列を、その組換え蛋白質を生産するのに用いる
のと同一の種から誘導された調節要素の制御下に置くこ
とによって組換え蛋白質の発現水準を最適化することが
できる。これらの調節配列は、遺伝子の５′−非暗号領
域に存在しているプロモーターおよび遺伝子の３°−非
暗号領域に局在しているターミネータ−等である。
の暗号配列を、その組換え蛋白質を生産するのに用いる
のと同一の種から誘導された調節要素の制御下に置くこ
とによって組換え蛋白質の発現水準を最適化することが
できる。これらの調節配列は、遺伝子の５′−非暗号領
域に存在しているプロモーターおよび遺伝子の３°−非
暗号領域に局在しているターミネータ−等である。
プラスミドｐＰＳ６５で、ペニシリウムに好まし１、”
ＤＡＯＣＳ発現ベクターであるストレプトマイセス・ク
ラブリゲルスＤＡＯＣＳ遺伝子の暗号配列は、ペニシリ
ウムＩ ＰＮＳ遺伝子の５′−非暗号領域にある調節要
素だけの制御下にある。プラスミドｐＰＳ６９は、５″
および３°調節要素がともにペニシリウムＤＡＯＣＳ発
現ベクターに存在している本発明のベクターの例を示し
ている。
ＤＡＯＣＳ発現ベクターであるストレプトマイセス・ク
ラブリゲルスＤＡＯＣＳ遺伝子の暗号配列は、ペニシリ
ウムＩ ＰＮＳ遺伝子の５′−非暗号領域にある調節要
素だけの制御下にある。プラスミドｐＰＳ６９は、５″
および３°調節要素がともにペニシリウムＤＡＯＣＳ発
現ベクターに存在している本発明のベクターの例を示し
ている。
Ａ、中間体プラスミドｐＰ ３６８の組立てプラスミド
ｐＬＣ２をペニシリウムＩＰＮＳ遺伝子の３°調節領域
の供給源として使用することができる。Ｅ、コリＫ１２
ＪＭ１０９／ｐＬＣ２の凍結乾燥品は、ジ・アメリ
カン・タイプ・カルチャー１コレクシヨン（ｔｈｅ
Ａｍｅｒｉｃａｎ ＴｙｐｅＣｕｌｔｕｒｅＣｏｌｌ
ｅｃｔｉｏｎ）、ロックビル（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ）、
マリ−ランド（Ｍａｒｙｌａｎｄ）から受託番号ＡＴＣ
Ｃ５３３３４（寄託日、【９８５年１１月２０日）のも
とに入手できる。添付図面第１５図にプラスミドｐＬＣ
２の制限酵素部位および機能地図を示す。
ｐＬＣ２をペニシリウムＩＰＮＳ遺伝子の３°調節領域
の供給源として使用することができる。Ｅ、コリＫ１２
ＪＭ１０９／ｐＬＣ２の凍結乾燥品は、ジ・アメリ
カン・タイプ・カルチャー１コレクシヨン（ｔｈｅ
Ａｍｅｒｉｃａｎ ＴｙｐｅＣｕｌｔｕｒｅＣｏｌｌ
ｅｃｔｉｏｎ）、ロックビル（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ）、
マリ−ランド（Ｍａｒｙｌａｎｄ）から受託番号ＡＴＣ
Ｃ５３３３４（寄託日、【９８５年１１月２０日）のも
とに入手できる。添付図面第１５図にプラスミドｐＬＣ
２の制限酵素部位および機能地図を示す。
プラスミドｐＬＣ２を制限酵素ＰｓｔＩで消化し、ター
ミネータ−を含んでいる〜ｌ 、 ｌ ｋｂの制限酵素
断片を単離し、緑豆ヌクレアーゼで処理して１本鎖３゛
伸長鎖を取り出しライゲーション用に調製する。ついで
ｐｐ Ｓ ６４を制限酵素ｋｐｎ Ｉで消化し、緑豆ヌ
クレアーゼで処理してライゲージ９ン用に調製する。
ミネータ−を含んでいる〜ｌ 、 ｌ ｋｂの制限酵素
断片を単離し、緑豆ヌクレアーゼで処理して１本鎖３゛
伸長鎖を取り出しライゲーション用に調製する。ついで
ｐｐ Ｓ ６４を制限酵素ｋｐｎ Ｉで消化し、緑豆ヌ
クレアーゼで処理してライゲージ９ン用に調製する。
ついでｋｐｎ Ｉで消化しヌクレアーゼで処理したプラ
スミドｐＰＳ６４ＤＮＡを、３°調節領域を含んだヌク
レアーゼで処理した〜ｌ 、 ｌ ｋｂのプラスミドｐ
ＬＣ２のＰｓＬＩ制限酵素断片ヘライゲーションした。
スミドｐＰＳ６４ＤＮＡを、３°調節領域を含んだヌク
レアーゼで処理した〜ｌ 、 ｌ ｋｂのプラスミドｐ
ＬＣ２のＰｓＬＩ制限酵素断片ヘライゲーションした。
ライゲージ３ンによってプラスミドｐＰ５６８が生成し
た。ｌ 、 ｌ ｋｂの断片は２方向のうちの一方向で
ライゲーションできるので、所望のプラスミドｐＰ５６
８を生産するのはそのうちの一つだけであるから、制限
酵素分析を用いてプラスミドを同定する。添付図面第１
６図にプラスミドｐｐ Ｓ ６８の制限酵素部位および
機能地図を示す。
た。ｌ 、 ｌ ｋｂの断片は２方向のうちの一方向で
ライゲーションできるので、所望のプラスミドｐＰ５６
８を生産するのはそのうちの一つだけであるから、制限
酵素分析を用いてプラスミドを同定する。添付図面第１
６図にプラスミドｐｐ Ｓ ６８の制限酵素部位および
機能地図を示す。
プラスミドｐＰＳ６８はペニシリウム宿主細胞でＤＡＯ
ＣＳ発現をさせることができるが、選択可能なマーカー
を含んでいない。しかし選択マーカーの付加は容易に達
成できる。例えばプラスミドｐＰＳ６８を制限酵素Ｅｃ
ｏＲＩで消化して、ａ＋＊ｄＳ ヲ含Ａ、タフ５ スミ
ＦｐＰ Ｓ ５１（７）−５，６５ｋｂＥｃｏＲＩ制限
酵素断片ヘライゲーションすることができる。このライ
ゲーションによってプラスミドｐＰＳ６９およびｐＰＳ
７０が生産され、この二つはａｍｄ Ｓを含んだ５．６
５ｋｂのＥｃｏＲＩ制限酵素断片の方向だけが異なって
いる。添付図面第７図にプラスミドｐｐ Ｓ ６９の制
限酵素部位および機能地図を示す。ペニシリウムを本発
明のベクターで形質転換する方法を実施例８で説明する
。
ＣＳ発現をさせることができるが、選択可能なマーカー
を含んでいない。しかし選択マーカーの付加は容易に達
成できる。例えばプラスミドｐＰＳ６８を制限酵素Ｅｃ
ｏＲＩで消化して、ａ＋＊ｄＳ ヲ含Ａ、タフ５ スミ
ＦｐＰ Ｓ ５１（７）−５，６５ｋｂＥｃｏＲＩ制限
酵素断片ヘライゲーションすることができる。このライ
ゲーションによってプラスミドｐＰＳ６９およびｐＰＳ
７０が生産され、この二つはａｍｄ Ｓを含んだ５．６
５ｋｂのＥｃｏＲＩ制限酵素断片の方向だけが異なって
いる。添付図面第７図にプラスミドｐｐ Ｓ ６９の制
限酵素部位および機能地図を示す。ペニシリウムを本発
明のベクターで形質転換する方法を実施例８で説明する
。
形質転換に用いるペニシリウム株はジ・アメリカン・タ
イプ・カルチャー・コレクシジン（ロックビル、ＭＤ２
０８５２）から受託番号ＡＴＣＣ９４８０のもとに入手
した。またその他のペニシリウム・クリソゲヌム株また
はペニシリンＧまたはペニシリンＶの生産を改良する目
的で、ＡＴＣＣ９４８０かも突然変異、選別または遺伝
的育種によって誘導された任意の商業的な株も、本発明
のベクターおよびプラスミドで形質転換体を生産する用
途に好適である。
イプ・カルチャー・コレクシジン（ロックビル、ＭＤ２
０８５２）から受託番号ＡＴＣＣ９４８０のもとに入手
した。またその他のペニシリウム・クリソゲヌム株また
はペニシリンＧまたはペニシリンＶの生産を改良する目
的で、ＡＴＣＣ９４８０かも突然変異、選別または遺伝
的育種によって誘導された任意の商業的な株も、本発明
のベクターおよびプラスミドで形質転換体を生産する用
途に好適である。
Ｂ、細胞培 のための均一 種物の調製ペニシリウム・
クリソゲヌム細胞を効率的に形質転換するには、細胞壁
を除去して安定なプロトプラストを作成することが必要
である。そのようなプロトプラストの作成に際しては均
一な接種物によって始めるのが都合よい。そうでないと
培養中の細胞調製に再現性がなく、不適当ないし不十分
な量の細胞からＰ、クリソゲヌム・プロトゲラストを調
製しようとする試みにより時間を無駄にすることになる
。
クリソゲヌム細胞を効率的に形質転換するには、細胞壁
を除去して安定なプロトプラストを作成することが必要
である。そのようなプロトプラストの作成に際しては均
一な接種物によって始めるのが都合よい。そうでないと
培養中の細胞調製に再現性がなく、不適当ないし不十分
な量の細胞からＰ、クリソゲヌム・プロトゲラストを調
製しようとする試みにより時間を無駄にすることになる
。
凍結品または液体窒素貯蔵品から取り出して室温で融解
した栄養細胞アンプル（保存溶媒１．０■ｌ中、〜１０
’コロニー形成単位、５％ラクトース、１０％グリセリ
ンおよび０．１％ツイーン８０）を滅菌食塩水１．０ｍ
ｌで希釈する。この浮遊成約０゜１＋１を使用して、約
２０個の胞子形成用斜面培地（ラクトース、１５．０ｇ
／Ｉ；コーンステイープリカー、２．５ｇ／ｌ；ペプト
ン、５．０ｇ／ｌ；ＮａＣ１゜４．０ｇ／ｌ；Ｍｇ５Ｏ
ａ・７Ｈ，ｏ、０．５ｇ／Ｉ；ＫＨ！ＰＯ，，０，６ｇ
／Ｉ；ＦｅＣ１１’６）ｆｔｏ、０．００５ｇ／Ｉ；Ｃ
ｕ５Ｏ，・５Ｈ！Ｏ１０，００２ｇ／ｌ；ｐＨ７゜０に
調節、寒天、３０．０ｇ／呈、オートクレーブで２０分
間１２０ｐｓｉで加熱）へそれぞれ接種した。
した栄養細胞アンプル（保存溶媒１．０■ｌ中、〜１０
’コロニー形成単位、５％ラクトース、１０％グリセリ
ンおよび０．１％ツイーン８０）を滅菌食塩水１．０ｍ
ｌで希釈する。この浮遊成約０゜１＋１を使用して、約
２０個の胞子形成用斜面培地（ラクトース、１５．０ｇ
／Ｉ；コーンステイープリカー、２．５ｇ／ｌ；ペプト
ン、５．０ｇ／ｌ；ＮａＣ１゜４．０ｇ／ｌ；Ｍｇ５Ｏ
ａ・７Ｈ，ｏ、０．５ｇ／Ｉ；ＫＨ！ＰＯ，，０，６ｇ
／Ｉ；ＦｅＣ１１’６）ｆｔｏ、０．００５ｇ／Ｉ；Ｃ
ｕ５Ｏ，・５Ｈ！Ｏ１０，００２ｇ／ｌ；ｐＨ７゜０に
調節、寒天、３０．０ｇ／呈、オートクレーブで２０分
間１２０ｐｓｉで加熱）へそれぞれ接種した。
各斜面［１５ｃ＋ｓＸ ２．５ｃｍ］は固体培地２５ｍ
１を含有する。接種物、を寒天斜面表面へ均等に広げ、
菌糸の集密的菌叢が存在し胞子化するまで（大抵の株で
１週間）２５℃に保つ。ｌ斜面の発育を滅菌水性培地１
０ｍ１に浮遊させ、浮遊液を水性培地１０６＋ｍｌへ移
す。浮遊細胞を含有するフラスコを回旋振とう機に掛け
、１インチの偏心距離をもって２８５ ｒｐｍで２５°
Ｃで１８時間インキュベートしＩこ。
１を含有する。接種物、を寒天斜面表面へ均等に広げ、
菌糸の集密的菌叢が存在し胞子化するまで（大抵の株で
１週間）２５℃に保つ。ｌ斜面の発育を滅菌水性培地１
０ｍ１に浮遊させ、浮遊液を水性培地１０６＋ｍｌへ移
す。浮遊細胞を含有するフラスコを回旋振とう機に掛け
、１インチの偏心距離をもって２８５ ｒｐｍで２５°
Ｃで１８時間インキュベートしＩこ。
水性培地は下記のように調製した。Ａ液１００ｍ１（ス
クロース、３６ｇ／ｌ；Ｌ−アスパラギン、７゜５ｇ／
ｌ；ＫＨ２ＰＯい ｌ ５ｇ／ｌ；に！ＨＰＯい ２１
ｇ／ Ｉ ； Ｎ ａ ２ ｓ ｏ ４．０．７５８／
Ｉ；ＭｇＳＯ４” ７）（２０％０１８ｇ／Ｉ；ＣａＣ
ｌ＊、０．０６ｇ／Ｉ；塩溶液、１ｍｌ／ｌ、自然ｐＨ
）を５００１振どうフラスコに調製した。フラスコを市
販の蓋で被い、オートクレープで１２１ ”Ｏで２０分
間加熱した。ついでＢ液２１１１（グルコース、１０８
ｇ／Ｉ）およびＣ液４ｍ１（スクロース、２５ｇ／Ｉ；
コーンステイープリカー（４％（ｖ／ｖ）窒素）、１２
．５ｍｌ；酢酸アンモニウム、５．５ ｇ／ ｌ ；
Ｃａ ＣＯｓ、５ｇ／Ｉ；ＫＯＨでｐＨを６゜５に調節
し、オートクレーブで１２１℃で２０分間加熱）をＡ液
に添加して水性培地を調製する。
クロース、３６ｇ／ｌ；Ｌ−アスパラギン、７゜５ｇ／
ｌ；ＫＨ２ＰＯい ｌ ５ｇ／ｌ；に！ＨＰＯい ２１
ｇ／ Ｉ ； Ｎ ａ ２ ｓ ｏ ４．０．７５８／
Ｉ；ＭｇＳＯ４” ７）（２０％０１８ｇ／Ｉ；ＣａＣ
ｌ＊、０．０６ｇ／Ｉ；塩溶液、１ｍｌ／ｌ、自然ｐＨ
）を５００１振どうフラスコに調製した。フラスコを市
販の蓋で被い、オートクレープで１２１ ”Ｏで２０分
間加熱した。ついでＢ液２１１１（グルコース、１０８
ｇ／Ｉ）およびＣ液４ｍ１（スクロース、２５ｇ／Ｉ；
コーンステイープリカー（４％（ｖ／ｖ）窒素）、１２
．５ｍｌ；酢酸アンモニウム、５．５ ｇ／ ｌ ；
Ｃａ ＣＯｓ、５ｇ／Ｉ；ＫＯＨでｐＨを６゜５に調節
し、オートクレーブで１２１℃で２０分間加熱）をＡ液
に添加して水性培地を調製する。
Ｃ，ペニシリウム・プロトプラストの作成２４時間培養
から得た細胞を吸引濾過しくワットマン（Ｗｈａｔｍａ
ｎ）＃ ｌ濾紙、ブフナー漏斗）、緩衝液（０，０１Ｍ
塩酸トリス（ヒドロキシメチル）アミノエタン、０．０
１Ｍ Ｍｇ５ｏ４．ｏ、ｏ １Ｍジチオトレイトール、
１．００Ｍ ＫＣＩ（ＨＣＩでｐＨ７，０に調節））へ
浮遊させる。緩衝液５０ａ＋１当り細胞量が１ｇの最終
細胞濃度となるよう１二十分量の緩衝液を追加する。２
５０ｍ１の振とう７ラスコへ細胞浮遊液を加えて水浴式
回旋振とう機へ掛け、１インチの振り巾をもって４０「
ｐ■で２９〜３０℃で１０分間インキュベートする。ジ
チオトレイトールで処理した細胞を遠心により採取し、
ついで２５０１振とうフラスコ中で、酵素溶液５０ｍ１
（ｌ ＯＩ１ｇ／ｍｌノボチーム（Ｎ ｏｖｏｚｙｍＸ
ノボ・インダストリ（Ｎｏｖａ １ｎｄｕｓｔｒｉ）
Ａ／Ｂ、パグスバード（Ｂａｇｓｖａｅｒｄ）、デンマ
ーク（Ｄ ｅｎｍａｒｋ）、０．０１Ｍ塩酸トリス（ヒ
ドロキシメチル）アミノエタン、０゜０１Ｍ Ｍｇ５Ｏ
いｏ、ｏ １Ｍジチオトレイトール、１．００Ｍ ＫＣ
Ｉ（ＨＣＩでｐＨ５，８に調節））に再浮遊させた。こ
の細胞浮遊液を水浴式回旋振とう機に掛け、１インチの
振り巾をもって１４Ｏｒｐｍ＋で２９〜３０°Ｃで１５
分間インキュベートしｔ；。
から得た細胞を吸引濾過しくワットマン（Ｗｈａｔｍａ
ｎ）＃ ｌ濾紙、ブフナー漏斗）、緩衝液（０，０１Ｍ
塩酸トリス（ヒドロキシメチル）アミノエタン、０．０
１Ｍ Ｍｇ５ｏ４．ｏ、ｏ １Ｍジチオトレイトール、
１．００Ｍ ＫＣＩ（ＨＣＩでｐＨ７，０に調節））へ
浮遊させる。緩衝液５０ａ＋１当り細胞量が１ｇの最終
細胞濃度となるよう１二十分量の緩衝液を追加する。２
５０ｍ１の振とう７ラスコへ細胞浮遊液を加えて水浴式
回旋振とう機へ掛け、１インチの振り巾をもって４０「
ｐ■で２９〜３０℃で１０分間インキュベートする。ジ
チオトレイトールで処理した細胞を遠心により採取し、
ついで２５０１振とうフラスコ中で、酵素溶液５０ｍ１
（ｌ ＯＩ１ｇ／ｍｌノボチーム（Ｎ ｏｖｏｚｙｍＸ
ノボ・インダストリ（Ｎｏｖａ １ｎｄｕｓｔｒｉ）
Ａ／Ｂ、パグスバード（Ｂａｇｓｖａｅｒｄ）、デンマ
ーク（Ｄ ｅｎｍａｒｋ）、０．０１Ｍ塩酸トリス（ヒ
ドロキシメチル）アミノエタン、０゜０１Ｍ Ｍｇ５Ｏ
いｏ、ｏ １Ｍジチオトレイトール、１．００Ｍ ＫＣ
Ｉ（ＨＣＩでｐＨ５，８に調節））に再浮遊させた。こ
の細胞浮遊液を水浴式回旋振とう機に掛け、１インチの
振り巾をもって１４Ｏｒｐｍ＋で２９〜３０°Ｃで１５
分間インキュベートしｔ；。
酵素処理した細胞を１２４０Ｘｇで６分間遠心し、得ら
れたペレットを緩衝液（０，０１Ｍ塩酸トリス（ヒドロ
キシメチル）アミノエタン、０．０１ＭＭｇ５ｏ、、１
．００Ｍ ＫＣＩ（ＭＣＩ″Ｃ″ｐＨ７，０に調節））
に再浮遊させた。浮遊液をまず９５０ Ｘｇで６分間遠
心した。得られたペレットをこれと同じ緩衝液に再浮遊
させ、浮遊液を７００Ｘｇで６分間遠心した。得られた
ペレットを同じ緩衝液５ｍｌに再浮遊させた。この浮遊
液は主として大きいプロトゲラストおよび若干の細胞壁
が残っている浸透圧的に壊れ易い細胞を含んでいる。上
記の方法によって除去された小さいプロトプラストと比
較して、最終浮遊液中の大きいプロトプラストおよび浸
透圧的に壊れ易い細胞の方が細胞壁を再生し得るプロト
プラストの比率および生存可能な浸透圧的に安定な細胞
の比率がより高い。緩衝液で細胞浮遊液を〜２ＸｌＯ’
細胞／＋ｍｌ濃度まで希釈する。
れたペレットを緩衝液（０，０１Ｍ塩酸トリス（ヒドロ
キシメチル）アミノエタン、０．０１ＭＭｇ５ｏ、、１
．００Ｍ ＫＣＩ（ＭＣＩ″Ｃ″ｐＨ７，０に調節））
に再浮遊させた。浮遊液をまず９５０ Ｘｇで６分間遠
心した。得られたペレットをこれと同じ緩衝液に再浮遊
させ、浮遊液を７００Ｘｇで６分間遠心した。得られた
ペレットを同じ緩衝液５ｍｌに再浮遊させた。この浮遊
液は主として大きいプロトゲラストおよび若干の細胞壁
が残っている浸透圧的に壊れ易い細胞を含んでいる。上
記の方法によって除去された小さいプロトプラストと比
較して、最終浮遊液中の大きいプロトプラストおよび浸
透圧的に壊れ易い細胞の方が細胞壁を再生し得るプロト
プラストの比率および生存可能な浸透圧的に安定な細胞
の比率がより高い。緩衝液で細胞浮遊液を〜２ＸｌＯ’
細胞／＋ｍｌ濃度まで希釈する。
Ｄ、形質転換方法
浸透圧的に壊れ易いペニシリウム・クリソゲヌム細胞の
〜０ 、１ ｍｌ浮遊液（約２Ｘ１０’細胞）を５Ｏｎ
＋Ｍ ＣａＣ１ｔ Ｌ ０２ｍ、プラスミドＤＮＡ（
ＴＥ緩衝液５〜１５μｌ溶液）２５μｌ、新しく溶解し
たポリエチレングリコール４０００溶液（ベーカ−（Ｂ
ａｋｅｒ）、浸透圧的に安定化させｔ；緩衝液４０％
（重量／容量））０．９ｍｌと一緒に、各形質転換プラ
スミドに添加する。混合物を撹拌しｌ；のち、室温でｌ
Ｏ分間靜装置、７００ Ｘｇで２分間遠心し、もう−度
撹拌する。ついでＱ、５ｍｌずつ二つのアリコートを浸
透圧的に安定化させたアセトアミド培地（アミノ酸およ
び硫酸アンモニウムを含有しない酵母窒素塩基、１．７
ｇ／ｌ；スクロース、■２５ｇ／Ｉ；アセトアミド、０
．７３８ｇ／Ｉ；ＣａＣＩｇ、１．２７ｇ／ｌ；ノープ
ル（Ｎｏｂｌｅ）アガー２２ｇ／ｌ）の表面に広げる。
〜０ 、１ ｍｌ浮遊液（約２Ｘ１０’細胞）を５Ｏｎ
＋Ｍ ＣａＣ１ｔ Ｌ ０２ｍ、プラスミドＤＮＡ（
ＴＥ緩衝液５〜１５μｌ溶液）２５μｌ、新しく溶解し
たポリエチレングリコール４０００溶液（ベーカ−（Ｂ
ａｋｅｒ）、浸透圧的に安定化させｔ；緩衝液４０％
（重量／容量））０．９ｍｌと一緒に、各形質転換プラ
スミドに添加する。混合物を撹拌しｌ；のち、室温でｌ
Ｏ分間靜装置、７００ Ｘｇで２分間遠心し、もう−度
撹拌する。ついでＱ、５ｍｌずつ二つのアリコートを浸
透圧的に安定化させたアセトアミド培地（アミノ酸およ
び硫酸アンモニウムを含有しない酵母窒素塩基、１．７
ｇ／ｌ；スクロース、■２５ｇ／Ｉ；アセトアミド、０
．７３８ｇ／Ｉ；ＣａＣＩｇ、１．２７ｇ／ｌ；ノープ
ル（Ｎｏｂｌｅ）アガー２２ｇ／ｌ）の表面に広げる。
形質転換混合物内に存在する生存可能な細胞総数を数え
るため、アセトアミドを等モル量の硫酸アンモニウムで
置き代えた培地へ形質転換混合物の一部を接種する。形
質転換から７〜ｌＯ日後、継代培養に十分な大きさの形
質転換体コロニーがアセトアミド培地上に出現する。
るため、アセトアミドを等モル量の硫酸アンモニウムで
置き代えた培地へ形質転換混合物の一部を接種する。形
質転換から７〜ｌＯ日後、継代培養に十分な大きさの形
質転換体コロニーがアセトアミド培地上に出現する。
不全形質転換体は新たに調製したアセトアミド培地で継
代培養すると発育し得ないから、安定な形質転換体から
不全形質転換体を容易に区別できる。
代培養すると発育し得ないから、安定な形質転換体から
不全形質転換体を容易に区別できる。
アセトアミダーゼ遺伝子を含んでいるプラスミドで形質
転換した細胞は、形質転換後４〜５日で眼で見えるコロ
ニーを形成する。
転換した細胞は、形質転換後４〜５日で眼で見えるコロ
ニーを形成する。
Ｅ、ペニシリウム形質転換体の分析
ａｍｄ Ｓ遺伝子を含んだ本発明のベクターで形質転換
したベニンリウム形質転換体は、形質転換していない受
容体Ｐ、クリソゲヌム株（例えばＡＴｃｃ９４８Ｑ）の
抽出物中には検出されないアセトアミダーゼ活性（ａｎ
ｄ Ｓ遺伝子生産物）を発現する。この活性は、その他
の窒素供給源を入手し得ない場合に、アセトアミド加水
分解によって遊離されたアンモニアを利用して増殖する
、形質転換株の増殖能を生じる。また本発明のペニシリ
ウム形質転換体はＤＡＯＣＳ活性を発現する。
したベニンリウム形質転換体は、形質転換していない受
容体Ｐ、クリソゲヌム株（例えばＡＴｃｃ９４８Ｑ）の
抽出物中には検出されないアセトアミダーゼ活性（ａｎ
ｄ Ｓ遺伝子生産物）を発現する。この活性は、その他
の窒素供給源を入手し得ない場合に、アセトアミド加水
分解によって遊離されたアンモニアを利用して増殖する
、形質転換株の増殖能を生じる。また本発明のペニシリ
ウム形質転換体はＤＡＯＣＳ活性を発現する。
安定な形質転換体はその高分子量ＤＮＡ内に形質転換す
るＤＮＡを保持している。例えばアセトアミダーゼ遺伝
子を含んでいるＤＡＯＣＳ暗号配列またはアスペルギル
スＤＮＡ断片のようなプローブは、非選択的培地（アン
モニアを窒素供給源とする）で何回培養したのちでも、
これらの形質転換体から高分子量ＤＮＡとハイブリダイ
ズする。
るＤＮＡを保持している。例えばアセトアミダーゼ遺伝
子を含んでいるＤＡＯＣＳ暗号配列またはアスペルギル
スＤＮＡ断片のようなプローブは、非選択的培地（アン
モニアを窒素供給源とする）で何回培養したのちでも、
これらの形質転換体から高分子量ＤＮＡとハイブリダイ
ズする。
形質転換表現型（ＤＡＯＣＳ生産、ａ＋ａｄＳベクター
を使用した場合はアセトアミドを唯一の窒素供給源とす
る増殖能）は非選択培地を通したのちでも形質転換体に
よって保持される。
を使用した場合はアセトアミドを唯一の窒素供給源とす
る増殖能）は非選択培地を通したのちでも形質転換体に
よって保持される。
ペニシリウム・クリソゲヌムが天然にはアセトアミドを
唯一の窒素供給源として発育できないため、栄養要求株
のような特殊な受容様を組立てる必要がないので、アセ
トアミダーゼを含んだＤＡＯＣＳ発現ベクターは遺伝子
をペニシリウム・クリソゲヌムへ挿入するベクターとし
て特に有用である。形質転換するグラスミド内の遺伝子
による栄養要素マーカーの補充に基づく形質転換方法で
はこの利点を分かち得ない。ペニシリン生産のために高
度に開発されたＰ、クリソゲヌム株へ栄養要求マーカー
を導入するとしばしば多面発現突然変異を伴うことがあ
る。そのような突然変異は一般にペニシリン生産の低下
を招く「マクドナルド（ＭａｃＤｏｎａｌｄ）ら、ジャ
ーナル・才ブ・ジェネラル・マイクロバイオロジー（Ｊ
、 Ｇｅｎ、 Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、 ）、３３巻、
３６５〜３７４頁（１９６３年）］。
唯一の窒素供給源として発育できないため、栄養要求株
のような特殊な受容様を組立てる必要がないので、アセ
トアミダーゼを含んだＤＡＯＣＳ発現ベクターは遺伝子
をペニシリウム・クリソゲヌムへ挿入するベクターとし
て特に有用である。形質転換するグラスミド内の遺伝子
による栄養要素マーカーの補充に基づく形質転換方法で
はこの利点を分かち得ない。ペニシリン生産のために高
度に開発されたＰ、クリソゲヌム株へ栄養要求マーカー
を導入するとしばしば多面発現突然変異を伴うことがあ
る。そのような突然変異は一般にペニシリン生産の低下
を招く「マクドナルド（ＭａｃＤｏｎａｌｄ）ら、ジャ
ーナル・才ブ・ジェネラル・マイクロバイオロジー（Ｊ
、 Ｇｅｎ、 Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、 ）、３３巻、
３６５〜３７４頁（１９６３年）］。
第１図はプラスミｌ−′ｐＯＷ３８０の制限酵素部位お
よび機能地図、第２図はプラスミドｐＣＺ Ｒ３３６の
制限酵素部位および機能地図、第３図はプラスミドｐＯ
Ｗ３８２の制限酵素部位および機能地図、第４図はプラ
スミドｐｃＺＲ１１１の制限酵素部位および機能地図、
第５図はプラスミドｐＰＳ６５の制限酵素部位および機
能地図、第６図はプラスミドｐＰＳ６７の制限酵素部位
および機能地図、第７図はプラスミドｐＰ Ｓ ６９の
制限酵素部位および機能地図、第８図はグラスミドｐＰ
Ｓ６０の制限酵素部位および機能地図、第９図はプラス
ミドｐｐ Ｓ ６３の制限酵素部位および機能地図、第
１０図はプラスミドｐＰＳ６４の制限酵素部位および機
能地図、第１１図はプラスミドｐＭＬｃ１２の制限酵素
部位および機能地図、第【２図はプラスミドｐ３ Ｓ
Ｒ２の制限酵素部位および機能地図、第１３図はグラス
ミドｐＰＳ５１の制限酵素部位および機能地図、第１４
図はプラスミドｐＰＳ７１の制限酵素部位および機能地
図、第１５図はプラスミドｐＬＣ２の制限酵素部位およ
び機能地図、第１６図はプラスミドｐｐｓａａの制限酵
素部位および機能地図である。 ＦＩＧ、１ 特許出願人 イーライ・リリー・アンド・カンパニ代理
人弁理士青 山 葆 はか１名 ＦＩＧ、２ （６４００ｂｐ） ＦＩＧ、４ （６３９５ｂｐ） ＦＩＧ、３ ＦＩＧ、５ ＦＩＧ、６ ＮｄｅＩ ＦＩＧ、８ （７３４２ｂρ） ＦＩＧ、７ ｂａＩ ＦＩＧ、９ ＦＩＧ、ｌｏ ＦＩＧ、＋２ （９３６２ｂｐ） ＦＩＧＩ＋ （２６７１ｂｐ） ＦＩＧ、＋３ （７６６１ｂｐ） ＦＩＧ、１４ ＦＩＧ ＋５ （７，０５０ｂｐ） ｓｔＩ ｂａＩ
よび機能地図、第２図はプラスミドｐＣＺ Ｒ３３６の
制限酵素部位および機能地図、第３図はプラスミドｐＯ
Ｗ３８２の制限酵素部位および機能地図、第４図はプラ
スミドｐｃＺＲ１１１の制限酵素部位および機能地図、
第５図はプラスミドｐＰＳ６５の制限酵素部位および機
能地図、第６図はプラスミドｐＰＳ６７の制限酵素部位
および機能地図、第７図はプラスミドｐＰ Ｓ ６９の
制限酵素部位および機能地図、第８図はグラスミドｐＰ
Ｓ６０の制限酵素部位および機能地図、第９図はプラス
ミドｐｐ Ｓ ６３の制限酵素部位および機能地図、第
１０図はプラスミドｐＰＳ６４の制限酵素部位および機
能地図、第１１図はプラスミドｐＭＬｃ１２の制限酵素
部位および機能地図、第【２図はプラスミドｐ３ Ｓ
Ｒ２の制限酵素部位および機能地図、第１３図はグラス
ミドｐＰＳ５１の制限酵素部位および機能地図、第１４
図はプラスミドｐＰＳ７１の制限酵素部位および機能地
図、第１５図はプラスミドｐＬＣ２の制限酵素部位およ
び機能地図、第１６図はプラスミドｐｐｓａａの制限酵
素部位および機能地図である。 ＦＩＧ、１ 特許出願人 イーライ・リリー・アンド・カンパニ代理
人弁理士青 山 葆 はか１名 ＦＩＧ、２ （６４００ｂｐ） ＦＩＧ、４ （６３９５ｂｐ） ＦＩＧ、３ ＦＩＧ、５ ＦＩＧ、６ ＮｄｅＩ ＦＩＧ、８ （７３４２ｂρ） ＦＩＧ、７ ｂａＩ ＦＩＧ、９ ＦＩＧ、ｌｏ ＦＩＧ、＋２ （９３６２ｂｐ） ＦＩＧＩ＋ （２６７１ｂｐ） ＦＩＧ、＋３ （７６６１ｂｐ） ＦＩＧ、１４ ＦＩＧ ＋５ （７，０５０ｂｐ） ｓｔＩ ｂａＩ
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １、ストレプトマイセス・クラブリゲルスのＤＡＯＣＳ
活性をコードするＤＮＡ配列を含んでいる組換えＤＮＡ
化合物。 ２、式： 【遺伝子配列があります】 （ここで、Ａｌａはアラニン残基、Ａｒｇはアルギニン
残基、Ａｓｎはアスパラギン残基、Ａｓｐはアスパラギ
ン酸残基、−ＣＯＯＨはカルボキシ末端、Ｃｙｓはシス
テイン残基、Ｇｌｎはグルタミン残基、Ｇｌｕはグルタ
ミン酸残基、Ｇｌｙはグリシン残基、−Ｈ＿２Ｎはアミ
ノ末端、Ｈｉｓはヒスチジン残基、Ｉｌｅはイソロイシ
ン残基、Ｌｅｕはロイシン残基、Ｌｙｓはリシン残基、
Ｍｅｔはメチオニン残基、Ｐｈｅはフェニルアラニン残
基、Ｐｒｏはプロリン残基、Ｓｅｒはセリン残基、Ｔｈ
ｒはスレオニン残基、Ｔｒｐはトリプトファン残基、Ｔ
ｙｒはチロシン残基、Ｖａｌはバリン残基である） で示される構造を有する蛋白質をコードするＤＮＡ配列
を含んでいる請求項１記載の組換えＤＮＡ化合物。 ３、式： 【遺伝子配列があります】 （ここで、Ａはデオキシアデニル、Ｇはデオキシグアニ
ル、Ｃはデオキシシチジル、Ｔはチミジルである） で示されるＤＮＡ配列を含んでいる請求項１または２記
載の組換えＤＮＡ化合物。 ４、請求項１または２記載のＤＮＡ化合物を含んでいる
組換えＤＮＡベクター。 ５、該ＤＡＯＣＳ活性をコードするＤＮＡを発現させる
ために配置されたプロモーターをさらに含有してなる請
求項４記載の組換えＤＮＡベクター。 ６、そのプロモーターがエシェリキア・コリ内で機能す
るものである請求項５記載の組換えＤＮＡ発現ベクター
。 ７、そのプロモーターがλｐＬプロモーターである請求
項６記載の組換えＤＮＡ発現ベクター。 ８、プラスミドｐＯＷ３８２である請求項７記載の組換
えＤＮＡ発現ベクター。 ９、そのプロモーターがアスペルギルスまたはペニシリ
ウム内で機能するものである請求項５記載の組換えＤＮ
Ａ発現ベクター。 １０、そのプロモーターがペニシリウム・クリソゲヌム
ＩＰＮＳ遺伝子のプロモーターである請求項９記載の組
換えＤＮＡ発現ベクター。 １１、プラスミドｐＰＳ６３、ｐＰＳ６４、ｐＰＳ６５
、ｐＰＳ６６、ｐＰＳ６８、ｐＰＳ６９またはｐＰＳ７
０である請求項１０記載の組換えＤＮＡ発現ベクター。 １２、そのプロモーターがアスペルギルス・ニズランス
のａｍｄＳ遺伝子のプロモーターである請求項９記載の
組換えＤＮＡ発現ベクター。 １３、プラスミドｐＰＳ６７、ｐＰＳ７１またはｐＰＳ
７２である請求項１２記載の組換えＤＮＡ発現ベクター
。 １４、そのプロモーターがセファロスポリウムで機能す
る請求項５記載の組換えＤＮＡ発現ベクター。 １５、そのプロモーターがセファロスポリウム・アクレ
モニウムのＤＡＣＳまたはＤＡＯＣＳ遺伝子、あるいは
ＩＰＮＳ遺伝子のプロモーターである請求項１４記載の
組換えＤＮＡ発現ベクター。 １６、そのプロモーターがストレプトマイセスで機能す
る請求項５記載の組換えＤＮＡ発現ベクター。 １７、ｐＯＷ３８０またはｐＯＷ３８１である請求項４
記載の組換えＤＮＡ発現ベクター。 １８、請求項４の組換えＤＮＡベクターで形質転換され
た宿主細胞。 １９、エシェリキア・コリＫ１２である請求項１８記載
の形質転換宿主細胞。 ２０、エシェリキア・コリＫ１２ＪＡ２２１／ｐＯＷ３
８０である請求項１９記載の形質転換宿主細胞。 ２１、ペニシリウムである請求項１８記載の形質転換宿
主細胞。 ２２、ペニシリウム・クリソゲヌムである請求項２１記
載の形質転換宿主細胞。 ２３、ペニシリウム・クリソゲヌム／ｐＰＳ６５、ペニ
シリウム・クリソゲヌム／ｐＰＳ６６、ペニシリウム・
クリソゲヌム／ｐＰＳ６９、ペニシリウム・クリソゲヌ
ム／ｐＰＳ７０、ペニシリウム・クリソゲヌム／ｐＰＳ
７１またはペニシリウム・クリソゲヌム／ｐＰＳ７２で
ある請求項２１記載の形質転換宿主細胞。 ２４、セファロスポリウムである請求項１８記載の形質
転換宿主細胞。 ２５、ストレプトマイセスである請求項１８記載の形質
転換宿主細胞。 ２６、ストレプトマイセス・クラブリゲルスである請求
項２５記載の形質転換宿主細胞。２７、ｍＯＷ３８０お
よびｍＯＷ３８１からなる群から選択される組換えＤＮ
Ａベクター。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US07/192,273 US5070020A (en) | 1988-05-09 | 1988-05-09 | Recombinant dna expression vectors and dna compounds that encode deacetoxycephalosporin c synthetase |
| US192273 | 1988-05-09 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0227984A true JPH0227984A (ja) | 1990-01-30 |
Family
ID=22708994
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP1114883A Pending JPH0227984A (ja) | 1988-05-09 | 1989-05-08 | デアセトキシセファロスポリンｃ合成酵素をコードする組換えｄｎａ発現ベクターおよびｄｎａ化合物 |
Country Status (7)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5070020A (ja) |
| EP (1) | EP0341892A1 (ja) |
| JP (1) | JPH0227984A (ja) |
| AU (1) | AU622662B2 (ja) |
| DK (1) | DK217889A (ja) |
| HU (1) | HU209581B (ja) |
| IL (1) | IL90129A0 (ja) |
Families Citing this family (35)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6709859B1 (en) | 1986-01-31 | 2004-03-23 | Beecham Group P.L.C. | Chromosomal DNA Fragments Encoding Enzymes for Encoding B-Lactam Biosynthesis Enzymes, and Vector and Transformants for Their Expression |
| EP0233715B1 (en) * | 1986-01-31 | 1994-05-25 | BEECHAM GROUP plc | Isolation and expression of genes involved in the biosynthesis of beta-lactams |
| CA2045951A1 (en) * | 1990-07-06 | 1992-01-07 | Steven Kovacevic | Recombinant dna expression vectors and dna compounds that encode deacetylcephalosporin c synthase activity |
| US5318896A (en) * | 1991-09-11 | 1994-06-07 | Merck & Co., Inc. | Recombinant expandase bioprocess for preparing 7-aminodesacetoxy cephalosporanic acid (7-ADCA) |
| SK280569B6 (sk) * | 1991-10-15 | 2000-03-13 | Gist-Brocades B.V. | Biologický spôsob výroby kyseliny7-aminodeacetylce |
| US5554507A (en) * | 1992-07-30 | 1996-09-10 | American Cyanamid Company | Bacillus subtilis siderophore genes |
| ES2194873T3 (es) * | 1993-07-30 | 2003-12-01 | Dsm Ip Assets Bv | Procedimiento para la produccion eficaz de 7-adca a traves de 3-(carboxietil)propionil-7-adca. |
| JPH09512170A (ja) * | 1994-04-22 | 1997-12-09 | メルク エンド カンパニー インコーポレーテッド | セファマイシン生合成後期酵素コーディングｄｎａ |
| AU2705895A (en) * | 1994-06-30 | 1996-01-25 | Novo Nordisk Biotech, Inc. | Non-toxic, non-toxigenic, non-pathogenic fusarium expression system and promoters and terminators for use therein |
| DK0828850T3 (da) * | 1995-06-02 | 2002-05-21 | Dsm Nv | Fremgangsmåde til fremstilling af 7-ADCA via indvirkning af en expandase på pencillin G |
| US5731165A (en) * | 1995-06-02 | 1998-03-24 | Gist-Brocades, B.V. | Process for the production of 7-ADCA via expandase activity on penicillin G |
| WO1997020053A2 (en) * | 1995-11-27 | 1997-06-05 | Gist-Brocades B.V. | Improved process for the production of semi-synthetic cephalosporins via expandase activity on penicillin g |
| AU4114697A (en) * | 1996-07-16 | 1998-02-09 | Gist-Brocades B.V. | Improved process for the production of adipoyl cephalosporins |
| US5958730A (en) * | 1996-12-13 | 1999-09-28 | Eli Lilly And Company | Streptococcus pneumoniae gene sequence FtsY |
| EP1953230A1 (en) | 1998-05-19 | 2008-08-06 | DSM IP Assets B.V. | Improved in vivo production of cephalosporins |
| US6720479B1 (en) * | 1998-05-29 | 2004-04-13 | Iowa State University Research Foundation, Inc. | Plant retroelements and methods related thereto |
| US7094953B2 (en) | 1998-05-29 | 2006-08-22 | Iowa State University Research Foundation, Inc. | Plant retroelements and methods related thereto |
| US6284483B1 (en) * | 1999-10-06 | 2001-09-04 | Board Of Trustees Operating Michigan State University | Modified synthetases to produce penicillins and cephalosporins under the control of bicarbonate |
| US7264964B2 (en) * | 2001-06-22 | 2007-09-04 | Ceres, Inc. | Chimeric histone acetyltransferase polypeptides |
| EP1900815B1 (en) | 2001-07-12 | 2016-09-07 | University of Massachusetts | In vivo production of small interfering RNAs that mediate gene silencing |
| BR0211111A (pt) | 2001-07-12 | 2004-06-22 | Univ Massachusetts | Molécula de ácido nucleico isolada, vetor, célula hospedeira, transgene, precursor de rna engenheirado, animal transgênico não humano, e, método de induzir a interferência de ácido ribonucleico de um gene alvo em uma célula |
| US6699699B2 (en) | 2002-03-26 | 2004-03-02 | Synmax Biochemical Co., Ltd. | Mutated penicillin expandases |
| WO2004106347A1 (en) | 2003-05-28 | 2004-12-09 | Dsm Ip Assets B.V. | Cephem compound |
| EP2314692B1 (en) | 2003-06-02 | 2021-02-24 | University of Massachusetts | Methods and compositions for enhancing the efficacy and specificity of RNAi |
| EP3502252B1 (en) | 2003-06-02 | 2023-04-05 | University of Massachusetts | Methods and compositions for controlling efficacy of rna silencing |
| WO2007107810A1 (en) * | 2006-03-20 | 2007-09-27 | Council Of Scientific And Industrial Research | A method for detecting the presence of water born pathogens and indicator microorganism |
| US9637746B2 (en) | 2008-12-15 | 2017-05-02 | Greenlight Biosciences, Inc. | Methods for control of flux in metabolic pathways |
| CN105132387A (zh) * | 2008-12-22 | 2015-12-09 | 绿光生物科学公司 | 用于制造化合物的组合物和方法 |
| EP2566953B1 (en) | 2010-05-07 | 2019-01-02 | Greenlight Biosciences, Inc. | Methods for control of flux in metabolic pathways through enzyme relocation |
| WO2012030980A1 (en) | 2010-08-31 | 2012-03-08 | Greenlight Biosciences, Inc. | Methods for control of flux in metabolic pathways through protease manipulation |
| EP2753702B1 (en) | 2011-09-09 | 2021-12-15 | GreenLight Biosciences, Inc. | Cell-free preparation of carbapenems |
| DK3030671T3 (en) | 2013-08-05 | 2019-01-21 | Greenlight Biosciences Inc | MODIFIED PROTEINS WITH A PROTEASE CLEANING PLACE |
| KR20230048162A (ko) | 2015-03-30 | 2023-04-10 | 그린라이트 바이오사이언시스, 아이엔씨. | 리보핵산의 무세포 생산 |
| AU2017246458B2 (en) | 2016-04-06 | 2022-08-11 | Greenlight Biosciences, Inc. | Cell-free production of ribonucleic acid |
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|---|---|---|---|---|
| US4536476A (en) * | 1982-08-23 | 1985-08-20 | Queen's University At Kingston | Stable epimerase reagent, cyclase reagent and ring expansion reagent for cell-free production of cephalosporins |
| US4510246A (en) * | 1982-08-23 | 1985-04-09 | Queen's University At Kingston | Isolation of cyclase, epimerase and a ring expansion enzyme for producing unnatural cephalosporins |
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-
1988
- 1988-05-09 US US07/192,273 patent/US5070020A/en not_active Expired - Lifetime
-
1989
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- 1989-05-03 DK DK217889A patent/DK217889A/da not_active Application Discontinuation
- 1989-05-03 EP EP89304452A patent/EP0341892A1/en not_active Withdrawn
- 1989-05-05 AU AU34082/89A patent/AU622662B2/en not_active Ceased
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- 1989-05-08 HU HU892208A patent/HU209581B/hu not_active IP Right Cessation
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