JP3529099B2 - ４−置換−１，４−ジヒドロピリジン誘導体の不斉加水分解酵素活性タンパク質をコードする遺伝子およびその発現産物 - Google Patents

４−置換−１，４−ジヒドロピリジン誘導体の不斉加水分解酵素活性タンパク質をコードする遺伝子およびその発現産物

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Description

【発明の詳細な説明】 技術分野 本発明は、４−置換−1,4−ジヒドロピリジン誘導体
の不斉加水分解酵素活性を有するタンパク質、ならびに
該タンパク質をコードする遺伝子、および該タンパク質
の使用に関する。
４−置換−1,4−ジヒドロピリジン系のジヒドロピリ
ジン環の３位と５位に結合した２つの置換基が相互に異
なるものは、その４位に不斉炭素を有しており、２種の
光学異性体が存在する。最近、これらの化合物の生物学
的性質が検討された結果、それぞれの光学活性体間に薬
理活性、生体内動態、安全性などに差があることが報告
されている［K.Tamazawa et al.;J.Med.Chem.Vol.29,
25 04（1986）］。このような不斉炭素を有する化合物
を医薬品として使用する場合、生体に対して余計な負荷
を与えないという意味から、医薬品として好ましい一方
の異性体のみを与えるという考え方が一般的になりつつ
ある。このような観点から光学活性４−置換−1,4−ジ
ヒドロピリジンの3,5−ジ置換体を製造するための方法
が検討されている。
光学活性４−置換−1,4−ジヒドロピリジン誘導体、
特に3,5−ジカルボン酸モノエステル類を合成するため
の一般的方法としては、（4R）−1,4−ジヒドロピリジ
ン−３または５−カルボン酸モノエステルを中間体と
し、これに好ましいエステル残基を導入する方法が知ら
れている［A.Ashimori et al.:Chem.Pharm.Bull.Vol.
39,108（1991）］。この光学活性中間体の（4R）−1,4
−ジヒドロピリジン−3,5−ジカルボン酸モノエステル
の製造方法としては、柴沼らの化学的方法［Chem.Phar
m.Bull.Vol.28,2809（1980）］、並びに阿知波らの酵素
法［Tetrahedron Letters,Vol.3 2,5805（1991）］お
よびCharles J.Sinらの酵素法［Tetrahedron Letter
s,Vol.32,3465（1991）］が知られている。
ところが、前記方法は、必ずしも効率よく目的化合物
を得ることができないため、本発明者らは、より簡易で
効率のよい方法として、微生物、例えば、ストレプトミ
セス（Streptomyces）属、パエシロミセス（Paecilomyc
es）属、ボトリオデイオプロデイア（Botryodioplodi
a）属、アルテナリア（Alternaria）属等、の培養物を
用い、４−置換−1,4−ジヒドロピリジン−3,5−ジカル
ボン酸ジエステルから対応する3,5−ジカルボン酸モノ
エステルへ効率よく変換する方法を提案した（国際公開
第94/05637号パンフレット参照）。
しかし、さらに効率のよい光学活性４−置換−1,4−
ジヒドロピリジン−3,5−ジカルボン酸モノエステルの
製造に使用できる手段を提供する必要性は依然として存
在する。
従って、本発明の目的は、前記光学活性化合物の効率
のよい製造に資することのできる、単離された遺伝子、
それらを含む発現プラスミド、かかるプラスミドによる
形質転換体、ならびにかかる形質転換体の培養による４
−置換−1,4−ジヒドロピリジン誘導体の不斉加水分解
酵素活性を有するタンパク質の提供、およびその使用に
係る手段を提供することにある。
発明の開示 本発明者らは、前記ストレプトミセス属に属するスト
レプトミセスビリドスポルス（Streptomyces viridosp
orus）の染色体DNAから、４−置換−1,4−ジヒドロピリ
ジン誘導体（以下、「1,4−DHPD」という。）の不斉加
水分解酵素活性を有するタンパク質をコードする遺伝子
を含むDNA断片をクローニングし、そして前記遺伝子を
発現させることに成功した。
さらに、前記遺伝子の配列決定およびその発現により
得られるタンパク質の特性決定により、該タンパク質の
一次構造と前記不斉加水分解酵素活性との関連性等につ
いて、広範な知見を得た。また、該タンパク質と各種タ
ンパク質についてのアミノ酸配列のデーターベースを用
いる配列の相同性等に関する検索の結果、本発明に従う
タンパク質は、アミノ酸配列上ズブチリシン（Jacobs,
M.et al.,Nucleic Acids Res.（1985）13:8913−892
6参照）とある程度の相同性を有し、活性部位として、A
sp.HisおよびSerを有することが推測されることも見い
出した。
従って、本発明によれば、配列番号（SEQ ID NO）:
7に記載されたアミノ酸配列中の少なくともAsp（29）な
いしSer（238）の配列を含んでなり、かつ1,4−DHPDの
不斉加水分解酵素活性を有するタンパク質をコードする
単離された遺伝子または該遺伝子とハイブリッド形成し
うるDNA断片が提供される。
さらに、本発明によれば、前記遺伝子をベクターに組
み込んで構築されるプラスミド、かかるプラスミドによ
る形質転換体、その形質転換体を培養することによる1,
4−DHPDの不斉加水分解酵素活性を有するタンパク質の
製造方法も提供される。
またさらに、本発明によればかかる酵素活性を有する
タンパク質と、次式 （但し、式中Ｒは、低級アルカノイル基、複素環カルボ
ニル基、ハロ置換アセチル基、アルコキシアセチル基、
アリールオキシアセチル基、置換もしくは非置換フエニ
ル低級アルカノイル基、フエニル置換もしくは非置換低
級アルケノイル基、アルコキシもしくはアルケニルオキ
シカルボニル基、アラルキルオキシカルボニル基または
有機スルホニル基を表わし、ｎは、２〜４の整数を表わ
す。）で示される化合物またはその塩とを水性媒体中で
接触させ、次式 （但し、式中Ｒ及びｎは、前記と同意義である）で示さ
れる光学活性４−置換−1,4−ジヒドロピリジン化合物
またはその塩を回収することを特徴とする光学活性（4
R）−1,4−ジヒドロ−2,6−ジメチル−４−（ニトロフ
エニル）ピリジン−3,5−ジカルボン酸モノエステル誘
導体の製造方法も提供される。
こうして、製造される前記ジカルボン酸モノエステル
誘導体の一部は、それ自体既知の虚血性心疾患や高血圧
症などの予防および治療薬として有用な光学活性1,4−D
HPDの合成中間体として有用である。
図面の簡単な説明 図１は、ストレプトミセス ビリドスポルスの染色体
DNAに由来する1,4−DHPDの不斉加水分解酵素活性を有す
るタンパク質（DHP−Ａ）をコードする遺伝子（dhpA）
を含むDNA断片の制限酵素地図である。
図２は、本発明に従う遺伝子を担持するプラスミドpD
E88の構造図である。
図３は、本発明に従う1,4−DHPD不斉加水分解酵素活
性を有するタンパク質（DHP−Ａ）の分子量を算定する
ためのSDS−PAGE（ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアク
リルアミド電気泳動）の結果を示す図面である。なお、
図３において、「lane2 A914（pDE88）−５培養上清」
および「lane4 A914（pDE88）−５ fraction from bu
tyl−Toyopeal column」とあるのは、各レーンの説明文
が相互に逆になっており、すなわち、レーン２がbutyl
−Toyopeal column由来のA914（pDE88）−５画分の、そ
してレーン４がA914（pDE88）−５の培養上清のクロマ
トグラムを示すことに注意されたい。これは、レーン４
よりレーン２の方が夾雑物が殆んど存在しないことよ
り、レーン２がより精製段階の進んだ試料のクロマトグ
ラムを示すことが明らかだからである。
図４は、本発明に従う、前記タンパク質（DHP−Ａ）
とプロテアーゼP6のプロテアーゼ活性を対比して示すグ
ラフである。
図５は、本発明に従う、前記タンパク質（DHP−Ａ）
とリパーゼＢのリパーゼ活性を対比して示すグラフであ
る。
図６は、本発明に従う、前記タンパク質（DHP−Ａ）
とプロテアーゼP6の熱安定性を対比して示すグラフであ
る。
図７は、プラスミドpDE89の構造図である。
図８は、プラスミドpDE87の構造図である。
図９は、プラスミドpDE91の構造図である。図中、cat
−５はクロラムフェニコール耐性遺伝子を表す。
図10は、プラスミドpDE92の構造図である。
図11は、バチルス リケニホルミス（Bacillus linc
heniformis）由来のズブチリシン（Jacobs,M.et al.,N
ucleic Acids Res.（1985）13:8913−8926）と本発明
に従うタンパク質（DHP−Ａ）の相同性の程度を示す、
アミノ酸の一文字記号により示した部分的なアミノ酸配
列である。配列中の矢印は活性中心を表し、星印は、両
者に共通するアミノ酸を表し、ドットは、両者において
類縁性のあるアミノ酸を表す。Ｎ−末端側の数値205′
およびＣ−末端側の数値734′は、それぞれ配列番号:2
のアミノ酸番号、すなわちLeu（205）およびIle（734）
に相当する。
発明の詳細な記述 本明細書、配列表および図面に記載したアミノ酸の三
文字記号および一文字記号は、当該技術分野で慣用され
ている略号に基いている。
また、本発明にいう「４−置換−1,4−ジヒドロピリ
ジン誘導体の不斉加水分解酵素活性を有するタンパク
質」とは、少なくとも基質としての前記式（Ｉ）で示さ
れる化合物に作用させることにより前記式（II）で示さ
れる化合物へ変換できる活性を有するタンパク質を意味
する。
本発明者らは、このような活性を有するタンパク質
は、少なくとも配列番号:7に記載されたアミノ酸配列の
中の少なくともAsp（29）ないしSer（238）の配列を含
むものであることを見い出した（なお、本明細書中およ
び請求の範囲において、アミノ酸の記号に続けてカッコ
内に記載する数字は、相当する配列中の位置番号を意味
する）。このことは、図11に記載したバチルス リケニ
ホルミス（Bacillus lincheniformis）由来するズブチ
リシンのアミノ酸配列と本発明に従うタンパク質のアミ
ノ酸配列の対比から、本発明に従うタンパク質がその活
性部位としてセリン（Ser）残基に加え、アスパラギン
酸（Asp）残基およびヒスチジン（His）残基を有するこ
とが推測され、セリンプロテアーゼファミリーの一員に
属するものとみなせることから理解できるであろう。
したがって、本発明によれば、まず最初に、少なくと
も配列番号７に記載されたアミノ酸配列中、Ｎ−末端側
に位置する活性部位であるAsp（29）からＣ−末端側に
位置する活性部位であるSer（238）までの配列を必須の
ものとして含み、かつ1,4−DHPDの不斉加水分解酵素活
性を有するいずれかのタンパク質をコードする単離され
た遺伝子（もしくはDNA断片）またはその遺伝子とハイ
ブリダイズ（またはハイブッリド形成）しうるDNA断片
が提供される。遺伝子とハイブリッド形成しうるDNA断
片としては、具体的には遺伝子と一定部分に共通のヌク
レオチド配列を有し、５′末端もしくは３′末端または
中間配列において数個の異なるヌクレオチド配列を有す
るものが挙げられる。このような断片は、それらの発現
により、対応する遺伝子が産生するタンパク質と同様な
酵素活性を有するタンパク質を産生することができる
か、あるいは少なくとも前記遺伝子のクローニングに使
用することができる。
前記タンパク質の典型的なものとしては、配列番号:7
に記載されたアミノ酸残基数520個からなるものを初
め、そのＣ−末端側のアミノ酸残基が数個除去されたも
の、例えば、配列番号:7のLeu（１）ないしSer（518）
のアミノ酸配列で表されるもの、およびLeu（１）ない
しPro（512）のアミノ酸配列で表されるものが挙げられ
る。また、配列番号:7のＮ−末端側および／またはＣ−
末端側にさらなるアミノ酸配列が付加されたものも前記
タンパク質に包含され、具体的なものとしては、配列番
号:7のＣ−末端にIle Gly Tyr Thr Tyr Asp Thr
Ala Gly Ile（配列番号:4のIle（725）〜Ile（73
4）参照）が付加したアミノ酸配列を有するもの、配列
番号:4および配列番号:2に記載されたアミノ酸配列を有
するものが挙げられる。これらのタンパク質をコードす
る遺伝子の具体的なものとしては、配列番号:1および配
列番号:3に記載されたDNA配列で示されるものを挙げる
ことができる。
本発明で提供される上記遺伝子は、それらを適当な発
現ベクターに組み込み、組換えプラスミドとし、適当な
宿主微生物を形質転換することにより、1,4−DHPDの不
斉加水分解酵素活性を有するタンパク質を産生するのに
使用することができる。
したがって、本発明によれば、前記遺伝子を担持する
組換えプラスミドも提供される。使用できる発明ベクタ
ーとしては、外来の遺伝子を安定に発現するように構築
されたものを使用することが都合よく、限定されるもの
でないが、例えば、アミノグリコシドホスホトランスフ
ェラーゼをコードする遺伝子（aphまたはaph II）を有
するpI J680およびpI J425〔これらの構造図およびaph
の塩基配列については、D.A.Hopwoodら、Genetic Mani
pulation of Streptomyces−Ａ Laboratory Manual,Th
e John Innes Foundation,;（1985）;aph IIの塩基配列
については、E.Beck et al.,Gene,19,327−336（198
2）、参照〕などが挙げられる。
これらのベクタープラスミドを本発明に使用して本発
明の遺伝子を調製する場合について、その典型例を以
下、簡単に説明する。
1,4−DHPDの不斉加水分解酵素活性を有するタンパク
質をコードする遺伝子（以下、「dhpA」という。）で例
えば配列番号:3に記載のものの挿入断片はストレプトミ
セス ビリドスポルスの染色体DNAからの制限酵素Sau3A
I部分分解物のため、プラスミドからSau3A Iで切り出
そうとするとバラバラに分解してしまう。そこで例え
ば、適当なプライマーを用いてPCRで、2.54kb Sac I−
Sau3A I（BamH Iに改変）間を増幅し、増幅した断片をp
I J680のaph遺伝子上にあるBamH I部位またはpI J425の
aph II遺伝子上にあるSph I部位へ挿入し、各々dhpA遺
伝子の挿入方向がaph遺伝子またはaph II遺伝子に対し
逆方向になっているプラスミドを選択する。
これらのプラスミドはdhpA由来タンパク734アミノ酸
の後に機能的に無意味な29アミノ酸（配列番号:5参照）
（pI J680）または15アミノ酸（配列番号:6参照）（pI
J425）のタンパク質が融合した産物を与える。
上述のような本発明の遺伝子は、限定されるものでは
ないが、ストレプトミセス ビリドスポルス、例えば19
92年７月29日付で工業技術院生命工学工業技術研究所に
寄託され、その後同研究所の国際寄託当局にブタペスト
条約の規定の下に移管され、FERM BP−4334の受託番号
が付与されたＡ−914株から有利に調製することができ
る。また、本発明の遺伝子は、前記菌株の染色体から制
限酵素Sau3A Iにより切り出される約3.0kbのDNA断片で
あって、図１の制限酵素地図で表わされる断片に含まれ
ている。
従って、本発明にいう「単離された・・・遺伝子」の
語は、上述したように前記DNA断片の形態にあるもの、
ならびにその断片から目的とする酵素活性を有するタン
パク質自体をコードするヌクレオチド部分のみ、および
外来のヌクレオチド部分がそれに追加した形態にあるも
のを包含する概念で用いている。後者の形態にあるもの
は、後述するように、前記DNA断片の配列決定を行え
ば、当業者にとって容易に特定することができ、また単
離することもできる。
したがって、1,4−DHPDの不斉加水分解酵素活性を有
するタンパク質をコードする遺伝子（dhpA）を含むDNA
断片は、当該技術分野で周知の遺伝子工学的方法によ
り、前記Ａ−914株から容易に取得することができる。
この方法については多く実験書に教示されているのでそ
れらを利用することができるが、Ａ−914株は、放線菌
であることから、放線菌の遺伝子工学的方法を記載した
実験書、例えばD.A.Hopwood et al.:Genetic Manipu
lation of Streptomyces,A Laboratory Manual（19
85）（John Innes foundatron）などに従うことが望
ましい。
以下に本発明のDNA断片を取得する方法について簡単
に説明するが詳細な方法については特に断らない限り前
述のHopwoodらの実験書に記載された公知の方法に従っ
て行うことができる。
遺伝子のクローニング Ａ−914株から全DNAをSDS−フエノール法により抽出
する。このDNAを制限酵素Sau3A Iで部分分解する。次に
この分解物を0.8％アガロースゲル電気泳動にかけ、ベ
クターに組み込みやすい長さの断片に分画する。この分
画されたDNAをSau3A Iと付着末端を同じくするBamH I、
Bgl II、Bcl Iをクローニングサイトとして利用可能な
ベクター・プラスミド例えばBgl IIが利用可能なpI J70
2等にT4DNAライゲースを用いて連結する。
このDNAでベクターが導入可能な宿主のうち1,4−DHPD
の不斉加水分解酵素活性を有するタンパク質を有さない
もの［一例としてpI J702を用いた場合と宿主としてス
トレプミセス リビダンス（Streptomyces lividans）
66（FERM BP−737）などが挙げられる。］を形質転換
して、供与体ゲノムDNA中のランダムな領域を組み込ん
だプラスミドをもつ多数の形質転換体を取得する。それ
らのうち個々の形質転換体に対し、1,4−DHPDの不斉加
水分解酵素活性の測定を行う。具体的な酵素活性の測定
方法については後述する。
この結果形質転換体の中から目的の活性を有するタン
パク質を発現する形質転換体を分離することができる。
本発明のdhpAを含むDNA断片はその形質転換体がもつプ
ラスミドに組み込まれた形で存在させておくのが、その
後の使用を考慮すると都合がよい。このようなプラスミ
ドを得るには、その形質転換体を培養し、アルカリ−SD
S法に従ってプラスミドを単離すればよい。得られたプ
ラスミドDNAを各種制限酵素で切断し、切断されたDNA断
片の長さをアガロース・ゲル電気泳動で分析することに
より切断部位のマッピングを行うことができる。この結
果からプラスミドに組み込まれたDNA断片の制限酵素地
図が作成できるがそれは図１に示される通りである。
したがって、本発明のdhpAを含むDNA断片が取得され
ているか否かは、DNA断片を組み込んだプラスミドによ
る形質転換体の1,4−DHPDの不斉加水分解酵素活性の測
定と、そのDNA断片の制限酵素地図を図１のものと、ま
た、配列決定による場合には配列番号3:の核酸配列と比
較することにより確認することができる。
こうして得られるDNA断片は、必要によりさらに制限
酵素あるいはエキソヌクレアーゼで処理して短縮化し、
前記ベクターを初めとする各種発現ベクター、例えば、
pI J350、pI J41、pI J943、pI J922などの放線菌ベク
ターの他、pUC18、pUC19など、一般的な遺伝子操作で汎
用される大腸菌ベクターに、組み込んで、本発明のプラ
スミドを提供することができる。
以上の操作を参照すれば、当業者は上記の本発明に従
う遺伝子を担持するいずれの組換えプラスミドも得るこ
とができるであろう。
dhpAを含むDNA断片を組み込んだプラスミドをもつ形質
転換体の作出 本発明によるプラスミドは、それらを受容可能な宿主
へ導入することができる。ベクターおよびそれが受容可
能な宿主の組み合せは多数存在し、適宜選択可能である
ので限定できない。しかし、特に実用性に富む組み合せ
としては、ベクターとして、前述のようなpI J702に代
表される放線菌の高コピープラスミドを使用し、宿主と
して、放線菌例えばストレプミセス リビダンス66、ス
トレプミセス ビリドスポルスＡ−914、ストレプミセ
ス クラブス（Streptomyces clavus）Ｎ−1284を用い
ることが望ましい。その理由は、dhpAを高発現させる
ことができ、導入されたプラスミドが構造的に安定し
て保持されることによる。その上、特に宿主がストレプ
ミセス ビリドスポルス（S.viridosporus）Ａ−914お
よびストレプミセス クラブス（S.clavus）Ｎ−1284の
場合、さらに宿主自体に1,4−DHPD不斉加水分解酵素
の生産能があることから、導入プラスミド由来の酵素活
性を合わせて増強された酵素活性が期待できる。反応
基質、反応生成物に対する副反応が少ない、といった利
点もある。
本発明によれば、こうして得られる形質転換体、例え
ばStreptomyces viridosporus Ａ−914（pDE88）−５
を初めとする、前記遺伝子のいずれかを担持するプラス
ミドにより宿主微生物（例えば、ストレプトミセス ビ
リドスポルス、ストレプトミセス リビダンスおよびス
トレプトミセス クラブスからなる群より選ばれる一菌
株）が形質転換された形質転換体が提供される。なお、
前記Ａ−914（pDE88）−５株は、1995年７月10日付けで
生命工学工業技術研究所に寄託し、FERM Ｐ−15037の
受託番号が付された後、ブタペスト条約の規定の下で国
際寄託に移管されFERM BP−5574の受託番号で寄託され
ている。
これらの形質転換体は、栄養培地で培養することによ
り1,4−DHPDの不斉加水分解酵素活性を有するタンパク
質を産生するので、培養物から目的の酵素活性を有する
タンパク質を回収することにより、前記酵素活性を有す
るタンパク質を製造することができる。
したがって、本発明によれば、前記形質転換体を使用
する1,4−DHPDの不斉加水分解酵素活性を有するタンパ
ク質の製造方法も提供される。
本発明に従う遺伝子を使用すれば、それらの遺伝子に
コードされたタンパク質が発現されるので、上述したタ
ンパク質もまた本発明により提供される。しかし、例え
ば、前記Ａ−914（pDE88）−５株（FERM BP−5574）を
培養することにより発現されるタンパク質は、培養中に
プロセシングを受け短縮化されたタンパク質として蓄積
されるので、本発明の好ましい態様のタンパク質として
は、配列番号:7に記載されたアミノ酸配列で示されるも
の（Leu（１）〜Thr（520））、そのＣ−末端側の一部
のアミノ酸残基が除去されたもの（例えば、Leu（１）
〜Ser（518）およびLeu（１）〜Pro（512）のアミノ酸
配列で示されるもの）、ならびに前記Leu（１）〜Thr
（520）のＣ−末端のThrに、さらにIle Gly Tyr Thr
Tyr Asp Thr Ala Gly Ileが付加したアミノ酸配
列で示されるものが挙げられる。
本発明に従うタンパク質の製造に使用できる前記栄養
培地としては、特に限定されるものでないが、通常の微
生物の培養に用い得るもの、例えば、炭素源としては、
前記微生物の利用可能なものであればいずれでもあって
もよく、具体的には、グルコース、フルクトース、シュ
クロース、デキストリンなどの糖類；グリセロール、ソ
ルビトールなどの糖アルコール；フマル酸、クエン酸な
どの有機酸を挙げることができる。これらの炭素源の培
地への添加量は、通常0.1〜10％程度とすることが好ま
しい。
窒素源としては、例えば、塩化アンモニウム、硫酸ア
ンモニウム、リン酸アンモニウムなどの無機酸アンモニ
ウム塩；フマル酸アンモニウム、クエン酸アンモニウム
などの有機酸アンモニウム塩；肉エキス、酵母エキス、
コーンスティープリカー、カゼイン加水分解物等の天然
有機窒素源などを使用することができる。このうち有機
窒素源は、多くの場合、炭素源としても兼用できる。窒
素源の添加量は、通常0.1〜10％が適当である。
無機塩類としては、例えば、リン酸カリウム、リン酸
ナトリウムなどのリン酸アルカリ金属塩；塩化カリウ
ム、塩化ナトリウムなどの塩化アルカリ金属塩；硫酸マ
グネシウム、硫酸第一鉄などの硫酸金属塩等を使用でき
る。その使用量は、0.001％〜１％の範囲が適当であ
る。
微生物（形質転換体）の培養は、上記の培地で20〜40
℃、好ましくは28〜37℃、pHは５〜９、好ましくは、pH
6〜８で好気的条件下で実施すればよい。
こうして、製造される1,4−DHPDの不斉加水分解酵素
活性を有するタンパク質は、単離された形態、または培
養物そのもの、培養物の粗精製物または固定化された形
態にあるいずれかで、その酵素活性タンパク質と前記式
（Ｉ）の化合物とを、水性媒体中で接触させ、前記式
（II）の化合物を製造するのに使用することができる。
したがって、本発明によれば、前記1,4−DHPDの不斉加
水分解酵素活性を有するタンパク質を使用する、式
（Ｉ）の化合物の式（II）の化合物への酵素転化方法も
提供される。
前記水性媒体としては、必要により緩衝化された水溶
液を使用することができる。式（Ｉ）の化合物は、水ま
たはアセトン、ジメチルスルホキシド、等の補助溶媒に
溶解して加え、pHを7.0〜9.5に調節した後、通常、20〜
50℃で前記酵素と接触するように反応させることで、式
（II）の化合物へ転化することができる。反応終了後、
希塩酸等を用いてpHを1.5〜3.0に調節し、次いでクロロ
ホルム、酢酸エチル、酢酸ブチル、ブタノール等の有機
溶媒で抽出し、さらに必要により結晶化するか、または
転溶、沈殿化等の手段により精製された式（II）の化合
物を得ることができる。
以下、具体例を示して、さらに本発明を詳細に説明す
るが、これらの例示は本発明の理解を容易にする目的で
提供される。
実施例１ プラスミドpDE88の構築 S.viridosporus Ａ−914株（FERM BP−4334）をTSB
培地（Difco tryptic Soy Broth 3.0％）25mlに植
菌し、28℃で３日間振とう培養した。これを種菌とし
て、その2mlをYEME培地（34％サッカロース、0.3％ Ba
cto Yeast Extract、0.5％ Bacto Pepton、0.3％
Bacto Malt Extract、0.5％ Glycine、5mM MgCl2、
pH無調整）50mlに植え継ぎ28℃で40時間振とう培養し
た。この培養液から菌体を8000×ｇ、10分間の遠心分離
で集菌し、Hopwoodらの実験書、Genetic Manupilation
of Streptomyces/John Innes Foundation（1985）
に示された方法に従って全DNAを抽出精製した。
このDNA100μｇを含むTE（10mM Tris−HCl pH8.0、
1mM EDTA pH8.0）溶液100μｌに対し、80μｌのH2Oお
よび20μｌの10倍濃度Ｍバッファー（100mM Tris−HCl
pH7.5、500mM NaCl、100mM MgCl2、10mMジチオスレ
イトール）および制限酵素Sau3A I 1ユニット（0.25μ
ｌ）を順次加え37℃で30分反応させた。その後等量（20
0μｌ）のTE飽和フエノール・クロロホルム混液（フエ
ノール：クロロホルム：イソアミノルアルコール−25:2
5:1に８−キノリノールを0.2％添加したもの）で抽出後
水層を取り、これをさらに等量のクロロホルムで抽出し
た。水層を採取後これに1/10容量の3M酢酸ナトリウムを
加え、続いて３倍容量のエタノールを加えよく混ぜた後
−80℃で15分間冷却した。その後5000×ｇ、５分間の遠
心でDNAを沈殿させた。このDNAを70％エタノール1mlで
１回洗浄し、減圧下で乾燥した後100μｌのTEに溶解し
た。
この溶液に11μｌの10倍濃度gel loading buffer
（25％ Ficoll、0.25％ ブロムフェノールブルー）を
加えた後、13cm×13cmの0.8％アガロースゲル ４ウエ
ルに分注し、λフアージDNA−Hind III分解物をサイズ
マーカーとして30Vで泳動した。泳動後４〜6kbに相当す
るDNAを含むゲル部分を切り出し、ウルトラフリーC3ユ
ニット0.45μｍ（ミリポア社製）を用いて、DNAを回収
精製した。このDNA溶液（濃度0.5μg/μｌ）９μｌに予
め脱リン酸化したBgl II線状化pI J702DNA溶液（濃度１
μg/μｌ）１μｌを加えたベクター・インサート混合液
をライゲーションキットver.1（宝酒造株式会社製）を
用いてライゲーション反応（16℃、３時間）を行った。
ここでベクターpI J702の脱リン酸化Bgl II線状化DNA
溶液は、以下のようにして調製した。pI J702 DNA 10
μｇを含む総量50μｌの反応液（10mM Tris−HCl pH
7.5、100mM NaCl、10mM MgCl2:1mMジチオスレイトー
ル）に25ユニット（2.5μｌ）のBgl IIを加え、37℃で
４時間反応後、すでに前述したようにフェノールとクロ
ロホルムの混液およびクロロホルムによる抽出、エター
ル沈殿、70％エタール洗浄乾燥を順次行った後、DNAを4
5μｌの10mM Tris−HCl pH8.0に溶解した。この溶液に
５μｌの10倍濃度のアルカリホスファターゼバッファー
（500mM Tris−HCl pH8.0、1mM EDTA）およびcalf
intestinal alkaline phosphatase（東洋紡株式会社
製）１μｌ（1.7ユニット）を加え、37℃で１時間イン
キュベートした後65℃で45minインキュベートして酵素
を失活させた。その後は前述と同様な条件でフエノール
とクロロホルムの混液およびクロロホルムによる抽出、
エタール沈殿、洗浄、乾燥を行った。このDNAを10μｌ
のTEで溶解し、最終的に脱リン酸化されたBgl II線状化
pI J702 DNA溶液を調製した。
ライゲーション後、反応液15μｌを用いて、前述のHo
pwoodらの実験書に記載された方法に従ってS.lividans6
6のプロトプラスト（１×109cells）の形質転換を行っ
た。ここで抗生物質による選択条件はチオペプチン50μ
g/mlとした。28℃で４日間培養後約1500株の形質転換株
を得た。pI J702に存在するmel遺伝子（メラニン色素生
産遺伝子）に位置するクローニングサイト（Bal II）に
供与体DNAが挿入した場合、mel遺伝子は不活性化され
る。そして形質転換株がそのようなプラスミドをもつ場
合黒色（メラニン）色素を生産しない株として視覚的に
容易に見分けることができる。メラニン色素非生産株コ
ロニーを１個ずつDHP培値（３％TSB、1.5％バクトアガ
ー、500μg/ml M801）に25株/8cmプレートの密度でパ
ッチ状に植菌し、28℃で５日間培養した。コルクボーラ
ー（内径6mm）で菌体の一部を培地ごと切り出し、培地
片をシリカゲルTLCプレートの各レーン（8mmごとに幅1m
mで縦に切れ目を入れたもの）に付着させ、室温に30分
間放置し、培地内容物を浸出、乾燥させた。このプレー
トをクロロホルム・メタノール（6:1）からなる溶媒系
で展開し、各レーン毎に培地中のM801（Rf値0.59）の不
斉加水分解物M802（Rf値0.53）の有無を調べた。
このようにして形質転換体の中から、M801の不斉加水
分解活性をもつ株S.lividans（pDE88）を分離した。こ
の株がもつプラスミド（pDE88と命名した。）に目的の
遺伝子dhpAがクローニングされているか否かを確かめる
ため、pDE88 DNAを前述Hopwoodらの実験書に示された
公知の方法に従って抽出精製し、再びS.lividans66を形
質転換して、２次形質転換株を得た。前述のTLCアッセ
イの結果、この株は最初に取得された株と同様に1,4−D
HPDを不斉加水分解活性を発現し、pDE88にdhpAが含まれ
ていることが明らかとなった。pDE88を各種制限酵素で
切断しその断片の長さをアガロースゲル電気泳動で分析
した結果図１の制限酵素切断地図で示される約3.0kbのd
hpAを含む供与体DNA断片がベクターpI J702に組み込ま
れていた。pDE88の構造図を図２に示す。
実施例２ 形質転換体の取得と酵素活性の測定 放線菌S.calvus Ｎ−1284を前述のHopwoodらの実験
書に記載された常法に従ってプロトプラストを調製し
た。培養の時にYEME培地の代わりに0.5％グリシンおよ
び5mM MgCl2を添加したTSB培地を用いたこと以外前述
の方法と同様にS.viridosporus Ａ−914からもプロト
プラストを調製した。このようにして得た各プロトプラ
スト１×109 Cellsを含む懸濁液1mlをポリスチレン製
滅菌チューブ（15ml容量、コーニング社製）中に入れ、
遠心分離（5000×ｇ、10分間）後上清を捨て、残りのプ
ロトプラストに実施例１で取得したプラスミドpDE88 D
NA溶液（濃度１μg/ml）を10μｌを加えよく混ぜた。こ
れにＴバッファー（0.24％ サッカロース、0.2％トレ
ース・エレメント溶液（後述１）、0.023％ K2SO4、1.
5％ CaCl2、50mM Tris−マレイン酸 pH8.0を含む溶
液3mlに対し、ポリエチレングリコール（重合度1000）1
gを溶解してできる溶液）0.4mlを加え30秒間室温に放置
した後、Ｐバッファー（後述２）10mlでプロトプラスト
を洗浄し、次いでR3培地（13.5％サッカロース、0.05％
KC1、0.6％MgCl2、6H2O、１％グルコース、0.4％バク
トペプトン、0.4％酵母エキス、0.57％TES、2.2％バク
トアガー、をオートクレーブ後、0.5％KH2PO4を1/100容
量、5M CaCl2を0.3/100容量、1N NaOHを1.8/100容量添
加）５枚にプレーティングした。これを28℃16時間培養
後、チオペプチン250μg/ml（最終濃度）を添加したSNA
培地（0.8％ Nutrient Broth、0.3％ Bacto Agar）
2mlをプレート上に均一に重層し、さらに５日間培養を
続けた。
トレースエレメント溶液１（１リットル当り）： ZnCl2 40mg FeCl3・6H2O 200mg CuCl2・2H2O 10mg MuCl2・4H2O 10mg Na2B4O7・10H2O 10mg （NH4）6MO7O24・4H2O 10mg Ｐバッファー2: 10.3％ サッカロース 0.025％ K2SO4 0.202％ MgCl2・6H2O 0.2（v/v）％ トレース・エレメント溶液 オートクレーブ後 0.005％ KH2PO4 0.368％ CaCl2・2H2O 0.573％ TES pH7.2 その結果S.clavus Ｎ−1284を宿主としたものから31
株、S.viridosporus Ａ−914を宿主としたものから24
株の形質転換株を得た。異なる宿主をもつものから１株
ずつを選択し、それぞれS.clavus Ｎ−1284（pDE88）
−６およびS.viridosporus Ａ−914（pDE88）−５と命
名した。これらの株およびS.lividans（pDE88）ならび
に各々の宿主として使用された株をTSB培地（形質転換
株に対してはチオペプチン５μg/mlを添加したもの）25
mlで４日間培養した後、この培養液1mlを種菌としてＣ
培地（２％グルコース、２％溶性でんぷん、２％エスサ
ンミート、（大豆粉：味の素株式会社製）0.5％酵母エ
キス、0.25％NaCl、0.32％CaCO3、0.0005％FeSO4、0.00
05％MnSO4、0.0005％ZnSO4、pH7.4）30mlへ添加し、28
℃で各菌が1,4−DHPDの不斉加水分解酵素活性タンパク
質を最大限生産し得る期間、すなわちS.lividansおよび
S.lividans（pDE88）では３日間、S.clavus Ｎ−1284
およびS.clavus Ｎ−1284（pDE88）−６では４日間、
S.viridosporus Ａ−914およびS.viridosporus Ａ−9
14（pDE88）−５では６日間振とう培養を行った。得ら
れた培養液を後述する方法に従って、1,4−DHPD不斉加
水分解酵素の特異活性を測定した。その結果を表１に示
す。
このとき、対照酵素として、1,4−DHPDの不斉化加水
分解能をもつことが知られているProtease P6（天野製
薬株式会社）［T.Adachi et al;Tetrahedron Asymme
try Vol.4,2061（1933）］の酵素活性を同時に測定し
た。
表１によると、S.clavus Ｎ−1284およびS.viridosp
orus Ａ−914は本来1,4−DHPDの不斉加水分解活性を発
現している菌株であるがpDE88で形質転換することによ
り、それらの培養液中の酵素活性（プロテアーゼP6換算
量で比較）が各々の宿主の４倍以上に増加した。一方で
S.lividansは本来全く酵素活性を示さない菌株であるが
形質転換体の１つS.lividans（pDE88）−１の培養液中
には、プロテアーゼP6に換算して6.8mg/mlの特異活性が
検出された。これはS.clavus Ｎ−1284の5.6倍および
S.viridosporusの2.9倍に相当した。最大の比活性を示
したものはS.viridosporus Ａ−914（pDE88）−５で、
プロテアーゼP6に換算して10.4mg/mlに相当する比活性
が認められた。このように、本発明によるdhpAを含むプ
ラスミドで形質転換株は、いずれも、培養液中に大量の
酵素活性タンパク質を分泌することが明らかになった。
（活性測定法） Ｍ−801を基質として反応し、不斉加水分解物Ｍ−802
を高速液体クロマトグラフイー（HPLC）により測定し
た。即ち、0.5Mトリス−塩酸緩衝液（pH8.5）0.1ml、蒸
留水0.2ml、5M NaCl溶液0.1ml、1,4−DHPDの不斉加水
分解酵素活性を有するタンパク質溶液0.1ml、30mg/ml
M801−ジメチルスルフォキシド溶液５μｌを順次混合
し、40℃で１時間インキュベーションした。１時間後、
0.02M KH2PO4:メタノール＝1:1溶液2.4mlに反応液0.1m
lを加え反応を停止した。この溶液を8000×ｇ、10分間
遠心分離し、上清をHPLCにより測定した。HPLC測定条件
は、カラム:YMC−Ａ−302（4.6ID×150mm）、移動相0.0
2M KH2PO4:メタノール＝1:1溶液、流速0.8ml/min、検
出UV350nm、温度50℃、インクジェクション量10μｌで
行った。この条件下でＭ−801の保持時間は６−7min、
Ｍ−802は４−5minであった。
実施例３ S.viridosporus Ａ−914（pDE88）−５の培
養及び硫安分画 S.viridosporus Ａ−914（pDE88）−５を、５μg/ml
のチオペプチンを添加したＣ培地30mlに植菌し、28℃で
４日間振とう培養した。この培養液から濾過により、上
清を集めた。（以後の操作は４℃で行った。）この上清
に60％飽和となるように硫酸アンモニウムを加えた。３
時間撹拌した後、9000×ｇ、20分間遠心分離し、上清を
得た。さらにその上清に80％飽和となるように硫酸アン
モニウムを加え、18時間撹拌した。9000×ｇ、20分間遠
心分離したのち得られた沈殿を蒸留水に溶解し、60−80
％硫安分画とし、以下の精製に供した。
実施例４ 酵素活性タンパク質の精製 上記の60−80％硫安分画画分20mlを流速34ml/hrで1.8
M硫酸アンモニウムを含む50mMトリス−塩酸緩衝液（pH
7.5）で平衡化したButyl−Toyopearl650（商品名：東ソ
ー社製）のカラム（26×27.5cm）にアプライした。硫酸
アンモニウム1.8M及び0.4Mを含む50mMトリス−塩酸緩衝
液（pH7.5）1000mlずつで硫酸アンモニウム1.8Mから0.4
Mの直線濃度勾配を作り、溶出を行った。10mlずつ分取
し、各フラクションについて実施例２の活性測定法にし
たがって1,4−DHPD不斉加水分解酵素の活性を測定し
た。不斉加水分解活性の認められたフラクションを集
め、1,4−DHPDの不斉加水分解酵素活性を有するタンパ
ク質（以下、DHP−Ａという）の画分とした。
実施例５ 分子量の測定 得られたDHP−Ａ画分をLaemmliの方法（Nature、22
7、680−685（1970））に従ってSDS−PAGE（４−20％グ
ラジエント）を行い、その分子量を算定した。（結果を
図２に示す。）なお図３においてレーン１は分子量マー
カー、レーン２はS.viridosporus Ａ−914（pDE88）−
５の培養上清、レーン３は同培養液の60〜80％硫安画画
分、レーン４はＡ−914のDHP−Ａ画分である。これより
推定されたDHP−Ａの分子量は約55kDaであった。
実施例６ （比活性の測定） プロテアーゼP6及びDHP−Ａを実施例２の活性測定法
にしたがって活性測定を行った。また、プロテインアッ
セイキット（Bio−Rad社）により蛋白定量を行い、比活
性を算出した。活性は１時間に1mgのＭ−802を生成する
酵素量を1Uとした。その結果、DHP−ＡはプロテアーゼP
6に比べ、2.12倍高い比活性を示した。
（プロテアーゼ活性測定） 紫外部吸収法によりDHP−Ａ及びプロテアーゼP6のプ
ロテアーゼ活性測定を行った。即ち、基質溶液として、
ハンマステンカゼイン0.6gに0.1N水酸化ナトリウム溶液
10ml、蒸留水30ml、0.05Mトリス−塩酸緩衝液（pH8.5）
40mlを加え、pHを8.5に調製し、蒸留水で100mlにした。
各種濃度のプロテアーゼP6及びDHP−Ａ溶液50μｌに2mM
酢酸カルシウム溶液150μｌを加え、酵素液とした。そ
の酵素液0.2mlに基質溶液1.0mlを加え、30℃、10分間イ
ンキュベートした。その後、トリクロロ酢酸混液（1.8
％トリクロロ酢酸、22％1M酢酸ナトリウム溶液、33％1M
酢酸溶液）1.0mlを加え、反応を停止し、8000×ｇ、５
分間遠心分離し、上清の275nmにおける吸光度を測定し
た。この活性は30℃、10分間反応させた時の275nmにお
ける吸光度1.0を呈する酵素量を1Uとした。その結果を
図４に示す。DHP−Ａのプロテアーゼ活性はプロテアー
ゼP6に比べ、1/30以下であった。
（リパーゼ活性測定） リパーゼUVオートテストワコー（和光純薬）によりDH
P−ＡとリパーゼＢのリパーゼ活性を測定した。活性は3
7℃、６分間反応させた時の340nmにおける吸光度1.0を
呈するタンパク質量を1Uとした。図５に結果を示す。DH
P−Ａにリパーゼ活性は認められなかった。
以上より、本発明の1,4−DHPDの不斉加水分解酵素活
性を有するタンパク質DHP−Ａは同様な目的で使用され
る従来の酵素プロテアーゼP6やリパーゼＢ等とは異な
り、プロテアーゼ（カゼイン分解）活性やリパーゼ活性
を殆ど示さないことから、これらの酵素とは区別される
新規で特異な酵素活性を示すタンパク質である。特にプ
ロテアーゼP6に対しては、比活性が高い、熱安定性が優
れているといった利点を有する。本発明の1,4−DHPDの
不斉加水分解酵素活性を有するタンパク質のもつプロテ
アーゼ活性を殆ど示さないという性質はプロテアーゼP6
において活性低下の原因である自己分解反応が起こりに
くいことを意味している。
（酵素活性タンパク質の熱安定性） 1mg/mlDHP−Ａ溶液0.6mlまたは2mg/mlプロテアーゼP6
溶液0.6mlに0.5Mトリス−緩衝液（pH8.5）0.2ml及び蒸
留水0.2mlを混合し、30、35、40、45、50、55、60℃で1
5分間熱処理を行い、その後30mg/mlM−801溶液を加え、
60分間インキュベートした。その混合液を実施例２の活
性測定法に従って酵素活性を測定した。結果を図６に示
す。DHP−Ａは30℃から45℃までほぼ100％活性を保持し
ていたが、プロテアーゼP6は45℃で約25％活性は低下し
ていた。
実施例７ Ｎ末端アミノ酸配列の決定 実施例４にて精製された酵素溶液を分画分子量10,000
の遠心濾過チューブ、ウルトラフリーC3LGC（ミリポア
社製）にて脱塩・濃縮し、2mg/mlの溶液とした。この酵
素液2.5μｌをPhastGel Homogeneous12.5（ファルマシ
ア社製）にアプライし、PhastSystem（ファルマシア社
製）を用いて、250V,10mAで１時間SDS−PAGEを行った。
その後PhastTransfer（ファルマシア社製）を用いて、2
0V,25mA,で40分、酵素蛋白質をPVDF（Polyvinyldifluor
ide）膜（ミリポア社製）へ転写した。この時、転写バ
ッファーとして、25mM Tris,192mM Glycine（pH8.
3）,20％Methanolを用いた。転写後、膜を風乾し、酵素
蛋白質が転写された部分を切出し、プロテインシーケン
サーPSQ−１型（島津製作所製）でＮ末端配列の分析を
実施した結果、Leu−Asp−Thr−Ser−Val−Glyからなる
配列が決定された。これは配列番号:4のアミノ酸配列第
205番目から第210番目の配列に一致した。このことか
ら、実施例４に従う1,4−DHPDの不斉加水分解酵素活性
を有するタンパク質（DHP−Ａ）のＮ末端はプロセッシ
ングを受けて、205番目のロイシンから始まっているこ
とが分かった。
実施例８ 質量分析測定によるＣ末端アミノ酸の決定 実施例４にて精製された酵素溶液を分画分子量10,000
の遠心濾過チューブ、ウルトラフリーC3LGC（ミリポア
社製）にて0.1％蟻酸溶液に置換し、さらに脱塩・濃縮
し、2mg/mlの溶液とした。この溶液200μｌを検体とし
て高性能四重極三連質量分析装置API III（Perkin Elm
er Sociex社製）にて酵素蛋白質の分子量測定を正イオ
ンモードで行った。その結果、［Ｍ＋Ｈ］＋（ただしＭ
は酵素蛋白質の分子量、Ｈはプロトンの分子量を表わ
す。）で52501の値が得られ、この値は配列番号:4のア
ミノ酸配列で205番目のLeuから724番目のThrまでの推定
分子量52503.61に極めて近いことから、実施例４に従う
1,4−DHPDの不斉加水分解酵素活性を有するタンパク質
（DHP−Ａ）は、そのＣ末端はプロセッシングを受け
て、724番目のThrで終わっているタンパク質（配列番
号:7参照）を主とするものであることが分かった。
実施例９ 製造法 S.viridosporus Ａ−914（pDE88）−５株の凍結種母
0.45mlをＣ培地30mlを入れた250mlフラスコに植菌し、2
8℃で45時間ロータリーシエーカー上で培養し、種母と
した。このようにして培養した種母60mlをチオペプチン
を除いたＣ培地に消泡剤として0.09％KM−75、0.09％ア
デカノールLG−126を添加した培地15リットルに植菌
し、28℃で５日間培養した。得られた培養液を濾過し、
濾液9.5リットルを得た。これをUF膜により約４倍濃縮
し、DHP−Ａ酵素液とした。この酵素液1280mlに塩化ナ
トリウム74g、60mg/ml Ｏ−フェナンスロリンDMSO溶液
12.8mlを加え、pHスタット装置を備えた反応容器で1N水
酸化ナトリウムを用いてpH8.5−8.6に調整しながら、窒
素置換下で30℃で撹拌を行った。これに50mMトリス−塩
酸緩衝液（pH8.5）480mlにＰ−902 36gを溶解した溶液
を26.64ml/hrの速度で18時間添加した。反応開始34時間
後に反応混合物に等量の酢酸エチルを加え、得られた水
層をpH2.0に調整し、等量の酢酸エチルで２回抽出し
た。酢酸エチル層を蒸留水で洗浄した後、無水硫酸ナト
リウムで乾燥した。乾燥剤を濾過した後、濃縮乾固し、
黄色固体を得た。これを減圧乾固し、Ｐ−903 25.0gを
得た。
得られたＰ−903の光学純度検定を行った。即ち、Ｐ
−903 100μg/ml溶液を下記条件下でHPLC分析を行っ
た。カラム:ES−OVM4.6ID×450mm、移動相２−PrOH:0.0
2M KH2PO4＝20:80、カラム温度35℃、流速1.0ml/min、
検出UV350nm、インジェクション量10μｌ。この条件下
で（Ｓ）−Ｐ−903の保持時間は、14〜15minで、（Ｒ）
−Ｐ−903の保持時間は16〜17minであった。
Ｐ−902およびＰ−903は次の式で示される。
実施例10 上記宿主−ベクター系1,4−DHPDの不斉加水
分解活性を有するタンパク質の発現に必須なdhpA遺伝子
領域の限定 pDE88で形質転換したストレプトマイセス・リビダン
ス66（Streptomyces lividans 66）が、前述のように、
１、４−DHPDの不斉加水分解活性を有するタンパク質を
発現したことより同活性の発現に必須な領域はpDE88中
の3.0kb Sau3A I挿入断片中に存在すると考えられた。
この領域をさらに限定するために、pDE89（図７）およ
びpDE87（図８）を構築した。すなわち、pDE88 0.2μｇ
をSac Iで分解して、得られたDNA断片をLigation Kit v
ersion 2（宝酒造株式会社製）にて自己環状化反応を行
った。この反応溶液でStreptomyces lividans 66を形質
転換して得た形質転換株からすでに実施例１で述べたHo
pwoodらの実験書に示された方法でプラスミドpDE89を調
製した。pDE89はpDE88から0.64kb Sac I断片が欠失した
プラスミドである。
また、pDE87の調製方法はSac Iで分解する代わりにMl
u Iで分解するところを除いてはpDE89の調製方法と同じ
である。pDE87はpDE88から1.8kb Mlu I断片が欠失した
プラスミドである。
pDE89で形質転換したStreptomyces lividans 66は1,4
−DHPDの不斉加水分解活性を示したが、pDE87で形質転
換したStreptomyces lividans 66は1,4−DHPDの不斉加
水分解活性を示さなかった。このことは、1,4−DHPDの
不斉加水分解活性を有するタンパク質の発現に必須な領
域がSac I−Sau3A I間の2.5kbに限定され、その中に含
まれるMlu I部位が活性の発現に必要であることを示唆
している。
実施例11 dhpA遺伝子の配列決定用ベクターへのサブク
ローニング（pDE91） pDE88 １μｇをSac IおよびBamH Iで分解した。この分
解物をベクター・プラスミドpKF3（宝酒造株式会社製）
のSac I−BamH I分解物0.2μｇと混合し、Ligation Kit
version 2（宝酒造株式会社製）にてライゲーションを
行った。反応後、この溶液で大腸菌（Escherichia col
i）TH2コンピテント・セル（宝酒造株式会社製）を形質
転換し、リコンビナント選択培地（１％バクトトリプト
ン、０、５％酵母エキス、０、５％NaCl、50μg/mlスト
レプトマイシン硫酸塩、12μg/mlクロラムフェニコー
ル、pH7,5）に生育した株からプラスミドpDE91（図９）
を調製した。pDE91はpDE88由来1.8kb Sac I−BamH I断
片をpKF3に挿入したプラスミドである。
（pDE92） pDE88 1μｇをBamH IおよびSph Iで分解した。この分解
物をpKF3のBamH I−Sph I分解物0.2μｇと混合した。以
下pDE91の構築の時と同様な方法で、ライゲーション、
形質転換し、得られた株からプラスミドpDE92（図10）
を調製した。pDE92はpDE88由来0.9kb BamH I−Sph I断
片をpKF3に挿入したプラスミドである。
実施例12 dhpA遺伝子塩基配列の決定 pDE91を１μｇずつ７本のチューブに分け、それぞれPsh
B IおよびSac I,PshB IおよびSph I,PshB IおよびXho
I,PshB IおよびMlu I,Xba IおよびMlu I,Xba IおよびXh
o I,Xba IおよびSph Iで分解した後、DNA Bluntimg Kit
（宝酒造株式会社製）を用いて、DNA末端平滑化反応お
よび自己環状化反応を行った。この溶液で、E.coli TH2
コンピテント・セルを形質転換して得た株より欠失プラ
スミドを調製した。さらにpDE92 5μｇをBamH IおよびK
pn Iで分解し、エキソヌクレアーゼIII/S1ヌクレアーゼ
処理により、BamH I末端より400b（ベース・ペア）のDN
Aを削り取った。同様にして、pDE92 5μｇをXho Iおよ
びSac Iで分解し、エキソヌクレアーゼIII/S1ヌクレア
ーゼ処理により、Xho I末端より160bおよび450bのDNAを
削り取った後、さらにPshB Iで分解した。これらの欠失
DNA断片に対し、DNA Blunting Kit（宝酒造株式会社
製）を用いて、DNA末端平滑化反応および自己環状化反
応を行った。この溶液で、E.coli TH2コンピテント・セ
ルを形質転換して得た株より欠失プラスミドを調製し
た。このようにして得られた種々の欠失プラスミドなら
びにpDE91およびpDE92を鋳型にして、DNAシークエンサ
ー377型（アプライド バイオシステムズ株式会社製）
を用いて塩基配列の決定を行った。各プラスミドの配列
データをつなぎ合わせた結果、実施例８で示された４−
置換1,4−DHPD不斉加水分解活性の発現に必須な領域で
あるSac I部位からSau3A I部位までの2539bの塩基配列
が決定された。
決定された塩基配列をもとにBibbらの方法（Gene,30,
157（1984））に従ってオープンリーディングフレーム
（ORF）を調べた。その結果、配列表の配列番号:1の配
列に示したORFを見出した。この配列は実施例８で示し
たMlu I部位（DNA配列858−863位）を含んでいた。dhpA
遺伝子は配列番号:1のDNA配列338番目のGTGから始まる
が、その下流から実施例８で限定された領域の末端すな
わち配列番号１のDNA配列2539番目（Sau3A I部位GATCの
C;シトシン位）までに停止コドンが見出されなかった。
pDE88の構造より、その末端よりさらに下流には、ベ
クターpI J702の配列すなわちストレプトマイセス・ア
ンティビオティクス（Streptomyces antibioticus）由
来メラニン色素産生遺伝子（mel）領域がdhpA遺伝子の
方向と相対する向きで隣接していた。Bernanらが報告し
たmel遺伝子の塩基配列（Gene,37,101（1985））を考慮
した結果、このmel領域にてdhpA遺伝子より続くORFの停
止コマンド（TAA）を配列番号１のDNA配列2807番目に見
出した。そこまでの翻訳領域に相当するDNA配列からア
ミノ酸配列を決定し、配列番号:1にDNA配列とともに示
した。また同一のアミノ酸配列は配列番号:2の配列とし
て示されている。配列番号:1に示した配列のうちdhpA遺
伝子がもつ機能すなわち1,4−DHPDの不斉加水分解活性
を有するタンパク質を前記宿主−ベクター系で発現させ
るのに必要な塩基配列（配列番号:1のDNA配列１−2539
位）と対応するアミノ酸を配列番号:3に示した。さらに
同一のアミノ酸配列を配列番号:4の配列として示した。
産業上の利用可能性 本発明に従えば、1,4−DHPDの不斉加水分解酵素活性
を有するタンパク質の微生物による生産性を高めること
のできる該タンパク質をコードする遺伝子が提供され
る。さらに、本発明によれば、かかる遺伝子を組み込ん
だ発現プラスミドおよびそれによる形質転換体も提供さ
れる。またさらに、本発明によれば、かかる形質転換体
を用いることにより、1,4−DHPDの不斉加水分解酵素活
性を有するタンパク質を効率よく製造することもでき
る。本発明に従う、1,4−DHPDの不斉加水分解酵素活性
を有するタンパク質はプロテアーゼ活性が低いため、各
種反応条件下で安定性が高く、工業的な光学活性1,4−
ジヒドロピリジン誘導体の合成に有利である。
したがって、本発明は微生物を用いる各種化合物の製
造業や医薬製造業で利用可能である。
配列表 配列番号:1 配列の長さ:2809 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類:genomic DNA 起源 生物名：ストレプトマイセス・ビリドスポルス（Strept
omyces viridosporus） 株名:A−914 生物名：ストレプトマイセス・アンティビオティクス
（Streptomyces antibioticus） 配列の特徴 特徴を表す記号:CDS 存在位置:338..2539 特徴を決定した方法:E 特徴を表す記号:CDS 存在位置:2540..2809 特徴を決定した方法:P 配列 配列番号:2 配列の長さ:823 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：タンパク質 配列 配列番号:3 配列の長さ:2539 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類:genomic DNA 起源 生物：ストレプトマイセス・ビリドスポルス（Streptom
yces viridosporus） 株名:A−914 配列の特徴 特徴を表す記号:CDS 存在位置:338..2539 特徴を決定した方法:E 配列 配列番号:4 配列の長さ:734 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：タンパク質 配列 配列番号:5 配列の長さ:90 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 アンチセンス:Yes フラグメント型：中間フラグメント 配列 配列番号:6 配列の長さ:48 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 シポロジー：直鎖状 アンチセンス:Yes フラグメント型：中間フラグメント 配列 配列番号:7 配列の長さ:520 配列の型：アミノ酸 シポロジー：直鎖状 配列の種類：タンパク質 配列
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ Ｃ１２Ｒ 1:465） (Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ Ｃ１２Ｒ 1:465） (72)発明者 中島 崇 神奈川県藤沢市鵠沼神明２―９―２―Ｎ 204 (72)発明者 一色 邦夫 神奈川県茅ヶ崎市今宿911―３―318 (72)発明者 吉岡 武男 神奈川県綾瀬市吉岡1782―10 (56)参考文献 Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔｅ ｒｓ，Ｖｏｌ．34，Ｎｏ．21，，ｐ. 3441−3444 Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔｅ ｒｓ，Ｖｏｌ．34，Ｎｏ．37，ｐ．5915 −5918 (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) C12N 9/00 - 9/99 C12N 15/00 - 15/90 ZNA ＪＳＴＰｌｕｓ（ＪＯＩＳ) ＢＩＯＳＩＳ／ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ) ＰｕｂＭｅｄ ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ／ＰＩＲ／ＧｅｎｅＳ ｅｑ ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ／Ｇ ｅｎｅＳｅｑ

Claims (11)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】以下の（ａ）または（ｂ）のタンパク質を
    コードする遺伝子DNA。 （ａ）配列番号（SEQ ID NO）:7に記載されたアミノ
    酸配列、並びに該配列番号:7のLeu（１）ないしSer（51
    8）のアミノ酸配列、配列番号:7のLeu（１）ないしPro
    （512）のアミノ酸配列および配列番号:7のＣ−末端に
    さらにIle Gly Tyr Thr Tyr Asp Thr Ala Gly
    Ileが付加したアミノ酸配列からなる群より選ばれる
    アミノ酸配列よりなるタンパク質 （ｂ）配列番号:7のタンパク質をコードするDNAとハイ
    ブリダイズするDNAによりコードされ、かつ４−置換−
    1,4−ジヒドロピリジン誘導体（1,4−DHPD）の不斉加水
    分解酵素活性を有するタンパク質
  2. 【請求項２】該（ｂ）のタンパク質をコードするDNAが
    配列番号:1または配列番号:3の核酸配列からなる請求項
    １記載のDNA。
  3. 【請求項３】請求項１または２記載のいずれかの遺伝子
    をベクターに組み込んで構築された組換えプラスミド。
  4. 【請求項４】請求項３記載の組換えプラスミドにより宿
    主微生物が形成転換された形質転換体。
  5. 【請求項５】宿主微生物がストレプトミセス リビダン
    ス（Streptomyces lividans）、ストレプトミセス ビ
    リドスポルス（Streptomyces viridosporus）およびス
    トレプトミセス クラブス（Streptomyces clavus）か
    らなる群より選ばれる菌株である請求項３記載の形質転
    換体。
  6. 【請求項６】請求項３記載の組換えプラスミドにより宿
    主微生物が形質転換された形質転換体を栄養培地で培養
    し、培養物から1,4−DHPDの不斉加水分解酵素活性を有
    するタンパク質を回収することを特徴とする該タンパク
    質の製造方法。
  7. 【請求項７】請求項３記載の組換えプラスミドにより宿
    主微生物が形質転換された形質転換体を、栄養培地で培
    養し、培養物から得ることのできる1,4−DHPDの不斉加
    水分解酵素活性を有するタンパク質。
  8. 【請求項８】配列番号:7に記載されたアミノ酸配列自
    体、配列番号:7のLeu（１）ないしSer（518）のアミノ
    酸配列、配列番号:7のLeu（１）ないしPro（512）のア
    ミノ酸配列、および配列番号:7のＣ−末端にさらにIle
    Gly Tyr Thr Tyr Asp Thr Ala Gly Ileが付
    加したアミノ酸配列からなる群より選ばれる配列を有す
    るタンパク質。
  9. 【請求項９】請求項７または８に記載のタンパク質と、
    次式 （但し、式中Ｒは、低級アルカノイル基、複素環カルボ
    ニル基、ハロ置換アセチル基、アルコキシアセチル基、
    アリールオキシアセチル基、置換もしくは非置換フエニ
    ル低級アルカノイル基、フエニル置換もしくは非置換低
    級アルケノイル基、アルコキシもしくはアルケニルオキ
    シカルボニル基、アラルキルオキシカルボニル基または
    有機スルホニル基を表わし、ｎは、２〜４の整数を表わ
    す。）で示される化合物またはその塩を水性媒体中で接
    触させ、次式 （但し、式中Ｒ及びｎは、前記と同意義である）で示さ
    れる光学活性４−置換−1,4−ジヒドロピリジン化合物
    またはその塩を回収することを特徴とする光学活性（4
    R）−1,4−ジヒドロ−2,6−ジメチル−４−（ニトロフ
    エニル）ピリジン−3,5−ジカルボン酸モノエステル誘
    導体の製造方法。
  10. 【請求項１０】タンパク質が請求項８記載のタンパク質
    である請求項９記載の製造方法。
  11. 【請求項１１】タンパク質が配列番号:7に記載されたア
    ミノ酸配列で表される請求項９記載の製造方法。
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