JPH09512170A - セファマイシン生合成後期酵素コーディングｄｎａ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 抗生物質セファマイシンの合成に関与する後期酵素をコードするＤＮＡを単離精製した。この特異的酵素はセファマイシン生合成の後期段階に関与する。これらのＤＮＡを配列決定し、宿主細胞における組換え発現のために組換え発現ベクター中にクローニングした。ＤＮＡ、このＤＮＡを含むベクター、及び、このベクターを発現させる組換え宿主細胞が、抗生物質の生産のために有用である。

Description

【発明の詳細な説明】 セファマイシン生合成後期酵素コーディングＤＮＡ 概論 セファマイシンＣは、Ｎｏｃａｒｄｉａ ｌａｃｔａｍｄｕｒａｎｓ（Ｓｔａ ｐｌｅｙ他，１９７２）、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｃｌａｖｕｌｉｇｅｒｕ ｓ （Ｂｒｏｗｎ他，１９７９）、及び、他の幾つかの放線菌類（Ｍａｒｔｉｎ及 びＬｉｒａｓ、１９８９の論評を参照されたい）によって生産されるセファロス ポリンである。セファマイシンＣは、ｐｃｂＡＢ遺伝子（Ｃｏｑｕｅ他，１９９ １ａ）でコードされた多酵素であるα−アミノアジピル−システイニル−バリン 合成酵素（Ｍａｒｔｉｎ他，１９９２；Ａｈａｒｏｎｏｗｉｔｚ他，１９９３） によって、前駆体アミノ酸であるＬ−α−アミノアジピン酸、Ｌ−システイン、 及び、Ｌ−バリンから合成される。α−アミノアジピン酸は、ｌａｔ遺伝子（Ｃ ｏｑｕｅ他，１９９１ｂ；Ｍａｄｄｕｒｉ他，１９９１）でコードされたリジン −６−アミノトランスフェラーゼによってＬ−リジンから形成される。このトリ ペプチドを更に環化してイソペニシリンＮが形成した後に、この中間体をエピマ ー化してペニシリンＮが形成し、そ の後で、デアセトキシセファロスポリンＣシンターゼ（エキスパンダーゼ（ｅｘ ｐａｎｄａｓｅ））によってデアセトキシセファロスポリンＣ（ＤＡＯＣ）に変 換される。これら３つの酵素ステップをコードする遺伝子である、Ｎ．ｌａｃｔ ａｍｄｕｒａｎｓ のｐｃｂＣ、ｃｅｆＤ、ｃｅｆＥは、ｌａｔとｐｃｂＡＢとに よってクラスター化されることが公知である（Ｃｏｑｕｅ他，１９９３ａ，ｂ） 。 セファロスポリンＣは、Ｃｅｐｈａｌｏｓｐｏｒｉｕｍ ａｃｒｅｍｏｎｉｕ ｍ の生合成経路の最終産物である。しかし、セファマイシン生産放線菌類では、 Ｃ−７−メトキシル基の合成と、Ｃ−３′におけるカルバモイル基の結合とに、 更に別の反応が関与している（図１）。しかし、デアセトキシセファロスポリン ＣをセファマイシンＣに変換する、いわゆる「後期」遺伝子に関する情報は、僅 かしか得られていない。このデアセトキシセファロスポリンＣは、α−ケトグル タル酸要求性（α−ｋｅｔｏｇｌｕｔａｒａｔｅ−ｒｅｑｕｉｒｉｎｇ）ジオキ シゲナーゼ（Ｔｕｒｎｅｒ他，１９７９；Ｂａｋｅｒ他，１９９１）によってＳ ．ｃｌａｖｕｌｉｇｅｒｕｓ 中でヒドロキシル化され、デアセチルセファロスポ リンＣ（ＤＡＣ）が形成す ることが知られているが、Ｎ．ｌａｃｔａｍｄｕｒａｎｓに関しては上記酵素は 現時点では報告されていない。これと並行して、デアセチルセファロスポリンＣ が、カルバモイルリン酸からカルバモイル基を転移させるＯ−カルバモイルトラ ンスフェラーゼによってＯ−カルバモイルデアセチルセファロスポリンＣに酵素 的に転換される（Ｂｒｅｗｅｒ他，１９８０）。上記セファマイシン中のＣ−７ におけるメトキシル基は、モノオキシゲナーゼとメチルトランスフェラーゼの作 用（Ｏ’Ｓｕｌｌｉｖａｎ他，１９７９）によって分子酸素とメチオニンから得 られる（Ｗｈｉｔｎｅｙ他，１９７２）。 微生物代謝生成物のヒドロキシル化には、少なくとも２つのタイプのオキシゲ ナーゼが関与する。第１のタイプはα−ケトグルタル酸依存性オキシゲナーゼで あり、基質中にＯ₂由来の酸素原子を導入するためにＦｅ²⁺イオンを必要とする （Ａｂｂｏｔ及びＬｉｎｄｓｔｅｄｔ，１９７４）。第２のタイプのオキシゲナ ーゼであるフラビンモノオキシゲナーゼは、電子供与体としてのピリジンヌクレ オチドとＯ₂とを必要とする。最も良く知られたフラビンモノオキシゲナーゼの １つは、二タンパク質成分酵素（ｔｗｏ ｐｒｏｔｅｉｎ ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ ｅｎｚｙｍｅ）であるＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａのｐ−ヒドロキ シフェニルアセタート−３−ヒドロキシラーゼである（Ａｒｕｎａｃｈａｌａｎ 他，１９９２）。長年に亙って、Ｃ−７ヒドロキシラーゼが、ＤＡＯＣをＤＡＣ に変換するＣ−３′ヒドロキシラーゼと異なっているかどうかは不明のままであ る。Ｄｅｍａｉｎと彼の共同研究者たち［Ｘｉａｏ他，１９９１］は、Ｓ．ｃｌ ａｖｕｌｉｇｅｒｕｓ の７−ヒドロキシラーゼ活性を精製し、このタンパク質の 配列決定されたアミノ酸末端は、以前にクローン化したＣ−３ヒドロキシラーゼ のそれに酷似している（Ｘｉａｏ他，１９９１）。 上記カルバモイル基は、シトルリンやカルバモイルアスパラギン酸のような一 次代謝の中間体の中に存在している。これらの分子は、アルギニン又はピリミジ ンの生合成の過程で、オルニチンカルバモイルトランスフェラーゼによって、又 は、アスパラギン酸カルバモイルトランスフェラーゼによって、オルニチン又は アスパラギン酸とカルバモイルリン酸から各々に形成される。 二次代謝では、上記カルバモイル基は、様々な抗生物質と他の代謝物との中に 存在している。こうしたカルバモイル基は、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ａｕｒｅｏｆａｃｉｅｎｓ Ｄｕｇｇｅｒ及びＳｔ ｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｈｙｇｒｏｓｃｏｐｉｃｕｓ Ａ−１３０によって生産 されるベンツリシジン（ｖｅｎｔｕｒｉｃｉｄｉｎ）Ａ（Ｂｒｕｆａｎｉ他，１ ９７１；１９６８）と、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｓｕｂｆｌａｖｕｓによっ て生産される抗真菌性抗生物質イルママイシン（ｉｒｕｍａｍｙｃｉｎ）（Ｎａ ｋａｇａｗａ他，１９８５）とこれに関連したＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｓｐ ．からのマクロライド系抗生物質Ｘ−１４９５２３（Ｏｍｕｒａ他，１９８５） の３′−Ｏ−カルバモイル−２−デオキシ−β−Ｄ−ラモース（ｒｈａｍｏｓｅ ）部分と、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｃａｅｓｐｉｔｏｓｕｓやＳｔｒｅｐｔ ｏｍｙｃｅｓ ｏｒｄｕｓやＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｖｅｒｔｉｃｉｌｌａ ｔｕｓ によって生産される抗腫瘍性抗生物質ミトマイシン及びポルフィロマイシ ン（ｐｏｒｆｉｒｏｍｙｃｉｎｓ）（Ｇｌａｓｂｙ，１９７９）と、Ｓｔｒｅｐ ｔｏｍｙｃｅｓ ｎｉｖｅｕｓによって生産されるＤＮＡギラーゼ阻害剤である ノボビオシン（Ｋｏｍｉｎｅｋ，１９７２）との中に存在することが発見されて いる。根粒着生に関与するＲｈｉｚｏｂｉｕｍ ｓｐ．のオリゴ糖の中にカルバ モイル基が存在することも同様に公知である （Ｐｒｉｃｅ他，１９９２；Ｈｏｌｓｔｅｒｓ他，１９９３）。 セファマイシン群のβ−ラクタム抗生物質では、カルバモイル基がセファマイ シンＣのＣ−３′ヒドロキシメチル側鎖に結合している。現在では、生化学分野 （Ｊｅｎｓｅｎ，１９８６；Ｍａｒｔｉｎ及びＬｉｒａｓ，１９８９）と遺伝学 分野（Ｋｏｖａｃｅｖｉｃ他，１９９０；Ｋｏｖａｃｅｖｉｃ及びＭｉｌｌｅｒ ，１９９１；Ｃｏｑｕｅ他，１９９１ａ，ｂ）とにおいてセファマイシンＣ生合 成の有用な知識が得られている（Ａｈａｒｏｎｏｗｉｔｚ他，１９９２）。セフ ァマイシンＣ生合成経路の初期段階のための酵素をコードする遺伝子（ｌａｔ、ｐｃｂ ＡＢ、ｐｃｂＣ）（Ｃｏｑｕｅ他，１９９１；Ｍａｄｄｕｒｉ他，１９９ １）と、上記経路の中間段階のための酵素をコードする遺伝子（ｃｅｆＤ、ｃｅ ｆ Ｅ、ｃｅｆＦ）は、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｃｌａｖｕｌｉｇｅｒｕｓ（ Ｋｏｖａｃｅｖｉｃ他，１９９０；Ｋｏｖａｃｅｖｉｃ他，１９８９）とＮｏｃ ａｒｄｉａ ｌａｃｔａｍｄｕｒａｎｓ（Ｃｏｑｕｅ他，１９９３）とにおいて クローン化されている。 セファマイシンＣ生合成の後期段階は僅かしか判明していない。生合成中間体 デアセチルセファロスポリンＣ（ＤＡＣ）は、 Ｃ−７における２段階のメトキシル化のための基質である。Ｃ−７ヒドロキシラ ーゼとＣ−７ Ｏ−メチルトランスフェラーゼとをコードする遺伝子（ｃｍｃＩ 、ｃｍｃＪ）は、Ｎ．ｌａｃｔａｍｄｕｒａｎｓから発見されていない。ＤＡＣ のＣ−３′−ヒドロキシメチル側鎖におけるカルバモイル化は、メトキシル化の 後で、又は、恐らくは、代謝グリッド（ｍｅｔａｂｏｌｉｃ ｇｒｉｄ）の形成 （図１）と並行して生じる。カルバモイルリン酸をカルバモイル供与体として使 用するＡＴＰ−依存性カルバモイルトランスフェラーゼの予備的説明が、Ｂｒｅ ｗｅｒ他（１９８０）によって行われている。しかし、こうした遺伝子をコード する遺伝子、又は、様々な抗生物質の生合成においてカルバモイル化反応を生じ させる酵素をコードする他のいずれかの遺伝子については、未だ何も分かってい ない。更に、セフェム−カルバモイルトランスフェラーゼをコードする遺伝子と 、オルニチン（又は、アスパラギン酸）カルバモイルトランスフェラーゼをコー ドする遺伝子とが何らかの類似性を有するかどうかは分かっていない。 セファマイシン生合成の後期段階を触媒する酵素をコードするＤＮＡの同定と 単離と精製は、この抗生物質を生産するため に極めて有用だろう。これらのＤＮＡは、これらの抗生物質を工業的規模で生産 するための組換え宿主細胞を樹立する上で有用だろう。 デアセトキシセファロスポリンＣヒドロキシラーゼと、Ｃ−７にメトキシル基 を導入する他の２つのタンパク質をコードする、Ｎ．ｌａｃｔａｍｄｕｒａｎｓ のセファマイシンＣ生合成のクラスター内に位置した３つの遺伝子が、単離され 配列決定された。上記２つのタンパク質の一方の配列は、芳香族化合物又はキノ ン型の化合物中に存在するヒドロキシル基に対して作用する、互いに異なった起 源のコレステロールヒドロキシラーゼとメチルトランフェラーゼの両方に類似し ている。これらのタンパク質はいずれも、Ｃ−７におけるヒドロキシル化と、７ −ヒドロキシセフェム中間体へのＳ−アデノシルメチオニンからのメチル基の転 移とにとって必要である。これに加えて、Ｎｏｃａｒｄｉａの３′−ヒドロキシ メチルセフェム Ｏ−カルバモイルトランスフェラーゼをコードする遺伝子の単 離とヌクレオチド配列とキャラクタリゼーションが開示されている。この遺伝子 は、β−ラクタム抗生物質の生合成に関与する遺伝子の標準的な命名法（ｃｅｆ は、セファロスポリン生産株とセフ ァマイシン生産株とに共通の遺伝子を表し、ｃｍｃはセファマイシン生合成に特 異的な遺伝子を表す）に従って「ｃｍｃＨ」と名付けられている（Ｍａｒｔｉｎ 他，１９９１；Ａｈａｒｏｎｏｗｉｔｚ他，１９９２）。図面の簡単な説明 図１は、セファマイシンＣ生合成経路の後期段階を示す説明図である。カルバ モイル化を、Ｃ−７におけるメトキシル基の導入の前に生じさせることも可能で ある。 図２は、ＯＲＦ７、ＯＲＦ８、ＯＲＦ９、ＯＲＦ１０を含むＮ．ｌａｃｔａｍ ｄｕｒａｎｓ の５．４ｋｂ ＢａｍＨＩ ＤＮＡフラグメントの制限地図である 。黒の太線（図の下方）は、ｐｌＪ７０２−誘導プラスミドを得るためにサブク ローニングされたＤＮＡフラグメントを示す。 図３は、５．４ｋｂ ＢａｍＨＩ ＤＮＡフラグメント内部の２６７２ｂｐの 配列を示す。 最初の６９ｎｔはｐｃｂＣ遺伝子の３′末端に相当する。ＯＲＦ７、ＯＲＦ８ 、ＯＲＦ９によってコードされる対応（ｄｅｄｕｃｅｄ）アミノ酸配列を、右側 に示す。翻訳開始コドン、翻訳終止コドン、及び、推定リボソーム結合部位には 下線を記 している。転写ターミネーターに相当する可能性があるＲＮＡ中のステムおよび ループ構造を形成するＯＲＦ９の下流の配列（ｎｔ２７３４−２７６５）を、矢 印で表示する。 図４は、Ｎ．ｌａｃｔａｍｄｕｒａｎｓのｃｍｃＨ遺伝子（ＯＲＦ１０）のヌ クレオチド配列とその対応（ｄｅｄｕｃｅｄ）アミノ酸配列を示す。反転反復を 伴った短い遺伝子間領域と、フレーム中最初のＡＴＧ（ｔｈｅ ｆｉｒｓｔ ｉ ｎ ｆｒａｍｅ ＡＴＧ）の前に位置するＧＧＡＧＧＡ（推定リボソーム結合） 配列とに留意されたい。 図５は、ｃｅｆＦ遺伝子とｃｍｃＨ遺伝子とを有するＳ．ｃｌａｖｕｌｉｇｅ ｒｕｓ セファマイシンクラスターのフラグメントを示す。プラスミドｐＵＬＦＪ Ｐ６２とｐＵＬＦＪ３０を黒の太線で示す。 図６（パネルＡ、パネルＢ）は、材料と方法に示される通りにＳ．ｌｉｖｉｄ ａｎｓ ｐｌＪ７０２−５８ａの抽出物の脱塩硫酸アンモニウム画分（３０−７ ０％）を使用する３′−セフェムヒドロキシラーゼ（ＤＡＯＣヒドロキシラーゼ ）アッセイの反応生成物のＨＰＬＣ分析を示す。パネルＡはゼロ時間の分析結果 を示し、パネルＢは２時間の反応の後の分析結果を示す。 図７（パネルＡ、パネルＢ、パネルＣ、パネルＤ）は、Ｓ．ｌｉｖｉｄａｎｓ ｐＵＬ７０２−５５ａの抽出物の脱塩硫酸アンモニウム画分を使用する７−セ フェムヒドロキシラーゼアッセイの反応生成物のＨＰＬＣ（パネルＡ、パネルＢ ）と７−ヒドロキシセフェムメチルトランスフェラーゼアッセイの反応生成物の ＨＰＬＣ（パネルＣ、パネルＤ）を示す。パネルＡとパネルＣはゼロ時間の分析 結果を示し、パネルＢとパネルＤは２時間の反応の後の分析結果を示す。 図８（パネルＡ、パネルＢ、パネルＣ）は、セファロスポリンＣ（５０μｇ／ ｍＬ）が存在する場合（ｎ）と存在しない場合（ｓ）とにおける、Ｓ．ｌｉｖｉ ｄａｎｓ ｐＵＬ７０２−５６ａ抽出物（パネルＡ）とＳ．ｌｉｖｉｄａｎｓ ｐＵＬ７０２−５７ａ抽出物（パネルＢ）とＳ．ｌｉｖｉｄａｎｓ ｐｌＪ７０ ２抽出物（パネルＣ）によるＮＡＤＨ酸化を示す。ゼロ時間において５０μｇの ＮＡＤＨを反応に加えた。発明の詳細な説明 本発明は、セファマイシンの生合成の後期段階に関与する酵素をコードするＤ ＮＡ分子の単離と精製とキャラクタリゼーションとに係わる。本発明は、組換え 宿主細胞中での発現のため にこれらのＤＮＡ分子を使用することにも係わる。本発明のＤＮＡ分子の組換え 発現は（ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）、セファマイシン抗 生物質の作製のために有用である。 この組換え発現は、組換えタンパク質の作製と精製とキャラクタリゼーション と、抗生物質の生産のための組換えタンパク質の使用を容易にするだろう。 本発明は、ｃｍｃＨ、ｃｍｃＩ、ｃｍｃＪと呼ばれるセファマイシン生合成の ための新規の酵素をコードするＤＮＡに係わる。本発明は更に、組換え発現プラ スミド中に含まれるクローン化酵素コーディングＤＮＡを発現させる組換え宿主 細胞にも係わる。本発明のＤＮＡは、セファマイシン生産細胞から単離される。 特に、上記酵素をコードするＤＮＡの単離に適したセファマイシン生産細胞は、 非限定的に、Ｎｏｃａｒｄｉａ ｌａｃｔａｍｄｕｒａｎｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍ ｙｃｅｓ ｃｌａｖｕｌｉｇｅｒｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｌｉｐｍａ ｎｉｉ 、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｐａｎａｙｅｎｓｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍ ｙｃｅｓ ｃａｔｔｌｅｙａ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｇｒｉｓｅｕｓ，Ｓ ｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｗａｄａｙａｍｅｎｓｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅ ｓ ｔｏ ｄｏｒｏｍｉｎｅｎｓｉｓ 、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｆｉｌｉｐｉｎｅｎｓ ｉｓ ｃｅｐｈａｍｙｃｉｎｉ、及び、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｈｅｔｅｒ ｏｍｏｒｐｈｕｓ を含む。最も好ましいセファマイシン生産細胞は、Ｎｏｃａｒ ｄｉａ 属である。 本発明の酵素コーディングＤＮＡを単離するために使用するのに適した細胞と 細胞系が他にもある。適切な細胞の選択を、細胞中の酵素活性をスクリーニング することによって行うことが可能である。酵素活性を検出するための方法は当業 界で公知であり、この方法に関しては下記で説明する。こうしたアッセイで酵素 活性を有する細胞は、上記酵素をコードするＤＮＡを単離するのに適しているだ ろう。 ＤＮＡをクローニングするために様々な方法の何れかを使用することが可能で ある。こうした方法は、非限定的に、酵素含有ＤＮＡライブラリーを適切な発現 ベクター系中で構築した後でＤＮＡを直接的に機能発現（ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）させることを含む。別の方法は、特定のタンパク質の アミノ酸配列から設計した標識化オリゴヌクレオチドプローブによってバクテリ オファージ又はプラスミドシャトル ベクター中で構築した、酵素活性含有ＤＮＡライブラリーをスクリーニングする ことである。好ましい方法は、上記の特定のタンパク質をコードする部分ＤＮＡ によってバクテリオファージ又はプラスミドシャトルベクター中で構築した、酵 素活性含有ＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることである。この部分ＤＮ Ａは、本発明の酵素に関連した上記特定酵素又は他の酵素に関する既知のアミノ 酸配列からの縮重オリゴヌクレオチドプライマーの設計によって、ＤＮＡフラグ メントの特異的ＰＣＲ増幅によって得られる。 他のタイプのライブラリーや、他の細胞又は細胞系統から構築したライブラリ ーを、酵素コーディングＤＮＡの単離のために使用することも可能であることは 当業者には容易に理解される。他のタイプのライブラリーは、非限定的に、Ｎｏ ｃａｒｄｉａ 細胞以外の他の細胞又は細胞系統から得られるＤＮＡライブラリー と、ゲノムＤＮＡライブラリーとを含む。 特定の酵素活性を有する細胞又は細胞系統から適切なＤＮＡライブラリーを調 製可能であることが当業者に容易に明らかである。酵素コーディングＤＮＡを単 離するためのＤＮＡライブラリーの調製に使用する細胞又は細胞系統の選択は、 本明細書で使用する公知のアッセイを使用する細胞性酵素活性を最初に 測定することによって行うことが可能である。 ＤＮＡライブラリーの調製は、当業界で公知の標準的方法で行うことが可能で ある。公知のＤＮＡライブラリー構築方法に関しては、例えば、Ｍａｎｉａｔｉ ｓ，Ｔ．，Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｅ．Ｆ．，Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．，Ｍｏｌｅｃｕ ｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎ ｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８２）を参照することが可能である 。 更に、本発明の酵素コーディングＤＮＡを適切なゲノムＧＮＡライブラリーか ら単離することも可能であることが当業者に容易に明らかである。 ゲノムＤＮＡライブラリーの構築を、当業界で公知の標準的な方法で行うこと が可能である。公知のゲノムＤＮＡライブラリー構築方法に関しては、、Ｍａｎ ｉａｔｉｓ，Ｔ．，Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｅ．Ｆ．，Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．，Ｍｏ ｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（ Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ Ｓ ｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８２）を参照することが可能である。 上記方法の中の何れか１つの方法で酵素コーディングＤＮＡ遺伝子をクローニ ングするためには、別の生物からの上記特定酵素又はその関連酵素のアミノ酸配 列又はＤＮＡ配列が必要である。このために、上記特定酵素又はその関連酵素を 精製し、部分アミノ酸配列を自動シークエネーターによって決定することが可能 である。アミノ酸配列全体を配列決定する必要はないが、６アミノ酸から８アミ ノ酸の２つの領域の直線配列を部分ＤＮＡフラグメントのＰＣＲ増幅のために決 定することが可能である。 適切なアミノ酸配列を同定した後に、そのアミノ酸配列をコードすることが可 能なＤＮＡ配列を合成する。遺伝コードが縮重しているので、個々のアミノ酸を コードするために１つ以上のコドンを使用することが可能であり、従って、その アミノ酸配列を、類似のＤＮＡオリゴヌクレオチドのセットの何れかによってコ ードすることが可能である。そのセットの１つのメンバーだけが酵素配列と同一 であり、そのセットの他のメンバーは、誤対合ＤＮＡオリゴヌクレオチドの存在 下でさえ上記ＤＮＡとハイブリッド形成することが可能だろう。この誤対合ＤＮ Ａオリゴヌクレオチドは、酵素コーディングＤＮＡの同定と単 離を可能にするのに十分なだけ上記ＤＮＡとハイブリッド形成することが依然と して可能だろう。 本発明の酵素コーディングＤＮＡを得るための別の方法は、少なくとも一定程 度の相同性を有することが知られているか又はその可能性が推測されている別個 の異なったタンパク質をコードするＤＮＡ配列を使用することである。こうした 別個の異なったタンパク質をコードするＤＮＡは、求める酵素をコードするＤＮ Ａと部分的な相同性を有するか又は相同性領域を共有することが可能である。一 定程度の相同性を有すると推測されるタンパク質をコードするＤＮＡをハイブリ ッド形成プローブとして使用することによって、このプローブとハイブリッド形 成するＤＮＡフラグメントを同定するために、ライブラリーを上記の通りにスク リーニングすることが可能である。この手段によって同定されるハイブリッド形 成ＤＮＡフラグメントを、求める酵素をこれらのＤＮＡフラグメントがコードす るかどうかを決定するために更にキャラクタリゼーションする。 上記方法の１つを使用して、上記酵素をコーディングするＤＮＡクローンを、 ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）に基づく方法とＤＮＡライブラリースクリーニ ングとを使用する２段階の アプローチで単離する。第１の段階では、精製酵素又は相同タンパク質からのＮ Ｈ₂末端及び内部アミノ酸配列情報を、酵素特異性ＤＮＡフラグメントの増幅の ための縮重オリゴヌクレオチドプライマーを設計するために使用する。第２の段 階では、これらのフラグメントを、Ｎｏｃａｒｄｉａ又は他のセファマイシン生 産細胞から得られるＤＮＡライブラリーから全長ＤＮＡを単離するためのプロー ブの役割を果たすようにクローニングする。 適切なプロモーターと他の適切な転写調節要素とを含む発現ベクターの中への 分子クローニングによって、上記方法で得たクローン化ＤＮＡを組換え発現させ 、原核宿主細胞又は真核宿主細胞の中に転移させ、組換え酵素を作製する。こう した操作のための方法に関しては、Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔ他の上記文献の記載内 容を参照することが可能であり、また、当業界で公知である。 本明細書では、発現ベクターを、クローン化ＤＮＡの転写と適切な宿主中にお けるそのｍＲＮＡの翻訳とのために必要なＤＮＡ配列と定義する。こうしたベク ターを、様々な宿主（例えば、バクテリア、藍藻、植物細胞、昆虫細胞、酵母菌 及び糸状菌を含む菌類細胞、動物細胞）中で真核細胞ＤＮＡを発現させ るために使用することが可能である。 特別に設計されたベクターは、「バクテリア細胞−菌類細胞」又は「バクテリ ア細胞−動物細胞」のような宿主間のＤＮＡのシャトリング（ｓｈｕｔｔｌｉｎ ｇ）を可能にする。適切に構築された発現ベクターは、宿主細胞中の自律複製の ための複製起点と、選択可能なマーカー（ｓｅｌｅｃｔａｂｌｅ ｍａｒｋｅｒ ｓ）と、限定数の有効制限酵素部位と、高コピー数のためのポテンシャルと、活 性プロモーターとを含まなければならない。プロモーターは、ＤＮＡに結合して ＲＮＡ合成を開始するようにＲＮＡポリメラーゼに命じるＤＮＡ配列と定義され る。強力なプロモーターは、ｍＲＮＡの高頻度の開始を生じさせるプロモーター である。発現ベクターは、非限定的に、クローニングベクター、修飾クローニン グベクター、特別に設計されたプラスミド又はウイルスを含む。 本発明の組換えセファマイシン生合成酵素を菌類細胞中で発現させるために、 様々な発現ベクターを使用することが可能である。組換え酵素の発現に適してい る可能性がある市販入手可能な発現ベクターは、非限定的に、ｐＩＪ７０２（Ａ ＴＣＣ ３５２８７）、ｐＶＥＩ（ＡＴＣＣ １４５８５）、ｐＵＬＪＬ４３（ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｌｅｏｎ）を含む。 本発明の酵素コーディングＤＮＡを、宿主細胞中での発現のための発現ベクタ ーの中にクローニングすることが可能である。宿主細胞は原核細胞と真核細胞の どちらであってもよく、非限定的に、バクテリア、哺乳動物細胞、昆虫細胞、酵 母菌及び糸状菌を含む菌類細胞を含む。適切であり且つ市販入手可能な菌類種か ら得られる細胞は、非限定的に、Ｃｅｐｈａｌｏｓｐｏｒｉｕｍ ａｃｒｅｍｏ ｎｉｕｍ （Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ）、Ａｓｐｅｒｇｉ ｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓ、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕ ｍ 、及び、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｎｏｔａｔｕｍを含む。 形質転換、トランスフェクション、プロトプラストフュージョン、エレクトロ ポレーションを非限定的に含む多くの方法の何れかを使用して、発現ベクターを 宿主細胞中に導入することが可能である。発現ベクターを内含する細胞を個々に 分析し、こうした細胞が組換えタンパク質を生産するかどうかを判定する。アン チ酵素抗体を使用する免疫反応性と、宿主細胞関連酵素活性の存在とを非限定的 に含む幾つかの手段によって、酵素発現細胞の同定を行うことが可能である。 ＤＮＡの全長オープンリーディングフレームと、上記タンパク質の特定のドメ イン又は上記タンパク質の転位ドメイン（ｒ ｅａｒｒａｎｇｅｄ ｄｏｍａｉｎｓ）だけをコードするＤＮＡ部分を含む様々 な構築物とを非限定的に含むＤＮＡ分子を、最適レベルの酵素活性及び／又はタ ンパク質をもたらすＤＮＡ配列を決定するために構築することが可能である。全 ての構築物を、酵素コーディングＤＮＡの５′及び／又は３′非翻訳領域を全く 含まないか、その全てを含むか、又は、一部分を含むように設計することが可能 である。適切な宿主細胞の中へ上記構築物を単独及び組み合わせの両方で導入し た後に、酵素活性とタンパク質発現レベルを測定することが可能である。過渡的 （ｔｒａｎｓｉｅｎｔ）アッセイにおいて最適発現をもたらすＤＮＡカセットを 決定した後に、このＤＮＡ構築物を、昆虫細胞、バクテリア、菌類細胞（酵母菌 と糸状菌を含む）を非限定的に含む様々な発現ベクター（組換えウイルスを含む ）に転移させる。 宿主細胞中の特異的組換えタンパク質のレベルを、免疫アフィニティー及び／ 又は酵素活性法を非限定的に含む様々な方法で定量する。³⁵Ｓ−メチオニンで標 識した又は非標識の組換え酵素を単離するために、酵素特異性アフィニティービ ーズ（ｅｎｚｙｍｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｆｆｉｎｉｔｙ ｂｅａｄｓ）又は 酵素特異性抗体を使用する。標識した組換え酵素をＳ ＤＳ−ＰＡＧＥで分析する。ＥＰ３特異性抗体を使用するウエスタンブロッティ ング、ＥＬＩＳＡ、又は、ＲＩＡアッセイによって、非標識の組換えタンパク質 を検出する。組換え酵素の酵素活性も下記の通りに検出し測定する。 宿主細胞中の酵素の発現の後に、酵素を回収して、その特異性活性を生じさせ ることが可能な活性形態で酵素を与えることができる。幾つかの組換え酵素精製 方法が使用可能であり、使用に適している。塩分別、イオン交換クロマトグラフ ィー、サイズ排除クロマトグラフィー、ヒドロキシルアパタイト吸着クロマトグ ラフィー、及び、疎水性相互作用クロマトグラフィーを様々に組み合わせて、又 は、これらの方法を単独で使用して、細胞ライゼートと細胞抽出物から、又は、 ならし培地から、組換え酵素を精製することが可能である。 これに加えて、全長酵素又はその酵素のポリペプチドフラグメントに対して特 異性を有するモノクローナル抗体又はポリクローナル抗体で作製した免疫アフィ ニティーカラムを使用して、組換え酵素を他の細胞タンパク質から分離すること が可能である。 上記酵素に対する単一特異性抗体を、特異的酵素に対して反 応性を有する抗体を含む哺乳動物抗血清から精製するか、又は、Ｋｏｈｌｅｒ及 びＭｉｌｓｔｅｉｎ，Ｎａｔｕｒｅ ２５６：４９５−４９７（１９７５）の方 法を使用してその酵素に対して反応性を有するモノクローナル抗体として調製す る。本明細書では、術語「単一特異性抗体」を、当該酵素に対する均一な結合特 性を有する単一の抗体種又は複数の抗体種と定義する。本明細書では、上記のよ うに、術語「均一な結合」は、上記酵素に関連した特異的抗原又はエピトープの ような特異的抗原又はエピトープに対する抗体種の結合能力を意味する。免疫ア ジュバントと共に又は免疫アジュバントなしで、適切な濃度の酵素によって動物 （例えば、マウス、ラット、モルモット、ウサギ、ヤギ、ウマ等）を免疫感作す ることによって、組換え酵素特異性抗体を生じさせる。 単一特異性抗体を作製するための上記方法が、ポリペプチドフラグメント又は 全長ポリペプチドに対して特異性を有する抗体を作製するために使用可能である ことは、当業者には容易に明らかである。 抗体がアガロースゲルビーズ支持体との共有結合を形成するようにＮ−ヒドロ キシスクシンイミドエステルで予活性化した ゲル支持体、Ａｆｆｉｇｅｌ−１０（Ｂｉｏｒａｄ）に抗体を加えることによっ て、酵素特異性抗体アフィニティーカラムを作製する。その後で、スペーサーに よってアミド結合を介して抗体をゲルと結合させる。残りの活性化エステルを１ ＭエタノールアミンＨＣｌ（ｐＨ８）でクエンチする。カラムを水で洗浄し、そ の後で０．２３ＭグリシンＨＣｌ（ｐＨ２．６）で洗浄し、非複合抗体（ｎｏｎ −ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ ａｎｔｉｂｏｄｙ）又は異質（ｅｘｔｒａｎｅｏｕｓ ）タンパク質を全て取り除く。更に、カラムをリン酸緩衝溶液（ｐＨ７．３）中 で平衡化し、組換え酵素又はそのフラグメントを含む細胞培養上清液又は細胞抽 出物を、上記カラム中をゆっくりと通過させる。その後で、そのカラムを、光学 濃度（Ａ₂₈₀）がバックグラウンドに低下するまでリン酸緩衝溶液で洗浄し、タ ンパク質を０．２３Ｍグリシン−ＨＣｌ（ｐＨ２．６）で溶離させる。精製した タンパク質をリン酸緩衝溶液に対して透析する。 本発明を説明するために下記の実施例を示すが、これらの実施例は本発明を何 ら限定するものではない。実施例１ 細菌菌株とプラスミド 改良セファマィシンＣ生産菌であるＮ．ｌａｃｔａｍｄｕｒ ａｎｓ ＬＣ４１１を、ＤＮＡ及びＲＮＡの供給源として使用した。β−ラクタ ム抗生物質を合成できない菌株であるＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｌｉｖｉｄａ ｎｓ １３２６（Ｈｏｐｗｏｏｄ他、１９８５）を、形質転換と発現実験とのた めの宿主として使用した。Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＨ５αを高頻度形質転換のために使 用し、Ｅ．ｃｏｌｉ ＷＫ６をヘルパーファージＭＫ１３Ｋ０７と共に一本鎖Ｄ ＮＡを得るために使用した。 セファマイシンＣ生合成クラスターの遺伝子をラムダファージＥＭＢＬ−Ｃ２ とＣ８から単離し（Ｃｏｑｕｅ他、１９９１ａ）、プラスミドｐＢｌｕｅｓｃｒ ｉｐｔ ＫＳ（＋）又はｐｌＪ２９２１の中にサブクローニングした。Ｎ．ｌａ ｃｔａｍｄｕｒａｎｓ 遺伝子をＳ．ｌｉｖｉｄａｎｓ中で発現させるために、こ の遺伝子をｐｌＪ７０２中にサブクローニングした（Ｋａｔｚ他，１９８３）。実施例２ 発酵条件 種培養（ｓｅｅｄ ｃｕｌｔｕｒｅｓ）を準備するために、組換えプラスミド を含むＳ．ｌｉｖｉｄａｎｓ形質転換細胞を、スクロース３４％を含むＹＥＭＥ 培地中で成長させた（Ｈｏｐｗｏｏｄ他，１９８５）。ＹＥＭＥ培地中で４８時 間成長させ た後に、この培養２５ｍＬを使用して、グルコースとリジンを含む最少培地１０ ０ｍＬを入れた５００ｍＬトリプルバッフルフラスコに接種し（Ｃｏｑｕｅ他， １９９１ｂ）、２５０ｒｐｍで作動する軌道振とう機（ｏｒｂｉｔａｌ ｓｈａ ｋｅｒ）中で３０℃で成長させた。形質転換細胞菌株の培養を成長させるために 使用した接種材料と発酵培地の全てはチオエストレプトン（ｔｈｉｏｅｓｔｒｅ ｐｔｏｎ）（５μｇ／ｍＬ）を含んでいた。 ２０μｇ／ｍＬ ＤＮＡｓｅと１ｍＭ ＰＭＳＦとを含むＭＯＰＳ緩衝液１０ ０ｍＭ（ｐＨ７．５）中に、洗浄した菌糸体を懸濁させることによって、無細胞 抽出物を調製した。Ｂｒａｎｓｏｎ Ｓｏｎｉｆｉｅｒ Ｂ−１２又はＦｒｅｎ ｃｈ Ｐｒｅｓｓ（Ａｍｉｎｃｏ）を使用して音波処理によって細胞を破壊した 。実施例３ ＤＮＡ単離、配列決定、及び、操作 配列決定すべきフラグメントをｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＫＳ（＋）中で両方 向にサブクローニングした。ネストＤＮＡフラグメントの定序セット（ｏｒｄｅ ｒｅｄ ｓｅｔｓ ｏｆ ｎｅｓｔｅｄ ＤＮＡ ｆｒａｇｍｅｎｔｓ）を、Ｅ ｒａｓｅ −ａ−Ｂａｓｅシステム（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓ）を使用し て逐次欠失によって作製した。圧縮（ｃｏｍｐｒｅｓｉｏｎ）を防ぐためにＴａ ｑポリメラーゼ（Ｐｒｏｍｅｇａ）と７−デアザ−ｄＧＴＰを使用するジデオキ シヌクレオチド配列決定法（Ｓａｎｇｅｒ他，１９７７）によって、ＤＮＡを両 方向に配列決定した。プラスミドＤＮＡの単離、エンドヌクレアーゼによる消化 、標識化、及び、サザンハイブリッド形成を、標準的手順（Ｓａｍｂｒｏｏｋ他 ，１９８９）に従って行った。Ｓ．ｌｉｖｉｄａｎｓの形質転換を公知の通りに 行った（Ｈｏｐｗｏｏｄ他，１９８５；Ｇａｒｃｉａ−Ｄｏｍｉｎｇｕｅｚ他， １９９１）。ＤＮＡ及びタンパク質の配列解析 ＤＮＡ中のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）をＧＥＮＥＰＬＯＴプロ グラムを使用して同定した。逆方向反復塩基配列をＳＴＥＭ＆ＬＯＯＰプログラ ムによって位置決定した。ＥＭＢＬ Ｓｗｉｓｓ Ｐｒｏｔデータバンクを使用 したＡＡＬＩＧＮプログラムによってタンパク質の比較を行った。 Ｄｏｔ Ｐｌｏｔ分析を、２５アミノ酸の窓サイズ（ｗｉｎｄｏｗ ｓｉｚｅ ）と３０％のパーセント符合を使用したＤｏｔ−Ｐｌｏｔプログラムによって行 った。 『ｐｃｂＣ遺伝子から下流に位置した３つのオープンリーディングフレーム（Ｏ ＲＦ）の中の１つが、ｃｅｆＥプローブとハイブリッド形成する。』 Ａ．ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ遺伝子ｃｅｆＥＦの７３４ｂｐ Ｓａｃｌｌ内部 プローブを使用してＮ．ｌａｃｔａｍｄｕｒａｎｓからのｃｅｆＥ遺伝子をクロ ーニングしていた時に、２つの陽性のハイブリッド形成バンドを、Ｎ．ｌａｃｔ ａｍｄｕｒａｎｓ の全体ＤＮＡ中に発見した。その１つをキャラクタリゼーショ ンし（ｃｅｆＥ遺伝子）、ＤＡＯＣシンターゼ（エキスパンダーゼ）（Ｃｏｑｕ ｅ他，１９９１ａ）をコードすることを確認した。第２のハイブリッド形成バン ドが何であるかは不明だったが、近縁の遺伝子又は重複ｃｅｆＥ遺伝子である可 能性があった。従って、そのＤＮＡバンドがコードしたものを確定するために、Ｎ．ｌａｃｔａｍｄｕｒａｎｓ セファマイシンＣ遺伝子クラスターのＤＮＡフラ グメントを含むファージをＢａｍＨＩで消化し、Ｎ．ｌａｃｔａｍｄｕｒａｎｓ からのｃｅｆＥ遺伝子の内部の５０３ｂｐ Ａｖａｌｌ ＤＮＡフラグメントと ハイブリッド形成させた。５．４ｋｂ ＢａｍＨＩ ＤＮＡフラグメント（図２ ）［ｐｃｂＣ遺伝子を含むがｃｅｆＥ遺伝子は含まないことが知られている（Ｃ ｏｑｕｅ他，１９ ９１；１９９３）］は、強い陽性のハイブリッド形成を生じさせた。ｐｃｂＣか ら下流に位置するこの５．４ｋｂ ＤＮＡフラグメントの領域全体を配列決定し た。３つのＯＲＦであるＯＲＦ７、ＯＲＦ８、ＯＲＦ９（図２）を発見し、第４ の完全ＯＲＦ（ＯＲＦ１０）はＯＲＦ９の下流に存在した。ＧＥＮＥＰＬＯＴプ ログラム（ＤＮＡＳＴＡＲ）を使用した時に、この４つのＯＲＦは、放線菌遺伝 子において予想されるようなコドンの第３位置における高頻度のＧＣを明らかに 示した。 サブクローニング実験と欠失実験とによって、ｃｅｆＥプローブが特異的にＯ ＲＦ９とハイブリッド形成することが明らかになった。 『ｃｅｆＦ遺伝子としてのＯＲＦ９のキャラクタリゼーション』 ＯＲＦ９はｐｃｂＣから１．６ｋｂ下流に位置し、このＯＲＦ９は９３３ヌク レオチドのサイズ（図３）と６８．１％のＧ＋Ｃ含量を有する。ＯＲＦ９は、推 定Ｍｒが３４，３６６で且つ予想ｐＩが４．６５であるタンパク質をコードする 。この遺伝子は上流ＯＲＦ（ＯＲＦ８）から２３ヌクレオチド分だけ離れている 。推定リボソーム結合部位（ＲＢＳ）ＧＡＧＧＡＧＣＡがＡＴＧ翻訳開始トリプ レットから７ｂｐ上流の遺伝子間領 域内に存在する。ＴＡＧ終止コドンの下流には、二次構造（ｎｔ２７３４−２７ ６７）が、−３１Ｋｃａｌ／モルの計算上の自由エネルギーを有するターミネー ターに対応する可能性があるステム及びループ構造を形成する。 コンピューターを使用して、ＯＲＦ９のアミノ酸及びヌクレオチド配列を、セ ファロスポリン生合成又はセファマイシン生合成に関与するエキスパンダーゼ及 びヒドロキシラーゼと比較することによって、Ｓ．ｃｌａｖｕｌｉｇｅｒｕｓのｃｅｆ Ｆコード化タンパク質との８０．８％のヌクレオチドの同一性と７７．５ ％のアミノ酸の同一性が明らかになった。ＯＲＦ９でコードされたタンパク質は 、（ｃｅｆＥＦでコードされた）Ａ．ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍの二機能（ｂｉｆ ｕｎｃｔｉｏｎａｌ）エキスパンダーゼ／ヒドロキシラーゼと、（ｃｅｆＦでコ ードされた）Ｎ．ｌａｃｔａｍｄｕｒａｎｓとＳ．ｃｌａｖｕｌｉｇｅｒｕｓの エキスパンダーゼとに対しても、高い類似性を示した。 『ＯＲＦ７とＯＲＦ８のキャラクタリゼーション』 推定ｐＩが４．８９である２３６アミノ酸（２７，３６４ダルトン）のタンパ ク質（Ｐ７と名付ける）をコードする７１１ヌクレオチドのＯＲＦ（ＯＲＦ７） が、ｐｃｂＣ遺伝子から下 流に１３ヌクレオチド離れた位置で開始する。ＯＲＦ７から僅かに７ヌクレオチ ド離れた下流の位置で、ｐＩが５．０２である２９２アミノ酸（３２，０９０ダ ルトン）の対応（ｄｅｄｕｃｅｄ）タンパク質（Ｐ８）をコードする８７６ヌク レオチドの配列ＯＲＦ８が開始する（図３）。ＯＲＦ７のＧ＋Ｃ含量は６７．５ ％であり、ＯＲＦ８のＧ＋Ｃ含量は７１．９％である。ＯＲＦ７のＡＴＧから１ ３ヌクレオチド上流の位置に、ＯＲＦ９の上流に発見したＲＢＳ配列と同一の推 定ＲＢＳ配列（ＧＡＧＧＡＧＣＡ）を確認した。ＯＲＦ７とＯＲＦ８との間が僅 かしか離れていないことと、推定ＰＢＳ配列（ＧＡＧＧＡＧＣＡ）がＯＲＦ７末 端の前（コーディング配列の内側）に存在することとは、これらの両遺伝子がリ ボソームの放出なしに共翻訳されることを示唆している。 データバンク中に含まれる他のタンパク質に対する、ＯＲＦ７によってコード された推定タンパク質の比較ＤＯＴＰＬＯＴ分析によって、ＯＲＦ７生成物が、Ｓ．ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ とＥ．ｃｏｌｉからの化学走性（ｃｈｅ遺伝子）に 関与するＯ−メチルトランスフェラーゼと、ヒドロキシインドイル−Ｏ−メチル トランスフェラーゼと、カテコール−Ｏ−メチルトランスフェラーゼと、コーヒ ー酸−Ｏ−メチルトランスフェラー ゼとに対して相同性を示し、一方、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｆｒａｄｉａｅ （ｔｃｍＰ、ｔｃｍＯ）からのチロシンメチルトランスフェラーゼと、Ａｚｏｒ ｈｉｚｏｂｉｕｍ （ｎｏｄＳ）の根粒着生に関与するオリゴ糖のメチル化のため のメチルトランスフェラーゼとに対して、より低い相同性を示すことが明らかで ある。典型的なＳ−アデノシルメチオニン結合モチーフがＮ末端領域（アミノ酸 １０から２６）中に存在する（Ｉｎｇｒｏｓｓｏ他，１９８９）。これらのタン パク質全てがフェノール性又はヘテロ環式ヒドロキシル基のＯ−メチル化を触媒 するので、ＯＲＦ７はＣ−７ヒドロキシセフェムメチルトランスフェラーゼをコ ードすると考えられる。しかし、これに加えて、上記タンパク質は、コレステロ ール核内のＣ−７位置に酸素を導入する酵素であるヒト及びラットのコレステロ ール７−α−モノオキシゲナーゼに対して、５９アミノ酸において３０．５％の 同一性を示す。 ＯＲＦ８タンパク質は、ＥＭＢＯとＳｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔデータバンクとに含 まれる何れのタンパク質とも有意な相同性を示さず、カップリングタンパク質（ ｃｏｕｐｌｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ）として振る舞う。 『Ｎ．ｌａｃｔａｍｄｕｒａｎｓのＯＲＦ１０の位置』 ５．４ｋｂ ＢａｍＨＩ ＤＮＡフラグメント中に存在する遺伝子ｃｅｆＦ、ｃｍｃ Ｉ、ｃｍｃＪのキャラクタリゼーションの間に、不完全ＯＲＦ（ＯＲＦ１ ０）を発見した。このＯＲＦはｃｅｆＦの下流に位置した。この遺伝子の完全配 列を得るために、セファマイシンＣ遺伝子クラスターの３．６ｋｂ ＢａｍＨＩ ＤＮＡフラグメント［ＯＲＦ９（ｃｅｆＦ）から下流の５．４ｋｂ ＢａｍＨ Ｉフラグメントに近接していることが知られている（Ｃｏｑｕｅ他，１９９３） ］をサブクローニングし、両方向に配列決定した。この３．６ｋｂ ＢａｍＨＩ フラグメントは、ｂｌａ遺伝子（Ｃｏｑｕｅ他，１９９３）と、ＯＲＦ１０の３ ′領域と、ＯＲＦ１４の５′末端を含む。単一ＤＮＡフラグメント中のＯＲＦ１ ０を得るために、３．４ｋｂ ＮｏｔＩ ＤＮＡフラグメントを組換えラムダフ ァージＥＭＢＬ−Ｃ２から単離し、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＫＳ（＋）中でサ ブクローニングした。このフラグメントを回収し、末端をクレノウポリメラーゼ で充填し、合成８−ｍｅｒ ＢｇｌＩＩリンカーに連結反応させ、ＢｇｌＩＩで 消化したｐＩＪ２９２１中でサブクローニングした。このプラスミドから、Ｂｇ ｌ ＩＩ末端を有する３．４ｋｂフラグメントを、ｍｅｌ遺伝子の 同一方向に且つｍｅｌプロモーターから下流にＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓプラス ミドｐｌＪ７０２中でサブクローニングし、プラスミドｐＵＬ７０２−３７ａを 得た（図２）。 『ＯＲＦ１０のキャラクタリゼーション』 ＯＲＦ１０の翻訳イニシエーターＡＴＧコドンはｃｅｆＦから７４ｂｐ下流に 位置する。シャイン・ダルガルノリボソーム結合配列に類似するＧＧＡＧＧＡ配 列がその前に位置する。転写される場合に、−３１Ｋｃａｌ／モルの計算上の自 由エネルギーを有するステム及びループ構造を形成することが可能な１５ｂｐの 逆方向反復塩基配列が、遺伝子間領域内に存在する。この構造が機能ターミネー ター（ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ）である場合には、ＯＲＦ １０をそれ自体のプロモーターから発現させなければならない。或いは、ＯＲＦ １０を上流プロモーターから発現させることも可能であり、逆方向反復塩基配列 が、抗終結機構によって調節されたターミネーターとして作用する可能性がある 。ＯＲＦ１０は１５６３ｎｔを含み（図４）、Ｎ．ｌａｃｔａｍｄｕｒａｎｓ配 列決定ゲノムの平均Ｇ＋Ｃ含量（７０．４％）（Ｃｏｑｕｅ他，１９９３ａ）に 近い６８．８％のＧ＋Ｃ含量を有する。これは、推定 Ｍｒが５７１４９でｐＩが５ ２である５２０アミノ酸のタンパク質をコードす る。 アミノ酸比較をＡａｌｉｇｎプログラムを使用して行った時に、ＯＲＦ１０に よってコードされたタンパク質は、Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｆｒｅｄｉｉとＢｒａ ｄｙｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｊａｐｏｎｉｃｕｍの両方からのｎｏｄＵ遺伝子のＣ 末端に対して３２．１％（２８７アミノ酸）及び３０．２％（２８１アミノ酸） の同一性を示した。ｎｏｄＵ遺伝子は、根粒着生に必要なカルバモイル化多糖の 生合成のためのＯ−カルバモイルトランスフェラーゼをコードする（Ｌｅｗｉｎ 他，１９９０）。従って、ＯＲＦ１０に対応する遺伝子は、セフェム−カルバモ イルトランスフェラーゼをコードし、β−ラクタム生合成遺伝子の呼称に関する Ｍａｒｔｉｎ他（１９９１）及びＡｈａｒｏｎｏｗｉｔｚ他（１９９２）の提案 に従って、この遺伝子をｃｍｃＨと命名した。ｃｍｃＨでコードされたタンパク 質は、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓ、及び、様々 な他の微生物のアスパラギン酸カルバモイルトランスフェラーゼとオルニチンカ ルバモイルトランスフェラーゼとに対して全般的相同性をほとんど示さなかった 。 『Ｓ．ｃｌａｖｕｌｉｇｅｒｕｓのｃｍｃＨ遺伝子の位置』 ラムダＧＥＭ１２中のＳ．ｃｌａｖｕｌｉｇｅｒｕｓ ＤＮＡのゲノムライブ ラリーから、ｃｍｃＨ及び近傍のｃｅｆＦ遺伝子を、プラスミドｐＵＬＦＪＰ６ ２を起点とする６．２ｋｂ ＢａｍＨＩ ＤＮＡフラグメントとしてｐＩＪ７０ ２の中にサブクローニングした。セファマイシンクラスターのＤＮＡフラグメン トを含むラムダＧＥＭ１２ファージを、Ｎ．ｌａｃｔａｍｄｕｒａｎｓのｃｅｆ Ｆ遺伝子又はｃｍｃＨ遺伝子でハイブリッド形成させた時に、ファージＥＭＢＬ −Ｃ５中と６．２ｋｂ ＢａｍＨＩ ＤＮＡフラグメント中とに陽性のハイブリ ッド形成を発見した。従って、Ｓ．ｃｌａｖｕｌｉｇｅｒｕｓの６．２ｋｂ Ｄ ＮＡフラグメントは、ｃｅｆＦ遺伝子（Ｋｏｖａｃｅｖｉｃ他，１９９１）とｃ ｍｃ Ｈ遺伝子とを含む。 ハイブリッド形成Ｓ．ｃｌａｖｕｌｉｇｅｒｕｓ ＤＮＡ配列を、ｃｅｆＦ遺 伝子も含む３．０ｋｂ ＫｐｎＩ ＤＮＡフラグメント内に更に厳密にマッピン グした（図５）。３．０ｋｂ ＫｐｎＩ ＤＮＡフラグメントを、プラスミドｐ ＵＬＦＪＰ３０を与えるｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＫＳ（＋）中にサブクローニ ングし、（ｃｅｆＦの下流の）遠位末端のＫｐｎＩ部位における１６０ｂｐを配 列決定した。１６０ｎｔ配列は、Ｎ． ｌａｃｔａｍｄｕｒａｎｓ のｃｍｃＨ遺伝子の配列（図３Ａのｎｔ１４７９−１ ６３９）に殆ど完全に一致し、ヌクレオチドにおいて８０％の同一性とその対応 （ｄｅｄｕｃｅｄ）アミノ酸において８１％の同一性を有した。こうした結果は 、セファマイシンＣ生産菌Ｓ．ｃｌａｖｕｌｉｇｅｒｕｓとＮ．ｌａｃｔａｍｄ ｕｒａｎｓ との両方のセファマイシンクラスターの組織全体が互いに異なってい るにも係わらず、ｃｅｆＦとｃｍｃＨの相対位置がこれらのクラスターにおいて 同一であるということを明らかに示していた（Ｍａｒｔｉｎ他，１９９２；Ｍａ ｒｔｉｎ及びＧｕｔｉｅｒｒｅｚ，１９９４）。実施例４ 細胞成長と無細胞抽出物の調製 グルコースとリジンとを含む最少培地中で４８時間成長させたＳ．ｌｉｖｉｄ ａｎｓ 形質転換細胞から無細胞抽出物を得た（Ｍａｄｄｕｒｉ他，１９９１）。 細胞を洗浄し、ＤＴＴ（１ｍＭ）とＰＭＳＦ（１ｍＭ）とＤＮＡｓｅ（２０μｇ ／ｍＬ）とを含む１００ｍＭ ＭＯＰＳ（ｐＨ７．５）中に懸濁した。この細胞 懸濁液をＢｒａｎｓｏｎ Ｂ−１２振動器で音波処理した。プロタミン硫酸（０ ．１％）による処理によって無細胞 抽出物から核酸を取り除き、上清液中のタンパク質を硫酸アンモニウム（０−８ ０％）で沈殿させた。このタンパク質沈殿物を同じＭＯＰＳ緩衝液中に溶解し、 ＰＤ−１０カラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を通過させた。実施例５ ３′−ヒドロキシメチルセフェム Ｏ−カルバモイルトランスフェラーゼ（ＣＣ Ｔ）アッセイ ３′−ヒドロキシメチルセフェム Ｏ−カルバモイルトランスフェラーゼ活性 を、次の３つの異なる方法で検定した。ｉ）Ｂｒｅｗｅｒ他（１９８０）が報告 しているように、デカルバモイルセフロキシムと［¹⁴Ｃ］カルバモイルリン酸と を基質として使用し、Ｐｈｉｌｌｉｐｓ ＰＷ４７００ シンチレーション計数 管によって、酢酸エチルで抽出可能なカルバモイル化セフロキシムの放射能を測 定した。（ｉｉ）或いは、カルバモイル化の定性決定のために、反応生成物のＴ ＬＣクロマトグラフィーを、ｎ−プロパノール：氷酢酸：水（５：１：２）を使 用してシリカゲル６０プレート（２０ｘ２０）上で行い、（ａ）１％ｗ／ｖアジ 化ナトリウムを含むＩ₂／ＫＩ ５ｍＭ溶液と （ｂ）デンプン１％溶液とを上記プレートに散布することによって、セフェム環 を含む化合物を検出した。 『Ｎ．ｌａｃｔａｍｄｕｒａｎｓとＳ．ｃｌａｖｕｌｉｇｅｒｕｓのｃｍｃＨ遺 伝子が機能的３′−ヒドロキシメチルセフェム Ｏ−カルバモイルトランスフェ ラーゼ活性をコードする。』 Ｓ．ｌｉｖｉｄａｎｓ［ｐＩＪ７０２］、Ｓ．ｌｉｖｉｄａｎｓ［ｐＵＬ７０ ２−３７ａ］（Ｎ．ｌａｃｔａｍｄｕｒａｎｓからのｃｍｃＨ遺伝子を含む）、 及び、Ｓ．ｌｉｖｉｄａｎｓ［ｐＵＬＦＰ６２］（Ｓ．ｃｌａｖｕｌｉｇｅｒｕ ｓ からのｃｍｃＨ遺伝子を含む）の培養（最少培地中で４８時間）の無細胞抽出 物を得、ＣＣＴ活性を定量した。表１は、Ｎ．ｌａｃｔａｍｄｕｒａｎｓ遺伝子 を含むＳ．ｌｉｖｉｄａｎｓ菌株のＣＣＴ特異的活性が、ｐＩＪ７０２で形質転 換したＳ．ｌｉｖｉｄａｎｓのバックグラウンドレベルよりも７．５倍高く、Ｓ ．ｃｌａｖｕｌｉｇｅｒｕｓ 遺伝子を含むＳ．ｌｉｖｉｄａｎｓ菌株のＣＣＴ特 異的活性が、ｐＩＪ７０２で形質転換したＳ．ｌｉｖｉｄａｎｓのバックグラウ ンドレベルよりも７．７倍高いことを示している。無細胞抽出物を硫酸アンモニ ウムで処理した後に、３′−ヒドロキシメチルセフェム Ｏ−カルバモイ ルトランスフェラーゼが４５−６５％の画分で沈殿することを確認し、更に別の 生化学的キャラクタリゼーションのために精製した。このことは、ＯＲＦ１０（ｃｍｃ Ｈ）が機能的３′−ヒドロキシメチルセフェム Ｏ−カルバモイルトラン スフェラーゼをコードすることを実証する。 実施例６ ３′−メチルセフェム−ヒドロキシラーゼ活性 硫酸アンモニウム（３０−７０％）によって粗抽出物を沈殿させ、その調製物 をＳｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−２５ カラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ ＰＤ−２）を通 して脱塩した後に、この活性（ＤＡＯＣヒドロキシラーゼとしても知られる）を 測定した。ＤＡＯＣからＤＡＣへの変換に基づくアッセイを、Ｋｏｖａｃｅｖｉ ｃ他（１９８９）によって説明されている通りに行い、３０℃で１２０分間イン キュベートした。メタノール（２００μＬ）で反応を停止させ、沈殿タンパク質 を１０分間１４，０００ｒｐｍで遠心分離して取り除き、反応生成物を上清液中 で定量した。ＤＡＯＣからＤＡＣへのヒドロキシル化の後に、２００ｍＭ Ｎａ Ｈ₂ＰＯ₄（ｐＨ４．０）により流量１．５ｍＬ／分で平衡化と溶離を行ったＷａ ｔｅｒｓ ｐＢｏｎｄａｐａｋ Ｃ１８ カラム（３００ｘ３．８ｍｍ）を使用 してＨＰＬＣを行った。溶離画分を２５４ｎｍで測定した。この条件下で、ＤＡ ＯＣが保持時間１０．７分で溶出し、ＤＡＣが保持時間３．７分で溶出した。 『ｃｅｆＦ遺伝子が、セフェム−７−ヒドロキシラーゼ活性の ない機能的セフェム−３−ヒドロキシラーゼをコードする。』 ＯＲＦ９の生成物を完全にキャラクタリゼーションするために、５．４ｋｂ Ｂａｍ ＨＩフラグメントをｐｌＪ７０２中にサブクローニングし［Ｋａｔｚ．， Ｅ．他，１９８３，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，１２９，ｐｐ２７０３ −２７１４］、プラスミドｐｌＪ７０２−５４ａを得た。更に、１．４ｋｂ Ｎ ｏｔ ｌ−Ｍｌｕｌ ＤＮＡフラグメント（５．４ｋｂフラグメントに対して内部 ）を、末端充填（ｅｎｄ−ｆｉｌｌｅｄ）し、ｐｌＪ２９２１のポリリンカー中 にサブクローニングし、ＢｇｌＩＩで回収し、ｐｌＪ７０２のＢｇｌＩＩ部位中 にサブクローニングし、ｐｌＪ７０２−５８ａを得た（図２）。両方の場合とも 、ＯＦＲ９をｍｅｌプロモーターから下流に且つｍｅｌプロモーターと同方向に サブクローニングした。更に、１．４ｋｂ Ｎｏｔｌ−Ｍｌｕｌフラグメントを ｐｌＪ６９９のＢａｍＨＩ部位中にサブクローニングし［Ｋｉｅｓｅｒ，Ｄ．及 びＭｅｌｔｏｎ，Ｒ．Ｄ．，１９８８，Ｇｅｎｅ，６５，ｐｐ８３−９１］、プ ラスミドｐｌＪ６９９−５８ａを得た。 発現プラスミド［ｐｌＪ７０２−５４ａ］によって形質転換したＳ．ｌｉｖｉ ｄａｎｓ の４８時間培養からの無細胞抽出物 に対して、ＤＡＯＣヒドロキシラーゼ活性のアッセイを行った。反応生成物のＨ ＰＬＣ分析は、純粋なデアセチルセファロスポリンＣと共に共溶離した（ｃｏ− ｅｌｕｔｅｄ）（図６Ａ）保持時間３．７分の生成物の形成（図６Ｂ）を示し、 ＤＡＯＣヒドロキシラーゼ活性を立証した。同じＤＡＯＣヒドロキシラーゼ活性 をＳ．ｌｉｖｉｄａｎｓ［ｐｌＪ７０２−５８ａ］の培養中で確認した。 Ｓ．ｌｉｖｉｄａｎｓ［ｐｌＪ７０２−５８ａ］とＳ．ｌｉｖｉｄａｎｓ［ｐ ｌＪ６９９−５８ａ］の培養を、発酵中に別々の時点でＣ−７ヒドロキシラーゼ 活性に関して試験した。何れの時点でもＣ−７ヒドロキシラーゼ活性は検出でき ず、このことは、ＯＲＦ９が、Ｃ−３′位置でセフェム核をヒドロキシル化する がＣ−７位置ではヒドロキシル化しないＮ．ｌａｃｔａｍｄｕｒａｎｓのｃｅｆ Ｆ遺伝子をコードすることを立証した。 これらの結果は、２つの異なったヒドロキシラーゼがセファマイシン生合成の 後期反応に必要であることを示している。実施例７ ７−セフェム−ヒドロキシラーゼと７−ヒドロキシセフェムメチルトランスフェ ラーゼのアッセイ 上記の通りに、Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−２５ カラムを通して脱塩した後に粗 抽出物の３０−７０％硫酸アンモニウム沈殿物中の上記酵素を測定した。このア ッセイは、セファロスポリンＣの７−ヒドロキシセファロスポリンＣ及び７−メ トキシセファロスポリンＣへの変換に基づいている（Ｘｉａｏ及びＤｅｍａｉｎ ，１９９１）。その反応に必要な酸素転移を促進するために振とうを行いながら 、水浴中で反応を実施した。３０℃で１２０分間インキュベートした後に、酢酸 （１０μＬ）を加えて反応を停止させ、５分間１４，０００ｒｐｍで遠心するこ とによってタンパク質を取り除いた。 上清液を、５０ｍＭトリス塩酸（ｐＨ６．０）で平衡化したＱＡＥ−Ｓｅｐｈ ａｄｅｘカラム（カラム床体積１ｍＬ）に充填した。上記緩衝液６００μＬでカ ラムを洗浄した後に、反応生成物を３Ｎ ＮａＣｌ（６００μＬ）で溶離させた 。１．５ｍＬの流量で、０−２０分：メタノール０％、３０分：メタノール５％ 、及び、４０分：メタノール１０％のメタノール勾配で溶離を行ったことを除い て、上記の通りにＷａｔｅｒｓ μＢｏｎｄａｐａｃｋ Ｃ₁₈カラム中で反応生 成物のクロマトグラフィーを行った。こうした条件の下で、基質と生成物の保 持時間は、セファロスポリンＣが２９．２分、７−ヒドロキシセファロスポリン Ｃが１４．２分、７−メトキシ−セファロスポリンＣが１７．７分だった。或い は、Ｓ−アデノシル−Ｌ−［メチル−¹⁴Ｃ］メチオニン（２５μＣｉ／ｍＬ）を アッセイに使用し（反応毎に２５０ｎＣｉ）、ＨＰＬＣクロマトグラフィー後に 放射性同位体検出器（Ｂｅｃｋｍａｎ １７１）を使用して標識化７−メトキシ セファロスポリンＣを測定した。 『Ｓ．ｌｉｖｉｄａｎｓ中のＯＲＦ７とＯＲＦ８の発現が、Ｃ−７メトキシル化 活性を生じさせる。』 ＯＲＦ７によってコードされたタンパク質とメチルトランスフェラーゼとの間 の類似性は、セフェム核内のＣ−７におけるメトキシル化のための酵素をコード する遺伝子にＯＲＦ７（及びＯＲＦ８）が対応する可能性があることを示唆して いる。従って、（ＯＲＦ７とＯＲＦ８を含む）ｐｌＪ７０２−５４ａからの３０ ６１ｂｐ Ｐｓｔｌ ＤＮＡフラグメントを、ｐｌＪ２９２１中にサブクローニ ングし、ＢｇｌＩＩ回収し、ｐｌＪ７０２中にｍｅｌプロモーターから下流に且 つｍｅｌプロモーターと同方向にサブクローニングし、発現プラスミドｐｌＪ７ ０２−５５ａを得た。Ｓ．ｌｉｖｉｄａｎｓ［ｐｌＪ７０２ −５５ａ］の４８時間培養の無細胞抽出物を硫酸アンモニウム（３０−７０％） で沈殿させ、Ｃ−７ヒドロキシラーゼ活性とメチルトランスフェラーゼ活性に関 して試験した。保持時間１４．２分（図７Ｂ）の生成物がＣ−７ヒドロキシル化 中に形成される。このピークは、ｓ−アデノシルメチオニン（ＳＡＭ）をそのア ッセイに加えた時に減少（図７Ｄ）し、保持時間１７．７分の第２の生成物が付 随的形成した。このことは、Ｃ−７ヒドロキシラーゼ活性とメチルトランスフェ ラーゼ活性（７−メトキシＣＰＣとして同定）の両方が形質転換細胞中に存在す ることを示し、この２つの活性は両方とも対照試料のＳ．ｌｉｖｉｄａｎｓ［ｐ ｌＪ０Ｏ２］無細胞抽出物中には発見されなかった（図７Ａと図７Ｃ）。保持時 間が１７．７分の生成物を同定するために、標識したＳＡＭを上記アッセイに使 用し、反応生成物の放射能をＨＰＬＣとＴＬＣで観察し、更にその後でオートラ ジオグラフィーで観察した。放射能の３つのピークを、保持時間１０．７分、１ ４．０分、及び、１７．７分のＨＰＬＣ溶出画分において発見した。３つの標識 ピークの形成は、反応へのＣＰＣ基質の添加に依存していた。これらのピークの １つ（保持時間１７．７分）を、７−メトキシセファロスポリン Ｃと同定し、一方、他の２つは、その反応を停止するための酸による処理に起因 する７−メトキシセファロスポリンＣの加水分解生成物に対応するものと考えら れる。 発酵中の形質転換細胞のＣ−７ヒドロキシラーゼ活性とメチルトランスフェラ ーゼ活性を測定した。２つのタイプの形質転換細胞を使用した。ｍｅｌプロモー ターの下流に３つの遺伝子を含み、且つ、ＯＲＦ７−ＯＲＦ８がそれ自身のプロ モーターから発現させられなければならない２つの転写ターミネーターを有する ｐｌＪ６９９ａプラスミド中でｃｅｆＦ遺伝子又はＯＲＦ７−ＯＲＦ８包含フラ グメントのどちらかがサブクローニングされる構造を有するＳ．ｌｉｖｉｄａｎ ｓ ［ｐｌＪ７０２−５５ａ］。発酵中のメチルトランスフェラーゼ活性の時間過 程は、７−ヒドロキシラーゼ活性の時間過程とオーバーラップし、このことは両 方の活性が相関的に発現させられることを示唆している。 『ＯＲＦ７が７−ヒドロキシラーゼ活性をコードするが、ＯＲＦ７とＯＲＦ８に よってコードされた２つのタンパク質が７−メトキシラーゼ活性のために必要で ある。』 どの酵素活性が各々の遺伝子に対応するかを確定するために、 ＯＲＦ７とＯＲＦ８を個々にサブクローニングした。ＯＲＦ７とＯＲＦ８を別々 に含むＤＮＡフラグメントのＰｓｔｌ−Ｘｈｏｌ（２０５６ｂｐ）とＫｐｎｌ（ １０４８ｂｐ）（図２）を、ｐｌＪ２９２１中でクローニングし、ＢｇｌＩＩで 回収し、ｍｅｌプロモーターから下流に且つｍｅｌプロモーターと同方向にｐｌ Ｊ７０２のＢｇｌＩＩ部位中にサブクローニングし、プラスミドｐＵＬ７０２− ５６ａとｐＵＬ７０２−５７ａを得た。 Ｃ−７ヒドロキシラーゼ活性を、繰返し実験においてＳ．ｌｉｖｉｄａｎｓ［ ｐＵＬ７０２−５６ａ］の培養中に発見した。ＯＲＦ７とＯＲＦ８の両方を有す るＤＮＡフラグメント（即ち、ｐＵＬ７０２−５５ａ）でＳ．ｌｉｖｉｄａｎｓ を形質転換しなかった場合には、７−ヒドロキシメチルトランスフェラーゼ活性 は認められなかった。 従って、上記タンパク質両方のインビトロの相補性を試験した。Ｓ．ｌｉｖｉ ｄａｎｓ ［ｐＵＬ７０２−５６ａ］とＳ．ｌｉｖｉｄａｎｓ［ｐＵＬ７０２−５ ７ａ］との無細胞抽出物を、ｉ）Ｃ−７ヒドロキシラーゼ活性とｉｉ）Ｃ−７ヒ ドロキシラーゼ及びメチルトランスフェラーゼ活性とに必要な補助因子の存在下 で３０分間に亙って共にインキュベートした。これらの 条件下でＣ−７ヒドロキシセファロスポリンＣのピークを観察し、このことはＣ −７ヒドロキシラーゼ活性がＯＲＦ７で実際にコードされたことを示した。ＯＲ Ｆ７タンパク質及びＯＲＦ８タンパク質を共に混合した時にはインビトロでは７ −メトキシＣＰＣの形成は認められなかったが、このことは、ＯＲＦ８の発現レ ベルが低いが、メトキシＣＰＣを検出するには十分であることを示唆した。ＯＲ Ｆ７とＯＲＦ８の両方からのタンパク質がインビボで会合するだろうが、無細胞 抽出物中のタンパク質が低濃度なので、こうした会合はインビトロでは困難であ ると考えられる。 『７−ヒドロキシラーゼは、セファロスポリン依存性ＮＡＤＨ−オキシダーゼ活 性を示す。』 ＯＲＦ７とＯＲＦ８でコードされたタンパク質は、二タンパク質成分系として 振る舞う。ＯＲＦ７を発現させるＳ．ｌｉｖｉｄａｎｓ［ｐｌＪ７０２−５６ａ ］の無細胞抽出物は、強いセファロスポリン依存性ＮＡＤＨオキシダーゼ活性を 示した（図８）。ＯＲＦ８でコードされたタンパク質は有効なＮＡＤＨ−オキシ ダーゼ活性を示さなかったが、生産的な７−メトキシル化のためには絶対に不可 欠だった。こうした結果は、ヒド ロキシル基を導入にするために分子酸素を還元するための電子供与体としてＮＡ ＤＨを使用するヒドロキシラーゼによって、Ｃ−７におけるヒドロキシル化が仲 介されることを示している。ＯＲＦ８でコードされたタンパク質が、７−メトキ シＣＰＣ誘導体を形成するためのメチル基の導入に不可欠である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ Ｃ１２Ｒ 1:365） (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，Ｍ Ｃ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ， ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)， ＡＭ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＮ，Ｃ Ｚ，ＥＥ，ＦＩ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＧ，ＫＲ ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＴ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＮ， ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＧ，ＳＩ，Ｓ Ｋ，ＴＪ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＳ，ＵＺ (72)発明者 エンジタ，フランシスコ・ホタ アメリカ合衆国、ニユー・ジヤージー・ 07065、ローウエイ、イースト・リンカー ン・アベニユー・126 (72)発明者 フウエンテ，フアン・エレ アメリカ合衆国、ニユー・ジヤージー・ 07065、ローウエイ、イースト・リンカー ン・アベニユー・126 (72)発明者 リヤレーナ，フランシスコ・ホタ アメリカ合衆国、ニユー・ジヤージー・ 07065、ローウエイ、イースト・リンカー ン・アベニユー・126 (72)発明者 リラス，パロマ アメリカ合衆国、ニユー・ジヤージー・ 07065、ローウエイ、イースト・リンカー ン・アベニユー・126 (72)発明者 マルテイン，フアン・エフエ アメリカ合衆国、ニユー・ジヤージー・ 07065、ローウエイ、イースト・リンカー ン・アベニユー・126

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １． セファマイシン生合成の後期酵素をコードする単離精製したＤＮＡ分子。 ２． 前記ＤＮＡが３′−ヒドロキシメチルセフェム Ｏ−カルバモイルトラン スフェラーゼ活性を有するタンパク質をコードする請求項１に記載の単離精製し たＤＮＡ分子。 ３． 前記ＤＮＡが次のヌクレオチド配列： を有する請求項２に記載のＤＮＡ分子。 ４． 前記ＤＮＡが３′−メチルセフェムヒドロキシラーゼ活性を有するタンパ ク質をコードする請求項１に記載の単離精製したＤＮＡ分子。 ５． 前記ＤＮＡが次のヌクレオチド配列： を有する請求項４に記載のＤＮＡ分子。 ６． 前記ＤＮＡがＣ−７ヒドロキシセフェムメチルトランスフェラーゼ活性を 有するタンパク質をコードする請求項１に記載の単離精製したＤＮＡ分子。 ７． 前記ＤＮＡが次のヌクレオチド配列： を有する請求項６に記載のＤＮＡ分子。 ８． 前記ＤＮＡが次のヌクレオチド配列： を有する請求項６に記載のＤＮＡ分子。 ９． １つ以上のセファマイシン生合成後期酵素をコードする１つ以上の組換え 遺伝子を含む細胞の培養によってセファマイシン抗生物質を生産する方法。 １０． ３′−ヒドロキシメチルセフェム Ｏ−カルバモイルトランスフェラー ゼ、３′−メチルセフェムヒドロキシラーゼ、及びＣ−７ヒドロキシセフェムメ チルトランスフェラーゼから成る群から前記セファマイシン生合成後期酵素を選 択する請求項９に記載の方法。 １１． ３′−ヒドロキシメチルセフェム Ｏ−カルバモイルトランスフェラー ゼ、３′−メチルセフェムヒドロキシラーゼ、及びＣ−７ヒドロキシセフェムメ チルトランスフェラーゼから成る群から前記セファマイシン生合成後期酵素を選 択し、且つ、前記細胞培養がセファマイシン抗生物質生合成が可能である請 求項９に記載の方法。 １２． セファマイシン生合成が可能である前記細胞がＮｏｃａｒｄｉａの種で ある請求項１１に記載の方法。 １３． セファマイシン生合成後期酵素である単離精製したタンパク質。 １４． 前記タンパク質が３′−ヒドロキシメチルセフェム Ｏ−カルバモイル トランスフェラーゼ活性を有する請求項１３に記載の単離精製したタンパク質。 １５． 前記タンパク質が次のアミノ酸配列： を有する請求項１４に記載のタンパク質。 １６． 前記タンパク質が３′−メチルセフェムヒドロキシラーゼ活性を有する 請求項１３に記載の単離精製したタンパク質。 １７． 前記タンパク質が次のアミノ酸配列： を有する請求項１６に記載のタンパク質。 １８． 前記タンパク質がＣ−７ヒドロキシセフェムメチルトランスフェラーゼ 活性を有する請求項１３に記載の単離精製したタンパク質。 １９． 前記タンパク質が次のアミノ酸配列： を有する請求項１８に記載のタンパク質。 ２０． 前記タンパク質が次のアミノ酸配列： を有する請求項１８に記載のタンパク質。