KR20220133619A

KR20220133619A - 활성형 인간 티로시나아제 생산용 재조합 균주 및 이를 이용한 활성형 티로시나아제 정제방법

Info

Publication number: KR20220133619A
Application number: KR1020210038946A
Authority: KR
Inventors: 공광훈; 최혜원; 이성준; 장시욱; 채기현
Original assignee: 중앙대학교 산학협력단
Priority date: 2021-03-25
Filing date: 2021-03-25
Publication date: 2022-10-05

Abstract

본 발명은 활성형 인간 티로시나아제 및 인간 티로시나아제 관련 단백질 1 생산용 재조합 균주에 관한 것이다. 본 발명에 따른 활성형 인간 티로시나아제 및 인간 티로시나아제 관련 단백질 1 생산용 재조합 균주는 재조합 단백질을 세포내 발현하는 것을 확인하였다. 또한 발현된 활성형 인간 티로시나아제 및 인간 티로시나아제는 정제 시 순도를 현저히 높일 수 있음을 확인하였다. 이는 낮은 비용 및 적은 시간으로 순도가 높은 활성형 인간 티로시나아제를 제조할 수 있음을 의미하는바, 백색증 등의 질환 예방 및 치료 분야, 미백 성분의 스크리닝 분야에서 다양하게 활용될 수 있다.

Description

활성형 인간 티로시나아제 생산용 재조합 균주 및 이를 이용한 활성형 티로시나아제 정제방법{Recombinant strain for active tyrosinase production and active human tyrosinase purification method using same}

본 발명은 활성형 인간 티로시나아제 및 인간 티로시나아제 관련 단백질 1 생산용 재조합 균주에 관한 것이다.

멜라닌의 색소 침착은 주근깨, 검버섯, 기미와 같은 피부 문제를 일으킨다. 또한 티로시나아제의 하향 조절은 화장품 산업에서 피부 미백 시약 개발을 위한 전통적인 접근 방식이다. 체내 멜라닌 합성에 관여하는 인간 티로시나아제의 구조는 피부 미백 시약 발굴을 위한 핵심 정보를 담고 있다. 그러나 인간 티로시나아제의 구조는 아직 밝혀진 바가 없다.

최근 몇 년 동안 개발된 피부 미백 제제는 티로시나아제 억제제이다. 상기 피부 미백 제제는 다음과 같이 6개 그룹으로 분류된다.

(1) 도파퀴논의 화학적 환원을 유발하는 환원제

(2) o-도파퀴논 스캐빈저

(3) 효소 기질을 대체하는 페놀 화합물

(4) 활성을 변성시키는 비특이적 효소 비활성화제

(5) 자살 기질(suicide substrate)라고 하는 티로시나아제 비활성화제

(6) 티로시나아제에 결합하는 티로시나아제 억제제

마지막으로 분류된 억제제인 티로시나아제 억제제는 일반적으로 경쟁, 비경쟁, 혼합 및 비경쟁 억제제로 분류된다. 이들 중 경쟁 억제제는 효소 또는 기타 기질의 활성 부위에 있는 구리 이온에 결합 할 수 있는 반면, 비경쟁적 억제제는 효소-기질 복합체에만 결합한다.

식품 의약품 안전처에 따르면 인간 또는 버섯 티로시나아제를 체외 피부 미백제 평가에 사용하도록 규정하고 있다. 그러나 재조합 인간 티로시나아제 공급 문제로 인해 버섯 티로시나아제는 화장품 산업에서 피부 미백 시약을 스크리닝하는 유일한 도구로 사용되고 있다.

그러나 인간 및 버섯 티로시나아제는 최대 억제 농도(IC₅₀)가 다른 것으로 알려져 있다. 특히, 인간 티로시나아제 및 Agaricus bisporus 유래 버섯 티로시나아제는 아미노산 서열에서 23%의 동일성만을 가진다. 인간 및 버섯 티로시나아제의 최대 억제 농도 차이 등은 단백질의 구조 및 특성 차이에 의한 것으로 사료된다. 따라서 피부 미백 제제의 정확한 평가를 위해서는 재조합 인간 티로시나아제의 대규모 생산 시스템 구축이 필요한 실정이다.

이에 본 발명자들은 재조합 인간 티로시나아제의 대규모 생산 시스템을 구축하기 위하여, 인간 티로시나아제 및 인간 티로시나아제 관련 단백질 1을 균체 내에서 발현하는 재조합 피키아 파스토리스를 개발함으로써 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서 본 발명의 목적은, 서열번호 1의 염기서열로 표시되는 인간 티로시나아제 유전자; 서열번호 3의 염기서열로 표시되는 AOX1 프로모터; 및 서열번호 4의 염기서열로 표시되는 알파-메이팅 팩터 신호 서열;을 포함하는 고순도 티로시나아제 생산용 재조합 피키아 파스토리스 SMD1168(Pichia pastoris SMD1168) 균주를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은, 서열번호 2의 염기서열로 표시되는 인간 티로시나아제 관련 단백질 1 유전자; 서열번호 3의 염기서열로 표시되는 AOX1 프로모터; 및 서열번호 4의 염기서열로 표시되는 알파-메이팅 팩터 신호 서열;을 포함하는 고순도 티로시나아제 관련 단백질 1 생산용 재조합 피키아 파스토리스 SMD1168(Pichia pastoris SMD1168) 균주를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은, 재조합 피키아 파스토리스 SMD1168 균주를 크로마토그래피로 전개하여 용출액을 수득하는 단계;를 포함하는 티로시나아제 또는 티로시나아제 관련 단백질 1의 정제방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은, 재조합 피키아 파스토리스 SMD1168 균주를 배양하는 단계;를 포함하는 티로시나아제 또는 티로시나아제 관련 단백질 1의 생산방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은, 재조합 피키아 파스토리스 SMD1168 균주를 포함하는 티로시나아제 또는 티로시나아제 관련 단백질 1 생산용 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은, 상기 방법으로 생산된 티로시나아제 또는 티로시나아제 관련 단백질 1을 포함하는 멜라닌 합성 억제제 스크리닝용 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은, (a) 상기 생산방법으로 제조된 티로시나아제 또는 티로시나아제 관련 단백질 1; 및 스크리닝하고자 하는 대상 물질;을 처리하는 단계; 및 (b) 티로시나아제 또는 티로시나아제 관련 단백질 1의 활성을 억제하는 대상 물질을 선별하는 단계;를 포함하는 멜라닌 합성 억제제 스크리닝 방법을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 1의 염기서열로 표시되는 인간 티로시나아제 유전자; 서열번호 3의 염기서열로 표시되는 AOX1 프로모터; 및 서열번호 4의 염기서열로 표시되는 알파-메이팅 팩터 신호 서열;을 포함하는 고순도 티로시나아제 생산용 재조합 피키아 파스토리스 SMD1168(Pichia pastoris SMD1168) 균주를 제공한다.

또한 본 발명은 서열번호 2의 염기서열로 표시되는 인간 티로시나아제 관련 단백질 1 유전자; 서열번호 3의 염기서열로 표시되는 AOX1 프로모터; 및 서열번호 4의 염기서열로 표시되는 알파-메이팅 팩터 신호 서열;을 포함하는 고순도 티로시나아제 관련 단백질 1 생산용 재조합 피키아 파스토리스 SMD1168(Pichia pastoris SMD1168) 균주를 제공한다.

또한 본 발명은 재조합 피키아 파스토리스 SMD1168 균주를 크로마토그래피로 전개하여 용출액을 수득하는 단계;를 포함하는 티로시나아제 또는 티로시나아제 관련 단백질 1의 정제방법을 제공한다.

또한 본 발명은 재조합 피키아 파스토리스 SMD1168 균주를 배양하는 단계;를 포함하는 티로시나아제 또는 티로시나아제 관련 단백질 1의 생산방법을 제공한다.

또한 본 발명은 재조합 피키아 파스토리스 SMD1168 균주를 포함하는 티로시나아제 또는 티로시나아제 관련 단백질 1 생산용 조성물을 제공한다.

또한 본 발명은 상기 방법으로 생산된 티로시나아제 또는 티로시나아제 관련 단백질 1을 포함하는 멜라닌 합성 억제제 스크리닝용 조성물을 제공한다.

또한 본 발명은 (a) 상기 생산방법으로 제조된 티로시나아제 또는 티로시나아제 관련 단백질 1; 및 스크리닝하고자 하는 대상 물질;을 처리하는 단계; 및 (b) 티로시나아제 또는 티로시나아제 관련 단백질 1의 활성을 억제하는 대상 물질을 선별하는 단계;를 포함하는 멜라닌 합성 억제제 스크리닝 방법을 제공한다.

본 발명에 따른 활성형 인간 티로시나아제 및 인간 티로시나아제 관련 단백질 1 생산용 재조합 균주는 재조합 단백질을 세포내 발현하는 것을 확인하였다. 또한 발현된 활성형 인간 티로시나아제 및 인간 티로시나아제는 정제 시 순도를 현저히 높일 수 있음을 확인하였다. 이는 낮은 비용 및 적은 시간으로 순도가 높은 활성형 인간 티로시나아제를 제조할 수 있음을 의미하는바, 백색증 등의 질환 예방 및 치료 분야, 미백 성분의 스크리닝 분야에서 다양하게 활용될 수 있다.

도 1은 제작된 플라스미드 pPICZαC-hTYR 및 pPICZαC-hTYRP1의 개열지도를 나타낸 도이다.
도 2는 아가로스 겔 전기영동을 통해 선형화된 플라스미드 pPICZαC-hTYR 및 pPICZαC-hTYRP1를 확인한 결과를 나타낸 도이다(Lane M, marker; lane 1, linearized pPICZαC-hTYR by Sac I(5,085 bp); lane 2, linearized pPICZαC-hTYRP1 by Nco I(5,109 bp)).
도 3A는 hTYR의 콜로니를 이용한 qPCR 결과를 나타낸 도이다.
도 3B는 hTYRP1의 콜로니를 이용한 qPCR 결과를 나타낸 도이다.
도 4A는 배양 온도 및 시간에 따른 hTYR의 발현을 SDS-PAGE를 통해 분석한 결과를 나타낸 도이다(Lane M, Molecular weight marker; lane 1, supernatant of cell lysate hTYR(30℃); lane 2, supernatant of cell lysate hTYR(23℃); lane 3, supernatant of cell lysate hTYR(16℃); lane 4, pellet hTYR(30℃); lane 5, pellet hTYR(23℃); lane 6, pellet hTYR(16℃)).
도 4B는 배양 온도 및 시간에 따른 hTYRP1의 발현을 SDS-PAGE를 통해 분석한 결과를 나타낸 도이다(Lane M, Molecular weight marker; lane 1, supernatant of cell lysate hTYRP1(30℃); lane 2, supernatant of cell lysate hTYRP1(23℃); lane 3, supernatant of cell lysate hTYRP1(16℃); lane 4, pellet hTYRP1(30℃); lane 5, pellet hTYRP1(23℃); lane 6, pellet hTYRP1(16℃)).
도 5A는 면역 블롯팅을 통해 hTYR의 발현을 확인한 결과를 나타낸 도이다(Lane M, Molecular weight marker; lane 1, supernatant of cell lysate hTYR(16℃); lane 2, supernatant hTYR(16℃)).
도 5B는 면역 블롯팅을 통해 hTYRP1의 발현을 확인한 결과를 나타낸 도이다(Lane M, Molecular weight marker; lane 1 및 2, supernatant of cell lysate hTYRP1(16℃); lane 3 및 4, supernatant hTYRP1(16℃)).
도 6은 hTYR 및 hTYRP1의 발현 최적화 조건을 나타낸 도이다.
도 7A는 DEAE Sepharose 컬럼을 이용한 음이온 교환 크로마토그래피를 통해 hTYR을 정제한 결과를 나타낸 도이다(Lane M, Molecular weight marker; Lane 1 to 6, purified hTYR fraction).
도 7B는 Ni-NTA 컬럼을 이용한 고정된 금속 친화성 크로마토그래피를 통해 hTYR을 정제한 결과를 나타낸 도이다(Lane M, Molecular weight marker; Lane 1 to 6, purified hTYR fraction).
도 8A는 DEAE Sepharose 컬럼을 이용한 음이온 교환 크로마토그래피로 hTYR을 정제한 결과를 나타낸 도이다(Lane M, Molecular weight marker; Lane 1 to 6, purified hTYR fractions).
도 8B는 Ni-NTA 컬럼을 이용한 고정된 금속 친화성 크로마토그래피로 hTYR을 정제한 결과를 나타낸 도이다(Lane M, Molecular weight marker; Lane 1 to 6, purified hTYR fractions).
도 9는 on-plate tyrosinase activity assay를 통해 hTYR의 활성을 분석한 결과를 나타낸 도이다.
도 10은 native PAGE 및 L-DOPA를 통해 hTYR 및 hTYRP1의 활성을 분석한 결과를 나타낸 도이다(Lane M, Molecular weight marker; lane 1, purified hTYR dialyzed by 50 mM Tris-HCl, pH 7.5; lane 2 및 3, purified hTYR dialyzed by 50 mM Tris-HCl, pH 7.5, 0.5 mM CuSO₄; lane 4, purified hTYRP1 dialyzed by 50 mM Tris-HCl, pH 7.5; lane 5, purified hTYRP1 dialyzed by 50 mM Tris-HCl, pH 7.5, 0.5 mM ZnCl₂).
도 11A는 L-티로신에 대한 Lineweaver-Burk plot을 나타낸 도이다.
도 11B는 L-DOPA에 대한 Lineweaver-Burk plot을 나타낸 도이다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명의 양태에 따르면, 본 발명은 서열번호 1의 염기서열로 표시되는 인간 티로시나아제 유전자; 서열번호 3의 염기서열로 표시되는 AOX1 프로모터; 및 서열번호 4의 염기서열로 표시되는 알파-메이팅 팩터 신호 서열;을 포함하는 고순도 티로시나아제 생산용 재조합 피키아 파스토리스 SMD1168(Pichia pastoris SMD1168) 균주를 제공한다. 또한 본 발명은 서열번호 2의 염기서열로 표시되는 인간 티로시나아제 관련 단백질 1 유전자; 서열번호 3의 염기서열로 표시되는 AOX1 프로모터; 및 서열번호 4의 염기서열로 표시되는 알파-메이팅 팩터 신호 서열;을 포함하는 고순도 티로시나아제 관련 단백질 1 생산용 재조합 피키아 파스토리스 SMD1168(Pichia pastoris SMD1168) 균주를 제공한다.

본 발명에 있어서, 피키아 파스토리스(Pichia pastoris)는 재조합 단백질의 대량 생산에 적합한 발현계를 포함하는 균주로, 외래 단백질을 높은 수준으로 생산할 수 있으며, 진핵 생물의 단백질 합성 과정에서 일어나는 신호 서열 생성 뿐만 아니라 접힘, 인산화 및 당사슬 부가 등의 번역 후 변형이 일어난다는 장점이 있다. 특히, 피키아 파스토리스 SMD1168(Pichia pastoris SMD1168)는 프로테아제가 결핍된 균주로, 생성된 재조합 단백질의 분해를 감소시킬 수 있다는 장점이 있다.

본 발명에 있어서, 티로시나아제는 멜라닌 생합성 과정에서 멜라닌 생성을 조절하는 산화 효소로, 티로시나아제의 변이는 백색증 및 백반증 등을 유발한다. 인간을 포함한 포유류에서 유래한 티로시나아제의 결정구조는 티로시나아제의 구조적 복잡성에서 기인한 효과적인 발현 시스템, 정확한 접힘과 결정화에 대한 어려움으로 아직까지 보고된 바 없다. 높은 활성을 나타내고 비교적 쉬운 추출이 가능한 Agaricus bisporus 버섯 유래의 티로시나아제를 상업적으로 이용하고 있으나, 인체 티로시나아제와 촉매활성 및 기질 특이성에 상당한 차이가 있는 것으로 알려져 있다.

본 발명에 있어서, 티로시나아제 관련 단백질 1은 금속을 포함하는 당단백질로, 멜라닌 생합성에 관여하는 효소이다.

본 발명에 있어서, 유전자(gene)는 최광의의 의미로 간주되어야 하며, 구조 단백질 또는 조절 단백질을 암호화할 수 있다. 이때, 조절 단백질은 전사인자, 열 충격단백질 또는 DNA/RNA 복제, 전사 및/또는 번역에 관여하는 단백질을 포함한다. 본 발명에 있어서, 발현 억제의 대상이 되는 표적 유전자는 염색체 외 구성요소로서 존재할 수 있다.

또한, 상기 염기서열의 변이체가 본 발명의 범위 내에 포함된다. 구체적으로, 상기 본 명세서에 기재된 유전자는 각 염기서열과 70% 이상, 더욱 바람직하게는 80% 이상, 더 더욱 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의서열 상동성을 가지는 것으로, 본 명세서에 기재된 유전자의 염기서열과 실질적으로 동질의 생리활성을 나타내는 서열을 의미한다. 폴리뉴클레오티드에 대한 "서열 상동성의 %"는 두 개의 최적으로 배열된 서열과 비교 영역을 비교함으로써 확인되며, 비교 영역에서의 폴리뉴클레오티드 서열의 일부는 두 서열의 최적 배열에 대한 참고 서열(추가 또는 삭제를 포함하지 않음)에 비해 추가 또는 삭제(즉, 갭)를 포함할 수 있다.

본 발명에 있어서, AOX1 프로모터(Alcohol oxidase 1 promoter)는 메탄올 유도에 의해 재조합 단백질의 높은 발현량을 유도할 수 있는 프로모터이다.

본 발명에 있어서, 알파-메이팅 팩터 신호(α-mating factor signal)는 체내에서 생산된 단백질의 체외 발현을 유도하는 신호이다.

본 발명의 구체예에서, 상기 균주는 서열번호 5의 염기서열로 표시되는 폴리 히스티딘 태그를 더 포함하는 것이 바람직하다.

본 발명에 있어서, 폴리 히스티딘 태그(poly His tag)는 단백질 내 최소 6개 이상의 히스티딘 잔기로 구성된 아미노산 모티프로, 단백질의 N-말단 또는 C-말단에 있다. 폴리 히스티딘 태그는 원핵세포 발현 시스템에서 발현되는 재조합 단백질의 친화성 정제에 활용된다.

본 발명의 바람직한 구체예에서, 상기 균주는 인간 티로시나아제 유전자 또는 인간 티로시나아제 관련 단백질 1 유전자; AOX1 프로모터; 알파-메이팅 팩터 신호 서열; 및 폴리 히스티딘 태그;가 순차적으로 작동가능하게 연결된 벡터를 포함하는 것이 바람직하나, 언급된 유전자를 도입하기 위한 것이라면 제한없이 적용할 수 있다.

본 발명에 있어서, 작동 가능하게 연결(operably linked)된다는 것은 적절한 분자가 발현 조절 서열에 결합할 때 유전자 발현을 가능하게 하는 방식으로 연결되는 것을 의미한다.

본 발명의 구체예에서, 상기 균주는 인간 티로시나아제 또는 인간 티로시나아제 관련 단백질 1을 세포 내 발현하며, 발현된 단백질은 활성형일 수 있다.

상기 활성형 인간 티로시나아제 및 관련 인간 티로시나아제 관련 단백질 1과 관련하여, 외래 단백질을 대장균이나 효모같은 균주에서 발현하는 경우 접힘 구조가 불완전하거나 정확하지 않은 경우가 발생한다. 이 경우 최종 단백질의 활성에 부정적인 영향을 미친다. 티로시나아제 및 티로시나아제 관련 단백질 1은 일반적으로 막단백질로 진핵생물에서는 소포체에 결합한 리보솜에 의해 소포체의 내강으로 발현된 후, 골지체로 이동하여 골지체에서 구리이온과 결합하여 활성형이 된다. 이 때 활성부위에 금속(구리) 이온을 포함하는 형태의 단백질로 접힘이 제대로 이루어지지 않을 경우 구리결합부위가 불완전해지며, 활성을 나타내지 않을 가능성이 높다. 본 발명에 따른 균주는 재조합 인간 티로시나아제 또는 인간 티로시나아제 관련 단백질 1을 세포내 발현하는 것으로, 소포체로 이동하여 신호 서열이 절단된다. 이와 같은 과정을 통해 활성형 인간 티로시나아제 및 관련 인간 티로시나아제 관련 단백질 1을 얻었다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, (a) 상기 재조합 피키아 파스토리스 SMD1168 균주를 크로마토그래피로 전개하여 용출액을 수득하는 단계;를 포함하는 티로시나아제 또는 티로시나아제 관련 단백질 1의 정제방법을 제공한다.

본 발명의 구체예에서, 상기 단계 (a)의 재조합 피키아 파스토리스 SMD1168 균주는 세포 배양액 또는 세포 파쇄액 형태인 것이 바람직하나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 구체예에서, 상기 단계 (a)의 크로마토그래피는 Ni-NTA 컬럼, DEAE 컬럼, CM 컬럼, GST 컬럼, HIC 컬럼 및 겔 여과 컬럼으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 컬럼을 이용하는 것이 바람직하며, 더 바람직하게는 Ni-NTA 컬럼을 이용하는 것이다.

본 발명의 구체예에서, 상기 단계 (a)의 크로마토그래피는 고정된 금속 친화성 크로마토그래피(immobilized metal-affinity chromatography), 음이온 교환 크로마토그래피, 양이온 교환 크로마토그래피 또는 겔여과 크로마토그래피인 것이 바람직하며, 더 바람직하게는 고정된 금속 친화성 크로마토그래피이다.

본 발명의 바람직한 구체예에서, 상기 단계 (a)의 크로마토그래피는 Ni-NTA 컬럼을 이용한 고정된 금속 친화성 크로마토그래피이다.

본 발명의 구체예에서, 상기 정제방법은 (b) 단계 (a)에서 수득된 용출액을 5 내지 20 kDa 컷오프 투석막을 이용하여 투석하는 단계를 더 포함하는 것이 바람직하다. 상기 투석막은 내지 15 kDa 컷오프 투석막인 것이 더 바람직하고, 더욱 바람직하게는 12 내지 14 kDa 컷오프 투석막일 수 있다.

본 발명에 따른 정제방법은 상기 재조합 피키아 파스토리스 SMD1168 균주에서 얻은 활성형 인간 티로시나아제 및 인간 티로시나아제 관련 단백질 1을 정제하기 위해 최적화된 것이다. 종래 대장균 발현계 이용 및 정제를 통해 얻을 수 있는 인간 티로시나아제의 양은 약 1 내지 2 mg/L로 알려져 있다. 본 발명의 정제방법은 약 230 mg/L로, 종래 방법에 비해 약 230배 증가한 것이다. 이는 본 발명에 따른 정제방법이 낮은 비용 및 적은 시간으로 순도가 높은 인체 티로시나아제를 정제할 수 있음을 의미하는바, 백색증 등의 질환 예방 및 치료 분야, 미백 성분의 스크리닝 분야에서 다양하게 활용될 수 있다.

본 발명의 또 다른 양태에서, 상기 재조합 피키아 파스토리스 SMD1168 균주를 배양하는 단계;를 포함하는 티로시나아제 또는 티로시나아제 관련 단백질 1의 생산방법을 제공한다.

본 발명의 구체예에서, 배지 및 기타 배양조건은 통상의 피키아 파스토리스 SMD1168의 배양에 사용되는 배지이면 어느 것이나 사용할 수 있다. 바람직하게는, 본 발명의 재조합 피키아 파스토리스 SMD1168을 적당한 탄소원, 질소원, 아미노산, 비타민 등을 함유한 통상의 배지 내에서 호기성 조건 하에서 온도, pH 등을 조절하면서 배양한다.

본 발명의 바람직한 구체예에 있어서, 상기 배지는 탄소원으로서 당류 또는 당알코올을 포함할 수 있으며, 보다 상세하게는 포도당, 만니톨, 수크로오스, 아라비노스, 갈락토오스, 글리세롤, 자일로오스, 만노오스, 프락토오스, 락토오스, 말토오스, 수크로오스, 알긴산, 셀룰로오스, 덱스트린, 글리코겐, 히알루론산, 렌티난, 자이모산, 키토산, 글루칸, 리그닌 및 펙틴으로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상일 수 있으며, 바람직하게는 포도당, 만니톨, 알긴산, 수크로오스, 아라비노스, 갈락토오스 및 글리세롤로 이루어진 군에서 선택되는 1 종 이상을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 무기화합물로는 염화나트륨, 염화칼슘, 염화철, 황산마그네슘, 황산철, 황산망간 및 탄산칼슘 등이 사용될 수 있으며, 그 외에 아미노산, 비타민 및 적절한 전구체 등이 포함될 수 있다. 이들 배지 또는 전구체는 배양물에 회분식 또는 연속식으로 첨가될 수 있다.

배양 중에 수산화암모늄, 수산화칼륨, 암모니아, 인산 및 황산과 같은 화합물을 배양물에 적절한 방식으로 첨가하여, 배양물의 pH를 조정할 수 있다. 또한, 배양 중에는 지방산 폴리글리콜 에스테르와 같은 소포제를 사용하여 기포 생성을 억제할 수 있다. 또한, 배양물의 호기 상태를 유지하기 위하여, 배양물 내로 산소 또는 산소 함유 기체를 주입하거나 혐기 및 호기 상태를 유지하기 위해 기체의 주입없이 혹은 질소, 수소 또는 이산화탄소 가스를 주입할 수 있다.

배양물의 온도는 보통 27℃ 내지 37℃, 바람직하게는 30℃ 내지 35℃로 설정할 수 있다. 배양 기간은 원하는 유용 물질의 생성량이 수득될 때까지 계속될 수 있으며, 바람직하게는 10 내지 100 시간 동안 배양할 수 있다.

본 발명의 구체예에서, 상기 생산방법은 배양 단계에서 생산된 티로시나아제 또는 티로시나아제 관련 단백질 1을 추가로 정제 또는 회수하는 단계를 더 포함할 수 있으며, 재조합 피키아 파스토리스 SMD1168 균주 또는 배양물로부터 티로시나아제 또는 티로시나아제 관련 단백질 1을 회수하는 방법은 당업계에 알려진 방법, 예컨대 원심분리, 여과, 크로마토그래피, 결정화 및 HPLC 등이 사용될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기 회수 단계는 정제 공정을 포함할 수 있으며, 당업자는 공지된 여러 정제 공정 중 필요에 따라 선택하여 활용할 수 있다.

본 발명의 또 다른 양태에서, 본 발명은 재조합 피키아 파스토리스 SMD1168 균주를 포함하는, 티로시나아제 또는 티로시나아제 관련 단백질 1 생산용 조성물을 제공한다.

본 발명에 따른 티로시나아제 또는 티로시나아제 관련 단백질 1 생산용 조성물은 균주의 보존, 배양 및 정제 등을 위한 공지의 구성을 더 포함할 수 있으며, 그 예로는 배지 등이 있다.

본 발명의 또 다른 양태에서, 상기 생산방법으로 생산된 티로시나아제 또는 티로시나아제 관련 단백질 1을 포함하는 멜라닌 합성 억제제 스크리닝용 조성물을 제공한다.

상기 멜라닌 합성 억제제 스크리닝용 조성물은 당 분야의 일반적인 효소학적 분석에 사용되는 시약 등이 더 포함될 수 있다. 상기 시약의 일 예로, 적합한 담체, 검출 가능한 신호를 생성할 수 있는 표지 물질, 발색단(chromophores), 용해제, 세정제, 완충제, 안정화제 등이 포함되나 이에 제한되지 않는다. 표지물질이 효소인 경우에는 효소 활성을 측정할 수 있는 기질 및 반응 정지제를 포함할 수 있다. 담체는 가용성 담체, 불용성 담체가 있고, 가용성 담체의 일 예로 당 분야에서 공지된 생리학적으로 허용되는 완충액, 예를 들어 PBS가 있고, 불용성 담체의 예로는 폴리스틸렌, 폴리에틸렌, 폴리프로필렌, 폴리에스테르, 폴리아크릴로니트릴, 불소 수지, 가교 덱스트란, 폴리사카라이드, 라텍스에 금속을 도금한 자성 미립자와 같은 고분자, 기타 종이, 유리, 금속, 아가로오스 및 이들의 조합일 수 있다.

본 발명의 또 다른 양태에서, (a) 상기 생산방법으로 생산된 티로시나아제 또는 티로시나아제 관련 단백질 1; 및 스크리닝하고자 하는 대상 물질;을 처리하는 단계; 및 (b) 티로시나아제 또는 티로시나아제 관련 단백질 1의 활성을 억제하는 대상 물질을 선별하는 단계;를 포함하는 멜라닌 합성 억제제 스크리닝 방법을 제공한다.

본 발명에 따른 멜라닌 합성 억제제를 스크리닝하는 방법은 티로시나아제 또는 티로시나아제 관련 단백질 1이 기질과 결합하는 것을 방해하거나, 기질보다 효소에 더 높은 친화도로 결합하는 제제를 선별하는 것일 수 있다. 상기 방법으로 스크리닝된 제제는 새로운 멜라닌 합성 억제제, 즉, 미백을 위한 소재로 활용될 수 있다.

중복되는 내용은 본 명세서의 복잡성을 고려하여 생략하며, 본 명세서에서 달리 정의되지 않은 용어들은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상적으로 사용되는 의미를 갖는 것이다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

[실험예]

실험예 1. 피키아 파스토리스( Pichia pastoris )에서 hTYR 및 hTYRP1의 클로닝 및 선별

1.1. 피키아 파스토리스에서 플라스미드 DNA의 구축 및 형질전환

인간 티로시나제(hTYR, NM_7299) 및 인간 티로시나제 관련 단백질 1(hTYRP1, NM_7306)의 서열은 National Center for Biotechnology Information에서 얻었다. 상기 hTYR 및 hTYRP1 서열은 Genscript(USA)에 의해 피키아 파스토리스에서 효율적인 발현을 위해 코돈 최적화하였다. 코돈 최적화된 hTYR 및 hTYRP1은 각각 서열번호 1 및 2의 염기서열로 표시된다. 코돈 최적화 발현 플라스미드 pPICZαC 기반 구축물은 코돈 최적화된 hTYR 또는 hTYRP1 서열을 플라스미드의 EcoR Ⅰ 및 Sal Ⅰ 부위에서 폴리 히스티딘 태그(6x His)를 함유하는 C-말단과 연결하여 제작하였다. 제작된 플라스미드 pPICZαC-hTYR 및 pPICZαC-hTYRP1는 AOX-1 프로모터(서열번호 3), α-메이팅 팩터(α-mating factor, 서열번호 4), 표적 유전자(hTYR 또는 hTYRP1) 및 폴리 히스티딘 태그(6x His, 서열번호 5)의 순서로 작동가능하게 연결되어 있다. 제작된 플라스미드 2종의 개열지도는 도 1에 나타내었다.

제작된 플라스미드 pPICZαC-hTYR 및 pPICZαC-hTYRP1를 제한효소(hTYR; Sac Ⅰ, hTYRP1; Nco I)(Takara, Japan)를 처리하여 선형화시켰다. 선형화된 플라스미드는 0.8% 아가로스 겔을 이용한 전기영동으로 확인하였다.

Pichia EasyComp Kit(Invitrogen, USA)를 사용하여 피키아 파스토리스 SMD1168에 선형화된 DNA를 도입하였다. 형질전환된 피키아 파스토리스는 Zeocin(25 μg/ml)을 함유하는 YPD(1% 효모추출물, 2% 펩톤, 2% 덱스트로스, 1M 소르비톨) 한천 플레이트에서 선택하였다. pPICZαC-hTYR으로 형질전환된 콜로니 20개; 및 pPICZαC-hTYRP1로 형질전환된 콜로니 10개;를 선택하였다.

1.2. gDNA 분리 및 qPCR

콜로니를 선택한 후 Zeocin(25 ㎍/ml)이 포함된 YPD 성장 배지에서 30℃, 200 rpm에서 12 내지 16 시간 동안 배양하였다. 배양 후 22,800 g, 4℃에서 15분 동안 원심분리하여 세포 펠릿을 얻었다. 세포 펠릿을 30 μl STES 완충액(0.2M Tris-HCl pH 7.6, 0.5M NaCl, 0.01M EDTA, 0.1%(w/v) SDS)에 재현탁하고 22,800 g, 4℃에서 15분 동안 원심분리하였다. 상층액을 제거한 후 세포 펠릿을 30 μl STES 완충액에 재현탁하고, 유리비드를 메니스커스 수준(meniscus level)까지 첨가하였다. 이후 시료를 5분 동안 볼텍싱하고 페놀클로로포름 이소아밀알코올(24:25:1) 200 μl 및 TE 완충액(10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 7.4) 200 μl를 첨가하였다. 시료를 다시 2분 동안 볼텍싱한 후, 22,800 g, 4℃에서 15분 동안 원심분리하였다. 상청액(TE 완충액)을 수집하고 에탄올 침전을 수행하였다.

가장 많은 복제 DNA가 도입된 콜로니를 스크리닝하기 위해 qPCR을 수행하였다. 프라이머는 Applied Biosystems Primer Express^TM를 통해 구축하였다. 구축된 프라이머는 시판 업체(Bionics, Korea)에서 합성하였다. qPCR은 2X SYBR Green(Thermo Fisher Scientific, USA), 각 프라이머 5 내지 10 μM 및 gDNA 100 μM를 사용하여 수행하였다. gDNA 수준의 상대 정량은 QuantStudio1 Real-Time PCR System(Thermo Fisher Scientific, USA)에서 얻은 Ct 값과 comparative cycle threshold method 2^-ΔΔCt를 기반으로 분석하였다. 18s RNA는 정규화를 위한 대조군으로 사용하였다. 구축된 프라이머 및 qPCR 조건은 표 1 나타내었다.

Primer design for qPCR
	Primer	5' primer	3' primer
Human tyrosinase	sequence	CCA TGG CAC AGA TTG TTT TTG T (서열번호 6)	TTC TCG TCC CCA GTC AAC TTT T (서열번호 7)
	melting temperature	58℃	59℃
	GC content	41%	45%
Human tyrosinase related protein 1	sequence	AGG ACG AGA CTG CTC AAA TTC C (서열번호 8)	CGA AGT CAC CCT CCA AAT CAG(서열번호 9)
	melting temperature	58℃	58℃
	GC content	50%	52%
18s rDNA	sequence	CAC CAG GTC CAG ACA CAA TAA(서열번호 10)	TAG TTG GTG GAG TGA TTT GTC TG(서열번호 11)
	melting temperature	58.4℃	56.5℃
	GC content	48%	43%
qPCR condition
cycle step	temperature	time	cycle
initial denaturation	95℃	10min	1
denaturation	95℃	10sec	40
annealing	53℃	1min
extention	72℃	30sec
final extention	95℃	10sec	1
hold	4℃		∞

실험예 2. 피키아 파스토리스에서 hTYR 및 hTYRP1의 발현 및 정제

2.1. hTYR 및 hTYRP1의 발현

BMGY 배지(1% 효모 추출물, 2% 펩톤, 100 mM 인산 칼륨 완충액 pH 6.0, 4x10^-5% 비오틴, 1% 글리세롤, 1.34% YNB) 500 ml에 선택된 콜로니를 접종하였다. 배양액은 배양액이 OD₆₀₀이 2 내지 6이 될 때까지 30℃, 200 rpm에서 진탕배양하였다(log phase). 배양 후 1,500-3,000g, 실온에서 5분 동안 원심분리하여 세포를 수확하였다. 분리된 배양 배지를 따라 내고 세포 펠릿을 얻었다. hTYR 및 hTYRP1의 발현을 유도하기 위하여, 상기 세포 펠릿을 BMMY 배지(1% 효모 추출물, 2% 펩톤, 100 mM 포타슘 포스페이트 완충액 pH 6.0, 4x10^-5% 비오틴, 0.5% 메탄올, 1.34% YNB)에 최종 OD₆₀₀이 되도록 재현탁하였다.

hTYR 및 hTYRP1의 발현 조건을 최적화하기 위해 BMMY 배양 배지를 배양 온도를 변화시켜 조절하였다(16, 23 및 30℃). hTYR 및 hTYRP1의 발현을 유도하기 위하여, 필터링 및 멸균된 100% 메탄올을 최종 농도 0.5%로 24시간 마다 첨가한 후 72시간 동안 배양하였다.

또한 수확에 대한 최적 시간을 결정하기 위하여, 상기 세포 펠릿을 72시간 동안 배양하였다. 상기 배양 시 24시간 마다 배지 샘플 1 ml을 채취하여 hTYR 및 hTYRP1의 발현 수준을 분석하였다. 수확된 배지 샘플은 실온에서 2-3분 동안 탁상용 마이크로원심분리기의 최대 속도로 원심분리하였다.

배양 종료 후 배양된 배지를 8,600g, 4℃에서 30 분간 원심분리하였다. pPICZαC 벡터의 α-메이팅 팩터 분비 신호 서열(α-mating factor secretion signal sequence)에 의해 재조합 단백질이 세포 밖으로 분비되는지 여부를 분석하였다. 상기 분석은 배양 배지 및 세포를 각각 분석하였다.

먼저, 세포를 50 mM Tris-HCl, pH 7.5에 재현탁하고 초음파 처리기(VCX 500, Sonics & Material INC)로 초음파 처리하여 세포 용해물을 얻었다. 세포 용해물을 22,800 g, 4℃에서 30분 동안 원심분리하여, 상층액 및 세포 펠릿을 수득하였다.

배양 배지, 상기 세포 용해물의 상층액 및 세포 펠릿으로 SDS-PAGE를 위한 샘플을 준비하였다. 준비된 샘플을 12.5% SDS gel에 로딩한 후 SDS-PAGE를 수행하였다.

SDS-PAGE를 수행한 후, 상층액 및 펠릿 시료를 면역 블롯팅으로 분석하였다. 구체적으로, 16℃에서 배양하여 준비한 상층액 및 펠릿 시료를 각각 SDS-PAGE로 분리하였고, 이를 PVDF 멤브레인으로 옮겼다. mouse-anti his antibody(1:1000) 및 horseradish peroxidase(HRP) conjugated goat anti-mouse antibody(1 : 5000)(GenDEPOT, USA)를 사용하여 단백질을 검출하였다.

2.2. hTYR 및 hTYRP1의 정제

hTYR 및 hTYRP1의 정제는 DEAE-Sepharose Fast flow 음이온 교환 컬럼 및 Ni-NTA 아가로스 수지를 사용한 고정된 금속 친화성 크로마토그래피(immobilized metal affinity chromatography, IMAC)로 수행하였다. hTYR 및 hTYRP1의 전체 시퀀스의 이론적 등전점(pI)은 각각 5.71 및 5.62이다.

DEAE Sepharose(GE Healthcare, UK) 컬럼을 평형 버퍼(50 mM Tris-HCl, pH 7.5)로 평형화하였다. 각 재조합 단백질의 세포 용해물을 1N 수산화나트륨을 사용하여 pH 7.5로 조정하고, 0.45 μm 주사기 필터(Sartorius Stedim Biotech, Germany)를 통해 여과한 후 컬럼에 로딩하였다. 시료를 로딩한 후 OD₂₈₀이 0이 될 때까지 평형 버퍼를 넣었다. 버퍼의 세척 및 용리 조건을 최적화하기 위해 염화나트륨을 0에서 0.5M까지 구배로 첨가했다. 유속은 모든 조건에서 1 mL/분으로 조정하였다. 용출된 분획을 1 mL씩 수집하고, OPTIZEN POP UV/Vis Spectrophotometer(MECASYS, Korea)로 OD₂₈₀을 측정하였다. 측정된 OD₂₈₀ 값을 기반으로 크로마토그램을 작성하였다.

고정된 금속 친화성 크로마토그래피를 수행하기 위하여, Ni-NTA 컬럼(Qiagen, USA)를 평형 버퍼(hTYR; 50 mM Tris-HCl pH 7.5, 500 mM NaCl / hTYRP1; 50 mM Tris-HCl pH 7.5, 100 mM NaCl)로 평형화하였다. 샘플을 로딩한 후 OD₂₈₀이 0이 될 때까지 평형 버퍼를 로드하였다. 버퍼의 세척 및 용리 조건을 최적화하기 위하여, 이미다졸을 0에서 0.1 M까지 구배로 첨가하였다. 유속은 모든 조건에서 1 mL/분으로 조정하였다. 용출된 분획을 1 mL씩 수집하고 OD₂₈₀을 측정하였다. 측정된 OD₂₈₀ 값을 기반으로 크로마토그램을 작성하였다.

그 후, 모든 샘플을 투석하여 효소의 활성을 방해하는 염화나트륨 및 이미다졸을 제거하였다. 상기 투석은 Cellu-Sep T4 dialysis tube 12-14 kDa cut off(Membrane Filtration Products, USA)을 투석막으로 사용하였다. 정제된 hTYR 및 hTYRP1은 apo-enzyme로 존재하므로, 완충액(50 mM Tris-HCl, pH 7.5)에서 0.5 mM CuSO₄ 또는 ZnCl₂와 함께 4℃에서 4시간 동안 배양하였다. 모든 단백질 샘플은 24시간 동안 4℃에서 구리 및 아연이 없는 완충액(50 mM Tris-HCl, pH 7.5)으로 완충액을 교환하였다. 그 후, 정제된 단백질을 30 kDa MWCO Amicon Ultra-15 원심 분리 필터(Billerica, MA USA)로 농축하였다.

실험예 3. 재조합 단백질의 정량

단백질 농도는 소혈청 알부민(bovine serum albumin, BSA)을 표준으로 사용한 Bradford 방법으로 정량하였다. 상기 Bradford 방법은 BSA 단백질 분석 키트(Pierce Chemical Co., USA)를 사용하였고, 제조하의 매뉴얼에 따라 수행하였다. 구체적으로, 96웰 마이크로 플레이트에 샘플 5 μL 및 워킹 용액(시약 A : 시약 B = 50 : 1) 200 μL를 첨가하였다. 그 후 96웰 마이크로 플레이트는 30분 동안 37℃, 50 rpm 조건으로 어두운 곳에서 배양하였다. OD₅₆₂을 측정한 후 표준 곡선에 값을 대입하여 정량하였다.

실험예 4. 효소 활성 분석

4.1. hTYR 및 hTYRP1의 tyrosine hydroxylase 활성 분석

L-tyrosine hydroxylase 활성은 L-tyrosine(Sigma Aldrich, USA)을 기질로 사용하여 37℃에서 측정하였다. 96웰 마이크로 플레이트의 각 웰에 반응 혼합물 200 μl을 첨가하고, 37℃에서 평형화시켰다. 상기 반응 혼합물은 100 mM 인산염 완충액(pH 7.0)에 10%(v/v) DMSO(dimethylformamaide), 4 mM 기질 및 6 mM MBTH(3-methyl-2-benzothiazolinone hydrazone hydrochloride hydrate)(Alfa Aesar, USA)가 포함된 것이다. 상기 96 웰 마이크로 플레이트에 정제된 효소 용액 20 μl를 첨가하였다. 모든 샘플은 블랭크(blank) 시료와 함께 15 초마다 10-20분 동안 510 nm에서 흡광도를 측정하였다. 블랭크 시료는 정제된 효소 용액을 제외한 다른 것을 동일하게 측정하였다. 모든 측정은 3회 반복하였다.

4.2. hTYR 및 hTYRP1의 L-DOPA oxidase 활성

L-DOPA oxidase의 활성은 L-DOPA(Sigma Aldrich, USA)를 기질로 사용하여 37℃에서 측정하였다. 96웰 마이크로 플레이트의 각 웰에 반응 혼합물 200 μl을 첨가하고, 37℃에서 평형화시켰다. 상기 반응 혼합물은 100 mM 인산염 완충액(pH 7.0)에 10%(v/v) DMSO(dimethylformamaide), 4 mM 기질 및 6 mM MBTH(3-methyl-2-benzothiazolinone hydrazone hydrochloride hydrate)(Alfa Aesar, USA)를 포함한다. 상기 96 웰 마이크로 플레이트에 정제된 효소 용액 20 μl를 첨가하였다. 모든 샘플은 블랭크(blank) 시료와 함께 15 초 마다 10-20분 동안 510nm에서 흡광도를 측정했습니다. 블랭크 시료는 정제된 효소 용액을 제외한 다른 것을 동일하게 측정하였다. 모든 측정은 3회 반복하였다.

효소 활성의 1 단위(μmol/min)는 위에서 설명한 조건 하에서 분당 1 μmol의 부가물을 형성하는 효소의 양으로 정의한다. 특이적인 활성을 계산하기 위해 L- 및 D-Dopaquinone의 MBTH 부가물에 대해 29,000 M^-1cm^-1의 분자 흡수 계수(molar absorption coefficient)를 사용하였다. 효소의 특이적인 활성은 mg 당 효소 활성 단위로 설정하였다.

4.3. hTYRP1의 DHICA oxidase 활성

hTYRP1의 DHICA oxidase 활성은 DHICA(5,6-dihydroxyindole-2-carboxylic acid)를 기질로 사용하여 측정하였다. 구체적으로, 6 mM MBTH, 100 mM 인산염 완충액(pH 7.0), 10%(v/v) DMSO 및 2 mM DHICA를 포함하는 혼합물 90 μl를 준비하였다. 5분 또는 10분 동안 470nm 파장에서 상기 혼합물의 흡광도 변화를 측정하였다. DHICA oxidase의 분자 흡수 계수(ε)를 15000 M^-1cm^-1로 사용하였다. 모든 측정은 3회 반복하였다.

실험예 5. hTYR 활성의 비색 분석(Colorimetric assay)

5.1. On-plate tyrosinase activity assay

96웰 마이크로 플레이트에서 L-DOPA를 기질로 사용하여 On-plate tyrosinase activity assay을 수행하였다. 구체적으로, 각 웰에 사전 반응 혼합물(10%(v/v) DMSO, 0.25~4 mM L-DOPA 및 100 mM 인산염 완충액(pH 7.0))을 100 μl씩 첨가하였다. 각 웰에 정제된 효소 용액 10 μl을 첨가하였고, 분홍색인 퀴논-MBTH 부가물의 생성을 모니터링하였다. On-plate tyrosinase activity assay에 사용된 단백질 샘플은 0.5 mg/ml로 농축된 것을 사용하였다. 이미지는 각각 0, 20, 40, 80 및 160분 후에 촬영하였다.

5.2. Native PAGE에서 L-DOPA 염색

10 mM L-DOPA의 존재 하에서 10% Native PAGE 비색 염색을 수행하였다. native PAGE를 위한 샘플은 단백질 및 2X Native PAGE 샘플 버퍼(6.25 mM Tris-HCl(pH 6.8), 25% 글리세롤, 1% 브로모페놀블루)를 혼합하여 준비하였다. 준비된 샘플을 겔에 로딩하고 10% Native PAGE로 분리하였다. 샘플 준비 및 전기영동을 포함한 모든 과정은 얼음 위에서 진행하였다. 전기영동 후 겔을 10 mM L-DOPA 2-3 ml로 1시간 동안 염색하였다.

실험예 6. hTYR의 반응속도론적 연구

monophenolase(L-tyrosine hydroxylation) 및 monophenolase diphenol oxidase(L-DOPA oxidation) 반응에 대한 kinetics parameter는 Lineweaver-Burk plot 방법으로 결정하였다. 농도가 0.125 내지 6 mM 범위인 L-티로신 또는 L-DOPA를 기질로 사용하였다. 효소 분석은 위에서 설명한 것과 동일한 조건에서 수행하였다. 96웰 마이크로 플레이트에 사전 반응 혼합물(10%(v/v) DMSO, 0.25~4 mM L-DOPA 및 100 mM 인산염 완충액(pH 7.0)) 200 μl씩 첨가하였다. 그 후 각 웰에 정제된 효소 용액 20 μl을 더 넣어주었다. 모든 샘플은 블랭크(blank) 시료와 함께 15초 마다 10-20분 동안 37℃, 510 nm에서 흡광도를 측정하였다. 모든 측정은 3회 반복 수행하였다. Lineweaver-Burk plot 및 측정값을 이용하여 kinetics parabeter를 계산하였다.

실험예 7. 억제 분석(Inhibition assay)

Arbutin, L-ascorbic acid, Gluthathione, Kojic acid 및 L-Phenylalanine은 화장품 산업에서 잘 알려진 피부 미백 시약이다. 또한 버섯인 Agaricus bisporous의 티로시나아제는 피부 미백 시약의 효능을 분석하기 위한 시험관 내 효소 도구로 자주 사용된다.

재조합 인간 티로시나아제 및 버섯 티로시나아제의 IC₅₀ 값을 비교하기 위하여, 각 효소를 억제제와 함께 37℃에서 2분 동안 사전 배양하였다. 사전 배양물에 4 mM L-DOPA를 첨가하여 반응을 개시하였다. 상기 억제제의 최종 농도는 0.01 내지 5 mM이다.

억제 수준은 효소의 활성을 50% 감소시키는 억제제의 농도인 IC₅₀ 값으로 정의하였다. 50% 억제(IC₅₀)를 나타내는 억제제의 농도는 억제제 농도에 대한 잔류 활성(residual activity)의 플롯으로부터 결정하였다. 용량-반응 곡선의 경우, 다양한 농도의 억제제를 기질인 4 mM L-DOPA에 3 회 적용하였다. 상기 IC₅₀ 값은 AAT Bioquest IC₅₀ 계산기로 계산하였다. 억제제의 K_i 값은 Cheng-Prussoff 방정식으로 계산하였다.

[실시예]

실시예 1. 피키아 파스토리스에서 hTYR 및 hTYRP1의 발현

1.1. 형질전환 및 qPCR을 통한 콜로니 선별

제작된 플라스미드 pPICZαC-hTYR 및 pPICZαC-hTYRP1를 제한효소(hTYR; Sac Ⅰ, hTYRP1; Nco I)(Takara, Japan)를 처리하여 선형화시켰다. 선형화된 플라스미드는 0.8% 아가로스 겔을 이용한 전기영동으로 확인하였으며, 그 결과는 도 2에 나타내었다.

도 2에 나타낸 바와 같이, pPICZαC-hTYR에 대한 밴드는 5085 bp에서 확인되었고, pPICZαC-hTYRP1에 대한 밴드는 5109 bp에서 확인되었다. 선형화된 플라스미드는 에탄올 침전을 통해 5-10 μg까지 농축시켰고, 이를 다음 실험에 사용하였다.

pPICZαC-hTYR으로 형질전환된 콜로니 20개; 및 pPICZαC-hTYRP1로 형질전환된 콜로니 10개;를 이용한 qPCR 결과는 도 3A 및 B에 각각 나타내었다.

도 3A에 나타낸 바와 같이, 18번 hTYR 콜로니는 표준 콜로니에 비해 fold change가 18.8배 높은 것을 확인하였다.

도 3B에 나타낸 바와 같이, 5번 hTYRP1 콜로니는 표준 콜로니에 비해 fold change가 24배 높은 것을 확인하였다.

상기 결과에 따라, 18번 hTYR 콜로니 및 5번 hTYRP1 콜로니를 선택하였고, 후술되는 실험에 사용하였다.

1.2. hTYR 및 hTYRP1의 발현

배양 온도 및 시간에 따른 hTYR 및 hTYRP1의 발현을 SDS-PAGE를 통해 분석한 결과는 각각 도 4에 나타내었다.

도 4에 나타낸 바와 같이, hTYR는 16℃에서 배양한 경우 상층액 및 펠릿 시료에서 hTYR의 발현이 높은 것을 확인하였다(도 4A). 또한 hTYRP1은 상층액 시료의 경우 23℃에서 배양하였을 때 발현이 가장 높았고, 펠릿 시료의 경우 16℃에서 배양하였을 때 발현이 가장 높았다(도 4B). 특히, 조건과 관계없이 hTYR 및 hTYRP1은 세포 내에서 고발현되는 것을 확인하였다.

SDS-PAGE를 통해 16℃에서 배양하는 것이 hTYR 및 hTYRP1의 발현이 높은 것을 확인한바, 16℃에서 배양하여 준비한 상층액 및 펠릿 시료를 면역 블롯팅으로 분석하였다. 면역 블롯팅을 통해 hTYR 및 hTYRP1의 발현을 분석한 결과는 각각 도 5A 및 B에 나타내었다.

도 5A 및 B에 나타낸 바와 같이, hTYR 및 hTYRP1은 모두 펠릿 시료(도 5A의 lane 1, 도 5B의 lane 1 및 2)에서 발현이 높은 것을 확인하였다. 이는 hTYR 및 hTYRP1이 세포 내부에서 고발현된다는 것을 의미한다.

상기 SDS-PAGE 및 면역 블롯팅을 통해 확인한 hTYR 및 hTYRP1의 발현 최적화 조건은 도 6에 정리하였다.

실시예 2. hTYR 및 hTYRP1의 정제

2.1. hTYR의 정제

hTYR의 정제 조건을 최적화하기 위하여, 각각의 용출된 분획을 12.5% SDS-PAGE로 확인하였다. DEAE Sepharose 컬럼 및 Ni-NTA 컬럼을 이용한 hTYR을 정제한 결과는 도 7A 및 B에 각각 나타내었다.

도 7A 및 B에 나타낸 바와 같이, DEAE Sepharose 컬럼을 이용한 음이온 교환 크로마토그래피는 hTYR을 완전히 정제할 수 없는 것을 확인하였다(도 7A). 이와 달리 Ni-NTA 컬럼을 이용한 고정된 금속 친화성 크로마토그래피는 hTYR을 효과적으로 정제할 수 있음을 확인하였다(도 7B).

배양액 1L를 기준으로, 정제 여부에 따른 hTYR의 활성(unit), 총량(mg), 특이적인 활성(units/mg), 수율(%) 및 순도(fold)를 확인한 결과는 표 2에 나타내었다.

^aEnzyme activities were determined using L-DOPA as a substrate.

^bImmobilized metal affinity chromatography, Ni-NTA agarose resin.

표 2에 나타낸 바와 같이, 정제된 hTYR은 정제 전에 비해 특이적인 활성이 현저히 증가되고, 순도가 높은 것을 확인하였다. 특히, 정제된 hTYR의 총량은 1L 배양 플라스크를 기준으로 약 230 mg임을 확인하였다. 상기 결과는 Pichia pastoris 발현 시스템을 이용하는 것이 Escherichia coli 발현 시스템을 이용하는 것(Kong and others, 2000)에 비해 약 230배 많은 효소를 얻을 수 있음을 의미한다.

2.2. hTYRP1의 정제

hTYRP1의 정제 조건을 최적화하기 위하여, 각각의 용출된 분획을 12.5% SDS-PAGE로 확인하였다. DEAE Sepharose 컬럼 및 Ni-NTA 컬럼을 이용하여 hTYR을 정제한 결과는 도 8A 및 B에 각각 나타내었다.

도 8A 및 B에 나타낸 바와 같이, DEAE Sepharose 컬럼을 이용한 음이온 교환 크로마토그래피는 hTYRP1을 완전히 정제할 수 없는 것을 확인하였다(도 8A). 이와 달리 Ni-NTA 컬럼을 이용한 고정된 금속 친화성 크로마토그래피는 hTYRP1을 효과적으로 정제할 수 있음을 확인하였다(도 8B).

정제된 hTYRP1을 상기 실시예 2.1.과 동일한 조건으로 농축하였다.

그 결과, 정제된 hTYRP1의 총량은 1L 배양 플라스크를 기준으로 83.33 mg임을 확인하였다. 상기 결과는 Pichia pastoris 발현 시스템을 이용하는 것이 Escherichia coli 발현 시스템을 이용하는 것(Kong and others, 2000)에 비해 약 83배 많은 효소를 얻을 수 있음을 의미한다.

실시예 3. 효소 활성 분석(Enzyme activity assay)

상기 실시예 2에서 정제된 hTYR 및 hTYRP1의 효소 활성을 분석하였다.

3.1. hTYR의 효소 활성

hTYR을 대장균(Chen and others 2012; Kong and others 2000), 효모(Cordes and others 2013; Lai and others 2017), 곤충(Fogal and others 2015) 및 동물세포(Cordes and others) 등 다양한 발현 시스템을 활용하여 생산하였다. 종래 보고된 동물세포를 이용한 발현 시스템인 HEK293을 대조군으로 이용하였다(Cordes and others(2013)). hTYT의 특이적인 활성은 MBTH 분석법으로 확인하였다.

그 결과, 피키아 파스토리스에서 발현된 hTYR의 특이적인 활성은 0.06 unit/mg임을 확인하였고, 이는 대조군인 HEK293 발현 시스템에서 발현된 TYR의 특이적인 활성(0.04 unit/mg)에 비해 1.5배 더 높은 수치이다.

3.2. hTYRP1의 효소 활성

Lai and others(2017)는 hTYRP1이 L-tyrosine hydroxylase 및 L-DOPA oxidase 활성을 나타내지 않고, TYRP1의 구조에 관계없이 TYPRP1-Cu만이 in vitro에서 DHICA oxidase 활성을 나타낸다고 보고하였다.

상기 실시예 2에서 정제된 hTYRP1의 효소 활성은 DHICA oxidase 활성 분석법으로 확인하였다.

그 결과, 실시예 2에서 정제된 hTYRP1와 hTYRP1-Cu 및 apo hTYRP1은 DHICA oxidase 활성을 나타내지 않음을 확인하였다.

실시예 4. 비색 분석법(Colorimetric assay)을 통한 hTYR 활성 분석

4.1. On-plate tyrosinase activity assay

On-plate tyrosinase activity assay를 통해 실시예 2에서 정제된 hTYR의 활성을 분석하였다. 대조군(control)은 hTYR을 추가하지 않았다. on-plate tyrosinase activity assay 결과는 도 9에 나타내었다.

도 9에 나타낸 바와 같이, 실시예 2에서 정제된 hTYR을 처리한 웰은 기질 농도가 높아짐에 따라 색이 짙어지는 것을 확인하였다. 상기 결과는 정제된 hTYR의 활성이 우수하다는 것을 의미한다.

4.2. Native PAGE 및 L-DOPA 염색

native PAGE 및 L-DOPA 염색법으로 상기 실시예 2에서 정제된 hTYR 및 hTYRP1의 활성을 분석하였으며, 그 결과는 도 10에 나타내었다.

도 10에 나타낸 바와 같이, hTYR 처리군(lane 1, 2)는 40분 후 색이 염색되었고, 전체 젤은 1시간 후 갈색에서 검은색으로 염색되었다. 이와 달리, hTYRP1 처리군(lane 3, 4)은 비색 변화를 나타내지 않았다.

실시예 5. hTYR의 반응속도론적 연구

hTYR의 kinetics parameter는 Lineweaver-Burk plot 방법으로 결정하였다. L-티로신 및 L-DOPA에 대한 Lineweaver-Burk plot은 각각 도 11A 및 B에 나타내었고, 이를 이용하여 kinetics parameter를 계산한 결과는 표 3에 나타내었다.

The values shown are means ±S.D., generally based on ≥ 3.

표 3에 나타낸 바와 같이, 실시예 2에서 정제된 hTYR의 L-티로신 및 L-DOPA에 대한 K_m 값은 각각 0.5 및 0.298 mM임을 확인하였다. L-티로신에 대한 정제된 hTYR의 K_m 값은 B16 마우스 흑색종의 티로시나제(0.12 mM)보다 4.17배 더 높고(Jimenez-Cervantes and others 1993), L-DOPA에 대한 정제된 hTYR의 K_m 값은 흑색종 세포에서 추출한 것(0.4 mM)보다 1.34배 낮았다(Kim and Choi, 1993). 또한 L-티로신 및 L-DOPA에 대한 정제된 hTYR의 k_cat 값은 각각 0.148 s^-1 및 0.188 s^-1임을 확인하였다. 또한 L-티로신 및 L-DOPA에 대한 촉매효율(k_cat/K_m)은 각각 0.296 및 0.634 mM^-1s^-1임을 확인하였다.

상기 결과는 정제된 hTYR이 흑색종에서 유래한 것보다 L-티로신에 대한 친화성이 낮고, L-DOPA에 대한 친화성이 높다는 것을 의미한다.

실시예 6. 억제 분석

억제제인 Arbutin, L-ascorbic acid, glutathione, kojic acid 및 L-phenylalanine을 이용한 억제분석(inhibition assay)을 통해 상기 실시예 2에서 정제된 hTYR의 IC₅₀ 및 K_i 값을 얻었다. 대조군은 버섯 티로시나제를 사용하였다. IC₅₀ 및 K_i 값은 각각 표 4 및 5에 나타내었다.

표 4에 나타낸 바와 같이, Arbutin, L-ascorbic acid, glutathione 및 L-phenylalanine에 대한 정제된 hTYR의 IC₅₀ 값은 버섯 티로시나제보다 현저히 낮은 것을 확인하였다. 이와 달리, Kojik acid에 대한 정제된 hTYR의 IC₅₀ 값은 버섯 티로시나제보다 현저히 높은 것을 확인하였다.

표 5에 나타낸 바와 같이, Arbutin, L-ascorbic acid 및 glutathione에 대한 정제된 hTYR의 K_i 값은 버섯 티로시나제보다 현저히 낮은 것을 확인하였다. 이와 달리, kojic acid 및 L-phenylalanine에 대한 정제된 hTYR의 K_i 값은 버섯 티로시나제보다 높은 것을 확인하였다.

표 4 및 5의 결과를 종합하여 보면, 5가지 억제제 모두 인간 및 버섯 유래 티로시나제에 대해 서로 다른 IC₅₀ 및 K_i 값을 보였다. 구체적으로, Arbutin과 L-phenylalanine은 상대적으로 다른 것과 비교하여 유사한 억제 값을 나타냈다. 둘 다 기질 결합 부위와 결합하여 hTYR를 억제하는 기질 유사체 억제제이며, 특히 L-phenylalanine은 티로신과 티로시나제의 결합을 억제한다. 다른 세 가지 억제제, 즉 glutathione, kojic acid 및 L-ascorbic acid는 유의하게 다른 억제 값을 나타냈다. glutathione은 hTYR의 활성 부위에서 구리 이온과 결합하여 그 활성을 억제하는 황을 포함한다. kojic acid은 활성 부위에서 구리 이온과 킬레이트화되어 hTYR의 활성을 억제한다. L-Ascorbic acid는 o-dopaquinone의 dopa로의 dopaquinone 전환을 감소시키는 환원제이다.

즉, 상기 결과는 정제된 hTYR 및 버섯 티로시나아제는 기질 결합 부위는 유사하나 전체 구조, 특히 활성 부위가 상이하다는 것을 의미한다.

종합적으로 본 발명자들은 재조합 활성형 인간 티로시나아제 및 인간 티로시나아제 관련 단백질 1를 세포내 발현하는 재조합 균주를 제조하고, 상기 재조합 단백질들이 세포 내에서 발현되는 것을 확인하였다. 또한 재조합 활성형 인간 티로시나아제 및 인간 티로시나아제 관련 단백질 1의 순도를 높이기 위한 최적의 정제방법을 개발하였다. 이는 낮은 비용 및 적은 시간으로 순도가 높은 활성형 인간 티로시나아제를 제조할 수 있음을 의미하는바, 백색증 등의 질환 예방 및 치료 분야, 미백 성분의 스크리닝 분야에서 다양하게 활용될 수 있다.

이상, 본 발명내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의해 정의된다고 할 것이다.

<110> CHUNG ANG University industry Academic Cooperation Foundation <120> Recombinant strain for active tyrosinase production and active human tyrosinase purification method using same <130> 1-84P <160> 11 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 1587 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Codon-optimized human tyrosinase <400> 1 atgttgttgg ctgttttgta ctgtttgttg tggtctttcc aaacttctgc tggtcatttc 60 ccaagagctt gtgtttcttc taagaacttg atggagaagg aatgttgtcc tccatggtct 120 ggtgacagat ctccatgtgg tcaattgtct ggtagaggtt cttgtcaaaa cattttgttg 180 tctaacgctc ctttgggtcc acaattccct tttactggtg ttgatgatag agaatcttgg 240 ccttctgttt tctacaatag aacttgtcaa tgttctggta actttatggg tttcaactgt 300 ggtaactgta agtttggttt ctggggtcct aactgtactg agagaagatt gttggttaga 360 agaaacattt tcgatttgtc tgctccagaa aaggataaat ttttcgctta cttgactttg 420 gctaagcaca ctatttcttc tgattatgtt attccaattg gtacttacgg tcaaatgaag 480 aacggttcta ctccaatgtt caacgatatt aacatctacg atttgttcgt ttggatgcac 540 tactatgttt ctatggatgc tttgttgggt 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ctgttccaga gattattgct 1440 attgctgttg ttggtgcttt gttgttggtt gctttgattt tcggtactgc ttcttacttg 1500 attagagcta gaagatctat ggatgaggct aaccaacctt tgttgactga tcaatatcaa 1560 tgctatgccg aggagtatga gaaacttcaa aatccaaatc agtctgtcgt c 1611 <210> 3 <211> 936 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> AOX1 promoter <400> 3 gatctaacat ccaaagacga aaggttgaat gaaacctttt tgccatccga catccacagg 60 tccattctca cacataagtg ccaaacgcaa caggagggga tacactagca gcagaccgtt 120 gcaaacgcag gacctccact cctcttctcc tcaacaccca cttttgccat cgaaaaacca 180 gcccagttat tgggcttgat tggagctcgc tcattccaat tccttctatt aggctactaa 240 caccatgact ttattagcct gtctatcctg gcccccctgg cgaggttcat gtttgtttat 300 ttccgaatgc aacaagctcc gcattacacc cgaacatcac tccagatgag ggctttctga 360 gtgtggggtc aaatagtttc atgttcccca aatggcccaa aactgacagt ttaaacgctg 420 tcttggaacc taatatgaca aaagcgtgat ctcatccaag atgaactaag tttggttcgt 480 tgaaatgcta acggccagtt ggtcaaaaag aaacttccaa aagtcgccat accgtttgtc 540 ttgtttggta ttgattgacg aatgctcaaa aataatctca ttaatgctta 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<400> 6 ccatggcaca gattgttttt gt 22 <210> 7 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Human tyrosinase 3' primer <400> 7 ttctcgtccc cagtcaactt tt 22 <210> 8 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Human tyrosinase related protein 1 5' primer <400> 8 aggacgagac tgctcaaatt cc 22 <210> 9 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Human tyrosinase related protein 1 3' primer <400> 9 cgaagtcacc ctccaaatca g 21 <210> 10 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 18s rDNA 5' primer <400> 10 caccaggtcc agacacaata a 21 <210> 11 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 18s rDNA 3' primer <400> 11 tagttggtgg agtgatttgt ctg 23

Claims

서열번호 1의 염기서열로 표시되는 인간 티로시나아제 유전자;
서열번호 3의 염기서열로 표시되는 AOX1 프로모터; 및
서열번호 4의 염기서열로 표시되는 알파-메이팅 팩터 신호 서열;
을 포함하는 고순도 티로시나아제 생산용 재조합 피키아 파스토리스 SMD1168(Pichia pastoris SMD1168) 균주.
서열번호 2의 염기서열로 표시되는 인간 티로시나아제 관련 단백질 1 유전자;
서열번호 3의 염기서열로 표시되는 AOX1 프로모터; 및
서열번호 4의 염기서열로 표시되는 알파-메이팅 팩터 신호 서열;
을 포함하는 고순도 티로시나아제 관련 단백질 1 생산용 재조합 피키아 파스토리스 SMD1168(Pichia pastoris SMD1168) 균주.
제1항 또는 제2항에 있어서,
상기 균주는 서열번호 5의 염기서열로 표시되는 폴리 히스티딘 태그를 더 포함하는 것인, 재조합 피키아 파스토리스 SMD1168 균주.
제3항에 있어서,
상기 균주는
인간 티로시나아제 유전자 또는 인간 티로시나아제 관련 단백질 1 유전자;
AOX1 프로모터;
알파-메이팅 팩터 신호 서열; 및
폴리 히스티딘 태그;가 순차적으로 작동가능하게 연결된 벡터를 포함하는 것인, 재조합 피키아 파스토리스 SMD1168 균주.
제1항 또는 제2항에 있어서,
상기 균주는 인간 티로시나아제 또는 인간 티로시나아제 관련 단백질 1을 세포 내 발현하는 것인, 재조합 피키아 파스토리스 SMD1168 균주.
제1항 또는 제2항에 있어서,
상기 인간 티로시나아제 또는 인간 티로시나아제 관련 단백질 1은 활성형인, 재조합 피키아 파스토리스 SMD1168 균주.
(a) 제1항 또는 제2항의 재조합 피키아 파스토리스 SMD1168 균주를 크로마토그래피로 전개하여 용출액을 수득하는 단계;를 포함하는 티로시나아제 또는 티로시나아제 관련 단백질 1의 정제방법.
제7항에 있어서,
상기 단계 (a)의 재조합 피키아 파스토리스 SMD1168 균주는 세포 배양액 또는 세포 파쇄액 형태인, 정제방법.
제7항에 있어서,
상기 단계 (a)의 크로마토그래피는 고정된 금속 친화성 크로마토그래피(immobilized metal-affinity chromatography), 음이온 교환 크로마토그래피, 양이온 교환 크로마토그래피 또는 겔여과 크로마토그래피인, 정제방법.
제7항에 있어서,
상기 정제방법은 (b) 단계 (a)에서 수득된 용출액을 5 내지 20 kDa 컷오프 투석막을 이용하여 투석하는 단계를 더 포함하는 것인, 정제방법.
(a) 제1항 또는 제2항의 재조합 피키아 파스토리스 SMD1168 균주를 배양하는 단계;를 포함하는 티로시나아제 또는 티로시나아제 관련 단백질 1의 생산방법.
제1항 또는 제2항의 재조합 피키아 파스토리스 SMD1168 균주를 포함하는, 티로시나아제 또는 티로시나아제 관련 단백질 1 생산용 조성물.
제11항의 방법으로 생산된 티로시나아제 또는 티로시나아제 관련 단백질 1을 포함하는, 멜라닌 합성 억제제 스크리닝용 조성물.
(a) 제11항의 방법으로 생산된 티로시나아제 또는 티로시나아제 관련 단백질 1; 및 스크리닝하고자 하는 대상 물질;을 처리하는 단계; 및
(b) 티로시나아제 또는 티로시나아제 관련 단백질 1의 활성을 억제하는 대상 물질을 선별하는 단계;를 포함하는 멜라닌 합성 억제제 스크리닝 방법.