CN100443884C - 低密度脂蛋白胆固醇的定量测定方法、试剂及试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种定量测定血清样品中低密度脂蛋白胆固醇含量的试剂,该试剂由分别放置的试剂I和试剂II组成,其中,所述试剂I含有苯乙烯基苯酚聚氧乙烯(16)醚、定量酶试剂;所述试剂II含有反应促进剂。此外,本发明还提供了一种装有本发明试剂I和试剂II的试剂盒,以及一种测定低密度脂蛋白胆固醇含量的方法。
Description
技术领域
本发明涉及低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)的定量测定方法、试剂及试剂盒。
背景技术
胆固醇等脂质在血清中与脱辅蛋白质配合生成脂蛋白。根据其物理性质的差异,脂蛋白被分为乳糜微粒(CM)、极低密度脂蛋白(VLDL)、低密度脂蛋白(LDL)、高密度脂蛋白(HDL)等。由于众多流行病学、遗传学与临床研究证实,血清低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)水平与动脉粥样硬化、冠心病的发生率呈正相关,通常以高LDL-C作为冠心病的首要致病原因,为此,LDL-C的测定在临床方面日益受到普遍重视。由此,LDL-C的测定在心血管病发病方面有重要的预测作用。
在临床上,实验室直接分离、测定LDL-C含量的常规方法包括超速离心法、Friedewald公式计算法、化学沉淀法、免疫分离法和匀相测定法。
其中,超速离心法是通过超速离心除去VLDL组分(d<1.006kg/L)后,测定d>1.006kg/L组分的总胆固醇含量,减去HDL-C(d>1.063kg/L)含量得到LDL-C的含量,由于此法需要昂贵设备、操作复杂、费时且技术要求高,不易在普通实验室开展。
Friedewald公式计算法是目前应用较广的估测LDL-C的方法,其以VLDL组成恒定的假设为前提,具有简便、直接、快速等优点。但是如果某项测定值误差较大,则会导致计算结果不可靠,因而使其临床应用受到更多的挑战与限制。
化学沉淀法常用的沉淀剂为多聚阴离子,如磷钨酸(PTA)、硫酸葡聚糖(DS)、肝素、聚乙烯硫酸盐(PVS),或去污剂如SDS、聚乙二醇与某些二价阳离子(如镁、钙、锰的二价阳离子)合用。
化学沉淀法测定LDL-C含量的具体步骤是,向样本中加入沉淀剂选择性凝集LDL-C,并离心分离除去,然后测定上清液胆固醇,用样本的总胆固醇值减去其上清液胆固醇值即得到LDL-C值。由于该方法使用沉淀剂,同时需进行沉淀分离等操作,因此样本用量大,易产生误差的环节相对较多,尤其是无法实现整个分析步骤的完全自动化,因而限制了该项技术的使用。
免疫分离法省去了化学沉淀法所必需的离心步骤,但需要使用特殊装置,而且该方法所使用的试剂不适于推广应用,因此其使用范围也受到相当的限制。
匀相测定法包括选择性消除法、修饰酶法、透射比浊法等。匀相测定法因其标本用量少,不需沉淀处理,可用自动生化分析仪进行测定,以及精确度和准确度适当而被临床广为采用。
匀相测定法中的选择性消除法是通过应用两种不同的表面活性剂及多聚阴离子,根据脂蛋白的酶反应选择性,直接测定待测血清样品中的LDL-C。该方法所使用的试剂通常包括试剂I及试剂I I两种。
在进行测定时,首先加入试剂I,其中的表面活性剂会选择促进血清样品中的HDL颗粒解离、释放出的游离胆固醇和胆固醇脂立即同酶试剂反应,产生的H2O2在缺乏偶联剂的情况下只被消耗但不被显色。而此时LDL颗粒不解离。随后,加入试剂II,在另一种表面活性剂的作用下,酶试剂分解LDL,产生H2O2并继而在显色剂的作用下显色,色泽的深浅与LDL-C含量成正比。因此可以不进行分离而直接测定LDL-C的含量。
中国专利申请1219973A中公开了一种直接测定LDL-C含量的方法和试剂。
但是,目前用于直接测定LDL-C含量的市售试剂均为进口产品,价格偏高。因此,研制适用于上述直接测定LDL-C含量的选择性消除法,以及性能更为优良、价格更为低廉的试剂一直是所属领域技术人员努力的方向。
发明内容
我们在对血清脂蛋白中胆固醇的选择性直接测定方法进行多年研究,以及反复实验后发现,使用本发明所述的特殊表面活性剂作为优先选择剂,可使HDL的结构发生改变,从而使HDL-C先与所述酶试剂的反应。本发明特殊表面活性剂的使用,可消除HDL对于测定结果的影响,进而测定血清样品中LDL-C的含量。
本发明的目的之一是,提供一种用于直接测定血清样品中LDL-C含量的试剂。所述试剂由分别放置的试剂I和试剂I I组成,其中,所述试剂I含有苯乙烯基苯酚聚氧乙烯(16)醚、定量酶试剂;所述试剂I I含有反应促进剂。
本发明的另一个目的是,提供一种定量测定血清样品中LDL-C含量的试剂盒,其特征在于其中装有分别放置的前述试剂I及试剂II。
本发明的再一个目的是提供一种定量测定血清样品中LDL-C含量的方法。
具体实施方式
具体而言,本发明用于直接测定血清样品中LDL-C含量的试剂由分别放置的试剂I和试剂II组成。
所述试剂I包含优先选择剂、定量酶试剂、和选自4-氨基安替吡啉、显色剂之一的试剂。其中,本发明的试剂I中的优先选择剂为苯乙烯基苯酚聚氧乙烯(16)醚。
所述苯乙烯基苯酚聚氧乙烯(16)醚是已知的表面活性剂,例如,可以以农乳601号(Pesticide Emulsifier 601#)的商品名(江苏金陵石化公司化工二厂生产)从市场上购得。该表面活性剂的使用浓度可以根据使用该试剂的分析仪的特性,以及完成检测LDL-C的需求而定。其优选的使用浓度范围为1g/L-20g/L,更为优选的浓度范围为2g/L-8g/L。
所述的定量酶试剂选自胆固醇脂酶、胆固醇氧化酶和过氧化物酶。上述各种酶的优选浓度范围均为0.1ku/L-100ku/L。
本发明所述试剂II包含反应促进剂,和选自4-氨基安替吡啉、显色剂之一的试剂。
其中,本发明使用的反应促进剂可以是市售的TRITON X系列类表面活性剂,优选TRITON X-100。所述反应促进剂的浓度范围为:1g/L-50g/L,优选10g/L-30g/L。
本发明所述显色剂优选苯酚类衍生物显色剂,例如苯酚、4-氯苯酚、N-乙基-N-(2-羟基-3-磺丙基)-间甲苯胺钠(TOOS)或者N-(2-羟基-3-磺丙基)-3、5-二甲氧基苯胺钠(HDAOS)等苯酚类衍生物。其中,优选TOOS或者HDAOS。
所述试剂I、II还可以含有适当的pH缓冲液、去干扰剂、防腐剂等。其中,pH缓冲液选自2-吗啉代乙磺酸(MES)、3-吗啉代丙磺酸(MPOS)等GOOD’S系列,pH值优选为5-9,缓冲剂使用浓度优选20mmol/L-200mmol/L;去干扰剂选自亚铁氰化钾、抗坏血酸氧化酶等;防腐剂选自迭氮钠,其浓度范围优选为0.01g/L-5g/L。
所述显色剂在试剂I和I I中应择一使用,其优选的浓度范围为0.1g/L-10g/L。
所述4-氨基安替吡啉在试剂I和II中应择一使用。其优选的浓度范围为0.01g/L-1g/L。
所述显色剂和4-氨基安替吡啉不同时存在于试剂I或试剂II中。
本发明所述定量测定LDL-C的试剂盒中装有分别放置的上述试剂I和试剂II。
本发明所述直接测定血清样品中LDL-C含量的方法包括:首先向血清样品中加入试剂I,恒温定时孵育后,测定一定波长下的吸光度A1。然后向样品中加入试剂II,继续孵育,在上述给定波长下测定吸光度A2。用同样的方法测定校准液的吸光度值A1’值与A2’值。LDL-C含量可通过下式计算得到:
LDL-C含量=(A1-A2)÷(A1’-A2’)×(校准液LDL-C浓度)
(mmol/L或mg/dL)
本发明所述校准液是与试剂盒或试剂配套使用的、以血请为基质的次级标准(可称为定标物或校正物Calibrator),校准液的浓度与吸光度(OD)的关系可用于待测样品浓度的计算。
本发明的方法只需几微升血清,无需离心或电泳等分离处理,操作简便,可满足全自动分析的要求。
下面实施例是对本专利申请的具体描述,但是,本专利申请不限于这些实施例,这些实施例也不能解释为对本专利申请的限制。
实施例1:
一、按照下述成分和比例配制下述本发明试剂I及试剂II:
试剂I:
MOPS缓冲液,pH7.0 30mM
4-氨基安替吡啉 0.1g/L
胆固醇酯酶(CEH) 1520u/L
胆固醇氧化酶(COD) 1070u/L
过氧化物酶(POD) 8000u/L
农乳剂601号 5g/L
NaN3 1g/L
试剂II:
MOPS缓冲液,pH7.0 30mM
显色剂TOOS 0.2g/L
NaN3 1g/L
TRITON X-100 20g/L
二、在样品管中将300μl试剂I和3μl血清样品混合,在37℃下孵育5分钟,使用HITACHI7060全自动生化分析仪,在主波长600nm,副波长700nm处测定吸光度A1,然后向样品中加入100μl试剂II,混匀,在37℃下孵育5分钟后,测定相同波长下的吸光度A2。用同样的方法和条件测定校准液的吸光度值A1’值与A2’值,然后按下述公式计算样品的LDL-C含量:
LDL-C含量=(A1-A2)÷(A1’-A2’)×(校准液LDL-C浓度)
(mmol/L或mg/dL)
对低、中、高LDL-C含量的血清样品进行测定,重复测定20次,按照下述公式计算测定值的平均值(x)和标准差(s):
x=∑x/n
然后按下述公式计算变异系数CV:
CV%=s/x×100%
其中,所述校准液为市售“直接低密度脂蛋白胆固醇校准液”(批号:中生240401,中生北控生物科技股份有限公司生产)
结果列于下表1。
表1
高值 | 中值 | 低值 | |
重复次数 | 20 | 20 | 20 |
平均值(mg/dL) | 161.45 | 108.29 | 60.98 |
s(mg/dL) | 1.07 | 1.43 | 0.58 |
CV(%) | 0.66 | 1.32 | 0.95 |
通过以上重复性实验衡量一种方法的精密度,以变异系数(CV)作为衡量的指标,变异系数越小越精密,一般CV应小于5%。表1中所列测试结果都临近于1%,表明本方法具有良好的精密度。
实施例2:
使用本发明实施例1试剂,在实施例1所述条件下对11份健康人血清样品中的LDL-C含量进行测定。对同一样品同时使用市售沉淀法试剂盒(低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)聚乙烯硫酸盐沉淀法试剂盒,批号:中生210181,中生北控生物科技股份有限公司生产)进行对照性定量测定。结果如下表2所示。
表2
通过与沉淀法(参考方法)的相关性实验来衡量本方法的准确性。相关系数r表示两组数值的相关程度,r越接近1表明两组数据的相关性越好。通常认为r大于0.9时的相关性为良好。本方法与市售试剂盒沉淀法对于LDL-C含量的测定值的相关系数r=0.9893,表明本方法的准确性优良。
所述相关系数的计算方法如下:
其中,X为使用本发明方法测得的LDL-C含量浓度值;X为上述测得的X值的平均数;
Y为使用沉淀法测得的LDL-C含量浓度值;Y为上述测得的Y值的平均数。
根据上述测定结果我们可以得出这样的结论:本发明试剂在稳定性、重复性、准确性、线性等方面,均满足临床LDL-C含量分析要求,适用于直接测定新鲜血清或血浆中的LDL-C含量。
Claims (12)
1.一种定量测定血清样品中低密度脂蛋白胆固醇含量的试剂,该试剂由分别放置的试剂I和试剂II组成,其中,所述试剂I含有苯乙烯基苯酚聚氧乙烯(16)醚、胆固醇脂酶、胆固醇氧化酶和过氧化物酶;所述试剂II含有TRITON X系列表面活性剂。
2.根据权利要求1的试剂,其特征在于,所述试剂I中苯乙烯基苯酚聚氧乙烯(16)醚的浓度范围为1g/L-20g/L。
3.根据权利要求2的试剂,其特征在于,所述试剂I中苯乙烯基苯酚聚氧乙烯(16)醚的浓度范围为2g/L-8g/L。
4.根据权利要求1的试剂,其特征在于,所述三种酶的浓度范围分别为0.1ku/L-100ku/L。
5.根据权利要求1的试剂,其特征在于,所述试剂II中的TRITON X系列表面活性剂的浓度范围为1g/L-50g/L。
6.根据权利要求5的试剂,其特征在于,所述TRITON X系列表面活性剂为TRITON X-100,其浓度范围为10g/L-30g/L。
7.根据权利要求1所述的试剂,其特征在于,所述试剂I和试剂II中还可以含有pH缓冲液、去干扰剂、防腐剂,以及选自4-氨基安替吡啉、显色剂之一的试剂。
8.根据权利要求7的试剂,其特征在于,所述pH缓冲液选自2-吗啉代乙磺酸、3-吗啉代丙磺酸;去干扰剂选自亚铁氰化钾、抗坏血酸氧化酶;防腐剂选自迭氮钠;显色剂选自苯酚类衍生物显色剂;且4-氨基安替吡啉与所述显色剂不同时存在于试剂I或试剂II中。
9.根据权利要求8的试剂,其特征在于,所述显色剂选自苯酚、4-氯苯酚、N-乙基-N-(2-羟基-3-磺丙基)-间甲苯胺钠、N-(2-羟基-3-磺丙基)-3、5-二甲氧基苯胺钠。
10.根据权利要求7-9之一所述的试剂,其特征在于,所述4-氨基安替吡啉的浓度范围为0.01g/L-1g/L;所述显色剂的浓度范围为0.01g/L-10g/L。
11.一种定量测定血清样品中低密度脂蛋白胆固醇含量的试剂盒,其特征在于,其中装有分别放置的权利要求1-10之一所述的试剂I及试剂II。
12.一种定量测定血清样品中低密度脂蛋白胆固醇含量的方法,该方法包括首先向血清样品中加入权利要求1-10任一项所述的试剂I,恒温定时孵育,在一定的波长下测定样品吸光度A1;然后向样品中加入权利要求1-10任一项所述的试剂II,继续孵育后在上述波长下测定吸光度A2;用同样的方法测定校准液的吸光度值A1’值与A2’值;然后通过下式计算得到血清样品的LDL-C含量:
LDL-C含量=(A1-A2)÷(A1’-A2’)×(校准液LDL-C浓度)。
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