CN103305592A - 小而密低密度脂蛋白中的胆固醇的定量方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种sdLDL-C的定量方法，其中包括：步骤(i)，在含有优先抑制由胆固醇酯水解酶等胆固醇测定用酶引起的sdLDL-C的反应的表面活性剂的反应液中，使该胆固醇测定用酶作用于样品，除去该样品中的HDL-C、VLDL-C、CM-C以及LgLDL-C；步骤(ii)，添加引发在所述步骤(i)后的反应液中残留的sdLDL-C的反应的试剂，生成过氧化氢或者还原型辅酶，并测定所生成的过氧化氢或者还原型辅酶；以及步骤(iii)，由(i)和(ii)中的测定值、与预先制作的标准曲线来确定该样品中的sdLDL-C浓度。

Description

小而密低密度脂蛋白中的胆固醇的定量方法
本申请是申请号为200780033470.6(国际申请号为PCT/JP2007/070172)、中国国家阶段进入日为2009年3月9日(国际申请日为2007年10月16日)、发明名称为“小而密低密度脂蛋白中的胆固醇的定量方法”的中国发明专利申请的分案申请。
技术领域
本发明涉及样品中的小而密低密度脂蛋白(以下简记为sdLDL)中的胆固醇(以下简记为sdLDL-C)的定量方法以及定量用试剂盒。
背景技术
血液中存在的脂蛋白根据其比重大致分为高密度脂蛋白(以下简记为HDL)、低密度脂蛋白(以下简记为LDL)、极低密度脂蛋白(以下简记为VLDL)以及乳糜微粒(以下简记为CM)4类。构成各脂蛋白的脂质组成也不同，并且，根据构成各脂蛋白的载脂蛋白的种类的不同，在生物体中的作用大不相同。另外，作为在从VLDL到LDL代谢的过程中所生成的脂蛋白，存在密度在VLDL和LDL中间的中间密度脂蛋白(以下简记为IDL)，其在广义上也被分类为LDL。
临床检查中，作为动脉硬化诊断的筛选指标，使用总胆固醇、总甘油三酯、HDL胆固醇、LDL胆固醇、载脂蛋白AI、载脂蛋白B等。其中，被认为与动脉硬化形成紧密相关的LDL胆固醇已经开始被频繁地测定。另一方面发现，很多人尽管LDL胆固醇不高，但也具有冠动脉硬化病变。也有报道称：在该病症中，小而高密度的LDL(该LDL称为sdLDL)增加，sdLDL-C与冠动脉疾病的相关程度在LDL-C以上[参照“アーテリオスクレローシストロンボシスアンドヴァスキュラーバイオロジー(Arteriosclerosis Thrombosis,and Vascular Biology)”，2004年，第24卷，p.558-563]。
作为测定sdLDL的方法，已知有电泳法、超速离心法、分级沉淀法等。电泳法是使用2～16%的非变性梯度凝胶进行电泳、染色来测定LDL颗粒尺寸的方法，但操作繁杂，通用性差。另外，在该方法中虽然能够测定LDL的颗粒尺寸，但不能进行sdLDL的定量。此外，有通过离子强度的差使sdLDL混悬或溶解、再通过吸光度的差来测定sdLDL的方法(参照专利文献1)。但是，该方法中由于对浊度进行测定，因此特异性和精度不充分，并且，该方法中虽然能够测定sdLDL量，但不能测定sdLDL-C。
对sdLDL-C进行定量的方法有超速离心法、分级沉淀法等。超速离心法是使用超速离心分离机分离提取出样品中相当于sdLDL的比重区域并测定该比重区域中的胆固醇的方法，能够作为sdLDL-C定量的标准方法。但是，该方法需要昂贵的设备，测定需要非常长的时间，且需要技术上熟练。
分级沉淀法为如下方法：在第一步骤中，使用聚阴离子与2价阳离子或1价阳离子的组合、或者聚乙二醇，使样品中的HDL和sdLDL以外的脂蛋白聚集，通过离心分离或过滤器过滤除去聚集物，分离出HDL和sdLDL；在第二步骤中，对分离得到的含有HDL和sdLDL的试样中的sdLDL-C进行定量(参照专利文献2)。该方法比超速离心法操作简便，但由于需要进行分级沉淀操作，因此测定上需要时间。
许多文献报道有如下方法：在表面活性剂存在下，使胆固醇酯水解酶和胆固醇氧化酶或胆固醇脱氢酶特异性地作用于选自HDL、LDL、VLDL及CM中的一种或多种特定脂蛋白，来测定要测定的脂蛋白中的胆固醇。近来，报道了一种sdLDL-C的定量法，其特征在于，在聚氧乙烯-聚氧丙烯共聚物或其衍生物的存在下，向样品中添加胆固醇测定用酶，使聚氧乙烯-聚氧丙烯共聚物或其衍生物选择性地作用于sdLDL，并测定所生成的胆固醇的量(专利文献3)。
专利文献1：日本特开2003-28882号公报
专利文献2：国际公开第2004/053500号小册子
专利文献3：国际公开第2007/026829号小册子
发明内容
本发明的目的在于提供能够简便且准确地对样品中的sdLDL-C进行定量的方法及试剂盒。
本发明涉及下述[1]～[12]。
[1]一种样品中的sdLDL-C的定量方法，包括下述步骤(i)、(ii)和(iii)：
步骤(i)：在含有表面活性剂A的反应液中，使该胆固醇酯水解酶和该胆固醇氧化酶、或者该胆固醇酯水解酶、该胆固醇脱氢酶和氧化型辅酶作用于样品，除去该样品中的HDL-C、VLDL-C、CM-C以及LgLDL-C，其中，所述表面活性剂A为与由胆固醇酯水解酶和胆固醇氧化酶或者胆固醇脱氢酶-氧化型辅酶引起的HDL-C、VLDL-C、CM-C以及LgLDL-C的反应相比优先抑制由该胆固醇酯水解酶和该胆固醇氧化酶或者该胆固醇脱氢酶-氧化型辅酶引起的sdLDL-C的反应的表面活性剂；
步骤(ii)：添加引发由胆固醇酯水解酶和胆固醇氧化酶或者胆固醇脱氢酶-氧化型辅酶引起的、在所述步骤(i)的含有表面活性剂A的反应液中残留的sdLDL-C的反应的试剂，生成过氧化氢或者还原型辅酶，并测定所生成的过氧化氢或者还原型辅酶；以及
步骤(iii)：使用含有已知浓度的sdLDL-C的标准样品，进行所述步骤(i)和(ii)，生成过氧化氢或者还原型辅酶，并测定所生成的过氧化氢或者还原型辅酶，将sdLDL-C浓度与过氧化氢或者还原型辅酶的测定值相关联，来确定该样品中的sdLDL-C浓度；
其中，所述sdLDL-C表示小而密低密度脂蛋白中的胆固醇，所述HDL-C表示高密度脂蛋白中的胆固醇，所述VLDL-C表示极低密度脂蛋白中的胆固醇，CM-C表示乳糜微粒中的胆固醇，LgLDL-C表示大而轻低密度脂蛋白中的胆固醇。
[2]如[1]所述的方法，其中，引发由胆固醇酯水解酶和胆固醇氧化酶或者胆固醇脱氢酶-氧化型辅酶引起的、在步骤(i)的含有表面活性剂A的反应液中残留的sdLDL-C的反应的试剂为表面活性剂B，所述表面活性剂B是使由胆固醇酯水解酶和胆固醇氧化酶或者胆固醇脱氢酶-氧化型辅酶引起的sdLDL-C的反应解除抑制的表面活性剂。
[3]如[1]或[2]所述的方法，其中，表面活性剂A是选自聚氧乙烯烷基胺、氧化胺类、烷基甜菜碱、烷基铵-1-丙磺酸盐、酰胺烷基甜菜碱、聚氧乙烯苄基-烷基季铵盐、聚氧乙烯脂肪酰胺、聚氧乙烯多环苯基醚硫酸酯盐、聚氧乙烯烷基苯基醚硫酸酯盐、聚氧乙烯脂肪酰胺硫酸酯盐、聚氧乙烯烷基胺硫酸酯盐、N-酰基牛磺酸盐、N-酰基氨基酸盐、乙二胺-聚氧乙烯聚氧丙烯缩合物、不含有聚乙二醇的聚丙二醇衍生物、由下述通式(I)表示的聚氧乙烯聚氧丙烯缩合物、以及聚氧乙烯聚氧化烯烷基醚中的表面活性剂，其中，所述聚氧乙烯聚氧化烯烷基醚中的烷基为碳原子数9以下的烷基，
HO-(C3H6O)a-(C2H4O)b-(C3H6O)c-H     (I)
通式(I)中，a、b及c相同或者不同，表示1～200的整数。
[4]如[1]～[3]中任一项所述的方法，其中，表面活性剂B是选自聚氧乙烯烷基醚、聚氧乙烯聚氧化烯烷基醚、聚氧乙烯烷基苯基醚、聚氧乙烯聚氧化烯烷基苯基醚、聚氧乙烯多环苯基醚、聚氧乙烯聚氧化烯多环苯基醚、由下述通式(II)表示的聚氧乙烯聚氧丙烯缩合物、以及聚氧乙烯聚氧化烯烷基胺中的表面活性剂，其中，所述聚氧乙烯聚氧化烯烷基醚中的烷基为碳原子数10以上的烷基，
HO-(C2H4O)d-(C3H6O)e-(C2H4O)f-H     (II)
通式(II)中，d、e及f相同或者不同，表示1～200的整数。
[5]如[1]～[4]中任一项所述的方法，其中，在白蛋白存在下进行步骤(i)。
[6]一种样品中的sdLDL-C定量用试剂盒，其特征在于，含有：(a)第一试剂，含有表面活性剂A、胆固醇酯水解酶、胆固醇氧化酶以及过氧化氢除去试剂，所述表面活性剂A为与由胆固醇酯水解酶和胆固醇氧化酶或胆固醇脱氢酶-氧化型辅酶引起的高密度脂蛋白中的胆固醇、极低密度脂蛋白中的胆固醇、乳糜微粒中的胆固醇以及大而轻低密度脂蛋白中的胆固醇的反应相比、优先抑制由该胆固醇酯水解酶和该胆固醇氧化酶或该胆固醇脱氢酶-该氧化型辅酶引起的小而密低密度脂蛋白中的胆固醇即sdLDL-C的反应的表面活性剂；(b)第二试剂，含有：在表面活性剂A共存下引发由胆固醇酯水解酶和胆固醇氧化酶或者胆固醇脱氢酶-氧化型辅酶引起的sdLDL-C的反应的试剂、以及过氧化氢测定试剂。
[7]一种样品中的sdLDL-C定量用试剂盒，其特征在于，含有：(a)第一试剂，含有：表面活性剂A、胆固醇酯水解酶、氧化型辅酶以及胆固醇脱氢酶，所述表面活性剂A为与由胆固醇酯水解酶和胆固醇氧化酶或者胆固醇脱氢酶-氧化型辅酶引起的高密度脂蛋白中的胆固醇、极低密度脂蛋白中的胆固醇、乳糜微粒中的胆固醇以及大而轻低密度脂蛋白中的胆固醇的反应相比、优先抑制由该胆固醇酯水解酶和该胆固醇氧化酶或者该胆固醇脱氢酶-该氧化型辅酶引起的小而密低密度脂蛋白中的胆固醇即sdLDL-C的反应的表面活性剂；(b)第二试剂，含有：在表面活性剂A共存下引发由胆固醇酯水解酶和胆固醇氧化酶或者胆固醇脱氢酶-氧化型辅酶引起的sdLDL-C的反应的试剂。
[8]如[6]或[7]所述的试剂盒，其中，在表面活性剂A共存下引发由胆固醇酯水解酶和胆固醇氧化酶或者胆固醇脱氢酶-氧化型辅酶引起的sdLDL-C的反应的试剂为表面活性剂B，所述表面活性剂B是使由胆固醇酯水解酶和胆固醇氧化酶或者胆固醇脱氢酶-氧化型辅酶引起的sdLDL-C的反应解除抑制的表面活性剂。
[9]如[6]～[8]中任一项所述的试剂盒，其中，表面活性剂A是选自聚氧乙烯烷基胺、氧化胺类、烷基甜菜碱、烷基铵-1-丙磺酸盐、酰胺烷基甜菜碱、聚氧乙烯苄基-烷基季铵盐、聚氧乙烯脂肪酰胺、聚氧乙烯多环苯基醚硫酸酯盐、聚氧乙烯烷基苯基醚硫酸酯盐、聚氧乙烯脂肪酰胺硫酸酯盐、聚氧乙烯烷基胺硫酸酯盐、N-酰基牛磺酸盐、N-酰基氨基酸盐、乙二胺-聚氧乙烯聚氧丙烯缩合物、不含有聚乙二醇的聚丙二醇衍生物、由下述通式(I)表示的聚氧乙烯聚氧丙烯缩合物、以及聚氧乙烯聚氧化烯烷基醚中的表面活性剂，其中，所述聚氧乙烯聚氧化烯烷基醚中的烷基为碳原子数9以下的烷基，
HO-(C3H6O)a-(C2H4O)b-(C3H6O)c-H      (I)
通式(I)中，a、b及c相同或者不同，表示1～200的整数。
[10]如[6]～[9]中任一项所述的试剂盒，其中，表面活性剂B是选自聚氧乙烯烷基醚、聚氧乙烯聚氧化烯烷基醚、聚氧乙烯烷基苯基醚、聚氧乙烯聚氧化烯烷基苯基醚、聚氧乙烯多环苯基醚、聚氧乙烯聚氧化烯多环苯基醚、由下述通式(II)表示的聚氧乙烯聚氧丙烯缩合物、以及聚氧乙烯聚氧化烯烷基胺中的表面活性剂，其中，所述聚氧乙烯聚氧化烯烷基醚中的烷基为碳原子数10以上的烷基，
HO-(C2H4O)d-(C3H6O)e-(C2H4O)f-H      (II)
通式(II)中，d、e及f相同或者不同，表示1～200的整数。
[11]如[6]～[10]中任一项所述的试剂盒，其中，至少在第一试剂中含有白蛋白。
[12]如[6[～[11]中任一项所述的试剂盒，其中，作为第三试剂，包含含有已知浓度的sdLDL的标准品。
根据本发明，提供能够简便且准确地对样品中的sdLDL-C进行定量的方法及试剂盒。
具体实施方式
HDL-C、VLDL-C及CM-C分别是将HDL、VLDL及CM中的游离型胆固醇与酯型胆固醇合并而得到的胆固醇。
作为本发明的测定方法中使用的样品，可以列举例如全血、血浆、血清、脑脊液、唾液、羊水、尿、汗、胰液等，优选为血浆及血清。
作为本发明胆固醇酯水解酶，只要是具有水解胆固醇酯的能力的酶则没有特别的限定，例如，除了来自动物、植物或者微生物的胆固醇酯酶、脂蛋白脂肪酶之外，还可以使用通过基因工程的方法制造的胆固醇酯酶、脂蛋白脂肪酶等。
作为胆固醇酯水解酶，可以使用无修饰的胆固醇酯水解酶以及经过化学修饰的胆固醇酯水解酶。另外，作为胆固醇酯水解酶，也可以使用市售产品。
作为市售的胆固醇酯水解酶，可以列举：胆固醇酯酶“Amano”2(CHE2；天野エンザイム公司制)、胆固醇酯酶“Amano”3(CHE3；天野エンザイム公司制)、脂蛋白脂肪酶“Amano”3(LPL3；天野エンザイム公司制)、脂蛋白脂肪酶(LPL-311；东洋纺织公司制)、脂蛋白脂肪酶(LPL-312；东洋纺织公司制)、胆固醇酯酶(COE-301；东洋纺织公司制)、脂蛋白脂肪酶(LPBP；旭化成公司制)、胆固醇酯酶(CEBP-M；旭化成公司制)、胆固醇酯酶(CEN；旭化成公司制)、脂肪酶(LP；旭化成公司制)、脂肪酶(LPM；旭化成公司制)、脂肪酶(LPAP；旭化成公司制)、脂肪酶(LIPS；旭化成公司制)、胆固醇酯酶(CHE-BE；キッコーマン公司制)等。另外，本发明中，也可以组合使用2种以上的胆固醇酯水解酶。
经过化学修饰的胆固醇酯水解酶中，作为修饰胆固醇酯水解酶的基团(化学修饰基团)，可以列举例如：以聚乙二醇为主要成分的基团、以聚丙二醇为主要成分的基团、具有聚丙二醇和聚乙二醇的共聚物的基团、含有水溶性多糖类的基团、磺丙基、磺丁基、聚氨酯基、具有螯合功能的基团等，优选以聚乙二醇为主要成分的基团。作为水溶性多糖类，可以列举例如右旋糖酐、普鲁兰多糖、可溶性淀粉等。
作为用于化学修饰胆固醇酯水解酶的试剂(化学修饰剂)，可以列举兼具上述化学修饰基团和能与酶的氨基、羧基、巯基等反应的官能团或结构的化合物等。作为能与酶中的氨基反应的官能团或结构，可以列举例如：羧基、活性酯基(N-羟基琥珀酰亚胺基等)、酸酐、酰基氯、醛、环氧化物基、1,3-丙磺酸内酯、1,4-丁磺酸内酯等。作为能与酶中的羧基反应的官能团或结构，可以列举例如氨基等。作为能与酶中的巯基反应的基团或结构，可以列举例如马来酰亚胺基、二硫化物、α-卤代酯(α-碘代酯等)等。
作为化学修饰剂，也可以使用市售品。作为市售的化学修饰剂，可以列举：具有以聚乙二醇为主要成分的基团和N-羟基琥珀酰亚胺基的サンブライトVFM-4101、サンブライトME-050AS、サンブライトDE-030AS(均为日本油脂公司制)、具有以聚乙二醇或据丙二醇等聚亚烷基二醇为主要成分的基团和酸酐结构的サンブライトAKM系列(例如サンブライトAKM-1510等)、サンブライトADM系列、サンブライトACM系列(均为日本油脂公司制)、具有以聚乙二醇为主要成分的基团和环氧基团的EPOX-3400、M-EPOX-5000(均为Sheamater Polymers公司制)、具有螯合功能的基团和酸酐结构的二亚乙基三胺-N,N,N’,N”,N”-五乙酸二酐(DTPA anhydride；同仁化学研究所公司制)等。
胆固醇酯水解酶的化学修饰可以通过例如以下的方法来进行，但并不限定于本方法。首先，将胆固醇酯水解酶溶解在pH8.0以上的缓冲液{例如2-[4-(2-羟乙基)-1-哌嗪基]乙磺酸(HEPES)缓冲液}中，在0～55℃下添加0.01～500倍摩尔量的化学修饰剂，搅拌5分钟～5小时。在实际的酶反应中，作为经过化学修饰的胆固醇酯水解酶，不仅限于该反应液本身，也可以使用根据需要利用超滤膜等除去未反应的化学修饰剂等而得到的液体。
作为本反应的方法中使用的胆固醇酯水解酶的浓度，只要是能够进行本发明的sdLDL-C定量的浓度则没有特别的限制，在反应液中的浓度优选为0.001～2000U/mL，更优选为0.005～1000U/mL。
作为本发明中的胆固醇氧化酶，只要是具有将胆固醇氧化而生成过氧化氢的能力的酶则没有特别的限制，例如，除了来自动物、植物或微生物的胆固醇氧化酶之外，也可以使用通过基因工程的方法制造的胆固醇氧化酶等，还可以使用胆固醇氧化酶“Amano”1(CHOD1；天野エンザイム公司制)、胆固醇氧化酶(CHO-PEL；キッコーマン公司制)、胆固醇氧化酶(CHO-PEWL；キッコーマン公司制)、胆固醇氧化酶(CHO-CE；キッコーマン公司制)、胆固醇氧化酶(COO321；东洋纺织公司制)、胆固醇氧化酶(COO-322；东洋纺织公司制)等市售品。另外，本发明中，也可以组合使用2种以上的胆固醇氧化酶。
胆固醇氧化酶可以是无修饰的酶，也可以是经过化学修饰的酶。经过化学修饰的胆固醇氧化酶，例如可以使用前述化学修饰剂，通过前述化学修饰方法来制作。
作为本反应的方法中使用的胆固醇氧化酶的浓度，只要是能够进行本发明的sdLDL-C定量的浓度则没有特别的限制，在反应液中的浓度优选为0.001～2000U/mL，更优选为0.005～1000U/mL。
作为本发明中的胆固醇脱氢酶，只要是具有在氧化型辅酶存在下将胆固醇氧化而生成还原型辅酶的能力的酶则没有特别的限制，例如，除了来自动物、植物或微生物的胆固醇脱氢酶之外，也可以使用通过基因工程的方法制造的胆固醇脱氢酶等。还可以使用胆固醇脱氢酶“Amano”5(CHDH5；天野エンザイム公司制)等市售品。另外，本发明中，也可以组合使用2种以上的胆固醇脱氢酶。
胆固醇脱氢酶可以是无修饰的酶，也可以是经过化学修饰的酶。经过化学修饰的胆固醇脱氢酶，例如可以使用前述化学修饰剂，通过前述化学修饰方法来制作。
作为本反应的方法中使用的胆固醇脱氢酶的浓度，只要是能够进行本发明的sdLDL-C定量的浓度则没有特别的限制，在反应液中的浓度优选为0.001～2000U/mL，更优选为0.005～1000U/mL。
作为在使用胆固醇脱氢酶的定量中使用的氧化型辅酶，可以列举例如NAD(P)+、thio-NAD(P)+等。作为通过在氧化型辅酶共存下胆固醇脱氢酶与脂蛋白中的胆固醇之间的反应而生成的还原型辅酶，可以列举例如NAD(P)H、thio-NAD(P)H等。
作为本发明的方法中使用的氧化型辅酶的浓度，只要是能够进行本发明的sdLDL-C定量的浓度则没有特别的限制，在反应液中的浓度优选为0.01～400毫摩尔/L，更优选为0.1～1000毫摩尔/L。
本发明的sdLDL-C的定量方法中，也可以使用还原型辅酶氧化酶。在此，还原型辅酶氧化酶与胆固醇脱氢酶、氧化型辅酶一起使用，将通过在氧化型辅酶共存下胆固醇脱氢酶与脂蛋白中的胆固醇之间的反应而生成的还原型辅酶转变为过氧化氢。作为还原型辅酶氧化酶，可以列举例如NAD(P)H氧化酶等。作为还原型辅酶氧化酶，也可以使用市售品。作为市售的还原型辅酶氧化酶，可以列举NADH氧化酶(CosmoBio公司制)等。
作为本发明的方法中使用的还原型辅酶氧化酶的浓度，只要是能够进行本发明的sdLDL-C定量的浓度则没有特别的限制，在反应液中的浓度优选为0.01～400U/mL，更优选为0.02～200U/mL。
作为本发明中使用的白蛋白，只要是能够进行本发明的sdLDL-C定量的白蛋白则没有特别的限制，可以列举例如来自牛、马、羊、人的白蛋白等，优选牛血清白蛋白(BSA)。另外，也可以使用通过基因工程的方法制造的白蛋白。本发明中，也可以组合使用2种以上的白蛋白。作为本发明sdLDL-C定量中的白蛋白的浓度，只要是能够进行本发明的sdLDL-C定量的浓度则没有特别的限制，在反应液中的浓度优选为0.001～10%，更优选为0.01～5%。
本发明中的表面活性剂A具有抑制由胆固醇酯水解酶和胆固醇氧化酶或胆固醇脱氢酶-氧化型辅酶引起的sdLDL-C的反应、而使LgLDL-C的反应进行的性质。具体而言，表面活性剂A是与由胆固醇酯水解酶和胆固醇氧化酶或胆固醇脱氢酶-氧化型辅酶引起的HDL-C、VLDL-C、CM-C及LgLDL-C的反应相比、优先抑制由该胆固醇酯水解酶和胆固醇氧化酶或胆固醇脱氢酶-氧化型辅酶引起的sdLDL-C的反应的表面活性剂，在步骤(i)中，用于除去sdLDL-C以外的HDL-C、VLDL-C、CM-C和LgLDL-C。以下，有时将HDL-C、VLDL-C、CM-C和LgLDL-C总称为sdLDL-C以外的脂蛋白中的胆固醇。
作为表面活性剂A，可以列举例如：聚氧乙烯烷基胺(以下简记为POE烷基胺)、氧化胺类、烷基甜菜碱、烷基铵-1-丙磺酸盐、酰胺烷基甜菜碱、聚氧乙烯苄基-烷基季铵盐(以下简记为POE苄基-烷基季胺盐)、聚氧乙烯脂肪酰胺(以下简记为POE脂肪酰胺)、聚氧乙烯多环苯基醚硫酸酯盐(以下简记为POE多环苯基醚硫酸酯盐)、聚氧乙烯烷基苯基醚硫酸酯盐(以下简记为POE烷基苯基醚硫酸酯盐)、聚氧乙烯脂肪酰胺硫酸酯盐(以下简记为POE脂肪酰胺硫酸酯盐)、聚氧乙烯烷基胺硫酸酯盐(以下简记为POE烷基胺硫酸酯盐)、N-酰基牛磺酸盐、N-酰基氨基酸盐、乙二胺-聚氧乙烯聚氧丙烯缩合物(以下简记为乙二胺-POE/POP缩合物)、不含有聚乙二醇的聚丙二醇衍生物(以下简记为PPG衍生物)、由下述通式(I)表示的聚氧乙烯聚氧丙烯缩合物(以下简记为POE/POP缩合物)、以及聚氧乙烯聚氧化烯烷基醚(该烷基为碳原子数9以下的烷基)(以下简记为C9以下的POE/POA烷基醚)等。
HO-(C3H6O)a-(C2H4O)b-(C3H6O)c-H      (I)
(通式(I)中，a、b及c相同或者不同，表示1～200的整数)。
作为POE烷基胺、烷基甜菜碱、烷基铵-1-丙磺酸盐、酰胺烷基甜菜碱、POE烷基苯基醚硫酸酯盐、POE烷基胺硫酸酯盐中的烷基，可以列举例如碳原子数1～30的甲基、乙基、丙基、丁基、戊基、己基、庚基、辛基、壬基、癸基、十一烷基、十二烷基(月桂基)、十三烷基、十四烷基(肉豆蔻基)、十五烷基、十六烷基(鲸蜡基)、十七烷基、十八烷基(硬脂基)、十九烷基、二十烷基、二十一烷基、二十二烷基(山嵛基)、二十三烷基、二十四烷基、二十五烷基、二十六烷基、二十七烷基、二十八烷基、二十九烷基、三十烷基等。
作为POE烷基胺的市售品，可以列举：パイオニンD-3104、パイオニンD-3110、パイオニンD-3120(以上为竹本油脂公司制)、ナイミーンL-207(以上为日本油脂公司制)、BLAUNON L-205(以上为青木油脂公司制)等。
作为氧化胺类，可以列举例如烷基氧化胺、聚氧乙烯烷基氧化胺(以下简记为POE烷基氧化胺)等。作为烷基氧化胺、POE烷基氧化胺中的烷基，可以列举例如取代或未取代的碳原子数1～30的烷基等。作为该烷基，可以列举前述的烷基等。作为该取代基，可以列举例如羟基等。作为氧化胺类的市售品，可以列举：ユニセーフA-LE、ユニセーフA-LM、ユニセーフA-LY(以上为日本油脂公司制)等。
作为烷基甜菜碱的市售品，可以列举：ニッサンアノンBL、ニッサンアノンBF(以上为日本油脂公司制)、アンヒトール24B、アンヒトール86B(以上为花王公司制)等。
作为烷基铵-1-丙磺酸盐的市售品，可以列举：ZWITTERGENT3-10、ZWITTERGENT3-12(以上为CALBIOCHEM公司制)等。
作为酰胺烷基甜菜碱的市售品，可以列举アノンBDF-SF(日本油脂公司制)等。
作为POE苄基-烷基季胺盐的市售品，可以列举ビスノール(一方社公司制)等。
作为POE脂肪酰胺的市售品，可以列举ナイミッドMT-215(日本油脂公司制)、ニッコールTAMDS15(日光化学公司制)等。
作为POE多环苯基醚硫酸酯盐中的多环苯基，可以列举：由2个以上基团内具有1个芳香环的基团(取代基)取代的苯基、由1个或多个基团内具有2个以上芳香环的基团(取代基)取代的苯基等。作为基团内具有1个芳香环的基团，可以列举例如苄基、1-(苯基)乙基等。作为基团内具有2个以上芳香环的基团，可以列举例如萘基等。作为POE多环苯基醚硫酸酯盐的市售品，可以列举：ニューコール707-SF、ニューコール707-SFC、ニューコール707-SN、ニューコール723-SF(以上为日本乳化剂公司制)等。
作为POE烷基苯基醚硫酸酯盐的市售品，可以列举：ハイテノールN-07、ハイテノールN-08、ハイテノールN-17(以上为第一工业药品公司制)等。
作为POE脂肪酰胺硫酸酯盐的市售品，可以列举サンアミドCF-3、サンアミドCF-10(以上为日本油脂公司制)等。
作为POE烷基胺硫酸酯盐的市售品，可以列举ミグノールPA-30(一方社公司制)等。
作为N-酰基牛磺酸盐的市售品，可以列举：ニッコールCMT-30、ニッコールPMT(以上为日光化学公司制)、ダイヤポンT浆、ダイヤポンT粉末、ダイヤポンK、ダイヤポンLM、ダイヤポンK-MG(以上为日本油脂公司制)等。
作为N-酰基氨基酸盐中的氨基酸，可以列举肌氨酸、丙氨酸等。作为N-酰基氨基酸盐的市售品，可以列举：サルコシネートLN-30、サルコシネートCN-30、サルコシネートLK-30、アラニネートLN-30(以上为日光化学公司制)、フィレットL(日本油脂公司制)等。
作为乙二胺-POE/POP缩合物的市售品，可以列举：アデカプルロニックTR-701、アデカプルロニックTR-702、アデカプルロニックTR-704、アデカプルロニックTR-913R(以上为旭电化公司制)、ユニルーブ32TY-65BI(日本油脂公司制)等。
作为不含有聚乙二醇的PPG衍生物，可以列举：聚丙二醇(以下简记为PPG)、聚氧丙烯烷基醚(以下简记为POP烷基醚)等。作为PPG，例如优选分子量为1200以下的PPG。作为分子量为1200以下的PPG的市售品，可以列举：ユニオールD-700(日本油脂公司制)、ニューポールPP-400(三洋化成公司制)等。作为POP烷基醚的市售品，可以列举ユニルーブMB-2(日本油脂公司制)等。
作为由下述通式(I)表示的POE/POP缩合物的市售品，可以列举：プルロニック25R-1、プルロニック25R-2(以上为旭电化公司制)、BLAUNON EP-0480、BLAUNON EP-0670、BLAUNON EP-1461(以上为青木油脂公司制)等。
HO-(C3H6O)a-(C2H4O)b-(C3H6O)c-H     (I)
(通式(I)中，a、b及c相同或者不同，表示1～200的整数)。
作为C9以下的POE/POP烷基醚中的烷基，可以列举例如：甲基、乙基、丙基、丁基、戊基、己基、庚基、辛基、壬基等。作为C9以下的POE/POP烷基醚的市售品，可以列举：ユニルーブ50MB-26、ユニルーブ50MB-72(以上为日本油脂公司制)等。
本发明中，表面活性剂A不仅限于1种，也可以组合使用2种以上。
通过本申请，公开了存在显示如下作用的表面活性剂：抑制由胆固醇酯水解酶和胆固醇氧化酶或胆固醇脱氢酶-氧化型辅酶引起的sdLDL胆固醇的反应，而使LgLDL胆固醇的反应进行。除了上述例示的物质之外，本领域技术人员也可以根据下述判定容易地理解并选择本发明的表面活性剂A的具体例。根据该方法选择的表面活性剂也包含在本发明的表面活性剂A中。
表面活性剂A的判定可以通过例如以下记载的方法来进行。
1）脂蛋白组分的分离
利用比重对血清中的HDL、VLDL、CM、LgLDL、sdLDL各组分进行分离纯化。具体而言，按照“新生化学实验讲座4”(东京化学同人)记载的超速离心法，由人血清中分离提取出HDL(比重为1.063以上)、sdLDL(比重为1.044～1.063)、LgLDL(比重为1.006～1.044)、VLDL和CM(比重为1.006以下)这4种脂蛋白组分。
2）表面活性剂A的判定用试剂
例1
缓冲液，例如MOPS(pH7.0)
胆固醇酯水解酶，例如LPL3
胆固醇氧化酶，例如CHO-PEL
过氧化氢测定试剂，例如过氧化物酶、N-乙基-N-(3-甲基苯基)-N’-琥珀酰乙二胺(EMSE)及4-氨基安替比林(4-AA)
要研究的表面活性剂
例2
缓冲液，例如MOPS(pH7.0)
胆固醇酯水解酶，例如LPL3
胆固醇脱氢酶，例如CHDH5
氧化型辅酶，例如NAD
[根据需要选用的还原型辅酶测定试剂，例如2-(4-碘苯基)-3-(2,4-二硝基苯基)-5-(2,4-二磺苯基)-2H-四唑单钠盐(WST-3)]
要研究的表面活性剂
例3
缓冲液，例如MOPS(pH7.0)
胆固醇酯水解酶，例如LPL3
胆固醇脱氢酶，例如CHDH5
氧化型辅酶，例如NAD
还原型辅酶氧化酶，例如NADH氧化酶
过氧化氢测定试剂，例如过氧化物酶、EMSE及4-AA
要研究的表面活性剂
另外，上述各试剂中，根据需要也可以含有后述的水性介质、稳定剂、防腐剂、影响物质消除剂、反应促进剂等。
3)表面活性剂A判定方法
将各脂蛋白组分作为样品添加到反应池(2μL)中，接着添加上述2)中记载的试剂(0.15mL)，使反应开始，在37℃下加热5分钟，测定反应液的吸光度呈直线增加的时间、例如反应5分钟后的反应液的吸光度变化(△E脂蛋白组分)。
使用生理盐水代替各脂蛋白组分作为样品，进行同样的测定，计算出吸光度变化(△E空白)，根据下述(式1)计算出各脂蛋白组分中的“反应吸光度1”。
反应吸光度1=△E脂蛋白组分-△E空白    (式1)
对于各脂蛋白组分，利用日立7170S型自动分析装置，并使用总胆固醇定量用试剂盒デタミナーC TC(协和梅迪克斯公司制)，同样地操作，计算出“反应吸光度2”。
然后，根据下述(式2)计算出各脂蛋白组分的反应率。
反应率(%)=反应吸光度1/反应吸光度2×100    (式2)
选择sdLDL组分的反应率低、LgLDL组分的反应率高的表面活性剂，优选选择sdLDL组分的反应率低、HDL、VLDL、CM及LgLDL组分的反应率高的表面活性剂作为表面活性剂A。
与由胆固醇酯水解酶和胆固醇氧化酶或胆固醇脱氢酶-氧化型辅酶引起的HDL-C、VLDL-C、CM-C及LgLDL-C的反应相比、优先抑制由该胆固醇酯水解酶和胆固醇氧化酶或胆固醇脱氢酶-氧化型辅酶引起的sdLDL-C的反应，是指相对于HDL、VLDL、CM及LgLDL各组分胆固醇的反应率，sdLDL组分胆固醇的反应率更小，sdLDL组分胆固醇的反应率相对于HDL、VLDL、CM及LgLDL各组分胆固醇的反应率的比例，优选为50%以下，更优选为20%以下，特别优选为10%以下。
另外，所使用的酶的种类及浓度等反应条件不同时，有时表面活性剂的反应性也不同，可以在设定的条件下判断作为研究对象的表面活性剂是否能够在本发明中作为表面活性剂A使用。
本发明的sdLDL-C的定量方法中的表面活性剂A的浓度，优选为能够优先除去sdLDL以外的脂蛋白即HDL、VLDL、CM及LgLDL中的胆固醇的浓度，在反应液中的浓度优选为0.0001～1%，更优选为0.0005～0.5%。
本发明中引起sdLDL-C的反应的试剂，在样品与胆固醇酯水解酶和胆固醇氧化酶或胆固醇脱氢酶-氧化型辅酶在表面活性剂A存在下反应、除去sdLDL以外的脂蛋白中的胆固醇后，能够使由胆固醇酯水解酶和胆固醇氧化酶或胆固醇脱氢酶-氧化型辅酶引起的、反应液中残留的sdLDL-C的反应进行。具体可以列举：在表面活性剂B和表面活性剂A存在下能够与sdLDL-C反应的酶等。所述表面活性剂B，是使由在表面活性剂A存在下用于除去sdLDL以外的脂蛋白中的胆固醇的胆固醇酯水解酶和胆固醇氧化酶或胆固醇脱氢酶-氧化型辅酶引起的sdLDL-C的反应解除抑制的表面活性剂。
作为本发明中的表面活性剂B，可以列举例如：聚氧乙烯烷基醚(以下简记为POE烷基醚)、聚氧乙烯聚氧化烯烷基醚(该烷基为碳原子数10以上的烷基)(以下简记为C10以上的POE/POA烷基醚)、聚氧乙烯烷基苯基醚(以下简记为POE烷基苯基醚)、聚氧乙烯聚氧化烯烷基苯基醚(以下简记为POE/POA烷基苯基醚)、聚氧乙烯多环苯基醚(以下简记为POE多环苯基醚)、聚氧乙烯聚氧化烯多环苯基醚(以下简记为POE/POA多环苯基醚)、由下述通式(II)表示的聚氧乙烯聚氧丙烯缩合物(以下简记为POE/POP缩合物)、以及聚氧乙烯聚氧化烯烷基胺(以下简记为POE/POA烷基胺)等。
HO-(C2H4O)d-(C3H6O)e-(C2H4O)f-H      (II)
(通式(II)中，d、e及f相同或者不同，表示1～200的整数)。
作为POE烷基醚，优选为HLB低于15.0的POE烷基醚(该烷基为碳原子数20以下的烷基)。作为HLB低于15.0的POE烷基醚(该烷基为碳原子数20以下的烷基)中的烷基，可以列举例如：甲基、乙基、丙基、丁基、戊基、己基、庚基、辛基、壬基、癸基、异癸基、十一烷基、十二烷基(月桂基)、十三烷基、十四烷基(肉豆蔻基)、十五烷基、十六烷基(鲸蜡基)、己基癸基、十七烷基、十八烷基(硬脂基)、十九烷基、二十烷基、辛基十二烷基等。作为HLB低于15.0的POE烷基醚(该烷基为碳原子数20以下的烷基)的市售品，可以列举：モリノールL-80(HLB13.1；碳原子数12)(モーリン化学公司制)、エマルミンNL-80(HLB13.1；碳原子数12)、エマルミンNL-90(HLB13.6；碳原子数12)、エマルミンNL-100(HLB14.0；碳原子数12)、エマルミンNL-110(HLB14.4；碳原子数12)(以上为三洋化成公司制)、ノイゲンTDS-80(HLB13.3；碳原子数13)、ノイゲンTDS-120(HLB14.8；碳原子数13)(以上为第一工业制药公司制)、EMALEX1615(HLB13.0；碳原子数16)、EMALEX1820(HLB14.0；碳原子数18)、EMALEXOD-16(HLB12.0；碳原子数20)(以上为日本エマルジョン公司制)等。
作为C10以上的POE/POA烷基醚，优选为HLB低于15.0且烷基的碳原子数在10以上20以下的POE/POA烷基醚。作为HLB低于15.0且烷基的碳原子数在10以上20以下的POE/POA烷基醚中的烷基，可以列举例如：癸基、异癸基、十一烷基、十二烷基(月桂基)、十三烷基、十四烷基(肉豆蔻基)、十五烷基、十六烷基(鲸蜡基)、己基癸基、十七烷基、十八烷基(硬脂基)、十九烷基、二十烷基、辛基十二烷基等。作为HLB低于15.0且烷基的碳原子数在10以上20以下的POE/POA烷基醚中的聚氧化烯，可以列举聚氧乙烯以外的、例如聚氧丙烯、聚氧丁烯等。作为HLB低于15.0且烷基的碳原子数在10以上20以下的POE/POA烷基醚的市售品，可以列举例如：ワンダサーフID-50(HLB10.5；碳原子数10)、ワンダサーフID-70(HLB12.1；碳原子数10)、ワンダサーフID-90(HLB13.3；碳原子数10)、ワンダサーフS-800(HLB12.3；碳原子数13)、ワンダサーフS-1000(HLB13.2；碳原子数13)、ワンダサーフS-1400(HLB14.4；碳原子数13)(以上为青木油脂公司制)等。
作为POE烷基苯基醚，优选为HLB低于16.0的POE烷基苯基醚。作为HLB低于16.0的POE烷基苯基醚中的烷基，可以列举碳原子数1～30的、例如甲基、乙基、丙基、丁基、戊基、己基、庚基、辛基、壬基、癸基、十一烷基、十二烷基(月桂基)、十三烷基、十四烷基(肉豆蔻基)、十五烷基、十六烷基(鲸蜡基)、十七烷基、十八烷基(硬脂基)、十九烷基、二十烷基、二十一烷基、二十二烷基(山嵛基)、二十三烷基、二十四烷基、二十五烷基、二十六烷基、二十七烷基、二十八烷基、二十九烷基、三十烷基等。作为HLB低于16.0的POE烷基苯基醚的市售品，可以列举：ノニオンNS-210(HLB13.3)、ノニオンNS-212(HLB14.1)、ノニオンNS-215(HLB15.0)、ノニオンHS-210(HLB13.6)(以上为日本油脂公司制)、エマルゲン911(HLB13.7)、エマルゲン913(HLB14.5)(以上为花王公司制)等。
作为POE/POA烷基苯基醚，优选为HLB低于16.0的POE/POA烷基苯基醚。作为HLB低于16.0的POE/POA烷基苯基醚中的烷基，可以列举碳原子数1～30的、例如甲基、乙基、丙基、丁基、戊基、己基、庚基、辛基、壬基、癸基、十一烷基、十二烷基(月桂基)、十三烷基、十四烷基(肉豆蔻基)、十五烷基、十六烷基(鲸蜡基)、十七烷基、十八烷基(硬脂基)、十九烷基、二十烷基、二十一烷基、二十二烷基(山嵛基)、二十三烷基、二十四烷基、二十五烷基、二十六烷基、二十七烷基、二十八烷基、二十九烷基、三十烷基等。作为HLB低于16.0的POE/POA烷基苯基醚中的聚氧化烯，可以列举聚氧乙烯以外的、例如聚氧丙烯、聚氧丁烯等。作为HLB低于16.0的POE/POA烷基苯基醚的市售品，可以列举：アクロネセスKP-189R、ディスパノールLS-100(以上为日本油脂公司制)、エマルゲンL-40(花王公司制)等。
作为POE多环苯基醚，优选为HLB低于13.0的POE多环苯基醚。作为HLB低于13.0的POE多环苯基醚中的多环苯基，可以列举：由2个以上基团内具有1个芳香环的基团(取代基)取代的苯基、由1个或多个基团内具有2个以上芳香环的基团(取代基)取代的苯基等。作为基团内具有1个芳香环的基团，可以列举例如苄基、1-(苯基)乙基等。作为基团内具有2个以上芳香环的基团，可以列举例如萘基等。作为HLB低于13.0的POE多环苯基醚的市售品，可以列举：エマルゲンA-60(HLB12.8)(花王公司制)、BLAUNON DSP-9(HLB11.4)、BLAUNONDSP-12.5(HLB12.8)(以上为青木油脂公司制)、ニューコール2607(HLB11.8)(日本乳化剂公司制)等。
作为POE/POA多环苯基醚，优选为HLB低于13.0的POE/POA多环苯基醚。作为HLB低于13.0的POE/POA多环苯基醚中的多环苯基，可以列举：由2个以上基团内具有1个芳香环的基团(取代基)取代的苯基、由1个或多个基团内具有2个以上芳香环的基团(取代基)取代的苯基等。作为基团内具有1个芳香环的基团，可以列举例如苄基、1-(苯基)乙基等。作为基团内具有2个以上芳香环的基团，可以列举例如萘基等。作为HLB低于13.0的POE/POA多环苯基醚中的的聚氧化烯，可以列举聚氧乙烯以外的、例如聚氧丙烯、聚氧丁烯等。作为HLB低于13.0的POE/POA多环苯基醚的市售品，可以列举ニューコール707F(HLB12.4)(以上为日本乳化剂公司制)等。
作为由下述通式(II)表示的POE/POP缩合物，优选POP分子量为1200以上且POE含量为60%以下的POE/POP缩合物。
HO-(C2H4O)d-(C3H6O)e-(C2H4O)f-H     (II)
(通式(II)中，d、e以及f相同或者不同，表示1～200的整数)。作为POP分子量为1200以上且POE含量为60%以下的POE/POP缩合物的市售品，可以列举：プロノン204(POP分子量：2000；POE含量：40%)(日本油脂公司制)、ニューポールPE-62(POP分子量：1750；POE含量：20%)、ニューポールPE-64(POP分子量：1750；POE含量：40%)、ニューポールPE-71(POP分子量：2050；POE含量：10%)、ニューポールPE-75(POP分子量：2050；POE含量：50%)(以上为三洋化成公司制)、プルロニックP-84(POP分子量：2250；POE含量：40%)、プルロニックP-85(POP分子量：2250；POE含量：50%)、プルロニックP-103(POP分子量：3250；POE含量：30%)(以上为旭电化公司制)等。
作为POE/POA烷基胺中的烷基，可以列举碳原子数1～30的、例如甲基、乙基、丙基、丁基、戊基、己基、庚基、辛基、壬基、癸基、十一烷基、十二烷基(月桂基)、十三烷基、十四烷基(肉豆蔻基)、十五烷基、十六烷基(鲸蜡基)、十七烷基、十八烷基(硬脂基)、十九烷基、二十烷基、二十一烷基、二十二烷基(山嵛基)、二十三烷基、二十四烷基、二十五烷基、二十六烷基、二十七烷基、二十八烷基、二十九烷基、三十烷基等。作为POE/POA烷基胺中的聚氧化烯，可以列举聚氧乙烯以外的、例如聚氧丙烯、聚氧丁烯等。作为POE/POA烷基胺的市售品，可以列举：BLAUNON LPE1007(青木油脂公司制)、烷基(C16)胺EO20PO10(日本油脂公司制)等。
本发明中，表面活性剂B并不仅限于1种，可以组合使用2种以上。
另外，本领域技术人员可以根据本发明的实施例2所示的方法等，适当把握、选择提高sdLDL组分的反应率的表面活性剂作为表面活性剂B。所使用的酶的种类及浓度等反应条件不同时，有时表面活性剂的反应性也不同，可以在设定的条件下判断作为研究对象的表面活性剂是否能够在本发明中作为表面活性剂B使用。
本发明的sdLDL-C的定量方法中的表面活性剂B的浓度，是能够进行sdLDL-C定量的浓度，在反应液中的浓度优选为0.001～5%，更优选为0.01～0.5%。
作为在表面活性剂A存在下能够进行与sdLDL-C的反应的酶，可以列举胆固醇酯水解酶、胆固醇氧化酶或胆固醇脱氢酶等，优选胆固醇酯水解酶。使用胆固醇酯水解酶代替表面活性剂B时，作为该胆固醇酯水解酶，可以是与步骤(i)中使用的胆固醇酯水解酶相同种类的胆固醇酯水解酶，也可以是不同种类的胆固醇酯水解酶。使用相同种类的胆固醇酯水解酶时，在步骤(ii)中添加能够将残留的sdLDL-C定量的量的胆固醇酯水解酶即可。另外，使用不同种类的胆固醇酯水解酶时，只要是能够将残留的sdLDL-C定量的胆固醇酯水解酶，则没有特别的限制。
另外，步骤(ii)中，作为引起sdLDL-C的反应的试剂，也可以使用酶与表面活性剂的组合。该组合只要是能够将除去sdLDL以外的脂蛋白后的反应液中残留的sdLDL-C定量的组合，则没有特别的限制。构成该组合的酶和表面活性剂，不需要单独使用时能够将残留的sdLDL-C定量，只要通过组合使用能够将残留的sdLDL-C定量即可。
HLB是指亲水-亲油平衡值。本发明中使用的表面活性剂、例如POE多环苯基醚的HLB，通过表面活性剂手册(吉田时行等著，工业图书株式会社)或新表面活性剂(堀口博著，三共出版株式会社)中记载的方法能够算出。另外，作为该HLB，也可以利用各种表面活性剂的制造厂家的商品目录或手册中记载的HLB值。
(sdLDL-C定量方法)
本发明的sdLDL-C定量方法是包括下述步骤(i)～(iii)的方法。
步骤(i)：在含有表面活性剂A的反应液中，使胆固醇酯水解酶和胆固醇氧化酶、或者胆固醇酯水解酶、胆固醇脱氢酶和氧化型辅酶作用于样品，除去该样品中的sdLDL以外的脂蛋白中的胆固醇；
步骤(ii)：添加引起所述步骤(i)后的反应液中残留的sdLDL-C的反应的试剂，生成过氧化氢或还原型辅酶，并测定所生成的过氧化氢或还原型辅酶；
步骤(iii)：使用含有已知浓度的sdLDL-C的标准样品，进行所述步骤(i)和(ii)，生成过氧化氢或还原型辅酶，测定所生成的过氧化氢或还原型辅酶，将sdLDL-C浓度与过氧化氢或还原型辅酶浓度的测定值相关联来确定该样品中的sdLDL-C浓度。
另外，不进行步骤(iii)而进行步骤(i)和步骤(ii)，也可以作为样品中的sdLDL-C的检测方法。
作为步骤(i)中的除去样品中sdLDL以外的脂蛋白中的胆固醇的方法，可以列举例如：除去由该胆固醇转变而成的过氧化氢或通过该胆固醇而生成的还原型辅酶的方法。该除去方法优选为由该胆固醇生成过氧化氢、然后除去该过氧化氢的方法。
该过氧化氢的除去可以通过使用例如过氧化氢除去试剂来进行。作为过氧化氢除去方法，优选为如下方法：使过氧化氢酶作用于过氧化氢，或者使过氧化活性物质与氧化偶合显色反应中使用的2种氧化偶合色素原的1种组合作用于过氧化氢。
还原型辅酶的除去也可以通过例如使还原型辅酶氧化酶作用于还原型辅酶、使用过氧化氢除去试剂除去生成的过氧化氢来进行。
作为过氧化氢除去试剂，只要能够将由sdLDL以外的脂蛋白中的胆固醇生成的过氧化氢转变为不影响由sdLDL-C生成的过氧化氢的测定的物质，则没有特别的限制，可以列举例如：含有过氧化氢酶的试剂、含有过氧化活性物质和氧化偶合型显色反应中使用的2种氧化偶合型色素原的1种的试剂等。作为过氧化活性物质，可以列举例如过氧化物酶等。氧化偶合型显色反应中使用的2种氧化偶合型色素原的1种，具体可以例示后述的“氧化偶合显色型色素原”中的偶合剂、或者苯胺类或苯酚类。本说明书中，“另一种氧化偶合型色素原”，是与“氧化偶合型显色反应中使用的2种氧化偶合型色素原的1种”对应使用的，例如，前者表示偶合剂时，后者表示苯酚类或苯胺类，前者表示苯酚类或苯胺类时，后者表示偶合剂。
使用含有过氧化氢酶的试剂作为过氧化氢除去试剂时，过氧化氢酶的浓度优选为0.001～5000kU/L，更优选为0.01～1000kU/L。另外，本发明的步骤(i)中使用过氧化氢酶作为过氧化氢除去试剂时，优选在步骤(ii)中存在过氧化氢酶抑制剂。作为过氧化氢酶抑制剂，可以列举：叠氮化钠、H2S、HCN、NH2OH、3-氨基-1,2,4-三唑等。所使用的浓度，只要是能抑制过氧化氢酶活性、从而不影响在步骤(ii)中生成的过氧化氢的测定的浓度，则没有特别的限定，优选为0.5～60毫摩尔/L，更优选为1～30毫摩尔/L。
使用过氧化活性物质和氧化偶合型显色反应中使用的2种氧化偶合型色素原的1种作为过氧化氢除去试剂时，作为过氧化活性物质可以列举过氧化物酶等。过氧化物酶的浓度优选为0.01～500kU/L，更优选为1～100kU/L。作为氧化偶合型显色反应中使用的2种氧化偶合型色素原的1种的浓度，优选为0.01～10g/L。
另外，本发明中，步骤(i)中sdLDL以外的脂蛋白中的胆固醇的除去，并不限于将由该胆固醇生成的过氧化氢或还原型辅酶转变为其它物质来除去。例如，能够分别测定过氧化氢和还原型辅酶时，不需要将由该胆固醇生成的过氧化氢或还原型辅酶转变为其它物质。例如，在步骤(i)中由sdLDL以外的脂蛋白中的胆固醇生成还原型辅酶、在步骤(ii)中由sdLDL胆固醇生成过氧化氢时，不需要将步骤(i)中生成的还原型辅酶转变为其它物质。并且，本发明还包含：测定步骤(i)中生成的过氧化氢或还原型辅酶，根据得到的测定值，计算出步骤(ii)中生成的过氧化氢或还原型辅酶，由此对样品中的sdLDL-C进行定量。
在此，过氧化氢的测定，可以使用例如过氧化氢电极或后述的过氧化氢测定试剂来进行，优选通过使过氧化活性物质和氧化显色型色素原作用于过氧化氢而生成色素、测定该色素的吸光度来进行的方法。
还原型辅酶的测定，可以通过例如还原型辅酶的最大吸收附近的波长处的吸光度测定、或者使用后述的还原型辅酶测定试剂的测定来进行。
过氧化氢测定用试剂，是用于将生成的过氧化氢转变为能够检测的物质的试剂。作为能够检测的物质，可以列举例如色素、光等，优选色素。在能够检测的物质为色素时，过氧化氢测定用试剂含有氧化显色型色素原及过氧化物酶等过氧化活性物质。作为氧化显色型色素原，可以列举例如后述的氧化显色型色素原。在能够检测的物质为光时，过氧化氢测定用试剂含有化学发光物质。作为化学发光物质，可以列举例如：鲁米诺、异鲁米诺、光泽精、吖啶酯等。
使用含有氧化显色型色素原和过氧化活性物质的试剂作为过氧化氢测定用试剂时，过氧化氢在过氧化活性物质存在下与氧化显色型色素原反应而生成色素，测定所生成的色素，由此能够测定过氧化氢。另外，使用含有化学发光物质的过氧化氢测定用试剂时，过氧化氢与化学发光物质反应而产生光，测定所产生的光，由此能够测定过氧化氢。
作为氧化显色型色素原，可以列举例如：无色型色素原、氧化偶合显色型色素原等。
无色型色素原是在过氧化氢和过氧化活性物质存在下可单独转变为色素的物质。具体可以列举：10-N-羧基甲基氨基甲酰基-3,7-双(二甲基氨基)-10H-吩噻嗪(CCAP)、10-N-甲基氨基甲酰基-3,7-双(二甲基氨基)-10H-吩噻嗪(MCDP)、N-(羧基甲基氨基羰基)-4,4’-双(二甲基氨基)二苯基胺钠盐(DA-64)、4,4’-双(二甲基氨基)二苯基胺、双[3-双(4-氯苯基)甲基-4-二甲基氨基苯基]胺(BCMA)等。
氧化偶合显色型色素原是在过氧化氢和过氧化活性物质存在下由2种化合物进行氧化偶合而生成色素的物质。
作为2种化合物的组合，可以列举：偶合剂与苯胺类的组合、偶合剂与苯酚类的组合等。
作为偶合剂，可以列举例如：4-氨基安替比林(4-AA)、3-甲基-2-苯并噻唑啉酮肼等。
作为苯胺类，可以列举：N-(3-磺丙基)苯胺、N-乙基-N-(2-羟基-3-磺丙基)-3-甲基苯胺(TOOS)、N-乙基-N-(2-羟基-3-磺丙基)-3,5-二甲基苯胺(MAOS)、N-乙基-N-(2-羟基-3-磺丙基)-3,5-二甲氧基苯胺(DAOS)、N-乙基-N-(3-磺丙基)-3-甲基苯胺(TOPS)、N-(2-羟基-3-磺丙基)-3,5-二甲氧基苯胺(HDAOS)、N,N-二甲基-3-甲基苯胺、N,N-双(3-磺丙基)-3,5-二甲氧基苯胺、N-乙基-N-(3-磺丙基)-3-甲氧基苯胺、N-乙基-N-(3-磺丙基)苯胺、N-乙基-N-(3-磺丙基)-3,5-二甲氧基苯胺、N-(3-磺丙基)-3,5-二甲氧基苯胺、N-乙基-N-(3-磺丙基)-3,5-二甲基苯胺、N-乙基-N-(2-羟基-3-磺丙基)-3-甲氧基苯胺、N-乙基-N-(2-羟基-3-磺丙基)苯胺、N-乙基-N-(3-甲苯基)-N’-琥珀酰乙二胺(EMSE)、N-乙基-N-(3-甲苯基)-N’-乙酰基乙二胺(EMSE)、N-乙基-N-(2-羟基-3-磺丙基)-4-氟-3,5-二甲氧基苯胺(F-DAOS)等。
作为苯酚类，可以列举：苯酚、4-氯苯酚、3-甲基苯酚、3-羟基-2,4,6-三碘苯甲酸(HTIB)等。
还原型辅酶测定试剂是用于将生成的还原型辅酶转变为能够检测的物质的试剂。作为能够检测的物质，可以列举例如色素等。能够检测的物质为色素时，还原型辅酶测定试剂含有还原显色型色素原。作为还原显色型色素原，可以列举例如：3-(4,5-二甲基-2-噻唑基)-2,5-二苯基-2H-四唑溴化物(MTT)、2-(4-碘苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-(2,4-二磺基苯基)-2H-四唑单钠盐(WST-1)、2-(4-碘苯基)-3-(2,4-二硝基苯基)-5-(2,4-二磺基苯基)-2H-四唑单钠盐(WST-3)等。
过氧化氢的测定中，作为过氧化活性物质，可以列举例如过氧化物酶等。过氧化活性物质的浓度只要是适于进行测定的浓度则没有特别的限制，在使用过氧化物酶作为过氧化活性物质时，优选为1～100kU/L。另外，氧化显色型色素原的浓度只要是适于进行测定的浓度则没有特别的限制，优选为0.01～10g/L。
本发明中，sdLDL-C的测定优选在水性介质中进行。作为水性介质，可以列举例如去离子水、蒸馏水、缓冲液等，优选为缓冲液。作为缓冲液中使用的缓冲剂，可以列举例如：三(羟甲基)氨基甲烷缓冲剂、磷酸缓冲剂、硼酸缓冲剂、Good's缓冲剂等。
作为Good's缓冲剂，可以列举例如：2-吗啉乙磺酸(MES)、双(2-羟乙基)亚氨基三(羟甲基)甲烷(Bis-Tris)、N-(2-乙酰胺)亚氨基二醋酸(ADA)、哌嗪-N,N’-双(2-乙磺酸)(PIPES)、N-(2-乙酰胺)2-氨基乙磺酸(ACES)、3-吗啉-2-羟基丙磺酸(MOPSO)、N,N-双(2-羟乙基)-2-氨基乙磺酸(BES)、3-吗啉丙磺酸(MOPS)、N-[三(羟甲基)甲基]-2-氨基乙磺酸(TES)、2-[4-(2-羟乙基)-1-哌嗪基]乙磺酸(HEPES)、3-[N,N-双(2-羟乙基)氨基]-2-羟基丙磺酸(DIPSO)、N-[三(羟甲基)甲基]-2-羟基-3-氨基丙磺酸(TAPSO)、哌嗪-N,N’-双(2-羟基丙磺酸)(POPSO)、3-[4-(2-羟乙基)-1-哌嗪基]-2-羟基丙磺酸(HEPPSO)、3-[4-(2-羟乙基)-1-哌嗪基]丙磺酸[(H)EPES]、N-[三(羟甲基)甲基]甘氨酸(Tricine)、N,N-双(2-羟乙基)甘氨酸(Bicine)、N-三(羟甲基)甲基-3-氨基丙磺酸(TAPS)、N-环己基-2-氨基乙磺酸(CHES)、N-环己基-3-氨基-2-羟基丙磺酸(CAPSO)、N-环己基-3-氨基丙磺酸(CAPS)等。缓冲液的浓度只要是适于进行测定的浓度则没有特别的限制，优选为0.001～2.0摩尔/L，更优选为0.005～1.0摩尔/L.
用于确定试样中的sdLDL-C浓度的标准曲线可以通过例如下述方法制作：使用含有已知浓度的sdLDL-C的标准样品，进行本发明的步骤(i)和步骤(ii)，生成过氧化氢或还原型辅酶，测定所生成的过氧化氢或还原型辅酶，由该测定值和所使用的sdLDL-C浓度制作标准曲线。
本发明的步骤(i)和步骤(ii)例如在10～50℃、优选20～40℃下进行1～30分钟、优选2～15分钟。
(sdLDL-C定量用试剂盒)
本发明的sdLDL-C定量用试剂盒，能够在本发明的sdLDL-C定量方法中使用。sdLDL-C定量用试剂盒的形式，只要是能够实施本发明的sdLDL-C定量方法的形式则没有特别的限制，可以为2种试剂类、3种试剂类等任何一种形式，优选为2种试剂类。
作为本发明的sdLDL-C定量用试剂盒，可以列举例如以下的试剂盒：
样品中的sdLDL-C定量用试剂盒，其特征在于，含有：第一试剂，含有表面活性剂A、胆固醇酯水解酶、胆固醇氧化酶及过氧化氢除去试剂；第二试剂，含有引起sdLDL-C的反应的试剂及过氧化氢测定试剂。
样品中的sdLDL-C定量用试剂盒，其特征在于，含有：第一试剂，含有表面活性剂A、胆固醇酯水解酶、氧化型辅酶及胆固醇脱氢酶；第二试剂，含有引起sdLDL-C的反应的试剂。
sdLDL-C定量用试剂盒，其特征在于，含有：第一试剂，含有表面活性剂A、胆固醇酯水解酶、氧化型辅酶、胆固醇脱氢酶及还原型辅酶测定试剂；第二试剂，含有引起sdLDL-C的反应的试剂。
样品中的sdLDL-C定量用试剂盒，其特征在于，含有：第一试剂，含有表面活性剂A、胆固醇酯水解酶、胆固醇脱氢酶、氧化型辅酶、还原型辅酶氧化酶及过氧化氢除去试剂；第二试剂，含有引起sdLDL-C的反应的试剂及过氧化氢测定试剂。
sdLDL-C定量用试剂盒，其特征在于，含有：第一试剂，含有表面活性剂A、胆固醇酯水解酶、胆固醇氧化酶及过氧化氢除去试剂；第二试剂，含有表面活性剂B及过氧化氢测定试剂。
sdLDL-C定量用试剂盒，其特征在于，含有：第一试剂，含有表面活性剂A、胆固醇酯水解酶、氧化型辅酶及胆固醇脱氢酶；第二试剂，含有表面活性剂B。
sdLDL-C定量用试剂盒，其特征在于，含有：第一试剂，含有表面活性剂A、胆固醇酯水解酶、氧化型辅酶、胆固醇脱氢酶及还原型辅酶测定试剂；第二试剂，含有表面活性剂B。
sdLDL-C定量用试剂盒，其特征在于，含有：第一试剂，含有表面活性剂A、胆固醇酯水解酶、氧化型辅酶、胆固醇脱氢酶、还原型辅酶氧化酶及过氧化氢除去试剂；第二试剂，含有表面活性剂B及过氧化氢测定试剂。
在由第一试剂和第二试剂构成的2种试剂类的sdLDL-C定量用试剂盒中，胆固醇酯水解酶在第一试剂中含有，但也可以在第一和第二试剂两者中均含有。胆固醇氧化酶在第一试剂中含有，但也可以在第一和第二试剂两者中均含有。胆固醇脱氢酶在第一试剂中含有，但也可以在第一和第二试剂两者中均含有。
表面活性剂A优选在第一试剂中含有。
氧化型辅酶在第一试剂中含有，但也可以在第一和第二试剂两者中均含有。还原型辅酶氧化酶在第一试剂中含有，但也可以在第一和第二试剂两者中均含有。
过氧化氢除去试剂优选在第一试剂中含有。使用过氧化氢酶作为过氧化氢除去试剂时，过氧化氢酶优选在第一试剂中含有，过氧化氢酶抑制剂优选在第二试剂中含有。使用过氧化物酶与氧化偶合型显色反应中使用的2种氧化偶合型色素原的1种的组合作为过氧化氢除去试剂时，该组合优选在第一试剂中含有。
表面活性剂B优选在第二试剂中含有。如前所述，也可以使用能够对在除去sdLDL以外的脂蛋白中的胆固醇后的反应液中残留的sdLDL-C进行定量的酶、或者酶与表面活性剂的组合来代替表面活性剂B。
使用含有过氧化物酶与2种氧化偶合型色素原的试剂作为过氧化氢测定试剂时，2种氧化偶合型色素原优选分别在不同的试剂中含有。过氧化物酶在第一、第二试剂的任一者或两者中含有。另外，使用过氧化物酶与氧化偶合型显色反应中使用的2种氧化偶合型色素原的1种的组合作为过氧化氢除去试剂时，也可以将该组合与另一种偶合型色素原组合在一起作为过氧化氢测定试剂。另外，该另一种偶合型色素原在第二试剂中含有。
白蛋白优选在第一试剂中含有，但也可以在第一和第二试剂两者中均含有。
作为本发明的sdLDL-C定量用试剂盒，可以列举例如以下形式的试剂盒，但它们并不限定本发明的范围。
试剂盒1
第一试剂
表面活性剂A、胆固醇酯水解酶、胆固醇氧化酶、过氧化氢酶
第二试剂
表面活性剂B、过氧化氢酶抑制剂、过氧化氢测定试剂
试剂盒2
第一试剂
表面活性剂A、胆固醇酯水解酶、胆固醇氧化酶、过氧化物酶、氧化偶合型色素原的1种
第二试剂
表面活性剂B、另一种氧化偶合型色素原
试剂盒3
第一试剂
表面活性剂A、胆固醇酯水解酶、胆固醇氧化酶、过氧化物酶、氧化偶合型色素原
第二试剂
表面活性剂B
试剂盒4
第一试剂
表面活性剂A、胆固醇酯水解酶、氧化型辅酶、胆固醇脱氢酶
第二试剂
表面活性剂B
试剂盒5
第一试剂
表面活性剂A、胆固醇酯水解酶、氧化型辅酶、胆固醇脱氢酶、还原型辅酶测定试剂
第二试剂
表面活性剂B
试剂盒6
第一试剂
表面活性剂A、胆固醇酯水解酶、氧化型辅酶、胆固醇脱氢酶、还原型辅酶氧化酶、过氧化氢酶
第二试剂
表面活性剂B、过氧化氢酶抑制剂、过氧化氢测定试剂
试剂盒7
第一试剂
表面活性剂A、胆固醇酯水解酶、氧化型辅酶、胆固醇脱氢酶、还原型辅酶氧化酶、过氧化物酶、氧化偶合型色素原的1种
第二试剂
表面活性剂B、另一种氧化偶合型色素原
试剂盒8
第一试剂
表面活性剂A、胆固醇酯水解酶、胆固醇氧化酶、过氧化氢酶、白蛋白
第二试剂
表面活性剂B、过氧化氢酶抑制剂、过氧化氢测定试剂
试剂盒9
第一试剂
表面活性剂A、胆固醇酯水解酶、胆固醇氧化酶、过氧化物酶、氧化偶合型色素原的1种、白蛋白
第二试剂
表面活性剂B、另一种氧化偶合型色素原
试剂盒10
第一试剂
表面活性剂A、胆固醇酯水解酶、胆固醇氧化酶、过氧化物酶、氧化偶合型色素原、白蛋白
第二试剂
表面活性剂B
试剂盒11
第一试剂
表面活性剂A、胆固醇酯水解酶、氧化型辅酶、胆固醇脱氢酶、白蛋白
第二试剂
表面活性剂B
试剂盒12
第一试剂
表面活性剂A、胆固醇酯水解酶、氧化型辅酶、胆固醇脱氢酶、还原型辅酶测定试剂、白蛋白
第二试剂
表面活性剂B
试剂盒13
第一试剂
表面活性剂A、胆固醇酯水解酶、氧化型辅酶、胆固醇脱氢酶、还原型辅酶氧化酶、过氧化氢酶、白蛋白
第二试剂
表面活性剂B、过氧化氢酶抑制剂、过氧化氢测定试剂
试剂盒14
第一试剂
表面活性剂A、胆固醇酯水解酶、氧化型辅酶、胆固醇脱氢酶、还原型辅酶氧化酶、过氧化物酶、氧化偶合型色素原的1种、白蛋白
第二试剂
表面活性剂B、另一种氧化偶合型色素原
试剂盒15
第一试剂
表面活性剂A、胆固醇酯水解酶、胆固醇氧化酶、过氧化氢酶、白蛋白
第二试剂
表面活性剂B、过氧化氢酶抑制剂、过氧化氢测定试剂、白蛋白
试剂盒16
第一试剂
表面活性剂A、胆固醇酯水解酶、胆固醇氧化酶、过氧化物酶、氧化偶合型色素原的1种、白蛋白
第二试剂
表面活性剂B、白蛋白、另一种氧化偶合型色素原
试剂盒17
第一试剂
表面活性剂A、胆固醇酯水解酶、胆固醇氧化酶、过氧化物酶、氧化偶合型色素原、白蛋白
第二试剂
表面活性剂B、白蛋白
试剂盒18
第一试剂
表面活性剂A、胆固醇酯水解酶、氧化型辅酶、胆固醇脱氢酶、白蛋白
第二试剂
表面活性剂B、白蛋白
试剂盒19
第一试剂
表面活性剂A、胆固醇酯水解酶、氧化型辅酶、胆固醇脱氢酶、还原型辅酶测定试剂、白蛋白
第二试剂
表面活性剂B、白蛋白
试剂盒20
第一试剂
表面活性剂A、胆固醇酯水解酶、氧化型辅酶、胆固醇脱氢酶、还原型辅酶氧化酶、过氧化氢酶、白蛋白
第二试剂
表面活性剂B、过氧化氢酶抑制剂、过氧化氢测定试剂、白蛋白
试剂盒21
第一试剂
表面活性剂A、胆固醇酯水解酶、氧化型辅酶、胆固醇脱氢酶、还原型辅酶氧化酶、过氧化物酶、氧化偶合型色素原的1种、白蛋白
第二试剂
表面活性剂B、白蛋白、另一种氧化偶合型色素原
作为本发明的sdLDL-C定量用试剂盒中使用的表面活性剂A、胆固醇酯水解酶、胆固醇氧化酶、氧化型辅酶、胆固醇脱氢酶、还原型辅酶氧化酶、过氧化氢除去试剂、表面活性剂B、白蛋白、过氧化氢测定试剂，分别可以列举前面所述的物质。
本发明的sdLDL-C定量用试剂盒中，根据需要可以含有水性介质、稳定剂、防腐剂、影响物质消除剂、反应促进剂等。作为水性介质，可以列举例如前述的水性介质等。作为稳定剂，可以列举例如：乙二胺四乙酸(EDTA)、蔗糖、氯化钙等。作为防腐剂，可以列举例如：叠氮化钠、バイオエース(BIOACE)、抗生素等。作为影响物质消除剂，可以列举例如：用于消除抗坏血酸的影响的抗坏血酸氧化酶等。作为反应促进剂，可以列举例如：共脂肪酶等酶、硫酸钠、氯化钠等盐类等。
本发明的sdLDL-C定量用试剂盒，可以为冷冻干燥的状态，也可以为溶解于水性介质的状态。使用冷冻干燥状态的试剂对样品中的sdLDL-C进行定量时，将该试剂溶解于水性介质中使用。
作为本发明的sdLDL-C定量用试剂盒中的胆固醇酯水解酶、胆固醇氧化酶的含量，优选在用水性介质溶解的状态下的浓度为0.001～2000U/mL的含量，更优选为0.005～1000U/mL的含量。
作为本发明的sdLDL-C定量用试剂盒中的胆固醇脱氢酶、还原型辅酶氧化酶的含量，优选在用水性介质溶解的状态下的浓度为0.001～2000U/mL的含量，更优选为0.005～1000U/mL的含量。
作为本发明的sdLDL-C定量用试剂盒中的氧化型辅酶的含量，优选在用水性介质溶解的状态下的浓度为0.01～500毫摩尔/mL的含量，更优选为0.1～100毫摩尔/mL的含量。
作为本发明的sdLDL-C定量用试剂盒中的表面活性剂A的含量，优选在用水性介质溶解的状态下的浓度为0.0001～1%的含量，更优选为0.0005～0.5%的含量。
作为本发明的sdLDL-C定量用试剂盒中的表面活性剂B的含量，优选在用水性介质溶解的状态下的浓度为0.001～5%的含量，更优选为0.01～0.5%的含量。
作为本发明的sdLDL-C定量用试剂盒中的白蛋白的含量，优选在用水性介质溶解的状态下的浓度为0.0001～10%，更优选为0.001～5%。
下面，通过实施例对本发明进行更具体的说明，但这些实施例并不限定本发明的范围。另外，本实施例和参考例中，使用下述生产厂家的试剂和酶。
MOPS(同仁化学研究所公司制)、EMSE(ダイドーケミックス公司制)、硫酸钠(关东化学公司制)、4-氨基安替比林(埼京化成公司制)、过氧化物酶(东洋纺织公司制)、CHO-PEL(胆固醇氧化酶；キッコーマン公司制)、CHO-CE(胆固醇氧化酶；キッコーマン公司制)、COO-322(胆固醇氧化酶；东洋纺织公司制)、LPL3(胆固醇酯水解酶；天野エンザイム公司制)、、LP(胆固醇酯水解酶；旭化成公司制)、LIPS(胆固醇酯水解酶；旭化成公司制)、LPAP(胆固醇酯水解酶；旭化成公司制)、过氧化物酶(东洋纺织公司制)、BSA(Proliant公司制)。
パイオニンD-3110(竹本油脂公司制)、パイオニンD-3120(竹本油脂公司制)、ナイミーンL-207(日本油脂公司制)、ユニセーフAL-E(日本油脂公司制)、ZWITTERGENT3-10(CALBIOCHEM公司制)、ニッサンアノンBL(日本油脂公司制)、アノンBDF-SF(日本油脂公司制)、ビスノールSK(一方社公司制)、ナイミッドMT-215(日本油脂公司制)、ニューコール707-SF(日本乳化剂公司制)、ニューコール723-SF(日本乳化剂公司制)、ハイテノールN-17(第一工业药品公司制)、サンアミドCF-10(日本油脂公司制)、ミグノールPA-30(一方社公司制)、ニッコールCMT-30(日光化学公司制)、サルコシネートLN-30(日光化学公司制)、アデカプルロニックTR-704(旭电化公司制)、ユニオールD-700(日本油脂公司制)、プルロニック25R-2(旭电化公司制)、ユニルーブ50MB-26(日本油脂公司制)。
ノイゲンTDS-80(第一工业药品公司制)、ノイゲンTDS-120(第一工业药品公司制)、EMALEX OD-16(日本エマルジョン公司制)、ワンダサーフS-800(青木油脂公司制)、ワンダサーフS-1400(青木油脂公司制)、ノニオンNS-210(日本油脂公司制)、ノニオンNS-215(日本油脂公司制)、ニューコール2607(日本乳化剂公司制)、エマルゲンA-60(花王公司制)、BLAUNONDSP-12.5(青木油脂公司制)、ニューポールPE-64(三洋化成公司制)、BLAUNONLPE1007(青木油脂公司制)。
实施例1
制备由以下的第一试剂和第二试剂构成的sdLDL-C定量用试剂盒。以使用表1所示的表面活性剂A和表面活性剂B的试剂盒作为实施例1(1)～1(34)的试剂盒。
第一试剂
MOPS(pH7.0)           20毫摩尔/L
EMSE                  0.3g/L
硫酸钠                2g/L
表面活性剂A(以下简记为“表A”)
LPL3                  100kU/L
CHO-PEL               1kU/L
过氧化物酶            10kU/L
第二试剂
MOPS(pH7.0)           20毫摩尔/L
4-氨基安替比林        0.3g/L
过氧化物酶            20kU/L
表面活性剂B(以下简记为“表B”)
表1
Figure BDA00003214761000401
表1续1
Figure BDA00003214761000411
表1续2
实施例2
根据“新生化学实验讲座4”(东京化学同人)记载的超速离心法，从人血清中分离提取出HDL(比重为1.063以上)、sdLDL(比重为1.044～1.063)、LgLDL(比重为1.006～1.044)、VLDL和CM(比重为1.006以下)这4种脂蛋白组分，使用实施例1的试剂盒，计算出各脂蛋白组分中的胆固醇的反应率。
(1)通过各脂蛋白组分中的胆固醇与实施例1的试剂盒的反应而进行的各脂蛋白组分的“反应吸光度”的计算
使用日立7170S型自动分析装置，通过以下操作计算出“反应吸光度”。
以各脂蛋白组分为样品添加到反应池(2μL)中，然后分别添加实施例1的试剂盒的第一试剂(0.15mL)，使反应(第一反应)开始，在37℃下加热5分钟，以主波长600nm、副波长700nm测定反应5分钟后反应液的吸光度(E1)。接着，在该反应液中分别添加实施例1(1)～1(34)的试剂盒的第二试剂(0.05mL)，再在37℃下加热5分钟来进行反应(第二反应)，以主波长600nm、副波长700nm测定第二反应5分钟后反应液的吸光度(E2)，从E2中减去E1，计算出吸光度变化(△E’脂蛋白组分)。另外，使用生理盐水代替各脂蛋白组分作为样品，进行同样的测定，计算出吸光度变化(△E’空白)。最后，根据下述(式3)计算出各脂蛋白组分的“反应吸光度3”。
反应吸光度3=△E’脂蛋白组分-△E’空白    (式3)
(2)各脂蛋白组分中的胆固醇的反应率的计算
利用日立7170S型自动分析装置，并使用总胆固醇定量用试剂盒デタミナーC TC(协和梅迪克斯公司制)代替实施例1的试剂盒，除此以外，通过与(1)同样的方法计算出“反应吸光度4”，根据下述(式4)，计算出使用实施例1(1)～1(34)各试剂盒时各脂蛋白组分中的胆固醇的反应率(%)。另外，在使用デタミナーC TC的测定中算出的“反应吸光度4”，是指作为对象的脂蛋白中的胆固醇全部反应时的“反应吸光度”。
反应率(%)=反应吸光度3/反应吸光度4×100    (式4)
对于实施例1(1)～1(34)各试剂盒的各脂蛋白组分中的胆固醇的反应率，按照反应率0～10%为“－”、10～20%为“±”、20～50%为“＋”、50～80%为“＋＋”、80～100%为“＋＋＋”归纳显示于表2。
表2
由表2所示可知，实施例1(1)～1(34)所示的试剂盒能够用于sdLDL-C的定量。
实施例3
制备由以下的第一试剂和第二试剂构成的sdLDL-C定量用试剂盒。以使用表3所示的表面活性剂A和表面活性剂B的试剂盒作为实施例3(35)～3(44)的试剂盒。
第一试剂
MOPS(pH7.0)            20毫摩尔/L
EMSE                   0.3g/L
硫酸钠                 2 g/L
表面活性剂A(以下简记为“表A”)
LPL3                   100kU/L
CHO-PEL                1kU/L
过氧化物酶             10kU/L
BSA
第二试剂
MOPS(pH7.0)            20毫摩尔/L
4-氨基安替比林         0.3g/L
过氧化物酶             20kU/L
表面活性剂B(以下简记为“表B”)
表3
表3续
Figure BDA00003214761000471
实施例4
使用实施例3(35)～3(47)的试剂盒，与实施例2的(1)记载的测定方法同样地操作，利用日立7170S型自动分析装置，分别测定人血清24个样品的反应吸光度。
接着，使用该血清，通过Journal of Lipid Researchvol.44,p.2193-2201(2003)记载的超速离心法离心分离出该样品中的sdLDL，使用デタミナーL TCII(协和梅迪克斯公司制)测定所得到的sdLDL组分中的胆固醇量。将使用实施例3(35)～3(47)的试剂盒进行的测定中的测定值与通过超速离心法得到的测定值的相关系数记于表4。
表4
试剂盒 对超速离心法的相关系数
实施例3(35) 0.871
实施例3(36) 0.888
实施例3(37) 0.912
实施例3(38) 0.864
实施例3(39) 0.890
实施例3(40) 0.902
实施例3(41) 0.915
实施例3(42) 0.919
实施例3(43) 0.916
实施例3(44) 0.927
实施例3(45) 0.886
实施例3(46) 0.876
实施例3(47) 0.856
由表4所示可知，使用实施例3(35)～3(44)的试剂盒得到的测定结果，与通过超速离心法得到的测定结果显示出良好的相关。
另外，由使用第一试剂中含有BSA的实施例3(42)和3(43)的试剂盒的测定、与使用实施例3(35)和3(37)的试剂盒的测定之间的比较，可以判断：通过使用第一试剂中含有BSA的试剂盒，比使用第一试剂中不含有BSA的试剂盒时与超速离心法之间的相关更好。
实施例5
制备由以下的第一试剂和第二试剂构成的sdLDL-C定量用试剂盒。以使用表5所示的表面活性剂A和表面活性剂B的试剂盒作为实施例5(48)～5(57)的试剂盒。
第一试剂
MOPS(pH7.0)           20毫摩尔/L
EMSE                  0.3g/L
硫酸钠                2g/L
过氧化物酶            10kU/L
BSA                   3g/L
表面活性剂A(以下简记为“表A”)
胆固醇酯水解酶(以下简记为“CHER”)
胆固醇氧化酶(以下简记为“CHOD”)
第二试剂
MOPS(pH7.0)           20毫摩尔/L
4-氨基安替比林        0.3g/L
过氧化物酶            20kU/L
BLAUNON LPE-1007      1g/L
ワンダサーフS-800     0.3g/L
表5
Figure BDA00003214761000501
实施例6
使用实施例3(43)和实施例5(48)～5(57)的试剂盒，与实施例2的(1)记载的测定方法同样地操作，利用日立7170S型自动分析装置，分别测定人血清25个样品的反应吸光度。
接着，使用该血清，通过Journal of Lipid Researchvol.44,p.2193-2201(2003)记载的超速离心法离心分离出该样品中的sdLDL，使用デタミナーL TCII(协和梅迪克斯公司制)测定所得到的sdLDL组分中的胆固醇量。将使用实施例3(43)和实施例5(48)～5(57)的试剂盒进行的测定中的测定值与通过超速离心法得到的测定值的相关系数记于表6。
表6
试剂盒 对超速离心法的相关系数
实施例3(43) 0.914
实施例5(48) 0.949
实施例5(49) 0.914
实施例5(50) 0.887
实施例5(51) 0.935
实施例5(52) 0.969
实施例5(53) 0.928
实施例5(54) 0.880
实施例5(55) 0.918
实施例5(56) 0.924
实施例5(57) 0.897
由表6所示可知，使用实施例3(43)和实施例5(48)～5(57)的试剂盒得到的测定结果，与通过超速离心法得到的测定结果显示出良好的相关。
实施例7
制备由以下的第一试剂和第二试剂构成的sdLDL-C定量用试剂盒。以使用表7所示的表面活性剂A和表面活性剂B的试剂盒作为实施例7(58)～7(67)的试剂盒。
第一试剂
MOPS(pH7.0)           20毫摩尔/L
EMSE                  0.3g/L
硫酸钠                2g/L
表面活性剂A(以下简记为“表A”)
LPL3                  100kU/L
CHO-PEL               1kU/L
过氧化物酶            10kU/L
BSA
第二试剂
MOPS(pH7.0)           20毫摩尔/L
4-氨基安替比林        0.3g/L
过氧化物酶            20kU/L
表面活性剂B(以下简记为“表B”)
表7
实施例8
使用实施例3(36)和实施例7(58)～7(67)的试剂盒，与实施例2的(1)记载的测定方法同样地操作，分别测定人血清21个样品的反应吸光度。
接着，使用该血清，通过Journal of Lipid Researchvol.44,p.2193-2201(2003)记载的超速离心法离心分离出该血清中的sdLDL，使用デタミナーL TCII(协和梅迪克斯公司制)测定所得到的sdLDL组分中的胆固醇量。将使用各实施例和比较例的试剂盒进行的测定中的测定值与通过超速离心法得到的测定值的相关系数记于表8。
表8
试剂盒 对超速离心法的相关系数
实施例3(36) 0.889
实施例7(58) 0.925
实施例7(59) 0.879
实施例7(60) 0.922
实施例7(61) 0.915
实施例7(62) 0.908
实施例7(63) 0.890
实施例7(64) 0.933
实施例7(65) 0.931
实施例7(66) 0.914
实施例7(67) 0.932
由表8所示可知，使用实施例3(36)和实施例7(58)～7(67)的试剂盒得到的测定结果，与通过超速离心法得到的测定结果显示出良好的相关。
实施例9
样品中的sdLDL-C的定量
使用超速离心法及本发明的实施例3(36)和实施例3(44)的试剂盒，针对人新鲜血清2个样品，通过以下方法对各样品中的sdLDL-C进行定量。
(1)使用超速离心法进行的人血清样品中sdLDL-C的定量
使用该人血清2样品，通过Journal of Lipid Researchvol.44,p.2193-2201(2003)记载的超速离心法离心分离出该血清中的sdLDL，使用デタミナーL TCII(协和梅迪克斯公司制)测定所得到的sdLDL组分中的胆固醇量。
(2)标准曲线的制作
以通过超速离心法的测定判断sdLDL-C浓度为43.1mg/dL的血清标准液作为标准曲线制作用样品。与实施例2的(1)记载的测定方法同样地操作，利用日立7170S自动分析装置，使用实施例3(36)和实施例3(44)的试剂盒，测定标准曲线制作用样品的反应吸光度，由该反应吸光度与标准曲线制作用样品中的sdLDL-C浓度的关系制作各试剂盒的标准曲线。
(3)人血清2个样品中的sdLDL-C的定量
使用人血清2个样品代替标准曲线制作用样品，通过与上述(2)同样的方法，对该2个样品分别进行反应，针对各试剂盒，由反应后反应液的吸光度与上述(2)中制作的标准曲线，确定各样品中的sdLDL-C浓度。
对于该2个样品，将上述(1)的通过超速离心法确定的该样品中的sdLDL-C浓度、与上述(3)的通过使用实施例3(36)和实施例3(44)的试剂盒进行的测定而确定的该样品中的sdLDL-C浓度示于表9。
表9
Figure BDA00003214761000551
表9显示出，使用本发明的试剂盒，通过本发明的方法，能够对人血清中的sdLDL-C准确地进行定量。
工业上利用的可能性
根据本发明，能够提供在动脉硬化等冠状动脉疾病的诊断中有用的小而密低密度脂蛋白中的胆固醇的定量方法及定量用试剂盒。

Claims (2)

1.一种样品中的sdLDL-C的定量方法，包括下述步骤(i)、(ii)和(iii)：
步骤(i)：在含有表面活性剂A的反应液中，使胆固醇酯水解酶和胆固醇氧化酶、或者胆固醇酯水解酶、胆固醇脱氢酶和氧化型辅酶作用于样品，除去该样品中的高密度脂蛋白中的胆固醇、极低密度脂蛋白中的胆固醇、乳糜微粒中的胆固醇以及大而轻低密度脂蛋白中的胆固醇，其中，所述表面活性剂A是选自聚氧乙烯烷基胺、选自烷基氧化胺和聚氧乙烯烷基氧化胺的氧化胺类、烷基甜菜碱、烷基铵-1-丙磺酸盐、酰胺烷基甜菜碱、聚氧乙烯苄基-烷基季铵盐、聚氧乙烯脂肪酰胺、聚氧乙烯多环苯基醚硫酸酯盐、聚氧乙烯烷基苯基醚硫酸酯盐、聚氧乙烯脂肪酰胺硫酸酯盐、聚氧乙烯烷基胺硫酸酯盐、N-酰基牛磺酸盐、N-酰基肌氨酸盐、乙二胺-聚氧乙烯聚氧丙烯缩合物、分子量为1200以下的聚丙二醇、由下述通式(I)表示的聚氧乙烯聚氧丙烯缩合物、以及烷基的碳原子数为9以下的聚氧乙烯聚氧化烯烷基醚中的表面活性剂，
HO-(C3H6O)a-(C2H4O)b-(C3H6O)c-H      (I)
通式(I)中，a、b及c相同或者不同，表示1～200的整数；
步骤(ii)：添加表面活性剂B，生成过氧化氢或者还原型辅酶，并测定所生成的过氧化氢或者还原型辅酶，其中，所述表面活性剂B是选自HLB低于15.0且烷基的碳原子数为20以下的聚氧乙烯烷基醚、HLB低于15.0且烷基的碳原子数在10以上20以下的聚氧乙烯聚氧化烯烷基醚、HLB低于16.0的聚氧乙烯烷基苯基醚、HLB低于16.0的聚氧乙烯聚氧化烯烷基苯基醚、HLB低于13.0的聚氧乙烯多环苯基醚、HLB低于13.0的聚氧乙烯聚氧化烯多环苯基醚、由下述通式(II)表示的聚氧丙烯的分子量为1200以上且聚氧乙烯的含量为60%以下的聚氧乙烯聚氧丙烯缩合物、以及聚氧乙烯聚氧化烯烷基胺中的表面活性剂，
HO-(C2H4O)d-(C3H6O)e-(C2H4O)f-H      (II)
通式(II)中，d、e及f相同或者不同，表示1～200的整数；以及
步骤(iii)：使用含有已知浓度的sdLDL-C的标准样品，进行所述步骤(i)和(ii)，生成过氧化氢或者还原型辅酶，并测定所生成的过氧化氢或者还原型辅酶，将sdLDL-C浓度与过氧化氢或者还原型辅酶的测定值相关联，来确定该样品中的sdLDL-C浓度；
其中，所述sdLDL-C表示小而密低密度脂蛋白中的胆固醇。
2.如权利要求1所述的方法，其中，在白蛋白存在下进行步骤(i)。
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