KR101467926B1 - 소입자 저밀도 리포단백질 중의 콜레스테롤의 정량 방법 - Google Patents

소입자 저밀도 리포단백질 중의 콜레스테롤의 정량 방법 Download PDF

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Abstract

(i) 콜레스테롤에스테르 가수 분해 효소 등의 콜레스테롤 측정용 효소에 의한 sdLDL-C 의 반응을 우선적으로 억제하는 계면 활성제를 함유하는 반응액 중에서, 검체에 그 콜레스테롤 측정용 효소를 작용시켜, 그 검체 중의 HDL-C, VLDL-C, CM-C 및 LgLDL-C 를 제거하는 공정, (ii) 상기 공정 (i) 후의 반응액에 잔존하는 sdLDL-C 의 반응을 일으키는 시약을 첨가하여, 과산화수소 또는 환원형 조효소를 생성시키고, 생성된 과산화수소 또는 환원형 조효소를 측정하는 공정 및 (iii) (ii) 에서의 측정값과, 미리 작성한 검량선으로부터, 그 검체 중의 sdLDL-C 농도를 결정하는 공정을 포함하는 sdLDL-C 의 정량 방법.

Description

소입자 저밀도 리포단백질 중의 콜레스테롤의 정량 방법{METHOD FOR DETERMINATION OF CHOLESTEROL IN SMALL DENSE LOW-DENSITY LIPOPROTEIN}
본 발명은 검체 중의 소입자 저밀도 리포단백질 (이하, sdLDL 로 약기한다) 중의 콜레스테롤 (이하, sdLDL-C 로 약기한다) 의 정량 방법 및 정량용 키트에 관한 것이다.
혈액 중에 존재하는 리포단백질은, 그 비중에 따라 고밀도 리포단백질 (이하, HDL 로 약기한다), 저밀도 리포단백질 (이하, LDL 로 약기한다), 초저밀도 리포단백질 (이하, VLDL 로 약기한다) 및 카일로마이크론 (이하, CM 으로 약기한다) 의 4 가지로 크게 분류되어 있다. 각 리포단백질은 구성하는 지질 조성도 상이하고, 또한 각 리포단백질을 구성하는 아포단백의 종류의 차이에 따라 생체 중에서의 작용이 크게 상이하다. 또한, VLDL 로부터 LDL 로 대사되는 과정에 있어서 생성되는 리포단백질로서, VLDL 과 LDL 의 중간 밀도를 갖는 중간 밀도 리포단백질 (이하, IDL 로 약기한다) 이 존재하는데, 이것도 넓은 의미로는 LDL 로서 분류되어 있다.
임상 검사에 있어서, 동맥 경화 진단의 스크리닝 마커로서, 총 콜레스테롤, 총 트리글리세리드, HDL 중 콜레스테롤, LDL 중 콜레스테롤, 아포리포단백질 AI, 아포리포단백질 B 등이 이용되고 있다. 그 중에서도, 동맥 경화 형성에 강하게 관여한다고 일컬어지고 있는 LDL 중의 콜레스테롤이 빈번하게 측정되게 되었다. 한편, LDL 중의 콜레스테롤이 높지 않음에도 불구하고 관동맥 경화 병변을 갖는 사람도 많이 관찰된다. 이 병태에 있어서는 소형이며 고밀도인 LDL (당해 LDL 이 sdLDL 로 불리고 있다) 이 증가하고 있고, sdLDL-C 는 LDL-C 이상으로 관동맥 질환과 관계된다는 보고도 있다 [「아테리오스클레로시스 트롬보시스 앤드 배스큘러 바이올로지 (Arteriosclerosis Thrombosis, and Vascular Biology)」, 2004년, 제24권, p.558-563 참조].
sdLDL 을 측정하는 방법으로는, 전기 영동법, 초원심법, 분획법 등이 알려져 있다. 전기 영동법은 2 ∼ 16% 의 비변성 그래디언트 겔을 사용하여 전기 영동, 염색을 실시하여 LDL 의 입자 사이즈를 측정하는 방법인데, 조작이 번잡하여 범용성이 떨어진다. 또한 이 방법에서는 LDL 의 입자 사이즈는 측정할 수 있으나, sdLDL 의 정량은 불가능하다. 또한, 이온 강도의 차이에 의해 sdLDL 을 혼탁 또는 용해시켜 흡광도의 차이에 의해 sdLDL 을 측정하는 방법 (특허 문헌 1 참조) 이 있다. 그러나, 이 방법에서는 탁도를 측정하고 있기 때문에 특이성이나 정밀도가 불충분하고, 또한 이 방법에서는 sdLDL 량을 측정할 수 있으나, sdLDL-C 를 측정할 수는 없다.
sdLDL-C 를 정량하는 방법에는 초원심법, 분획법 등이 있다. 초원심법은 초원심 분리기를 사용하여 검체 중의 sdLDL 에 해당하는 비중 영역을 분취하여, 그 비중 영역 중의 콜레스테롤을 측정하는 방법으로서, sdLDL-C 정량의 표준법이 될 수 있는 방법이다. 그러나 이 방법은 고가의 설비를 필요로 하고, 측정에 매우 장시간을 필요로 하며, 숙련된 기술을 필요로 한다.
분획법으로는, 제 1 공정에서 폴리아니온과 2 가의 양이온 또는 1 가의 양이온의 조합, 혹은 폴리에틸렌글리콜을 사용하여 검체 중의 HDL 및 sdLDL 이외의 리포단백질을 응집시켜, 원심 분리나 필터 여과에 의해 응집물을 제거하고, HDL 및 sdLDL 을 분리하여, 제 2 공정에서 분리한 HDL 및 sdLDL 을 함유하는 시료로부터 sdLDL-C 를 정량하는 방법이다 (특허 문헌 2 참조). 이 방법은, 초원심법과 비교하여 조작이 간편화되었으나, 분획 조작이 필요하기 때문에 측정에 시간을 필요로 한다.
계면 활성제의 존재하에서, 콜레스테롤에스테르 가수 분해 효소 및 콜레스테롤 산화 효소 혹은 콜레스테롤 탈수소 효소를 HDL, LDL, VLDL 및 CM 으로 이루어지는 군에서 선택되는 하나 또는 복수의 특정한 리포단백질에 특이적으로 작용시켜, 측정해야 할 리포단백질 중의 콜레스테롤을 측정하는 방법은 다수 보고되어 있다. 최근, 폴리옥시에틸렌-폴리옥시프로필렌 공중합체 또는 그 유도체의 존재하에, 검체에 콜레스테롤 측정용 효소를 첨가하고, 폴리옥시에틸렌-폴리옥시프로필렌 공중합체 또는 그 유도체를 sdLDL 에 선택적으로 작용시켜, 생성된 콜레스테롤량을 측정하는 것을 특징으로 하는 sdLDL-C 의 정량법이 보고되었다 (특허 문헌 3).
특허 문헌 1 : 일본 공개특허공보 2003-28882호
특허 문헌 2 : 국제 공개 제2004/053500호 팜플렛
특허 문헌 3 : 국제 공개 제2007/026829호 팜플렛
발명의 개시
발명이 해결하고자 하는 과제
본 발명의 목적은 간편하고 또한 정확하게 검체 중의 sdLDL-C 를 정량할 수 있는 방법 및 키트를 제공하는 것에 있다.
과제를 해결하기 위한 수단
본 발명은 이하의 [1] ∼ [12] 에 관한 것이다.
[1] 하기 공정 (i), (ii) 및 (iii) 을 포함하는, 검체 중의 소입자 저밀도 리포단백질 중의 콜레스테롤 (이하, sdLDL-C 로 약기한다) 의 정량 방법.
(i) 콜레스테롤에스테르 가수 분해 효소 및 콜레스테롤 산화 효소 혹은 콜레스테롤 탈수소 효소-산화형 조효소에 의한 고밀도 리포단백질 중의 콜레스테롤 (이하, HDL-C 로 약기한다), 초저밀도 리포단백질 중의 콜레스테롤 (이하, VLDL-C 로 약기한다), 카일로마이크론 중의 콜레스테롤 (이하, CM-C 로 약기한다) 및 대입자 저밀도 리포단백질 중의 콜레스테롤 (이하, LgLDL-C 로 약기한다) 의 반응과 비교하여, 그 콜레스테롤에스테르 가수 분해 효소 및 그 콜레스테롤 산화 효소 혹은 그 콜레스테롤 탈수소 효소-산화형 조효소에 의한 sdLDL-C 의 반응을 우선적으로 억제하는 계면 활성제 (이하, 그 계면 활성제를 계면 활성제 A 로 약기한다) 를 함유하는 반응액 중에서, 검체에 그 콜레스테롤에스테르 가수 분해 효소 및 그 콜레스테롤 산화 효소 또는 그 콜레스테롤에스테르 가수 분해 효소, 그 콜레스테롤 탈수소 효소 및 산화형 조효소를 작용시켜, 그 검체 중의 HDL-C, VLDL-C, CM-C 및 LgLDL-C 를 제거하는 공정
(ii) 상기 공정 (i) 의 계면 활성제 A 를 함유하는 반응액에 잔존하는 sdLDL-C 의, 콜레스테롤에스테르 가수 분해 효소 및 콜레스테롤 산화 효소 혹은 콜레스테롤 탈수소 효소-산화형 조효소에 의한 반응을 일으키는 시약을 첨가하여, 과산화수소 또는 환원형 조효소를 생성시키고, 생성된 과산화수소 또는 환원형 조효소를 측정하는 공정
(iii) 이미 알려진 농도의 sdLDL-C 를 함유하는 표준 검체를 사용하여, 상기 (i) 및 (ii) 의 공정을 실시하여 과산화수소 또는 환원형 조효소를 생성시키고, 생성된 과산화수소 또는 환원형 조효소를 측정하고, sdLDL-C 농도와 과산화수소 또는 환원형 조효소에 관련된 측정값을 관련지어, 그 검체 중의 sdLDL-C 농도를 결정하는 공정
[2] 공정 (i) 의 계면 활성제 A 를 함유하는 반응액에 잔존하는 sdLDL-C 의, 콜레스테롤에스테르 가수 분해 효소 및 콜레스테롤 산화 효소 혹은 콜레스테롤 탈수소 효소-산화형 조효소에 의한 반응을 일으키는 시약이, sdLDL-C 의, 콜레스테롤에스테르 가수 분해 효소 및 콜레스테롤 산화 효소 혹은 콜레스테롤 탈수소 효소-산화형 조효소에 의한 반응의 억제를 해제하는 계면 활성제 (이하, 그 계면 활성제를 계면 활성제 B 로 약기한다) 인 [1] 에 기재된 방법.
[3] 계면 활성제 A 가, 폴리옥시에틸렌알킬아민, 아민옥사이드류, 알킬베타인, 알킬암모니오-1-프로판술폰산염, 산아미드알킬베타인, 폴리옥시에틸렌벤질-알킬4급암모늄염, 폴리옥시에틸렌지방산아미드, 폴리옥시에틸렌 다고리 페닐에테르황산에스테르염, 폴리옥시에틸렌알킬페닐에테르황산에스테르염, 폴리옥시에틸렌지방산아미드황산에스테르염, 폴리옥시에틸렌알킬아민황산에스테르염, N-아실타우린염, N-아실아미노산염, 에틸렌디아민-폴리옥시에틸렌폴리옥시프로필렌 축합물, 폴리에틸렌글리콜을 함유하지 않는 폴리프로필렌글리콜 유도체, 일반식 (I)
[화학식 1]
Figure 112009021032562-pct00001
(식 중, a, b 및 c 는 동일하거나 상이하고, 1 ∼ 200 의 정수를 나타낸다) 로 나타내는 폴리옥시에틸렌폴리옥시프로필렌 축합물 및 폴리옥시에틸렌폴리옥시알킬렌알킬에테르 (그 알킬은 탄소수 9 이하의 알킬) 로 이루어지는 군에서 선택되는 계면 활성제인 [1] 또는 [2] 에 기재된 방법.
[4] 계면 활성제 B 가, 폴리옥시에틸렌알킬에테르, 폴리옥시에틸렌폴리옥시알킬렌알킬에테르 (그 알킬은 탄소수 10 이상의 알킬), 폴리옥시에틸렌알킬페닐에테르, 폴리옥시에틸렌폴리옥시알킬렌알킬페닐에테르, 폴리옥시에틸렌 다고리 페닐에테르, 폴리옥시에틸렌폴리옥시알킬렌 다고리 페닐에테르, 일반식 (II)
[화학식 2]
Figure 112009021032562-pct00002
(식 중, d, e 및 f 는 동일하거나 상이하고, 1 ∼ 200 의 정수를 나타낸다) 로 나타내는 폴리옥시에틸렌폴리옥시프로필렌 축합물 및 폴리옥시에틸렌폴리옥시알킬렌알킬아민으로 이루어지는 군에서 선택되는 계면 활성제인 [1] ∼ [3] 중 어느 하나에 기재된 방법.
[5] 공정 (i) 을 알부민 존재하에서 실시하는 [1] ∼ [4] 중 어느 하나에 기재된 방법.
[6] (a) 콜레스테롤에스테르 가수 분해 효소 및 콜레스테롤 산화 효소 혹은 콜레스테롤 탈수소 효소-산화형 조효소에 의한 고밀도 리포단백질 중의 콜레스테롤, 초저밀도 리포단백질 중의 콜레스테롤, 카일로마이크론 중의 콜레스테롤 및 대입자 저밀도 리포단백질 중의 콜레스테롤의 반응과 비교하여, 그 콜레스테롤에스테르 가수 분해 효소 및 그 콜레스테롤 산화 효소 혹은 그 콜레스테롤 탈수소 효소-그 산화형 조효소에 의한 소입자 저밀도 리포단백질 중의 콜레스테롤 (이하, sdLDL-C 로 약기한다) 의 반응을 우선적으로 억제하는 계면 활성제 (이하, 그 계면 활성제를 계면 활성제 A 로 약기한다), 콜레스테롤에스테르 가수 분해 효소, 콜레스테롤 산화 효소 및 과산화수소 제거 시약을 함유하는 제 1 시약과, (b) 계면 활성제 A 공존하에서 sdLDL-C 의, 콜레스테롤에스테르 가수 분해 효소 및 콜레스테롤 산화 효소 혹은 콜레스테롤 탈수소 효소-산화형 조효소에 의한 반응을 일으키는 시약 및 과산화수소 측정 시약을 함유하는 제 2 시약을 함유하는 것을 특징으로 하는 검체 중의 sdLDL-C 정량용 키트.
[7] (a) 콜레스테롤에스테르 가수 분해 효소 및 콜레스테롤 산화 효소 혹은 콜레스테롤 탈수소 효소-산화형 조효소에 의한 고밀도 리포단백질 중의 콜레스테롤, 초저밀도 리포단백질 중의 콜레스테롤, 카일로마이크론 중의 콜레스테롤 및 대입자 저밀도 리포단백질 중의 콜레스테롤의 반응과 비교하여, 그 콜레스테롤에스테르 가수 분해 효소 및 그 콜레스테롤 산화 효소 혹은 그 콜레스테롤 탈수소 효소-그 산화형 조효소에 의한 소입자 저밀도 리포단백질 중의 콜레스테롤 (이하, sdLDL-C 로 약기한다) 의 반응을 우선적으로 억제하는 계면 활성제 (이하, 그 계면 활성제를 계면 활성제 A 로 약기한다), 콜레스테롤에스테르 가수 분해 효소, 산화형 조효소 및 콜레스테롤 탈수소 효소를 함유하는 제 1 시약과, (b) 계면 활성제 A 공존하에서 sdLDL-C 의, 콜레스테롤에스테르 가수 분해 효소 및 콜레스테롤 산화 효소 혹은 콜레스테롤 탈수소 효소-산화형 조효소에 의한 반응을 일으키는 시약을 함유하는 제 2 시약을 함유하는 것을 특징으로 하는 검체 중의 sdLDL-C 정량용 키트.
[8] 계면 활성제 A 공존하에서 sdLDL-C 의, 콜레스테롤에스테르 가수 분해 효소 및 콜레스테롤 산화 효소 혹은 콜레스테롤 탈수소 효소-산화형 조효소에 의한 반응을 일으키는 시약이, sdLDL-C 의, 콜레스테롤에스테르 가수 분해 효소 및 콜레스테롤 산화 효소 혹은 콜레스테롤 탈수소 효소-그 산화형 조효소에 의한 반응의 억제를 해제하는 계면 활성제 (이하, 그 계면 활성제를 계면 활성제 B 로 약기한다) 인 [6] 또는 [7] 에 기재된 키트.
[9] 계면 활성제 A 가, 폴리옥시에틸렌알킬아민, 아민옥사이드류, 알킬베타인, 알킬암모니오-1-프로판술폰산염, 산아미드알킬베타인, 폴리옥시에틸렌벤질-알킬4급암모늄염, 폴리옥시에틸렌지방산아미드, 폴리옥시에틸렌 다고리 페닐에테르황산에스테르염, 폴리옥시에틸렌알킬페닐에테르황산에스테르염, 폴리옥시에틸렌지방산아미드황산에스테르염, 폴리옥시에틸렌알킬아민황산에스테르염, N-아실타우린염, N-아실아미노산염, 에틸렌디아민-폴리옥시에틸렌폴리옥시프로필렌 축합물, 폴리에틸렌글리콜을 함유하지 않는 폴리프로필렌글리콜 유도체, 일반식 (I)
[화학식 3]
Figure 112009021032562-pct00003
(식 중, a, b 및 c 는 동일하거나 상이하고, 1 ∼ 200 의 정수를 나타낸다) 로 나타내는 폴리옥시에틸렌폴리옥시프로필렌 축합물 및 폴리옥시에틸렌폴리옥시알킬렌알킬에테르 (그 알킬은 탄소수 9 이하의 알킬) 로 이루어지는 군에서 선택되는 계면 활성제인 [6] ∼ [8] 중 어느 하나에 기재된 키트.
[10] 계면 활성제 B 가, 폴리옥시에틸렌알킬에테르, 폴리옥시에틸렌폴리옥시알킬렌알킬에테르 (그 알킬은 탄소수 10 이상의 알킬), 폴리옥시에틸렌알킬페닐에테르, 폴리옥시에틸렌폴리옥시알킬렌알킬페닐에테르, 폴리옥시에틸렌 다고리 페닐에테르, 폴리옥시에틸렌폴리옥시알킬렌 다고리 페닐에테르, 일반식 (II)
[화학식 4]
Figure 112009021032562-pct00004
(식 중, d, e 및 f 는 동일하거나 상이하고, 1 ∼ 200 의 정수를 나타낸다) 로 나타내는 폴리옥시에틸렌폴리옥시프로필렌 축합물 및 폴리옥시에틸렌폴리옥시알킬렌알킬아민으로 이루어지는 군에서 선택되는 계면 활성제인 [6] ∼ [9] 중 어느 하나에 기재된 키트.
[11] 적어도 제 1 시약에 알부민을 함유하는 [6] ∼ [10] 중 어느 하나에 기재된 키트.
[12] 제 3 시약으로서, 이미 알려진 농도의 sdLDL 을 함유하는 표준품을 함유하는 [6] ∼ [11] 중 어느 하나에 기재된 키트.
발명의 효과
본 발명에 의해, 간편하고 또한 정확하게 검체 중의 sdLDL-C 를 정량할 수 있는 방법 및 키트가 제공된다.
발명을 실시하기 위한 최선의 형태
HDL-C, VLDL-C 및 CM-C 란, 각각 HDL, VLDL 및 CM 중의 유리형 콜레스테롤과 에스테르형 콜레스테롤을 합한 것을 의미한다.
본 발명의 측정 방법에 있어서 이용되는 검체로는, 예를 들어 전혈, 혈장, 혈청, 골수액, 타액, 양수, 소변, 땀, 췌장액 등을 들 수 있는데, 혈장 및 혈청이 바람직하다.
본 발명에 있어서의 콜레스테롤에스테르 가수 분해 효소로는, 콜레스테롤에스테르를 가수 분해하는 능력을 갖는 효소이면 특별히 한정은 없고, 예를 들어 동물, 식물 또는 미생물 유래의 콜레스테롤에스테라아제, 리포프로테인리파아제 외에, 유전자 공학적인 수법에 의해 제조되는 콜레스테롤에스테라아제, 리포프로테인리파아제 등도 사용할 수 있다.
콜레스테롤에스테르 가수 분해 효소로는, 무수식(無修飾)의 콜레스테롤에스테르 가수 분해 효소나, 화학적으로 수식된 콜레스테롤에스테르 가수 분해 효소도 사용할 수 있다. 또한, 콜레스테롤에스테르 가수 분해 효소로는 시판품을 사용할 수도 있다.
시판되고 있는 콜레스테롤에스테르 가수 분해 효소로는, 콜레스테롤에스테라아제 "Amano"2 (CHE2 ; 아마노 엔자임사 제조), 콜레스테롤에스테라아제 "Amano"3 (CHE3 ; 아마노 엔자임사 제조), 리포프로테인리파아제 "Amano"3 (LPL3 ; 아마노 엔자임사 제조), 리포프로테인리파아제 (LPL-311 ; 토요 방적사 제조), 리포프로테인리파아제 (LPL-312 ; 토요 방적사 제조), 콜레스테롤에스테라아제 (COE-301 ; 토요 방적사 제조), 리포프로테인리파아제 (LPBP ; 아사히 화성사 제조), 콜레스테롤에스테라아제 (CEBP-M ; 아사히 화성사 제조), 콜레스테롤에스테라아제 (CEN ; 아사히 화성사 제조), 리파아제 (LP ; 아사히 화성사 제조), 리파아제 (LPM ; 아사히 화성사 제조), 리파아제 (LPAP ; 아사히 화성사 제조), 리파아제 (LIPS ; 아사히 화성사 제조), 콜레스테롤에스테라아제 (CHE-BE ; 키코망사 제조) 등을 들 수 있다. 또한 본 발명에 있어서는, 2 종류 이상의 콜레스테롤에스테르 가수 분해 효소를 조합하여 사용할 수도 있다.
화학적으로 수식된 콜레스테롤에스테르 가수 분해 효소에 있어서, 콜레스테롤에스테르 가수 분해 효소를 수식하는 기 (화학 수식기) 로는, 예를 들어 폴리에틸렌글리콜을 주성분으로 하는 기, 폴리프로필렌글리콜을 주성분으로 하는 기, 폴리프로필렌글리콜과 폴리에틸렌글리콜의 공중합체를 갖는 기, 수용성 다당류를 함유하는 기, 술포프로필기, 술포부틸기, 폴리우레탄기, 킬레이트 기능을 갖는 기 등을 들 수 있는데, 폴리에틸렌글리콜을 주성분으로 하는 기가 바람직하다. 수용 성 다당류로는, 예를 들어 덱스트란, 풀루란, 가용성 전분 등을 들 수 있다.
콜레스테롤에스테르 가수 분해 효소를 화학적으로 수식하기 위한 시약 (화학 수식제) 으로는, 상기 화학 수식기와, 효소의 아미노기, 카르복실기, 술프히드릴기 등과 반응할 수 있는 관능기 또는 구조를 겸비하는 화합물 등을 들 수 있다. 효소 중의 아미노기와 반응할 수 있는 관능기 또는 구조로는, 예를 들어 카르복실기, 활성 에스테르기 (N-히드록시숙신이미드기 등), 산 무수물, 산 염화물, 알데히드, 에폭사이드기, 1,3-프로판술톤, 1,4-부탄술톤 등을 들 수 있다. 효소 중의 카르복실기와 반응할 수 있는 관능기 또는 구조로는, 예를 들어 아미노기 등을 들 수 있다. 효소 중의 술프히드릴기와 반응할 수 있는 기 또는 구조로는, 예를 들어 말레이미드기, 디술파이드, α-할로에스테르 (α-요오드에스테르 등) 등을 들 수 있다.
화학 수식제로서, 시판품을 사용할 수도 있다. 시판되고 있는 화학 수식제로는, 폴리에틸렌글리콜을 주성분으로 하는 기와 N-히드록시숙신이미드기를 갖는 선브라이트 VFM-4101, 선브라이트 ME-050AS, 선브라이트 DE-030AS (모두 닛폰 유지사 제조), 폴리에틸렌글리콜이나 폴리프로필렌글리콜 등의 폴리알킬렌글리콜을 주성분으로 하는 기와 산 무수물 구조를 갖는 선브라이트 AKM 시리즈 (예를 들어 선브라이트 AKM-1510 등), 선브라이트 ADM 시리즈, 선브라이트 ACM 시리즈 (모두 닛폰 유지사 제조), 폴리에틸렌글리콜을 주성분으로 하는 기와 에폭사이드기를 갖는 EPOX-3400, M-EPOX-5000 (모두 Sheawater Polymers 사 제조), 킬레이트 기능을 갖는 기와 산 무수물 구조를 갖는 디에틸렌트리아민-N,N,N',N'',N''-펜타 무수 2아세 트산 (DTPA anhydride ; 도진 화학 연구소사 제조) 등을 들 수 있다.
콜레스테롤에스테르 가수 분해 효소의 화학 수식은, 예를 들어 이하의 방법으로 실시할 수 있으나, 본 방법으로 한정되는 것은 아니다. 먼저, 콜레스테롤에스테르 가수 분해 효소를 pH 8.0 이상의 완충액 {예를 들어 2-[4-(2-히드록시에틸)-1-피페라지닐]에탄술폰산 (HEPES) 완충액} 에 용해시키고, 0 ∼ 55℃ 에서 0.01 ∼ 500 배 몰량의 화학 수식제를 첨가하여, 5 분간 ∼ 5 시간 교반한다. 실제 효소 반응에 있어서는, 화학적으로 수식된 콜레스테롤에스테르 가수 분해 효소로서, 이 반응액 그 자체뿐만 아니라, 필요에 따라 한외 여과막 등에 의해 미반응의 화학 수식제 등을 제거한 것도 사용할 수도 있다.
본 반응의 방법에 사용되는 콜레스테롤에스테르 가수 분해 효소의 농도로는 본 발명의 sdLDL-C 의 정량을 가능하게 하는 농도이면 특별히 제한은 없으나, 반응액 중에서 0.001 ∼ 2000U/㎖ 의 농도인 것이 바람직하고, 0.005 ∼ 1000U/㎖ 인 것이 보다 바람직하다.
본 발명에 있어서의 콜레스테롤 산화 효소로는, 콜레스테롤을 산화시켜 과산화수소를 생성하는 능력을 갖는 효소이면 특별히 제한은 없고, 예를 들어 동물, 식물 또는 미생물 유래의 콜레스테롤옥시다아제 외에, 유전자 공학적인 수법에 의해 제조되는 콜레스테롤옥시다아제 등도 사용할 수 있고, 콜레스테롤옥시다아제 "Amano"1 (CHOD1 ; 아마노 엔자임사 제조), 콜레스테롤옥시다아제 (CHO-PEL ; 키코망사 제조), 콜레스테롤옥시다아제 (CHO-PEWL ; 키코망사 제조), 콜레스테롤옥시다아제 (CHO-CE ; 키코망사 제조), 콜레스테롤옥시다아제 (COO321 ; 토요 방적사 제 조), 콜레스테롤옥시다아제 (COO-322 ; 토요 방적사 제조) 등의 시판품을 사용할 수도 있다. 또한 본 발명에 있어서는, 2 종류 이상의 콜레스테롤 산화 효소를 조합하여 사용할 수도 있다.
콜레스테롤 산화 효소는 무수식의 효소이어도 되고, 화학적으로 수식된 효소이어도 된다. 화학적으로 수식된 콜레스테롤 산화 효소는, 예를 들어 전술한 화학 수식제를 사용하여 전술한 화학 수식 방법에 의해 제조할 수 있다.
본 반응의 방법에 사용되는 콜레스테롤 산화 효소의 농도로는, 본 발명의 sdLDL-C 의 정량을 가능하게 하는 농도이면 특별히 제한은 없으나, 반응액 중에서 0.001 ∼ 2000U/㎖ 의 농도인 것이 바람직하고, 0.005 ∼ 1000U/㎖ 의 농도인 것이 보다 바람직하다.
본 발명에 있어서의 콜레스테롤 탈수소 효소로는, 산화형 조효소의 존재하에 콜레스테롤을 산화시켜 환원형 조효소를 생성하는 능력을 갖는 효소이면 특별히 제한은 없고, 예를 들어 동물, 식물 또는 미생물 유래의 콜레스테롤디히드로게나아제 외에, 유전자 공학적인 수법에 의해 제조되는 콜레스테롤디히드로게나아제 등도 사용할 수 있다. 콜레스테롤디히드로게나아제 "Amano"5 (CHDH5 ; 아마노 엔자임사 제조) 등의 시판품을 사용할 수도 있다. 또한 본 발명에 있어서는, 2 종류 이상의 콜레스테롤 탈수소 효소를 조합하여 사용할 수도 있다.
콜레스테롤 탈수소 효소는 무수식의 효소이어도 되고, 화학적으로 수식된 효소이어도 된다. 화학적으로 수식된 콜레스테롤 탈수소 효소는, 예를 들어 전술한 화학 수식제를 사용하여 전술한 화학 수식 방법에 의해 제조할 수 있다.
본 반응의 방법에 사용되는 콜레스테롤 탈수소 효소의 농도로는, 본 발명의 sdLDL-C 의 정량을 가능하게 하는 농도이면 특별히 제한은 없으나, 반응액 중에서 0.001 ∼ 2000U/㎖ 의 농도인 것이 바람직하고, 0.005 ∼ 1000U/㎖ 의 농도인 것이 보다 바람직하다.
콜레스테롤 탈수소 효소를 이용한 정량에 있어서 사용되는 산화형 조효소로는, 예를 들어 NAD(P)+, thio-NAD(P)+ 등을 들 수 있다. 산화형 조효소 공존하에서의 콜레스테롤 탈수소 효소와 리포단백질 중의 콜레스테롤의 반응에 의해 생성되는 환원형 조효소로는, 예를 들어 NAD(P)H, thio-NAD(P)H 등을 들 수 있다.
본 발명의 방법에 사용되는 산화형 조효소의 농도로는, 본 발명의 sdLDL-C 의 정량을 가능하게 하는 농도이면 특별히 제한은 없으나, 반응액 중에서 0.01 ∼ 400mmol/ℓ 의 농도인 것이 바람직하고, 0.1 ∼ 100mmol/ℓ 의 농도인 것이 보다 바람직하다.
본 발명의 sdLDL-C 의 정량 방법에 있어서는, 환원형 조효소 산화 효소도 사용할 수 있다. 여기서, 환원형 조효소 산화 효소는 콜레스테롤 탈수소 효소, 산화형 조효소와 함께 사용되고, 산화형 조효소 공존하에서의 콜레스테롤 탈수소 효소와 리포단백질 중의 콜레스테롤의 반응에 의해 생성된 환원형 조효소를 과산화수소로 변환시킨다. 환원형 조효소 산화 효소로는, 예를 들어 NAD(P)H 산화 효소 등을 들 수 있다. 환원형 조효소 산화 효소로는, 시판품을 사용할 수도 있다. 시판되고 있는 환원형 조효소 산화 효소로는, NADH Oxidase (코스모·바이 오사 제조) 등을 들 수 있다.
본 발명의 방법에 사용되는 환원형 조효소 산화 효소의 농도로는, 본 발명의 sdLDL-C 의 정량을 가능하게 하는 농도이면 특별히 제한은 없으나, 반응액 중에서 0.01 ∼ 400U/㎖ 의 농도인 것이 바람직하고, 0.02 ∼ 200U/㎖ 의 농도인 것이 보다 바람직하다.
본 발명에 있어서 사용되는 알부민으로는, 본 발명의 sdLDL-C 의 정량을 가능하게 하는 알부민이면 특별히 한정은 없고, 예를 들어 소, 말, 양, 인간 유래의 알부민 등을 들 수 있는데, 소 혈청 알부민 (BSA) 이 바람직하다. 또한, 유전자 공학적인 수법에 의해 제조된 알부민도 사용할 수 있다. 본 발명에 있어서는, 2 종류 이상의 알부민을 조합하여 사용할 수도 있다. 본 발명의 sdLDL-C 의 정량에 있어서의 알부민의 농도로는, 본 발명의 sdLDL-C 의 정량을 가능하게 하는 농도이면 특별히 제한은 없으나, 반응액 중의 농도가 0.001 ∼ 10% 인 것이 바람직하고, 0.01 ∼ 5% 가 보다 바람직하다.
본 발명에 있어서의 계면 활성제 A 는, 콜레스테롤에스테르 가수 분해 효소 및 콜레스테롤 산화 효소 혹은 콜레스테롤 탈수소 효소-산화형 조효소에 의한 sdLDL-C 의 반응을 억제하고, LgLDL-C 를 반응시키는 성질을 갖는다. 구체적으로는, 콜레스테롤에스테르 가수 분해 효소 및 콜레스테롤 산화 효소 혹은 콜레스테롤 탈수소 효소-산화형 조효소에 의한 HDL-C, VLDL-C, CM-C 및 LgLDL-C 의 반응과 비교하여, 그 콜레스테롤에스테르 가수 분해 효소 및 그 콜레스테롤 산화 효소 혹은 그 콜레스테롤 탈수소 효소-산화형 조효소에 의한 sdLDL-C 의 반응을 우선적으 로 억제하는 계면 활성제이고, 공정 (i) 에 있어서 sdLDL-C 이외의, 즉 HDL-C, VLDL-C, CM-C 및 LgLDL-C 의 제거에 사용되는 계면 활성제이다. 이하, HDL-C, VLDL-C, CM-C 및 LgLDL-C 를 총칭하여, sdLDL 이외의 리포단백질 중의 콜레스테롤로 표기하는 경우가 있다.
계면 활성제 A 로는, 예를 들어 폴리옥시에틸렌알킬아민 (이하, POE 알킬아민으로 약기한다), 아민옥사이드류, 알킬베타인, 알킬암모니오-1-프로판술폰산염, 산아미드알킬베타인, 폴리옥시에틸렌벤질-알킬4급암모늄염 (이하, POE 벤질-알킬4급암모늄염으로 약기한다), 폴리옥시에틸렌지방산아미드 (이하, POE 지방산아미드로 약기한다), 폴리옥시에틸렌 다고리 페닐에테르황산에스테르염 (이하, POE 다고리 페닐에테르황산에스테르염으로 약기한다), 폴리옥시에틸렌알킬페닐에테르황산에스테르염 (이하, POE 알킬페닐에테르황산에스테르염으로 약기한다), 폴리옥시에틸렌지방산아미드황산에스테르염 (이하, POE 지방산아미드황산에스테르염으로 약기한다), 폴리옥시에틸렌알킬아민황산에스테르염 (이하, POE 알킬아민황산에스테르염으로 약기한다), N-아실타우린염, N-아실아미노산염, 에틸렌디아민-폴리옥시에틸렌폴리옥시프로필렌 축합물 (이하, 에틸렌디아민-POE·POP 축합물로 약기한다), 폴리에틸렌글리콜을 함유하지 않는 폴리프로필렌글리콜 유도체 (이하, PPG 유도체로 약기한다), 일반식 (I)
[화학식 5]
Figure 112009021032562-pct00005
(식 중, a, b 및 c 는 동일하거나 상이하고, 1 ∼ 200 의 정수를 나타낸다) 로 나타내는 폴리옥시에틸렌폴리옥시프로필렌 축합물 (이하, POE·POP 축합물로 약기한다) 및 폴리옥시에틸렌폴리옥시알킬렌알킬에테르 (그 알킬은 탄소수 9 이하의 알킬) (이하, C9 이하의 POE·POA 알킬에테르로 약기한다) 등을 들 수 있다.
POE 알킬아민, 알킬베타인, 알킬암모니오-1-프로판술폰산염, 산아미드알킬베타인, POE 알킬페닐에테르황산에스테르염, POE 알킬아민황산에스테르염에 있어서의 알킬로는, 탄소수 1 ∼ 30 의, 예를 들어 메틸, 에틸, 프로필, 부틸, 펜틸, 헥실, 헵틸, 옥틸, 노닐, 데실, 운데실, 도데실 (라우릴), 트리데실, 테트라데실 (미리스틸), 펜타데실, 헥사데실 (세틸), 헵타데실, 옥타데실 (스테아릴), 노나데실, 이코실, 헤네이코실, 도코실 (베헤닐), 트리코실, 테트라코실, 펜타코실, 헥사코실, 헵타코실, 옥타코실, 노나코실, 트리아콘틸 등을 들 수 있다.
POE 알킬아민의 시판품으로는, 파이오닌 D-3104, 파이오닌 D-3110, 파이오닌 D-3120 (이상, 타케모토 유지사 제조), 나이민 L-207 (이상, 닛폰 유지사 제조), BLAUNON L-205 (이상, 아오키 유지사 제조) 등을 들 수 있다.
아민옥사이드류로는, 예를 들어 알킬아민옥사이드, 폴리옥시에틸렌알킬아민옥사이드 (이하, POE 알킬아민옥사이드로 약기한다) 등을 들 수 있다. 알킬아민옥사이드, POE 알킬아민옥사이드에 있어서의 알킬로는, 예를 들어 치환 혹은 비치환의 탄소수 1 ∼ 30 의 알킬 등을 들 수 있다. 그 알킬로는 상기 알킬 등을 들 수 있다. 그 치환기로는, 예를 들어 수산기 등을 들 수 있다. 아민옥사이드류의 시판품으로는, 유니세이프 A-LE, 유니세이프 A-LM, 유니세이프 A-LY (이상, 닛폰 유지사 제조) 등을 들 수 있다.
알킬베타인의 시판품으로는, 닛산아논 BL, 닛산아논 BF (이상, 닛폰 유지사 제조), 안히톨 24B, 안히톨 86B (이상, 카오사 제조) 등을 들 수 있다.
알킬암모니오-1-프로판술폰산염의 시판품으로는, ZWITTERGENT3-10, ZWITTERGENT3-12 (이상, CALBIOCHEM 사 제조) 등을 들 수 있다.
산아미드알킬베타인의 시판품으로는, 아논 BDF-SF (닛폰 유지사 제조) 등을 들 수 있다.
POE 벤질-알킬4급암모늄염의 시판품으로는, 비스놀 SK (입포샤사 제조) 등을 들 수 있다.
POE 지방산아미드의 시판품으로는, 나이미드 MT-215 (닛폰 유지사 제조), 닛콜 TAMDS15 (닛코 케미컬즈사 제조) 등을 들 수 있다.
POE 다고리 페닐에테르황산에스테르염에 있어서의 다고리 페닐로는, 기 내에 1 개의 방향고리를 갖는 기 (치환기) 가 2 개 이상 치환된 페닐기, 기 내에 2 개 이상의 방향고리를 갖는 기 (치환기) 가 1 개 또는 복수 치환된 페닐기 등을 들 수 있다. 기 내에 1 개의 방향고리를 갖는 기로는, 예를 들어 벤질, 1-(페닐)에틸 등을 들 수 있다. 기 내에 2 개 이상의 방향고리를 갖는 기로는, 예를 들어 나프틸 등을 들 수 있다. POE 다고리 페닐에테르황산에스테르염의 시판품으로는, 뉴콜 707-SF, 뉴콜 707-SFC, 뉴콜 707-SN, 뉴콜 723-SF (이상, 닛폰 유화제사 제조) 등을 들 수 있다.
POE 알킬페닐에테르황산에스테르염의 시판품으로는, 하이테놀 N-07, 하이테놀 N-08, 하이테놀 N-17 (이상, 다이이치 공업 약품사 제조) 등을 들 수 있다.
POE 지방산아미드황산에스테르염의 시판품으로는, 산아미드 CF-3, 산아미드 CF-10 (이상, 닛폰 유지사 제조) 등을 들 수 있다.
POE 알킬아민황산에스테르염의 시판품으로는, 미그놀 PA-30 (입포샤사 제조) 등을 들 수 있다.
N-아실타우린염의 시판품으로는, 닛콜 CMT-30, 닛콜 PMT (이상, 닛코 케미컬즈사 제조), 다이아폰 T 페이스트, 다이아폰 T 파우더, 다이아폰 K, 다이아폰 LM, 다이아폰 K-MG (이상, 닛폰 유지사 제조) 등을 들 수 있다.
N-아실아미노산염에 있어서의 아미노산으로는 사르코신, 알라닌 등을 들 수 있다. N-아실아미노산염의 시판품으로는, 사르코시네이트 LN-30, 사르코시네이트 CN-30, 사르코시네이트 LK-30, 알라니네이트 LN-30 (이상, 닛코 케미컬즈사 제조), 필렛 L (닛폰 유지사 제조) 등을 들 수 있다.
에틸렌디아민-POE·POP 축합물의 시판품으로는, 아데카플루로닉 TR-701, 아데카플루로닉 TR-702, 아데카플루로닉 TR-704, 아데카플루로닉 TR-913R (이상, 아사히 전화사 제조), 유니루브 32TY-65BI (닛폰 유지사 제조) 등을 들 수 있다.
폴리에틸렌글리콜을 함유하지 않는 PPG 유도체로는, 폴리프로필렌글리콜 (이하, PPG 로 약기한다), 폴리옥시프로필렌알킬에테르 (이하, POP 알킬에테르로 약기한다) 등을 들 수 있다. PPG 로는, 예를 들어 분자량 1200 이하의 PPG 가 바람직하다. 분자량 1200 이하의 PPG 의 시판품으로는, 유니올 D-700 (닛폰 유지사 제조), 뉴폴 PP-400 (산요 화성사 제조) 등을 들 수 있다. POP 알킬에테르의 시판품으로는, 유니루브 MB-2 (닛폰 유지사 제조) 등을 들 수 있다.
일반식 (I)
[화학식 6]
Figure 112009021032562-pct00006
(식 중, a, b 및 c 는 동일하거나 상이하고, 1 ∼ 200 의 정수를 나타낸다) 으로 나타내는 POE·POP 축합물의 시판품으로는, 플루로닉 25R-1, 플루로닉 25R-2 (이상, 아사히 전화사 제조), BLAUNON EP-0480, BLAUNON EP-0670, BLAUNON EP-1461 (이상, 아오키 유지사 제조) 등을 들 수 있다.
C9 이하의 POE·POP 알킬에테르에 있어서의 알킬로는, 예를 들어 메틸, 에틸, 프로필, 부틸, 펜틸, 헥실, 헵틸, 옥틸, 노닐 등을 들 수 있다. C9 이하의 POE·POP 알킬에테르의 시판품으로는, 유니루브 50MB-26, 유니루브 50MB-72 (이상, 닛폰 유지사 제조) 등을 들 수 있다.
본 발명에 있어서는, 계면 활성제 A 는 1 종뿐만 아니라 2 종 이상을 조합하여 사용해도 된다.
본 출원에 의해, 콜레스테롤에스테르 가수 분해 효소 및 콜레스테롤 산화 효소 혹은 콜레스테롤 탈수소 효소-산화형 조효소에 의한 sdLDL 중의 콜레스테롤의 반응을 억제하고, LgLDL 중의 콜레스테롤을 반응시키는 작용을 나타내는 계면 활성제가 존재하는 것이 개시되어 있어, 당업자는 상기에 예시한 것 이외에도 하기의 판정에 의해 용이하게 본 발명의 계면 활성제 A 의 구체예를 파악하여 선택할 수 있다. 그 방법에 의해 선택되는 계면 활성제도 본원 발명의 계면 활성제 A 에 포함된다.
계면 활성제 A 의 판정은, 예를 들어 이하에 기재된 방법으로 실시할 수 있다.
1) 리포단백질 분획의 분리
혈청 중의 HDL, VLDL, CM, LgLDL, sdLDL 의 각 분획을 비중에 따라 분리 정제한다. 구체적으로는 「신생 화학 실험 강좌 4」(토쿄 화학 동인) 에 기재된 초원심법에 따라, 인간 혈청으로부터 HDL (비중 1.063 이상), sdLDL (비중 1.044 ∼ 1.063), LgLDL (비중 1.006 ∼ 1.044), VLDL 및 CM (비중 1.006 이하) 의 4 개의 리포단백질 분획을 분취한다.
2) 계면 활성제 A 의 판정용 시약
예 1
완충액, 예를 들어 MOPS (pH 7.0)
콜레스테롤에스테르 가수 분해 효소, 예를 들어 LPL3
콜레스테롤 산화 효소, 예를 들어 CHO-PEL
과산화수소 측정 시약, 예를 들어 퍼옥시다아제, N-에틸-N-(3-메틸페닐)-N'-숙시닐에틸렌디아민 (EMSE) 및 4-아미노안티피린 (4-AA)
검토해야 할 계면 활성제
예 2
완충액, 예를 들어 MOPS (pH 7.0)
콜레스테롤에스테르 가수 분해 효소, 예를 들어 LPL3
콜레스테롤 탈수소 효소, 예를 들어 CHDH5
산화형 조효소, 예를 들어 NAD
[필요에 따라 환원형 조효소 측정 시약, 예를 들어 2-(4-요오드페닐)-3-(2,4-디니트로페닐)-5-(2,4-디술포페닐)-2H-테트라졸륨모노나트륨염 (WST-3)]
검토해야 할 계면 활성제
예 3
완충액, 예를 들어 MOPS (pH 7.0)
콜레스테롤에스테르 가수 분해 효소, 예를 들어 LPL3
콜레스테롤 탈수소 효소, 예를 들어 CHDH5
산화형 조효소, 예를 들어 NAD
환원형 조효소 산화 효소, 예를 들어 NADH oxidase
과산화수소 측정 시약, 예를 들어 퍼옥시다아제, EMSE 및 4-AA
검토해야 할 계면 활성제
또한 상기 각 시약에는 필요에 따라 후술하는 수성 매체, 안정화제, 방부제, 영향 물질 소거제, 반응 촉진제 등을 함유시킬 수도 있다.
3) 계면 활성제 A 판정 방법
각 리포단백질 분획을 검체로 하여 반응 셀에 (2㎕) 첨가하고, 이어서 상기 2) 에 기재한 시약 (0.15㎖) 을 첨가하여 반응을 개시시키고, 37℃ 에서 5 분간 가온시켜, 반응액의 흡광도가 직선적으로 증가하는 시간, 예를 들어 반응 5 분 후의 반응액의 흡광도 변화 (ΔE리포단백질 분획) 를 측정한다.
각 리포단백질 분획 대신에 생리 식염수를 검체로서 사용하여, 동일한 측정을 실시하고, 흡광도 변화 (ΔE블랭크) 를 산출하여, 각 리포단백질 분획에 있어서의 「반응 흡광도 1」을 하기 (식 1) 에 의해 산출한다.
Figure 112009021032562-pct00007
각 리포단백질 분획에 대해, 히타치 7170S 형 자동 분석 장치를 사용하고, 총 콜레스테롤 정량용 키트인 데타미나 C TC (쿄와 메덱스사 제조) 를 사용하여, 동일하게 하여 「반응 흡광도 2」를 산출한다.
이어서, 각 리포단백질 분획의 반응률을 하기 (식 2) 로부터 산출한다.
Figure 112009021032562-pct00008
sdLDL 분획에 있어서의 반응률이 낮고, LgLDL 분획에 있어서의 반응률이 높은 계면 활성제를 선택하고, 바람직하게는 sdLDL 분획에 있어서의 반응률이 낮고, HDL, VLDL, CM 및 LgLDL 분획에 있어서의 반응률이 높은 계면 활성제를 계면 활성제 A 로서 선택한다.
콜레스테롤에스테르 가수 분해 효소 및 콜레스테롤 산화 효소 혹은 콜레스테롤 탈수소 효소-산화형 조효소에 의한 HDL-C, VLDL-C, CM-C 및 LgLDL-C 의 반응과 비교하여, 그 콜레스테롤에스테르 가수 분해 효소 및 그 콜레스테롤 산화 효소 혹 은 그 콜레스테롤 탈수소 효소-그 산화형 조효소에 의한 sdLDL-C 의 반응을 우선적으로 억제한다는 것은, HDL, VLDL, CM 및 LgLDL 의 각 분획 중의 콜레스테롤 반응률에 대한 sdLDL 분획 중의 콜레스테롤 반응률이 작은 것을 말하고, HDL, VLDL, CM 및 LgLDL 의 각 분획 중의 콜레스테롤 반응률에 대한 sdLDL 분획 중의 콜레스테롤 반응률의 비율이 바람직하게는 50% 이하이고, 보다 바람직하게는 20% 이하이고, 특히 바람직하게는 10% 이하이다.
또한, 사용하는 효소의 종류 및 농도 등의 반응 조건이 상이하면 계면 활성제의 반응성이 상이한 경우도 있으나, 설정한 조건에 의해 검토 대상의 계면 활성제를 본 발명에 계면 활성제 A 로서 사용할 수 있는지의 여부를 판단할 수 있다.
본 발명의 sdLDL-C 의 정량 방법에 있어서의 계면 활성제 A 의 농도는, 바람직하게는 sdLDL 이외의 리포단백질, 즉 HDL, VLDL, CM 및 LgLDL 중의 콜레스테롤을 우선적으로 제거할 수 있는 농도로서, 반응액 중에서의 농도가 0.0001 ∼ 1% 인 것이 바람직하고, 0.0005 ∼ 0.5% 인 것이 보다 바람직하다.
본 발명에 있어서의 sdLDL-C 의 반응을 일으키는 시약은, 검체와 콜레스테롤에스테르 가수 분해 효소 및 콜레스테롤 산화 효소 혹은 콜레스테롤 탈수소 효소-산화형 조효소를 계면 활성제 A 의 존재하에 반응시켜, sdLDL 이외의 리포단백질 중의 콜레스테롤을 제거한 후의 반응액 중에 잔존하는 sdLDL-C 의, 콜레스테롤에스테르 가수 분해 효소 및 콜레스테롤 산화 효소 혹은 콜레스테롤 탈수소 효소-산화형 조효소에 의한 반응을 가능하게 하는 시약이다. 구체적으로는, 계면 활성제 A 의 존재하에서의, sdLDL 이외의 리포단백질 중의 콜레스테롤을 제거하는 데에 사 용한 콜레스테롤에스테르 가수 분해 효소 및 콜레스테롤 산화 효소 혹은 콜레스테롤 탈수소 효소-산화형 조효소에 의한 sdLDL-C 의 반응 억제를 해제하는 계면 활성제 (이하, 그 계면 활성제를 계면 활성제 B 로 약기한다) 및 계면 활성제 A 의 존재하에 sdLDL-C 와의 반응을 가능하게 하는 효소 등을 들 수 있다.
본 발명에 있어서의 계면 활성제 B 로는, 예를 들어 폴리옥시에틸렌알킬에테르 (이하, POE 알킬에테르로 약기한다), 폴리옥시에틸렌폴리옥시알킬렌알킬에테르 (그 알킬은 탄소수 10 이상의 알킬) (이하, C10 이상의 POE·POA 알킬에테르로 약기한다), 폴리옥시에틸렌알킬페닐에테르 (이하, POE 알킬페닐에테르로 약기한다), 폴리옥시에틸렌폴리옥시알킬렌알킬페닐에테르 (이하, POE·POA 알킬페닐에테르로 약기한다), 폴리옥시에틸렌 다고리 페닐에테르 (이하, POE 다고리 페닐에테르로 약기한다), 폴리옥시에틸렌폴리옥시알킬렌 다고리 페닐에테르 (이하, POE·POA 다고리 페닐에테르로 약기한다), 일반식 (II)
[화학식 7]
Figure 112009021032562-pct00009
(식 중, d, e 및 f 는 동일하거나 상이하고, 1 ∼ 200 의 정수를 나타낸다) 로 나타내는 폴리옥시에틸렌폴리옥시프로필렌 축합물 (이하, POE·POP 축합물로 약기한다) 및 폴리옥시에틸렌폴리옥시알킬렌알킬아민 (이하 POE·POA 알킬아민으로 약기한다) 등을 들 수 있다.
POE 알킬에테르로는, HLB 가 15.0 미만인 POE 알킬에테르 (그 알킬은 탄소수 20 이하의 알킬) 가 바람직하다. HLB 가 15.0 미만인 POE 알킬에테르 (그 알킬 은 탄소수 20 이하의 알킬) 에 있어서의 알킬로는, 예를 들어 메틸, 에틸, 프로필, 부틸, 펜틸, 헥실, 헵틸, 옥틸, 노닐, 데실, 이소데실, 운데실, 도데실 (라우릴), 트리데실, 테트라데실 (미리스틸), 펜타데실, 헥사데실 (세틸), 헥시데실, 헵타데실, 옥타데실 (스테아릴), 노나데실, 이코실, 옥틸도데실 등을 들 수 있다. HLB 가 15.0 미만인 POE 알킬에테르 (그 알킬은 탄소수 20 이하의 알킬) 의 시판품으로는 모리놀 L-80 (HLB 13.1 ; 탄소수 12) (모린 화학사 제조), 에멀민 NL-80 (HLB 13.1 ; 탄소수 12), 에멀민 NL-90 (HLB 13.6 ; 탄소수 12), 에멀민 NL-100 (HLB 14.0 ; 탄소수 12), 에멀민 NL-110 (HLB 14.4 ; 탄소수 12) (이상, 산요 화성사 제조), 노이겐 TDS-80 (HLB 13.3 ; 탄소수 13), 노이겐 TDS-120 (HLB 14.8 ; 탄소수 13) (이상, 다이이치 공업 제약사 제조), EMALEX1615 (HLB 13.0 ; 탄소수 16), EMALEX1820 (HLB 14.0 ; 탄소수 18), EMALEX OD-16 (HLB 12.0 ; 탄소수 20) (이상, 니혼 에멀션사 제조) 등을 들 수 있다.
C10 이상의 POE·POA 알킬에테르로는, HLB 가 15.0 미만 또한 알킬의 탄소수가 10 이상 20 이하인 POE·POA 알킬에테르가 바람직하다. HLB 가 15.0 미만 또한 알킬의 탄소수가 10 이상 20 이하인 POE·POA 알킬에테르에 있어서의 알킬로는, 예를 들어 데실, 이소데실, 운데실, 도데실 (라우릴), 트리데실, 테트라데실 (미리스틸), 펜타데실, 헥사데실 (세틸), 헥시데실, 헵타데실, 옥타데실 (스테아릴), 노나데실, 이코실, 옥틸도데실 등을 들 수 있다. HLB 가 15.0 미만 또한 알킬의 탄소수가 10 이상 20 이하인 POE·POA 알킬에테르에 있어서의 폴리옥시알킬렌으로는, 폴리옥시에틸렌 이외의 예를 들어 폴리옥시프로필렌, 폴리옥시부틸렌 등 을 들 수 있다. HLB 가 15.0 미만 또한 알킬의 탄소수가 10 이상 20 이하인 POE·POA 알킬에테르의 시판품으로는, 예를 들어 원더서프 ID-50 (HLB 10.5 ; 탄소수 10), 원더서프 ID-70 (HLB 12.1 ; 탄소수 10), 원더서프 ID-90 (HLB 13.3 ; 탄소수 10), 원더서프 S-800 (HLB 12.3 ; 탄소수 13), 원더서프 S-1000 (HLB 13.2 ; 탄소수 13), 원더서프 S-1400 (HLB 14.4 ; 탄소수 13) (이상, 아오키 유지사 제조) 등을 들 수 있다.
POE 알킬페닐에테르로는, HLB 가 16.0 미만인 POE 알킬페닐에테르가 바람직하다. HLB 가 16.0 미만인 POE 알킬페닐에테르에 있어서의 알킬로는, 탄소수 1 ∼ 30 의, 예를 들어 메틸, 에틸, 프로필, 부틸, 펜틸, 헥실, 헵틸, 옥틸, 노닐, 데실, 운데실, 도데실 (라우릴), 트리데실, 테트라데실 (미리스틸), 펜타데실, 헥사데실 (세틸), 헵타데실, 옥타데실 (스테아릴), 노나데실, 이코실, 헤네이코실, 도코실 (베헤닐), 트리코실, 테트라코실, 펜타코실, 헥사코실, 헵타코실, 옥타코실, 노나코실, 트리아콘틸 등을 들 수 있다. HLB 가 16.0 미만인 POE 알킬페닐에테르의 시판품으로는 노니온 NS-210 (HLB 13.3), 노니온 NS-212 (HLB 14.1), 노니온 NS-215 (HLB 15.0), 노니온 HS-210 (HLB 13.6) (이상, 닛폰 유지사 제조), 에멀겐 911 (HLB 13.7), 에멀겐 913 (HLB 14.5) (이상, 카오사 제조) 등을 들 수 있다.
POE·POA 알킬페닐에테르로는, HLB 가 16.0 미만인 POE·POA 알킬페닐에테르가 바람직하다. HLB 가 16.0 미만인 POE·POA 알킬페닐에테르에 있어서의 알킬로는, 탄소수 1 ∼ 30 의, 예를 들어 메틸, 에틸, 프로필, 부틸, 펜틸, 헥실, 헵 틸, 옥틸, 노닐, 데실, 운데실, 도데실 (라우릴), 트리데실, 테트라데실 (미리스틸), 펜타데실, 헥사데실 (세틸), 헵타데실, 옥타데실 (스테아릴), 노나데실, 이코실, 헤네이코실, 도코실 (베헤닐), 트리코실, 테트라코실, 펜타코실, 헥사코실, 헵타코실, 옥타코실, 노나코실, 트리아콘틸 등을 들 수 있다. HLB 가 16.0 미만인 POE·POA 알킬페닐에테르에 있어서의 폴리옥시알킬렌으로는, 폴리옥시에틸렌 이외의 예를 들어 폴리옥시프로필렌, 폴리옥시부틸렌 등을 들 수 있다. HLB 가 16.0 미만인 POE·POA 알킬페닐에테르의 시판품으로는, 아크로네세스 KP-189R, 디스파놀 LS-100 (이상, 닛폰 유지사 제조), 에멀겐 L-40 (카오사 제조) 등을 들 수 있다.
POE 다고리 페닐에테르로는, HLB 가 13.0 미만인 POE 다고리 페닐에테르가 바람직하다. HLB 가 13.0 미만인 POE 다고리 페닐에테르에 있어서의 다고리 페닐로는, 기 내에 1 개의 방향고리를 갖는 기 (치환기) 가 2 개 이상 치환된 페닐기, 기 내에 2 개 이상의 방향고리를 갖는 기 (치환기) 가 1 개 또는 복수 치환된 페닐기 등을 들 수 있다. 기 내에 1 개의 방향고리를 갖는 기로는, 예를 들어 벤질, 1-(페닐)에틸 등을 들 수 있다. 기 내에 2 이상의 방향고리를 갖는 기로는, 예를 들어 나프틸 등을 들 수 있다. HLB 가 13.0 미만인 POE 다고리 페닐에테르의 시판품으로는, 에멀겐 A-60 (HLB 12.8) (카오사 제조), BLAUNON DSP-9 (HLB 11.4), BLAUNON DSP-12.5 (HLB 12.8) (이상, 아오키 유지사 제조), 뉴콜 2607 (HLB 11.8) (닛폰 유화제사 제조) 등을 들 수 있다.
POE·POA 다고리 페닐에테르로는, HLB 가 13.0 미만인 POE·POA 다고리 페닐 에테르가 바람직하다. HLB 가 13.0 미만인 POE·POA 다고리 페닐에테르에 있어서의 다고리 페닐로는, 기 내에 1 개의 방향고리를 갖는 기 (치환기) 가 2 개 이상 치환된 페닐기, 기 내에 2 개 이상의 방향고리를 갖는 기 (치환기) 가 1 개 또는 복수 치환된 페닐기 등을 들 수 있다. 기 내에 1 개의 방향고리를 갖는 기로는, 예를 들어 벤질, 1-(페닐)에틸 등을 들 수 있다. 기 내에 2 개 이상의 방향고리를 갖는 기로는, 예를 들어 나프틸 등을 들 수 있다. HLB 가 13.0 미만인 POE·POA 다고리 페닐에테르에 있어서의 폴리옥시알킬렌으로는, 폴리옥시에틸렌 이외의 예를 들어 폴리옥시프로필렌, 폴리옥시부틸렌 등을 들 수 있다. HLB 가 13.0 미만인 POE·POA 다고리 페닐에테르의 시판품으로는 뉴콜 707F (HLB 12.4) (이상, 닛폰 유화제사 제조) 등을 들 수 있다.
일반식 (II)
[화학식 8]
Figure 112009021032562-pct00010
(식 중, d, e 및 f 는 동일하거나 상이하고, 1 ∼ 200 의 정수를 나타낸다) 로 나타내는 POE·POP 축합물로는, POP 의 분자량이 1200 이상 또한 POE 함량이 60% 이하인 POE·POP 축합물이 바람직하다. POP 의 분자량이 1200 이상 또한 POE 함량이 60% 이하인 POE·POP 축합물의 시판품으로는 프로논 204 (POP 의 분자량 : 2000 ; POE 함량 : 40%) (닛폰 유지사 제조), 뉴폴 PE-62 (POP 의 분자량 : 1750 ; POE 함량 : 20%), 뉴폴 PE-64 (POP 의 분자량 : 1750 ; POE 함량 : 40%), 뉴폴 PE-71 (POP 의 분자량 : 2050 ; POE 함량 : 10%), 뉴폴 PE-75 (POP 의 분자량 : 2050 ; POE 함량 : 50%) (이상, 산요 화성사 제조), 플루로닉 P-84 (POP 의 분자량 : 2250 ; POE 함량 : 40%), 플루로닉 P-85 (POP 의 분자량 : 2250 ; POE 함량 : 50%), 플루로닉 P-103 (POP 의 분자량 : 3250 ; POE 함량 : 30%) (이상, 아사히 전화사 제조) 등을 들 수 있다.
POE·POA 알킬아민에 있어서의 알킬로는, 탄소수 1 ∼ 30 의, 예를 들어 메틸, 에틸, 프로필, 부틸, 펜틸, 헥실, 헵틸, 옥틸, 노닐, 데실, 운데실, 도데실 (라우릴), 트리데실, 테트라데실 (미리스틸), 펜타데실, 헥사데실 (세틸), 헵타데실, 옥타데실 (스테아릴), 노나데실, 이코실, 헤네이코실, 도코실 (베헤닐), 트리코실, 테트라코실, 펜타코실, 헥사코실, 헵타코실, 옥타코실, 노나코실, 트리아콘틸 등을 들 수 있다. POE·POA 알킬아민에 있어서의 폴리옥시알킬렌으로는, 폴리옥시에틸렌 이외의 예를 들어 폴리옥시프로필렌, 폴리옥시부틸렌 등을 들 수 있다. POE·POA 알킬아민의 시판품으로는 BLAUNON LPE1007 (아오키 유지사 제조), 알킬 (C16) 아민 EO20PO10 (닛폰 유지사 제조) 등을 들 수 있다.
본 발명에 있어서는, 계면 활성제 B 를 1 종뿐만 아니라 2 종 이상을 조합하여 사용해도 된다.
또한 당업자는 본 발명의 실시예 2 에 나타낸 방법 등에 의해, sdLDL 분획의 반응률을 높이는 계면 활성제를 계면 활성제 B 로서 적절히 파악·선택할 수 있다. 사용하는 효소의 종류 및 농도 등의 반응 조건이 상이하면 계면 활성제의 반응성이 상이한 경우도 있으나, 설정한 조건에 의해 검토 대상의 계면 활성제를 본 발명에 계면 활성제 B 로서 사용할 수 있는지의 여부를 판단할 수 있다.
본 발명의 sdLDL-C 의 정량 방법에 있어서의 계면 활성제 B 의 농도는 sdLDL-C 의 정량을 가능하게 하는 농도로서, 반응액 중에서의 농도가 0.001 ∼ 5% 인 것이 바람직하고, 0.01 ∼ 0.5% 인 것이 보다 바람직하다.
계면 활성제 A 의 존재하에 sdLDL-C 와의 반응을 가능하게 하는 효소로는, 콜레스테롤에스테르 가수 분해 효소, 콜레스테롤 산화 효소 또는 콜레스테롤 탈수소 효소 등을 들 수 있는데, 콜레스테롤에스테르 가수 분해 효소가 바람직하다. 콜레스테롤에스테르 가수 분해 효소를 계면 활성제 B 대신에 사용하는 경우, 그 콜레스테롤에스테르 가수 분해 효소로는, 공정 (i) 에서 사용되는 콜레스테롤에스테르 가수 분해 효소와 동종의 콜레스테롤에스테르 가수 분해 효소이어도 되고 이종의 콜레스테롤에스테르 가수 분해 효소이어도 된다. 동종의 콜레스테롤에스테르 가수 분해 효소를 사용하는 경우에는, 공정 (ii) 에 있어서, 잔존하는 sdLDL-C 의 정량을 가능하게 하는 양의 콜레스테롤에스테르 가수 분해 효소를 첨가하면 된다. 또한, 이종의 콜레스테롤에스테르 가수 분해 효소를 사용하는 경우에는, 잔존하는 sdLDL-C 의 정량을 가능하게 하는 콜레스테롤에스테르 가수 분해 효소이면 특별히 제한은 없다.
또한 공정 (ii) 에 있어서, sdLDL-C 의 반응을 일으키는 시약으로는, 효소와 계면 활성제의 조합을 사용할 수도 있다. 그 조합은, sdLDL 이외의 리포단백질을 제거한 후의 반응액에 잔존하는 sdLDL-C 의 정량을 가능하게 하는 조합이면 특별히 제한은 없다. 그 조합을 구성하는 효소 및 계면 활성제는 단독으로 잔존하는 sdLDL-C 의 정량을 가능하게 할 필요는 없고, 조합되어 사용됨으로써 잔존하 는 sdLDL-C 의 정량을 가능하게 하면 된다.
HLB 란, 친수성-친유성 균형값을 의미한다. 본 발명에 사용되는 계면 활성제, 예를 들어 POE 다고리 페닐에테르의 HLB 는, 계면 활성제 핸드북 (요시다 토키유키 들 저 코교 도서 주식회사) 이나 신계면 활성제 (호리구치 히로시 저 산쿄 출판 주식회사) 에 기재된 방법으로 산출할 수 있다. 또한, 그 HLB 로는, 각종 계면 활성제 제조 메이커의 카탈로그나 팜플렛에 기재되어 있는 HLB 값을 이용할 수도 있다.
(sdLDL-C 정량 방법)
본 발명의 sdLDL-C 정량 방법은, 하기 공정 (i) ∼ (iii) 을 포함하는 방법이다.
(i) 계면 활성제 A 를 함유하는 반응액 중에서, 검체에 콜레스테롤에스테르 가수 분해 효소 및 콜레스테롤 산화 효소, 혹은 콜레스테롤에스테르 가수 분해 효소, 콜레스테롤 탈수소 효소 및 산화형 조효소를 작용시켜, 그 검체 중의 sdLDL 이외의 리포단백질 중의 콜레스테롤을 제거하는 공정
(ii) 상기 공정 (i) 후의 반응액에 잔존하는 sdLDL-C 의 반응을 일으키는 시약을 첨가하고, 과산화수소 또는 환원형 조효소를 생성시켜, 생성된 과산화수소 또는 환원형 조효소를 측정하는 공정
(iii) 이미 알려진 농도의 sdLDL-C 를 함유하는 표준 검체를 사용하여, 상기 (i) 및 (ii) 의 공정을 실시하여 과산화수소 또는 환원형 조효소를 생성시키고, 생성된 과산화수소 또는 환원형 조효소를 측정하고, sdLDL-C 농도와 과산화수소 또는 환원형 조효소 농도에 관련된 측정값을 관련지어, 그 검체 중의 sdLDL-C 농도를 결정하는 공정
또한, 공정 (iii) 을 실시하지 않고, 공정 (i) 및 공정 (ii) 를 실시함으로써 검체 중의 sdLDL-C 의 검출 방법으로 할 수도 있다.
공정 (i) 에 있어서의 검체 중의 sdLDL 이외의 리포단백질 중의 콜레스테롤 제거 방법으로는, 예를 들어 그 콜레스테롤로부터 변환된 과산화수소 또는 그 콜레스테롤로부터 생성시킨 환원형 조효소를 제거하는 방법을 들 수 있다. 그 제거 방법으로는, 그 콜레스테롤로부터 과산화수소를 생성시키고, 이어서 그 과산화수소를 제거하는 방법이 바람직하다.
과산화수소의 제거는, 예를 들어 과산화수소 제거 시약을 사용함으로써 실시할 수 있다. 과산화수소 제거 방법으로는, 과산화수소에 카탈라아제를 작용시키거나, 또는 과산화수소에 과산화 활성 물질과 산화 커플링 발색 반응에 사용되는 2 개의 산화 커플링 색원체의 일방의 조합을 작용시키는 방법이 바람직하다.
환원형 조효소의 제거는, 예를 들어 환원형 조효소에 환원형 조효소 산화 효소를 작용시켜, 생성되는 과산화수소를 과산화수소 제거 시약을 사용하여 제거함으로써 실시할 수 있다.
과산화수소 제거 시약으로는, sdLDL-C 이외의 리포단백질의 콜레스테롤로부터 생성되는 과산화수소를, sdLDL-C 로부터 생성되는 과산화수소의 측정에 영향을 미치지 않는 물질로 변환시키는 시약이면 특별히 제한은 없는데, 예를 들어 카탈라아제를 함유하는 시약, 과산화 활성 물질과 산화 커플링형 발색 반응에 사용되는 2 개의 산화 커플링형 색원체의 일방을 함유하는 시약 등을 들 수 있다. 과산화 활성 물질로는, 예를 들어 퍼옥시다아제 등을 들 수 있다. 산화 커플링형 발색 반응에 사용되는 2 개의 산화 커플링형 색원체의 일방이란, 구체적으로는 후술하는 「산화 커플링 발색형 색원체」에 있어서의 커플러 또는 아닐린류 혹은 페놀류가 예시된다. 본 명세서에 있어서, 「다른 편방의 산화 커플링형 색원체」라는 용어는, 「산화 커플링형 발색 반응에 사용되는 2 개의 산화 커플링형 색원체의 일방」이라는 용어와 쌍으로 사용되고, 예를 들어 전자가 커플러를 의미하는 경우에는 후자는 페놀류 또는 아닐린류를 나타내고, 전자가 페놀류 또는 아닐린류를 의미하는 경우에는 후자는 커플러를 나타낸다.
과산화수소 제거 시약으로서 카탈라아제를 함유하는 시약을 사용하는 경우, 카탈라아제의 농도로는 0.001 ∼ 5000kU/ℓ 가 바람직하고, 0.01 ∼ 1000kU/ℓ 가 보다 바람직하다. 또한, 본 발명의 공정 (i) 에 있어서, 과산화수소 제거 시약으로서 카탈라아제를 사용하는 경우에는, 공정 (ii) 에 있어서 카탈라아제 저해제를 공존시키는 것이 바람직하다. 카탈라아제 저해제로는, 아지화나트륨, H2S, HCN, NH2OH, 3-아미노-1,2,4-트리아졸 등을 들 수 있고, 사용하는 농도로는 카탈라아제 활성을 저해하고, 공정 (ii) 에서 생성되는 과산화수소의 측정에 영향을 미치지 않는 농도이면 특별히 한정은 되지 않지만, 바람직하게는 0.5 ∼ 60mmol/ℓ, 보다 바람직하게는 1 ∼ 30mmol/ℓ 이다.
과산화수소 제거 시약으로서, 과산화 활성 물질과 산화 커플링형 발색 반응 에 사용되는 2 개의 산화 커플링형 색원체의 일방을 사용하는 경우, 과산화 활성 물질로는 퍼옥시다아제 등을 들 수 있다. 퍼옥시다아제의 농도는 0.01 ∼ 500kU/ℓ 가 바람직하고, 1 ∼ 100kU/ℓ 가 보다 바람직하다. 산화 커플링형 발색 반응에 사용되는 2 개의 산화 커플링형 색원체의 일방의 농도로는 0.01 ∼ 10g/ℓ 가 바람직하다.
또한 본 발명에 있어서, 공정 (i) 에 있어서의 sdLDL 이외의 리포단백질 중의 콜레스테롤의 제거란, 그 콜레스테롤로부터 생성된 과산화수소 또는 환원형 조효소를 다른 물질로 변환시켜 소거하는 것에 그치지 않는다. 예를 들어 과산화수소와 환원형 조효소의 분별 측정이 가능한 경우, 그 콜레스테롤로부터 생성된 과산화수소 또는 환원형 조효소를 다른 물질로 변환시킬 필요는 없다. 예를 들어 공정 (i) 에서 sdLDL 이외의 리포단백질 중의 콜레스테롤로부터 환원형 조효소를 생성시키고, 공정 (ii) 에서 sdLDL 중의 콜레스테롤로부터 과산화수소를 생성시키는 경우, 공정 (i) 에서 생성된 환원형 조효소를 다른 물질로 변환시킬 필요는 없다. 또한 본 발명은, 공정 (i) 에서 생성된 과산화수소 또는 환원형 조효소를 측정하여, 얻어진 측정값을 바탕으로 공정 (ii) 에서 생성된 과산화수소 또는 환원형 조효소를 산출함으로써 검체 중의 sdLDL-C 를 정량하는 것도 포함한다.
여기서, 과산화수소의 측정은, 예를 들어 과산화수소 전극이나 후술하는 과산화수소 측정 시약을 사용하여 실시할 수 있으나, 과산화수소에 과산화 활성 물질과 산화 발색형 색원체를 작용시켜 색소를 생성시키고, 그 색소의 흡광도를 측정함으로써 실시되는 방법이 바람직하다.
환원형 조효소의 측정은, 예를 들어 환원형 조효소의 흡수 극대 부근의 파장에서의 흡광도 측정이나, 후술하는 환원형 조효소 측정 시약을 사용한 측정에 의해 실시할 수 있다.
과산화수소 측정용 시약은, 생성된 과산화수소를 검출 가능한 물질로 변환시키기 위한 시약이다. 검출 가능한 물질로는, 예를 들어 색소, 광 등을 들 수 있는데, 색소가 바람직하다. 검출 가능한 물질이 색소인 경우에는, 과산화수소 측정용 시약은 산화 발색형 색원체 및 퍼옥시다아제 등의 과산화 활성 물질을 함유한다. 산화 발색형 색원체로는, 예를 들어 후술하는 산화 발색형 색원체를 들 수 있다. 검출 가능한 물질이 광인 경우에는, 과산화수소 측정용 시약은 화학 발광 물질을 함유한다. 화학 발광 물질로는, 예를 들어 루미놀, 이소루미놀, 루시게닌, 아크리디늄에스테르 등을 들 수 있다.
과산화수소 측정용 시약으로서, 산화 발색형 색원체 및 과산화 활성 물질을 함유하는 시약을 사용하는 경우에는, 과산화수소는 과산화 활성 물질의 존재하에 산화 발색형 색원체와 반응하여 색소를 생성시키고, 생성된 색소를 측정함으로써 과산화수소를 측정할 수 있다. 또한, 화학 발광 물질을 함유하는 과산화수소 측정용 시약을 사용하는 경우에는, 과산화수소는 화학 발광 물질과 반응하여 광을 발생시키고, 발생된 광을 측정함으로써 과산화수소를 측정할 수 있다.
산화 발색형 색원체로는, 예를 들어 로이코형 색원체, 산화 커플링 발색형 색원체 등을 들 수 있다.
로이코형 색원체는, 과산화수소 및 과산화 활성 물질의 존재하에서 단독으로 색소로 변환되는 물질이다. 구체적으로는, 10-N-카르복시메틸카르바모일-3,7-비스(디메틸아미노)-10H-페노티아진 (CCAP), 10-N-메틸카르바모일-3,7-비스(디메틸아미노)-10H-페노티아진 (MCDP), N-(카르복시메틸아미노카르보닐)-4,4'-비스(디메틸아미노)디페닐아민나트륨염 (DA-64), 4,4'-비스(디메틸아미노)디페닐아민, 비스[3-비스(4-클로로페닐)메틸-4-디메틸아미노페닐]아민 (BCMA) 등을 들 수 있다.
산화 커플링 발색형 색원체는, 과산화수소 및 과산화 활성 물질의 존재하에서 2 개의 화합물이 산화적 커플링되어 색소를 생성시키는 물질이다.
2 개의 화합물의 조합으로는, 커플러와 아닐린류의 조합, 커플러와 페놀류의 조합 등을 들 수 있다.
커플러로는, 예를 들어 4-아미노안티피린(4-AA), 3-메틸-2-벤조티아졸리논히드라진 등을 들 수 있다.
아닐린류로는, N-(3-술포프로필)아닐린, N-에틸-N-(2-히드록시-3-술포프로필)-3-메틸아닐린 (TOOS), N-에틸-N-(2-히드록시-3-술포프로필)-3,5-디메틸아닐린 (MAOS), N-에틸-N-(2-히드록시-3-술포프로필)-3,5-디메톡시아닐린 (DAOS), N-에틸-N-(3-술포프로필)-3-메틸아닐린 (TOPS), N-(2-히드록시-3-술포프로필)-3,5-디메톡시아닐린 (HDAOS), N,N-디메틸-3-메틸아닐린, N,N-비스(3-술포프로필)-3,5-디메톡시아닐린, N-에틸-N-(3-술포프로필)-3-메톡시아닐린, N-에틸-N-(3-술포프로필)아닐린, N-에틸-N-(3-술포프로필)-3,5-디메톡시아닐린, N-(3-술포프로필)-3,5-디메톡시아닐린, N-에틸-N-(3-술포프로필)-3,5-디메틸아닐린, N-에틸-N-(2-히드록시-3-술포프로필)-3-메톡시아닐린, N-에틸-N-(2-히드록시-3-술포프로필)아닐린, N-에틸-N- (3-메틸페닐)-N'-숙시닐에틸렌디아민 (EMSE), N-에틸-N-(3-메틸페닐)-N'-아세틸에틸렌디아민, N-에틸-N-(2-히드록시-3-술포프로필)-4-플루오로-3,5-디메톡시아닐린 (F-DAOS) 등을 들 수 있다.
페놀류로는, 페놀, 4-클로로페놀, 3-메틸페놀, 3-히드록시-2,4,6-트리요오드벤조산 (HTIB) 등을 들 수 있다.
환원형 조효소 측정 시약은, 생성된 환원형 조효소를 검출 가능한 물질로 변환시키기 위한 시약이다. 검출 가능한 물질로는, 예를 들어 색소 등을 들 수 있다. 검출 가능한 물질이 색소인 경우에는, 환원형 조효소 측정 시약은 환원 발색형 색원체를 함유한다. 환원 발색형 색원체로는, 예를 들어 3-(4,5-디메틸-2-티아졸릴)-2,5-디페닐-2H-테트라졸륨브로마이드 (MTT), 2-(4-요오드페닐)-3-(4-니트로페닐)-5-(2,4-디술포페닐)-2H-테트라졸륨모노나트륨염 (WST-1), 2-(4-요오드페닐)-3-(2,4-디니트로페닐)-5-(2,4-디술포페닐)-2H-테트라졸륨모노나트륨염 (WST-3) 등을 들 수 있다.
과산화수소의 측정에 있어서, 과산화 활성 물질로는 예를 들어 퍼옥시다아제 등을 들 수 있다. 과산화 활성 물질의 농도는, 측정에 적절한 농도이면 특별히 제한은 없으나, 과산화 활성 물질로서 퍼옥시다아제를 사용하는 경우에는 1 ∼ 100kU/ℓ 가 바람직하다. 또한, 산화 발색형 색원체의 농도는, 측정에 적절한 농도이면 특별히 제한은 없으나, 0.01 ∼ 10g/ℓ 가 바람직하다.
본 발명에 있어서, sdLDL-C 의 측정은 수성 매체 중에서 실시되는 것이 바람직하다. 수성 매체로는, 예를 들어 탈이온수, 증류수, 완충액 등을 들 수 있는 데, 완충액이 바람직하다. 완충액에 사용하는 완충제로는, 예를 들어 트리스(히드록시메틸)아미노메탄 완충제, 인산 완충제, 붕산 완충제, 굿 완충제 등을 들 수 있다.
굿 완충제(Good's buffer)로는, 예를 들어 2-모르폴리노에탄술폰산 (MES), 비스(2-히드록시에틸)이미노트리스(히드록시메틸)메탄 (Bis-Tris), N-(2-아세트아미드)이미노2아세트산 (ADA), 피페라진-N,N'-비스(2-에탄술폰산) (PIPES), N-(2-아세트아미드)-2-아미노에탄술폰산 (ACES), 3-모르폴리노-2-히드록시프로판술폰산 (MOPSO), N,N-비스(2-히드록시에틸)-2-아미노에탄술폰산 (BES), 3-모르폴리노프로판술폰산 (MOPS), N-[트리스(히드록시메틸)메틸]-2-아미노에탄술폰산 (TES), 2-[4-(2-히드록시에틸)-1-피페라지닐]에탄술폰산 (HEPES), 3-[N,N-비스(2-히드록시에틸)아미노]-2-히드록시프로판술폰산 (DIPSO), N-[트리스(히드록시메틸)메틸]-2-히드록시-3-아미노프로판술폰산 (TAPSO), 피페라진-N,N'-비스(2-히드록시프로판술폰산) (POPSO), 3-[4-(2-히드록시에틸)-1-피페라지닐]-2-히드록시프로판술폰산 (HEPPSO), 3-[4-(2-히드록시에틸)-1-피페라지닐]프로판술폰산[(H)EPPS], N-[트리스(히드록시메틸)메틸]글리신 (Tricine), N,N-비스(2-히드록시에틸)글리신 (Bicine), N-트리스(히드록시메틸)메틸-3-아미노프로판술폰산 (TAPS), N-시클로헥실-2-아미노에탄술폰산 (CHES), N-시클로헥실-3-아미노-2-히드록시프로판술폰산 (CAPSO), N-시클로헥실-3-아미노프로판술폰산 (CAPS) 등을 들 수 있다. 완충액의 농도는 측정에 적절한 농도이면 특별히 제한은 되지 않지만, 0.001 ∼ 2.0mol/ℓ 가 바람직하고, 0.005 ∼ 1.0mol/ℓ 가 보다 바람직하다.
시료 중의 sdLDL-C 농도를 결정하기 위해 사용하는 검량선은, 예를 들어 이미 알려진 농도의 sdLDL-C 를 함유하는 표준 검체를 사용하여, 본 발명의 공정 (i) 및 공정 (ii) 를 실시하여 과산화수소 또는 환원형 조효소를 생성시키고, 생성된 과산화수소 또는 환원형 조효소를 측정하여, 그 측정값과 사용한 sdLDL-C 농도로부터 작성할 수 있다.
본 발명의 공정 (i) 및 공정 (ii) 는, 예를 들어 10 ∼ 50℃ 에서, 바람직하게는 20 ∼ 40℃ 에서, 1 ∼ 30 분간, 바람직하게는 2 ∼ 15 분간 실시한다.
(sdLDL-C 정량용 키트)
본 발명의 sdLDL-C 정량용 키트는, 본 발명의 sdLDL-C 의 정량 방법에 사용될 수 있다. sdLDL-C 정량용 키트의 형태로는, 본 발명의 sdLDL-C 정량 방법을 가능하게 하는 형태이면 특별히 제한은 없고, 2 시약계, 3 시약계 등의 어느 형태이어도 되지만, 2 시약계가 바람직하다.
본 발명의 sdLDL-C 정량용 키트로는, 예를 들어 이하의 키트를 들 수 있다.
계면 활성제 A, 콜레스테롤에스테르 가수 분해 효소, 콜레스테롤 산화 효소 및 과산화수소 제거 시약을 함유하는 제 1 시약과, sdLDL-C 의 반응을 일으키는 시약 및 과산화수소 측정 시약을 함유하는 제 2 시약을 함유하는 것을 특징으로 하는 검체 중의 sdLDL-C 정량용 키트.
계면 활성제 A, 콜레스테롤에스테르 가수 분해 효소, 산화형 조효소 및 콜레스테롤 탈수소 효소를 함유하는 제 1 시약과, sdLDL-C 의 반응을 일으키는 시약을 함유하는 제 2 시약을 함유하는 것을 특징으로 하는 검체 중의 sdLDL-C 정량용 키 트.
계면 활성제 A, 콜레스테롤에스테르 가수 분해 효소, 산화형 조효소, 콜레스테롤 탈수소 효소 및 환원형 조효소 측정 시약을 함유하는 제 1 시약과, sdLDL-C 의 반응을 일으키는 시약을 함유하는 제 2 시약을 함유하는 것을 특징으로 하는 sdLDL-C 정량용 키트.
계면 활성제 A, 콜레스테롤에스테르 가수 분해 효소, 콜레스테롤 탈수소 효소, 산화형 조효소, 환원형 조효소 산화 효소 및 과산화수소 제거 시약을 함유하는 제 1 시약과, sdLDL-C 의 반응을 일으키는 시약 및 과산화수소 측정 시약을 함유하는 제 2 시약을 함유하는 것을 특징으로 하는 검체 중의 sdLDL-C 정량용 키트.
계면 활성제 A, 콜레스테롤에스테르 가수 분해 효소, 콜레스테롤 산화 효소 및 과산화수소 제거 시약을 함유하는 제 1 시약과, 계면 활성제 B 및 과산화수소 측정 시약을 함유하는 제 2 시약을 함유하는 것을 특징으로 하는 sdLDL-C 정량용 키트.
계면 활성제 A, 콜레스테롤에스테르 가수 분해 효소, 산화형 조효소 및 콜레스테롤 탈수소 효소를 함유하는 제 1 시약과, 계면 활성제 B 를 함유하는 제 2 시약을 함유하는 것을 특징으로 하는 sdLDL-C 정량용 키트.
계면 활성제 A, 콜레스테롤에스테르 가수 분해 효소, 산화형 조효소, 콜레스테롤 탈수소 효소 및 환원형 조효소 측정 시약을 함유하는 제 1 시약과, 계면 활성제 B 를 함유하는 제 2 시약을 함유하는 것을 특징으로 하는 sdLDL-C 정량용 키트.
계면 활성제 A, 콜레스테롤에스테르 가수 분해 효소, 산화형 조효소, 콜레스 테롤 탈수소 효소, 환원형 조효소 산화 효소 및 과산화수소 제거 시약을 함유하는 제 1 시약과, 계면 활성제 B 및 과산화수소 측정 시약을 함유하는 제 2 시약을 함유하는 것을 특징으로 하는 sdLDL-C 정량용 키트.
제 1 시약 및 제 2 시약으로 이루어지는 2 시약계의 sdLDL-C 정량용 키트에 있어서는, 콜레스테롤에스테르 가수 분해 효소는 제 1 시약에 함유되는데, 제 1 및 제 2 시약 양방에 함유되어도 된다. 콜레스테롤 산화 효소는 제 1 시약에 함유되는데, 제 1 및 제 2 시약 양방에 함유되어도 된다. 콜레스테롤 탈수소 효소는 제 1 시약에 함유되는데, 제 1 및 제 2 시약 양방에 함유되어도 된다.
계면 활성제 A 는 제 1 시약에 함유되는 것이 바람직하다.
산화형 조효소는 제 1 시약에 함유되는데, 제 1 및 제 2 시약 양방에 함유되어도 된다. 환원형 조효소 산화 효소는 제 1 시약에 함유되는데, 제 1 및 제 2 시약 양방에 함유되어도 된다.
과산화수소 제거 시약은 제 1 시약에 함유되는 것이 바람직하다. 과산화수소 제거 시약으로서 카탈라아제를 사용하는 경우, 카탈라아제는 제 1 시약에 함유되는 것이 바람직하고, 카탈라아제 저해제는 제 2 시약에 함유되는 것이 바람직하다. 과산화수소 제거 시약으로서 퍼옥시다아제와 산화 커플링형 발색 반응에 사용되는 2 개의 산화 커플링형 색원체의 일방의 조합을 사용하는 경우, 그 조합은 제 1 시약에 함유되는 것이 바람직하다.
계면 활성제 B 는 제 2 시약에 함유되는 것이 바람직하다. 전술한 바와 같이, 계면 활성제 B 대신에, sdLDL 이외의 리포단백질 중의 콜레스테롤을 제거한 후의 반응액에 잔존하는 sdLDL-C 의 정량을 가능하게 하는 효소나, 효소와 계면 활성제의 조합을 사용할 수도 있다.
과산화수소 측정 시약으로서, 퍼옥시다아제와 2 개의 산화 커플링형 색원체를 함유하는 시약을 사용하는 경우에는, 2 개의 산화 커플링형 색원체는 각각 별개의 시약에 함유되는 것이 바람직하다. 퍼옥시다아제는, 제 1, 제 2 시약 중 어느 일방 또는 양방에 함유된다. 또한, 과산화수소 제거 시약으로서, 퍼옥시다아제와 산화 커플링형 발색 반응에 사용되는 2 개의 산화 커플링형 색원체의 일방의 조합을 사용하는 경우, 당해 조합과 함께 다른 일방의 커플링형 색원체를 조합하여 과산화수소 측정 시약으로 할 수 있다. 또한, 그 다른 일방의 커플링형 색원체는 제 2 시약에 함유된다.
알부민은 제 1 시약에 함유되는 것이 바람직하지만, 제 1 및 제 2 시약 양방에 함유되어도 된다.
본 발명의 sdLDL-C 정량용 키트로는, 예를 들어 이하의 양태의 키트를 들 수 있으나 이들은 본 발명의 범위를 전혀 한정하지 않는다.
키트 1
제 1 시약
계면 활성제 A, 콜레스테롤에스테르 가수 분해 효소, 콜레스테롤 산화 효소, 카탈라아제
제 2 시약
계면 활성제 B, 카탈라아제 저해제, 과산화수소 측정 시약
키트 2
제 1 시약
계면 활성제 A, 콜레스테롤에스테르 가수 분해 효소, 콜레스테롤 산화 효소, 퍼옥시다아제, 산화 커플링형 색원체의 일방
제 2 시약
계면 활성제 B, 다른 일방의 산화 커플링형 색원체
키트 3
제 1 시약
계면 활성제 A, 콜레스테롤에스테르 가수 분해 효소, 콜레스테롤 산화 효소, 퍼옥시다아제, 산화 커플링형 색원체
제 2 시약
계면 활성제 B
키트 4
제 1 시약
계면 활성제 A, 콜레스테롤에스테르 가수 분해 효소, 산화형 조효소, 콜레스테롤 탈수소 효소
제 2 시약
계면 활성제 B
키트 5
제 1 시약
계면 활성제 A, 콜레스테롤에스테르 가수 분해 효소, 산화형 조효소, 콜레스테롤 탈수소 효소, 환원형 조효소 측정 시약
제 2 시약
계면 활성제 B
키트 6
제 1 시약
계면 활성제 A, 콜레스테롤에스테르 가수 분해 효소, 산화형 조효소, 콜레스테롤 탈수소 효소, 환원형 조효소 산화 효소, 카탈라아제
제 2 시약
계면 활성제 B, 카탈라아제 저해제, 과산화수소 측정 시약
키트 7
제 1 시약
계면 활성제 A, 콜레스테롤에스테르 가수 분해 효소, 산화형 조효소, 콜레스테롤 탈수소 효소, 환원형 조효소 산화 효소, 퍼옥시다아제, 산화 커플링형 색원체의 일방
제 2 시약
계면 활성제 B, 다른 일방의 산화 커플링형 색원체
키트 8
제 1 시약
계면 활성제 A, 콜레스테롤에스테르 가수 분해 효소, 콜레스테롤 산화 효소, 카탈라아제, 알부민
제 2 시약
계면 활성제 B, 카탈라아제 저해제, 과산화수소 측정 시약
키트 9
제 1 시약
계면 활성제 A, 콜레스테롤에스테르 가수 분해 효소, 콜레스테롤 산화 효소, 퍼옥시다아제, 산화 커플링형 색원체의 일방, 알부민
제 2 시약
계면 활성제 B, 다른 일방의 산화 커플링형 색원체
키트 10
제 1 시약
계면 활성제 A, 콜레스테롤에스테르 가수 분해 효소, 콜레스테롤 산화 효소, 퍼옥시다아제, 산화 커플링형 색원체, 알부민
제 2 시약
계면 활성제 B
키트 11
제 1 시약
계면 활성제 A, 콜레스테롤에스테르 가수 분해 효소, 산화형 조효소, 콜레스테롤 탈수소 효소, 알부민
제 2 시약
계면 활성제 B
키트 12
제 1 시약
계면 활성제 A, 콜레스테롤에스테르 가수 분해 효소, 산화형 조효소, 콜레스테롤 탈수소 효소, 환원형 조효소 측정 시약, 알부민
제 2 시약
계면 활성제 B
키트 13
제 1 시약
계면 활성제 A, 콜레스테롤에스테르 가수 분해 효소, 산화형 조효소, 콜레스테롤 탈수소 효소, 환원형 조효소 산화 효소, 카탈라아제, 알부민
제 2 시약
계면 활성제 B, 카탈라아제 저해제, 과산화수소 측정 시약
키트 14
제 1 시약
계면 활성제 A, 콜레스테롤에스테르 가수 분해 효소, 산화형 조효소, 콜레스테롤 탈수소 효소, 환원형 조효소 산화 효소, 퍼옥시다아제, 산화 커플링형 색원체의 일방, 알부민
제 2 시약
계면 활성제 B, 다른 일방의 산화 커플링형 색원체
키트 15
제 1 시약
계면 활성제 A, 콜레스테롤에스테르 가수 분해 효소, 콜레스테롤 산화 효소, 카탈라아제, 알부민
제 2 시약
계면 활성제 B, 카탈라아제 저해제, 과산화수소 측정 시약, 알부민
키트 16
제 1 시약
계면 활성제 A, 콜레스테롤에스테르 가수 분해 효소, 콜레스테롤 산화 효소, 퍼옥시다아제, 산화 커플링형 색원체의 일방, 알부민
제 2 시약
계면 활성제 B, 알부민, 다른 일방의 산화 커플링형 색원체
키트 17
제 1 시약
계면 활성제 A, 콜레스테롤에스테르 가수 분해 효소, 콜레스테롤 산화 효소, 퍼옥시다아제, 산화 커플링형 색원체, 알부민
제 2 시약
계면 활성제 B, 알부민
키트 18
제 1 시약
계면 활성제 A, 콜레스테롤에스테르 가수 분해 효소, 산화형 조효소, 콜레스테롤 탈수소 효소, 알부민
제 2 시약
계면 활성제 B, 알부민
키트 19
제 1 시약
계면 활성제 A, 콜레스테롤에스테르 가수 분해 효소, 산화형 조효소, 콜레스테롤 탈수소 효소, 환원형 조효소 측정 시약, 알부민
제 2 시약
계면 활성제 B, 알부민
키트 20
제 1 시약
계면 활성제 A, 콜레스테롤에스테르 가수 분해 효소, 산화형 조효소, 콜레스테롤 탈수소 효소, 환원형 조효소 산화 효소, 카탈라아제, 알부민
제 2 시약
계면 활성제 B, 카탈라아제 저해제, 과산화수소 측정 시약, 알부민
키트 21
제 1 시약
계면 활성제 A, 콜레스테롤에스테르 가수 분해 효소, 산화형 조효소, 콜레스테롤 탈수소 효소, 환원형 조효소 산화 효소, 퍼옥시다아제, 산화 커플링형 색원체 의 일방, 알부민
제 2 시약
계면 활성제 B, 알부민, 다른 일방의 산화 커플링형 색원체
본 발명의 sdLDL-C 정량용 키트에 사용되는 계면 활성제 A, 콜레스테롤에스테르 가수 분해 효소, 콜레스테롤 산화 효소, 산화형 조효소, 콜레스테롤 탈수소 효소, 환원형 조효소 산화 효소, 과산화수소 제거 시약, 계면 활성제 B, 알부민, 과산화수소 측정 시약으로는, 각각 전술한 것을 들 수 있다.
본 발명의 sdLDL-C 정량용 키트에는, 필요에 따라 수성 매체, 안정화제, 방부제, 영향 물질 소거제, 반응 촉진제 등이 함유되어도 된다. 수성 매체로는, 예를 들어 전술한 수성 매체 등을 들 수 있다. 안정화제로는, 예를 들어 에틸렌디아민4아세트산 (EDTA), 수크로오스, 염화칼슘 등을 들 수 있다. 방부제로는, 예를 들어 아지화나트륨, 바이오에이스, 항생 물질 등을 들 수 있다. 영향 물질 소거제로는, 예를 들어 아스코르브산의 영향을 소거하기 위한 아스코르브산옥시다아제 등을 들 수 있다. 반응 촉진제로는, 예를 들어 콜리파제 등의 효소, 황산나트륨, 염화나트륨 등의 염류 등을 들 수 있다.
본 발명의 sdLDL-C 정량용 키트는 동결 건조된 상태이어도 되고, 수성 매체에 용해된 상태이어도 된다. 동결 건조된 상태의 시약을 사용하여 검체 중의 sdLDL-C 를 정량하는 경우에는, 당해 시약은 수성 매체에 용해시켜 사용된다.
본 발명의 sdLDL-C 정량용 키트에 있어서의 콜레스테롤에스테르 가수 분해 효소, 콜레스테롤 산화 효소의 함량으로는, 수성 매체에 의해 용해된 상태에서의 농도가 0.001 ∼ 2000U/㎖ 로 되는 함량이 바람직하고, 0.005 ∼ 1000U/㎖ 로 되는 함량이 보다 바람직하다.
본 발명의 sdLDL-C 정량용 키트에 있어서의 콜레스테롤 탈수소 효소, 환원형 조효소 산화 효소의 함량으로는, 수성 매체에 의해 용해된 상태에서의 농도가 0.001 ∼ 2000U/㎖ 로 되는 함량이 바람직하고, 0.005 ∼ 1000U/㎖ 로 되는 함량이 보다 바람직하다.
본 발명의 sdLDL-C 정량용 키트에 있어서의 산화형 조효소의 함량으로는, 수성 매체에 의해 용해된 상태에서의 농도가 0.01 ∼ 500mmol/ℓ 로 되는 함량이 바람직하고, 0.1 ∼ 100mmol/ℓ 로 되는 함량이 보다 바람직하다.
본 발명의 sdLDL-C 정량용 키트에 있어서의 계면 활성제 A 의 함량으로는, 수성 매체에 의해 용해된 상태에서의 농도가 0.0001 ∼ 1% 로 되는 함량이 바람직하고, 0.0005 ∼ 0.5% 로 되는 함량이 보다 바람직하다.
본 발명의 sdLDL-C 정량용 키트에 있어서의 계면 활성제 B 의 함량으로는, 수성 매체에 의해 용해된 상태에서의 농도가 0.001 ∼ 5% 로 되는 함량이 바람직하고, 0.01 ∼ 0.5% 로 되는 함량이 보다 바람직하다.
본 발명의 sdLDL-C 정량용 키트에 있어서의 알부민 함량으로는, 수성 매체에 의해 용해된 상태에서의 농도가 0.0001 ∼ 10% 인 것이 바람직하고, 0.001 ∼ 5% 가 보다 바람직하다.
이하, 실시예에 의해 본 발명을 보다 상세하게 설명하는데, 이들은 본 발명의 범위를 전혀 한정하지 않는다. 또한, 본 실시예 및 참고예에 있어서는, 하 기 메이커의 시약 및 효소를 사용하였다.
MOPS (도진 화학 연구소사 제조), EMSE (다이토 케믹스사 제조), 황산나트륨 (칸토 화학사 제조), 4-아미노안티피린 (사이쿄 화성사 제조), 퍼옥시다아제 (토요 방적사 제조), CHO-PEL (콜레스테롤 산화 효소 ; 키코망사 제조), CHO-CE (콜레스테롤 산화 효소 ; 키코망사 제조), COO-322 (콜레스테롤 산화 효소 ; 토요 방적사 제조), LPL3 (콜레스테롤에스테르 가수 분해 효소 ; 아마노 엔자임사 제조), LP (콜레스테롤에스테르 가수 분해 효소 ; 아사히 화성사 제조), LIPS (콜레스테롤에스테르 가수 분해 효소 ; 아사히 화성사 제조), LPAP (콜레스테롤에스테르 가수 분해 효소 ; 아사히 화성사 제조), 퍼옥시다아제 (토요 방적사 제조), BSA (Proliant 사 제조).
파이오닌 D-3110 (타케모토 유지사 제조), 파이오닌 D-3120 (타케모토 유지사 제조), 나이민 L-207 (닛폰 유지사 제조), 유니세이프 AL-E (닛폰 유지사 제조), ZWITTERGENT 3-10 (CALBIOCHEM 사 제조), 닛산아논 BL (닛폰 유지사 제조), 아논 BDF-SF (닛폰 유지사 제조), 비스놀 SK (입포샤사 제조), 나이미드 MT-215 (닛폰 유지사 제조), 뉴콜 707-SF (닛폰 유화제사 제조), 뉴콜 723-SF (닛폰 유화제사 제조), 하이테놀 N-17 (다이이치 공업 약품사 제조), 산아미드 CF-10 (닛폰 유지사 제조), 미그놀 PA-30 (입포샤사 제조), 닛콜 CMT-30 (닛코 케미컬즈사 제조), 사르코시네이트 LN-30 (닛코 케미컬즈사 제조), 아데카플루로닉 TR-704 (아사히 전화사 제조), 유니올 D-700 (닛폰 유지사 제조), 플루로닉 25R-2 (아사히 전화사 제조), 유니루브 50MB-26 (닛폰 유지사 제조).
노이겐 TDS-80 (다이이치 공업 약품사 제조), 노이겐 TDS-120 (다이이치 공업 약품사 제조), EMALEX OD-16 (니혼 에멀션사 제조), 원더서프 S-800 (아오키 유지사 제조), 원더서프 S-1400 (아오키 유지사 제조), 노니온 NS-210 (닛폰 유지사 제조), 노니온 NS-215 (닛폰 유지사 제조), 뉴콜 2607 (닛폰 유화제사 제조), 에멀겐 A-60 (카오사 제조), BLAUNONDSP-12.5 (아오키 유지사 제조), 뉴폴 PE-64 (산요 화성사 제조), BLAUNONLPE1007 (아오키 유지사 제조).
실시예 1
이하의 제 1 시약 및 제 2 시약으로 이루어지는 sdLDL-C 정량용 키트를 조제하였다. 표 1 에 나타내는 계면 활성제 A 및 계면 활성제 B 를 사용한 키트를 실시예 1(1) ∼ 1(34) 의 키트로 하였다.
제 1 시약
MOPS (pH 7.0) 20mmol/ℓ
EMSE 0.3g/ℓ
황산나트륨 2g/ℓ
계면 활성제 A (이하, 「계 A」로 약기한다)
LPL3 100kU/ℓ
CHO-PEL 1kU/ℓ
퍼옥시다아제 10kU/ℓ
제 2 시약
MOPS (pH 7.0) 20mmol/ℓ
4-아미노안티피린 0.3g/ℓ
퍼옥시다아제 20kU/ℓ
계면 활성제 B (이하, 「계 B」로 약기한다)
[표 1-1]
Figure 112009021032562-pct00011
[표 1-2]
Figure 112009021032562-pct00012
[표 1-3]
Figure 112009021032562-pct00013
실시예 2
「신생 화학 실험 강좌 4」(토쿄 화학 동인) 에 기재된 초원심법에 따라, 인간 혈청으로부터 HDL (비중 1.063 이상), sdLDL (비중 1.044 ∼ 1.063), LgLDL (비중 1.006 ∼ 1.044), VLDL 및 CM (비중 1.006 이하) 의 4 개의 리포단백질 분획을 각각 분취하고, 실시예 1 의 키트를 사용하여, 각 리포단백질 분획 중 콜레스테롤의 반응률을 산출하였다.
(1) 각 리포단백질 분획 중 콜레스테롤과 실시예 1 의 키트의 반응에 의한 각 리포단백질 분획에 있어서의 「반응 흡광도」의 산출
히타치 7170S 형 자동 분석 장치를 사용하여, 이하의 조작에 의해 「반응 흡광도」를 산출하였다.
각 리포단백질 분획을 검체로 하여 반응 셀에 (2㎕) 첨가하고, 이어서 각각 실시예 1 의 키트의 제 1 시약 (0.15㎖) 을 첨가하여 반응 (제 1 반응) 을 개시시키고, 37℃ 에서 5 분간 가온시켜, 반응 5 분 후의 반응액의 흡광도 (E1) 를 주파장 600㎚, 부파장 700㎚ 로 측정하였다. 이어서, 이 반응액에 각각 실시예 1(1) ∼ 1(34) 의 키트의 제 2 시약 (0.05㎖) 을 첨가하여 다시 37℃ 에서 5 분간 가온시켜 반응 (제 2 반응) 을 실시하고, 제 2 반응 5 분 후의 반응액의 흡광도 (E2) 를 주파장 600㎚, 부파장 700㎚ 로 측정하고, E2 에서 E1 을 차감하여, 흡광도 변화 (ΔE'리포단백질 분획) 를 산출하였다. 또한, 각 리포단백질 분획 대신에 생리 식염수를 검체로서 사용하여 동일한 측정을 실시하고, 흡광도 변화 (ΔE'블랭크) 를 산출하였다. 마지막으로, 하기 (식 3) 에 의해 각 리포단백질 분획에 있어서의 「반응 흡광도 3」을 산출하였다.
Figure 112009021032562-pct00014
(2) 각 리포단백질 분획 중 콜레스테롤의 반응률 산출
히타치 7170S 형 자동 분석 장치를 사용하여, 총 콜레스테롤 정량용 키트인 데타미나 C TC (쿄와 메덱스사 제조) 를 실시예 1 의 키트 대신에 사용하는 것 이외에는 (1) 의 경우와 동일한 방법으로 「반응 흡광도 4」를 산출하고, 이하의 (식 4) 로 실시예 1(1) ∼ 1(34) 의 각각의 키트에 있어서의 각 리포단백질 분획 중 콜레스테롤의 반응률 (%) 을 산출하였다. 또한, 데타미나 C TC 를 사용한 측정에 있어서 산출한 「반응 흡광도 4」는, 대상으로 하는 리포단백질 중의 콜레스테롤이 전부 반응하였을 때의 「반응 흡광도」를 의미한다.
Figure 112009021032562-pct00015
실시예 1(1) ∼ 1(34) 의 각 키트에 있어서의 각 리포단백질 분획 중 콜레스테롤의 반응률에 대해, 반응률이 0 ∼ 10% 를 「-」, 10 ∼ 20% 를 「±」, 20 ∼ 50% 를 「+」, 50 ∼ 80% 를 「++」, 80 ∼ 100% 를 「+++」로 나타내어 정리한 것을 표 2 에 나타낸다.
[표 2]
Figure 112009021032562-pct00016
표 2 에 나타내는 바와 같이, 실시예 1(1) ∼ 1(34) 에 나타내는 키트가 sdLDL-C 의 정량에 사용될 수 있는 것을 알 수 있다.
실시예 3
이하의 제 1 시약 및 제 2 시약으로 이루어지는 sdLDL-C 정량용 키트를 조제하였다. 표 3 에 나타내는 계면 활성제 A 및 계면 활성제 B 를 사용한 키트를 실시예 3(35) ∼ 3(44) 의 키트로 하였다.
제 1 시약
MOPS (pH 7.0) 20mmol/ℓ
EMSE 0.3g/ℓ
황산나트륨 2g/ℓ
계면 활성제 A (이하, 「계 A」로 약기한다)
LPL3 100kU/ℓ
CHO-PEL 1kU/ℓ
퍼옥시다아제 10kU/ℓ
BSA
제 2 시약
MOPS (pH 7.0) 20mmol/ℓ
4-아미노안티피린 0.3g/ℓ
퍼옥시다아제 20kU/ℓ
계면 활성제 B (이하, 「계 B」로 약기한다)
[표 3-1]
Figure 112009021032562-pct00017
[표 3-2]
Figure 112009021032562-pct00018
실시예 4
실시예 3(35) ∼ 3(47) 의 키트를 사용하여, 실시예 2 의 (1) 에 기재된 측정 방법과 동일하게 하여 히타치 7170S 자동 분석 장치에 의해 인간 혈청 24 검체 각각에 있어서의 반응 흡광도를 측정하였다.
다음으로, 그 혈청을 사용하여 Journal of Lipid Research vol.44, p.2193-2201(2003) 에 기재된 초원심법으로 그 검체 중의 sdLDL 을 원심 분리하고, 얻어진 sdLDL 분획 중의 콜레스테롤량을 데타미나 L TCII (쿄와 메덱스사 제조) 를 사용하여 측정하였다. 실시예 3(35) ∼ 3(47) 의 키트를 사용한 측정에 있어서의 측정값과, 초원심법에 의한 측정값의 상관 계수를 표 4 에 기록한다.
[표 4]
Figure 112009021032562-pct00019
표 4 에 나타내는 바와 같이, 실시예 3(35) ∼ 3(47) 의 키트에 의한 측정 결과는 초원심법에서의 측정 결과와 양호한 상관을 나타냈다.
또한, 제 1 시약에 BSA 를 함유하는 실시예 3(42) 와 3(43) 의 키트를 사용한 측정과, 실시예 3(35) 와 3(37) 의 키트를 사용한 측정의 비교로부터, 제 1 시약에 BSA 를 함유하는 키트를 사용함으로써, 제 1 시약에 BSA 를 함유하지 않는 키트를 사용한 경우와 비교하여 초원심법과의 사이의 상관이 보다 양호해지는 것을 알 수 있었다.
실시예 5
이하의 제 1 시약 및 제 2 시약으로 이루어지는 sdLDL-C 정량용 키트를 조제하였다. 표 5 에 나타내는 계면 활성제 A 및 계면 활성제 B 를 사용한 키트를 실시예 5(48) ∼ 5(57) 의 키트로 하였다.
제 1 시약
MOPS (pH 7.0) 20mmol/ℓ
EMSE 0.3g/ℓ
황산나트륨 2g/ℓ
퍼옥시다아제 10kU/ℓ
BSA 3g/ℓ
계면 활성제 A (이하, 「계 A」로 약기한다)
콜레스테롤에스테르 가수 분해 효소 (이하, 「CHER」로 약기한다)
콜레스테롤 산화 효소 (이하, 「CHOD」로 약기한다)
제 2 시약
MOPS (pH 7.0) 20mmol/ℓ
4-아미노안티피린 0.3g/ℓ
퍼옥시다아제 20kU/ℓ
BLAUNON LPE-1007 1g/ℓ
원더서프 S-800 0.3g/ℓ
[표 5]
Figure 112009021032562-pct00020
실시예 6
실시예 3(43) 및 실시예 5(48) ∼ 5(57) 의 키트를 사용하여, 실시예 2 의 (1) 에 기재된 방법과 동일하게 하여 히타치 7170S 자동 분석 장치에 의해, 인간 혈청 25 검체 각각에 있어서의 반응 흡광도를 측정하였다.
다음으로, 그 혈청을 사용하여 Journal of Lipid Research vol.44, p.2193- 2201(2003) 에 기재된 초원심법으로 그 검체 중의 sdLDL 을 원심 분리하고, 얻어진 sdLDL 분획 중의 콜레스테롤량을 데타미나 L TCII (쿄와 메덱스사 제조) 를 사용하여 측정하였다. 실시예 3(43) 및 실시예 5(48) ∼ 5(57) 의 키트를 사용한 측정에 있어서의 측정값과 초원심법에 의한 측정값의 상관 계수를 표 6 에 기록한다.
[표 6]
Figure 112009021032562-pct00021
표 6 에 나타내는 바와 같이, 실시예 3(43) 및 실시예 5(48) ∼ 5(57) 의 키트를 사용한 측정 결과와 초원심법으로 얻어진 측정 결과는 양호한 상관을 나타냈다.
실시예 7
이하의 제 1 시약 및 제 2 시약으로 이루어지는 sdLDL-C 정량용 키트를 조제하였다. 표 7 에 나타내는 계면 활성제 A 및 계면 활성제 B 를 사용한 키트를 실시예 7(58) ∼ 7(67) 의 키트로 하였다.
제 1 시약
MOPS (pH 7.0) 20mmol/ℓ
EMSE 0.3g/ℓ
황산나트륨 2g/ℓ
계면 활성제 A (이하, 「계 A」로 약기한다)
LPL3 100kU/ℓ
CHO-PEL 1kU/ℓ
퍼옥시다아제 10kU/ℓ
BSA
제 2 시약
MOPS (pH 7.0) 20mmol/ℓ
4-아미노안티피린 0.3g/ℓ
퍼옥시다아제 20kU/ℓ
계면 활성제 B (이하, 「계 B」로 약기한다)
[표 7]
Figure 112009021032562-pct00022
실시예 8
실시예 3(36) 및 실시예 7(58) ∼ 7(67) 의 키트를 사용하여, 실시예 2 의 (1) 에 기재된 방법과 동일하게 하여 인간 혈청 21 검체 각각에 있어서의 반응 흡광도를 측정하였다.
다음으로, 그 혈청을 사용하여 Journal of Lipid Research vol.44, p.2193-2201(2003) 에 기재된 초원심법으로 그 혈청 중의 sdLDL 을 원심 분리하고, 얻어진 sdLDL 분획 중의 콜레스테롤량을 데타미나 L TCII (쿄와 메덱스사 제조) 를 사용하여 측정하였다. 각 실시예 및 비교예의 키트를 사용한 측정에 있어서의 측정값 과 초원심법에 의한 측정값의 상관 계수를 표 8 에 기록한다.
[표 8]
Figure 112009029907932-pct00029
표 8 에 나타내는 바와 같이, 실시예 3(36) 및 실시예 7(58) ∼ 7(67) 의 키트를 사용한 측정 결과와 초원심법으로 얻어진 측정 결과는 양호한 상관을 나타냈다.
실시예 9
검체 중의 sdLDL-C 의 정량
초원심법 그리고 본 발명의 실시예 3(36) 및 실시예 3(44) 의 키트를 사용하여, 인간 신선 혈청 2 검체에 대해 각 검체 중의 sdLDL-C 를 이하의 방법에 의해 정량하였다.
(1) 초원심법을 사용한 인간 혈청 검체 중의 sdLDL-C 의 정량
그 인간 혈청 2 검체를 사용하여 Journal of Lipid Research vol.44, p.2193-2201(2003) 에 기재된 초원심법으로 그 혈청 중의 sdLDL 을 원심 분리하고, 얻어진 sdLDL 분획 중의 콜레스테롤량을 데타미나 L TCII (쿄와 메덱스사 제조) 를 사용하여 측정하였다.
(2) 검량선의 작성
초원심법에 의한 측정으로부터, sdLDL-C 농도가 43.1㎎/㎗ 임이 판명되어 있는 혈청 표준액을 검량선 작성용 샘플로 하였다. 실시예 2 의 (1) 에 기재된 측정 방법과 동일하게 하여 히타치 7170S 자동 분석 장치에 의해, 실시예 3(36) 및 실시예 3(44) 의 키트에 의해 검량선 작성용 샘플 검체의 반응 흡광도를 측정하고, 그 반응 흡광도와 검량선 작성용 샘플 중의 sdLDL-C 농도의 관계로부터 각각의 키트의 검량선을 작성하였다.
(3) 인간 혈청 2 검체 중의 sdLDL-C 의 정량
검량선 작성용 샘플 대신에 인간 혈청 2 검체를 사용하여, 상기 (2) 와 동일한 방법에 의해 그 2 검체 각각에 대해 반응을 실시하고, 반응 후의 반응액의 흡광도와 상기 (2) 에서 작성한 검량선으로부터 각각의 키트에 대해 각 검체 중의 sdLDL-C 농도를 결정하였다.
그 2 검체에 대해, 상기 (1) 에 있어서의 초원심법에 의해 결정한 그 검체 중의 sdLDL-C 농도와, 상기 (3) 에 있어서의 실시예 3(36) 및 실시예 3(44) 의 키트를 사용한 측정에 의해 결정한 그 검체 중의 sdLDL-C 농도를 표 9 에 나타낸다.
[표 9]
Figure 112009021032562-pct00024
표 9 는, 본 발명의 키트를 사용하여, 본 발명의 방법에 의해 인간 혈청 중의 sdLDL-C 를 정확하게 정량할 수 있는 것을 나타낸다.
본 발명에 의해, 동맥 경화 등의 관동맥 질환의 진단에 유용한 소입자 저밀도 리포단백질 중의 콜레스테롤의 정량 방법 및 정량용 키트가 제공된다.

Claims (12)

  1. 하기 공정 (i), (ii) 및 (iii) 을 포함하는, 검체 중의 소입자 저밀도 리포단백질 중의 콜레스테롤 (이하, sdLDL-C 로 약기한다) 의 정량 방법.
    (i) 폴리옥시에틸렌알킬아민, 아민옥사이드류, 알킬베타인, 알킬암모니오-1-프로판술폰산염, 산아미드알킬베타인, 폴리옥시에틸렌벤질-알킬4급암모늄염, 폴리옥시에틸렌지방산아미드, 폴리옥시에틸렌 다고리 페닐에테르황산에스테르염, 폴리옥시에틸렌알킬페닐에테르황산에스테르염, 폴리옥시에틸렌지방산아미드황산에스테르염, 폴리옥시에틸렌알킬아민황산에스테르염, N-아실타우린염, N-아실아미노산염, 에틸렌디아민-폴리옥시에틸렌폴리옥시프로필렌 축합물, 폴리에틸렌글리콜을 함유하지 않는 폴리프로필렌글리콜 유도체, 일반식 (I)
    [화학식 9]
    Figure 112014039407811-pct00030
    (식 중, a, b 및 c 는 동일하거나 상이하고, 1 ∼ 200 의 정수를 나타낸다) 로 나타내는 폴리옥시에틸렌폴리옥시프로필렌 축합물 및 폴리옥시에틸렌폴리옥시알킬렌알킬에테르 (그 알킬은 탄소수 9 이하의 알킬) 로 이루어지는 군에서 선택되는 계면 활성제를 함유하는 반응액 중에서, 검체에 콜레스테롤에스테르 가수 분해 효소 및 콜레스테롤 산화 효소 또는 콜레스테롤에스테르 가수 분해 효소, 콜레스테롤 탈수소 효소 및 산화형 조효소를 작용시켜, 그 검체 중의 HDL-C, VLDL-C, CM-C 및 LgLDL-C 를 제거하는 공정
    (ii) 폴리옥시에틸렌알킬에테르, 폴리옥시에틸렌폴리옥시알킬렌알킬에테르 (그 알킬은 탄소수 10 이상의 알킬), 폴리옥시에틸렌알킬페닐에테르, 폴리옥시에틸렌폴리옥시알킬렌알킬페닐에테르, 폴리옥시에틸렌 다고리 페닐에테르, 폴리옥시에틸렌폴리옥시알킬렌 다고리 페닐에테르, 일반식 (II)
    [화학식 10]
    Figure 112014039407811-pct00031
    (식 중, d, e 및 f 는 동일하거나 상이하고, 1 ∼ 200 의 정수를 나타낸다) 로 나타내는 폴리옥시에틸렌폴리옥시프로필렌 축합물 및 폴리옥시에틸렌폴리옥시알킬렌알킬아민으로 이루어지는 군에서 선택되는 계면 활성제를 첨가하여, 과산화수소 또는 환원형 조효소를 생성시키고, 생성된 과산화수소 또는 환원형 조효소를 측정하는 공정
    (iii) 이미 알려진 농도의 sdLDL-C 를 함유하는 표준 검체를 사용하여, 상기 (i) 및 (ii) 의 공정을 실시하여 과산화수소 또는 환원형 조효소를 생성시키고, 생성된 과산화수소 또는 환원형 조효소를 측정하고, sdLDL-C 농도와 과산화수소 또는 환원형 조효소에 관련된 측정값을 관련지어, 그 검체 중의 sdLDL-C 농도를 결정하는 공정
  2. 제 1 항에 있어서,
    공정 (i) 을 알부민 존재하에서 실시하는 방법.
  3. (a) 폴리옥시에틸렌알킬아민, 아민옥사이드류, 알킬베타인, 알킬암모니오-1-프로판술폰산염, 산아미드알킬베타인, 폴리옥시에틸렌벤질-알킬4급암모늄염, 폴리옥시에틸렌지방산아미드, 폴리옥시에틸렌 다고리 페닐에테르황산에스테르염, 폴리옥시에틸렌알킬페닐에테르황산에스테르염, 폴리옥시에틸렌지방산아미드황산에스테르염, 폴리옥시에틸렌알킬아민황산에스테르염, N-아실타우린염, N-아실아미노산염, 에틸렌디아민-폴리옥시에틸렌폴리옥시프로필렌 축합물, 폴리에틸렌글리콜을 함유하지 않는 폴리프로필렌글리콜 유도체, 일반식 (I)
    [화학식 11]
    Figure 112014039407811-pct00032
    (식 중, a, b 및 c 는 동일하거나 상이하고, 1 ∼ 200 의 정수를 나타낸다) 로 나타내는 폴리옥시에틸렌폴리옥시프로필렌 축합물 및 폴리옥시에틸렌폴리옥시알킬렌알킬에테르 (그 알킬은 탄소수 9 이하의 알킬) 로 이루어지는 군에서 선택되는 계면 활성제, 콜레스테롤에스테르 가수 분해 효소, 콜레스테롤 산화 효소, 및 과산화수소 제거 시약을 함유하는 제 1 시약과, (b) 폴리옥시에틸렌알킬에테르, 폴리옥시에틸렌폴리옥시알킬렌알킬에테르 (그 알킬은 탄소수 10 이상의 알킬), 폴리옥시에틸렌알킬페닐에테르, 폴리옥시에틸렌폴리옥시알킬렌알킬페닐에테르, 폴리옥시에틸렌 다고리 페닐에테르, 폴리옥시에틸렌폴리옥시알킬렌 다고리 페닐에테르, 일반식 (II)
    [화학식 12]
    Figure 112014039407811-pct00033
    (식 중, d, e 및 f 는 동일하거나 상이하고, 1 ∼ 200 의 정수를 나타낸다) 로 나타내는 폴리옥시에틸렌폴리옥시프로필렌 축합물 및 폴리옥시에틸렌폴리옥시알킬렌알킬아민으로 이루어지는 군에서 선택되는 계면 활성제 및 과산화수소 측정 시약을 함유하는 제 2 시약을 함유하는 것을 특징으로 하는 검체 중의 sdLDL-C 정량용 키트.
  4. (a) 폴리옥시에틸렌알킬아민, 아민옥사이드류, 알킬베타인, 알킬암모니오-1-프로판술폰산염, 산아미드알킬베타인, 폴리옥시에틸렌벤질-알킬4급암모늄염, 폴리옥시에틸렌지방산아미드, 폴리옥시에틸렌 다고리 페닐에테르황산에스테르염, 폴리옥시에틸렌알킬페닐에테르황산에스테르염, 폴리옥시에틸렌지방산아미드황산에스테르염, 폴리옥시에틸렌알킬아민황산에스테르염, N-아실타우린염, N-아실아미노산염, 에틸렌디아민-폴리옥시에틸렌폴리옥시프로필렌 축합물, 폴리에틸렌글리콜을 함유하지 않는 폴리프로필렌글리콜 유도체, 일반식 (I)
    [화학식 13]
    Figure 112014039407811-pct00034
    (식 중, a, b 및 c 는 동일하거나 상이하고, 1 ∼ 200 의 정수를 나타낸다) 로 나타내는 폴리옥시에틸렌폴리옥시프로필렌 축합물 및 폴리옥시에틸렌폴리옥시알킬렌알킬에테르 (그 알킬은 탄소수 9 이하의 알킬) 로 이루어지는 군에서 선택되는 계면 활성제, 콜레스테롤에스테르 가수 분해 효소, 산화형 조효소 및 콜레스테롤 탈수소 효소를 함유하는 제 1 시약과, (b) 폴리옥시에틸렌알킬에테르, 폴리옥시에틸렌폴리옥시알킬렌알킬에테르 (그 알킬은 탄소수 10 이상의 알킬), 폴리옥시에틸렌알킬페닐에테르, 폴리옥시에틸렌폴리옥시알킬렌알킬페닐에테르, 폴리옥시에틸렌 다고리 페닐에테르, 폴리옥시에틸렌폴리옥시알킬렌 다고리 페닐에테르, 일반식 (II)
    [화학식 14]
    Figure 112014039407811-pct00035
    (식 중, d, e 및 f 는 동일하거나 상이하고, 1 ∼ 200 의 정수를 나타낸다) 로 나타내는 폴리옥시에틸렌폴리옥시프로필렌 축합물 및 폴리옥시에틸렌폴리옥시알킬렌알킬아민으로 이루어지는 군에서 선택되는 계면 활성제를 함유하는 제 2 시약을 함유하는 것을 특징으로 하는 검체 중의 sdLDL-C 정량용 키트.
  5. 제 3 항 또는 제 4 항에 있어서,
    적어도 제 1 시약에 알부민을 함유하는 키트.
  6. 제 3 항 또는 제 4 항에 있어서,
    제 3 시약으로서, 이미 알려진 농도의 sdLDL 을 함유하는 표준품을 함유하는 키트.
  7. 제 5 항에 있어서,
    제 3 시약으로서, 이미 알려진 농도의 sdLDL 을 함유하는 표준품을 함유하는 키트.
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