CN103415623A - Hdl亚组分中的胆固醇的测定方法、测定用试剂以及测定用试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明提供简便并且准确地测定样品中的HDL亚组分中的胆固醇的方法。一种样品中的HDL3中的胆固醇的测定方法，其特征在于，使样品与(1)胆固醇酯水解酶和胆固醇氧化酶的组合或(2)胆固醇酯水解酶、氧化型辅酶和胆固醇脱氢酶的组合在水性介质中反应，在没有分离除去HDL3以外的脂蛋白的情况下测定生成的物质或消耗的物质，所述水性介质含有(a)2价金属盐、(b)选自由硫酸盐、硝酸盐、碳酸盐、乙酸盐和卤化物组成的组中的碱金属盐以及(c)硫酸葡聚糖或其盐。
Description
技术领域
本发明涉及样品中的HDL亚组分中的胆固醇的测定方法、测定用试剂以及测定用试剂盒。
背景技术
高密度脂蛋白(HDL)为脂蛋白之一，具有1.063～1.210的比重。已知HDL中的胆固醇(HDL-C)是冠状动脉疾病(CHD)的负面危险因子。近年来，对于作为HDL的亚组分的HDL2和HDL3的临床意义的关注提高。HDL2为比重1.063～1.125的脂蛋白，HDL3为比重1.125～1.210的脂蛋白。
从肝脏或肠道分泌出的新生HDL粘着在末梢的细胞膜上，并由此处摄取游离型胆固醇，所摄取的游离型胆固醇由于HDL表面上存在的LCAT(卵磷脂胆固醇酰基转移酶)的作用而转化成酯型胆固醇，得到以该酯型胆固醇为核心的球状的HDL3。HDL3进一步由于LCAT的作用而酯型胆固醇增加，成为HDL2。
HDL2中的胆固醇通过两个途径代谢。一个是连同HDL2一起直接被摄入肝脏并以胆汁酸的形式排出的途径，另一个是HDL2中的酯型胆固醇由于CETP(胆固醇酯转移蛋白)的作用与极低密度脂蛋白(VLDL)、中密度脂蛋白(IDL)、低密度脂蛋白(LDL)等中性脂肪丰富的脂蛋白内的中性脂肪交换而转运至该中性脂肪丰富的脂蛋白中的途径(胆固醇逆向转运)。
关于HDL亚组分中的胆固醇的测定方法，至今，已知有伴有HDL3与HDL2的分离步骤的沉淀法、没有伴有HDL3与HDL2的分离步骤的匀相法。
作为沉淀法，已知：使用肝素、2价金属离子以及硫酸葡聚糖的、利用一个阶段的分离操作的、样品中的HDL3中的胆固醇的测定方法(例如，专利文献1、非专利文献1)；利用两个阶段的分离操作的、样品中的HDL3中的胆固醇的测定方法(例如，非专利文献2～4)等。利用一个阶段的分离操作的、样品中的HDL3中的胆固醇的测定方法是使样品中的HDL3以外的脂蛋白凝聚并分离除去而测定所得到的HDL3中的胆固醇的方法。利用两个阶段的分离操作的、样品中的HDL3中的胆固醇的测定方法为如下方法：首先，使样品中的HDL以外的脂蛋白凝聚，通过离心分离除去HDL以外的脂蛋白，接着，使所得到的含有HDL的上清液中的HDL2凝聚，通过离心分离除去HDL2，回收上清液中包含的HDL3，测定所得到的HDL3中的胆固醇。
作为匀相法，已知使用对HDL显示出高特异性的酶以及HLB值为17以上的非离子性表面活性剂的方法(例如，专利文献2)。
正在寻求没有伴有离心分离等烦杂的操作的、简便并且准确的样品中的HDL亚组分中的胆固醇的测定方法。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：日本特开2009-207463号公报
专利文献2：日本特开2001-346598号公报
非专利文献
非专利文献1：ジャーナルオブリピッドリサーチ(Journal ofLipid Research)、49卷、5号、1130-1136页(2008年)
非专利文献2：クリニカルケミストリ(Clinical Chemistry)、34卷、11号、2322-2327页(1998年)
非专利文献3：クリニカルケミストリ(Clinical Chemistry)、36卷、2号、265-270页(1999年)
非专利文献4：ジャーナルオブリピッドリサーチ(Journal ofLipid Research)、23卷、8号、1206-1223页(1982年)
发明内容
发明要解决的问题
本发明的目的在于提供简便并且准确地测定样品中的HDL亚组分中的胆固醇的方法、试剂以及试剂盒。
用于解决问题的方法
本发明人为了解决上述问题，反复进行了深入的研究，结果发现如下见解：通过使用胆固醇测定用酶、2价金属盐、特定的碱金属盐以及硫酸葡聚糖或其盐，能够在没有分离除去HDL3以外的脂蛋白的情况下测定HDL3中的胆固醇，从而完成了本发明。即，本发明涉及以下的[1]～[19]。
[1]一种样品中的HDL3中的胆固醇的测定方法，其特征在于，使样品与(1)胆固醇酯水解酶和胆固醇氧化酶的组合或(2)胆固醇酯水解酶、氧化型辅酶和胆固醇脱氢酶的组合在水性介质中反应，在没有分离除去HDL3以外的脂蛋白的情况下测定生成的物质或消耗的物质，上述水性介质含有(a)2价金属盐、(b)选自由硫酸盐、硝酸盐、碳酸盐、乙酸盐和卤化物组成的组中的碱金属盐以及(c)硫酸葡聚糖或其盐。
[2]如上述[1]所述的方法，其中，2价金属盐为镁盐或钙盐。
[3]如上述[1]或[2]所述的方法，其中，硫酸葡聚糖或其盐在反应液中的浓度为0.75～2.6g/L。
[4]如上述[1]～[3]中任一项所述的方法，其中，反应液中的来自2价金属盐的2价金属离子的浓度为12～20毫摩尔/L，反应液中的来自碱金属盐的碱金属离子的浓度为5～21毫摩尔/L。
[5]一种样品中的HDL2中的胆固醇的测定方法，其特征在于，包括以下的步骤：
(1)测定样品中的高密度脂蛋白(HDL)中的胆固醇的步骤；
(2)通过上述[1]～[4]中任一项所述的测定方法测定样品中的HDL3中的胆固醇的步骤；和
(3)从上述(1)步骤中测定的测定值中减去(2)步骤中测定的测定值的步骤。
[6]一种样品中的HDL3中的胆固醇的测定用试剂，用于通过上述[1]～[4]中任一项所述的测定方法在没有分离除去HDL3以外的脂蛋白的情况下测定样品中的HDL3中的胆固醇，其特征在于，含有胆固醇酯水解酶、胆固醇氧化酶、过氧化氢测定用试剂、(a)2价金属盐、(b)选自由硫酸盐、硝酸盐、碳酸盐、乙酸盐和卤化物组成的组中的碱金属盐以及(c)硫酸葡聚糖或其盐。
[7]一种样品中的HDL3中的胆固醇的测定用试剂，用于通过上述[1]～[4]中任一项所述的测定方法在没有分离除去HDL3以外的脂蛋白的情况下测定样品中的HDL3中的胆固醇，其特征在于，含有胆固醇酯水解酶、氧化型辅酶、胆固醇脱氢酶、(a)2价金属盐、(b)选自由硫酸盐、硝酸盐、碳酸盐、乙酸盐和卤化物组成的组中的碱金属盐以及(c)硫酸葡聚糖或其盐。
[8]如上述[7]所述的试剂，其中，还含有还原型辅酶测定用试剂。
[9]如上述[6]～[8]中任一项所述的试剂，其中，2价金属盐为镁盐或钙盐。
[10]如上述[6]～[9]中任一项所述的试剂，其中，硫酸葡聚糖或其盐以在反应液中的浓度达到0.75～2.6g/L的含量含有。
[11]如上述[6]～[10]中任一项所述的试剂，其中，2价金属盐以在反应液中的来自2价金属盐的2价金属离子的浓度达到12～20毫摩尔/L的含量含有，碱金属盐以在反应液中的来自碱金属盐的碱金属离子的浓度达到5～21毫摩尔/L的含量含有。
[12]一种试剂盒，含有第一试剂和第二试剂，用于通过上述[1]～[4]中任一项所述的测定方法在没有分离除去HDL3以外的脂蛋白的情况下测定样品中的HDL3中的胆固醇，其特征在于，在第一试剂中含有(a)2价金属盐、(b)选自由硫酸盐、硝酸盐、碳酸盐、乙酸盐和卤化物组成的组中的碱金属盐以及(c)硫酸葡聚糖或其盐，在第二试剂中含有胆固醇氧化酶，在第一试剂和第二试剂中的任意一者或两者中含有过氧化氢测定用试剂，在第一试剂和第二试剂中的任意一者或两者中含有胆固醇酯水解酶。
[13]一种试剂盒，含有第一试剂和第二试剂，用于通过上述[1]～[4]中任一项所述的测定方法在没有分离除去HDL3以外的脂蛋白的情况下测定样品中的HDL3中的胆固醇，其特征在于，在第一试剂中含有(a)2价金属盐、(b)选自由硫酸盐、硝酸盐、碳酸盐、乙酸盐和卤化物组成的组中的碱金属盐以及(c)硫酸葡聚糖或其盐，在第二试剂中含有胆固醇脱氢酶，在第一试剂和第二试剂中的任意一者或两者中含有氧化型辅酶，在第一试剂和第二试剂中的任意一者或两者中含有胆固醇酯水解酶。
[14]如上述[13]所述的试剂盒，其中，在第一试剂和第二试剂中的任意一者或两者中还含有还原型辅酶测定用试剂。
[15]如上述[12]～[14]中任一项所述的试剂盒，其中，2价金属盐为镁盐或钙盐。
[16]如上述[12]～[15]中任一项所述的试剂盒，其中，硫酸葡聚糖或其盐以在反应液中的浓度达到0.75～2.6g/L的含量含有。
[17]如上述[12]～[16]中任一项所述的试剂盒，其中，2价金属盐以在反应液中的来自2价金属盐的2价金属离子的浓度达到12～20毫摩尔/L的含量含有，碱金属盐以在反应液中的来自碱金属盐的碱金属离子的浓度达到5～21毫摩尔/L的含量含有。
[18]一种样品中的HDL2中的胆固醇的测定用试剂盒，其特征在于，含有上述[6]～[11]中任一项所述的HDL3中的胆固醇测定用试剂和HDL胆固醇测定用试剂。
[19]一种样品中的HDL2中的胆固醇的测定用试剂盒，其特征在于，含有上述[12]～[17]中任一项所述的HDL3中的胆固醇测定用试剂盒的第一试剂和第二试剂以及HDL胆固醇测定用试剂。
发明效果
通过本发明，能够提供简便并且准确地测定样品中的HDL亚组分中的胆固醇的方法、试剂以及试剂盒。
具体实施方式
<HDL3中的胆固醇的测定方法>
本发明的样品中的HDL3中的胆固醇(以下记为HDL3-C)的测定方法，是无需利用离心分离等物理方法进行脂蛋白的分离除去的方法，而且是在HDL3-C的测定之前没有除去样品中的HDL3以外的脂蛋白中的胆固醇的情况下测定样品中的HDL3-C的方法。
本发明的HDL3-C测定方法的特征在于，使样品与胆固醇测定用酶在含有(a)镁盐或钙盐、(b)选自由硫酸盐、硝酸盐、碳酸盐、乙酸盐和卤化物组成的组中的碱金属盐以及(c)硫酸葡聚糖或其盐的水性介质中反应，在没有分离除去HDL3以外的脂蛋白的情况下测定生成的物质或消耗的物质。作为胆固醇测定用酶，可以列举例如：胆固醇酯水解酶和胆固醇氧化酶的组合、以及胆固醇酯水解酶、氧化型辅酶和胆固醇脱氢酶的组合等。
本发明的测定方法包括：
(1)使样品与胆固醇测定用酶在含有(a)2价金属盐、(b)选自由硫酸盐、硝酸盐、碳酸盐、乙酸盐和卤化物组成的组中的碱金属盐以及(c)硫酸葡聚糖或其盐的水性介质中反应的步骤；
(2)在没有分离除去HDL3以外的脂蛋白的情况下测定通过步骤(1)的反应生成的物质或消耗的物质的步骤；
(3)使预先使用已知浓度的HDL3-C制作的标准曲线与上述(2)中的测定值相关的步骤，其中，所述标准曲线表示HDL3-C浓度与来自该生成的物质或该消耗的物质的信息量的关系；以及
(4)确定样品中的HDL3-C浓度的步骤。
在此，作为步骤(1)中的胆固醇测定用酶，可以列举上述胆固醇测定用酶等。
作为步骤(2)中的、通过步骤(1)的反应生成的物质，在使用胆固醇酯水解酶和胆固醇氧化酶的组合作为胆固醇测定用酶的情况下，可以列举过氧化氢等，在使用胆固醇酯水解酶、氧化型辅酶和胆固醇脱氢酶的组合作为胆固醇测定用酶的情况下，可以列举还原型辅酶等。
作为步骤(2)中的、通过步骤(1)的反应消耗的物质，在使用胆固醇酯水解酶和胆固醇氧化酶的组合作为胆固醇测定用酶的情况下，可以列举氧气分子等。
本发明的测定方法中，通过样品与胆固醇酯水解酶以及胆固醇氧化酶的反应生成的过氧化氢，可以使用例如过氧化氢电极或后述的过氧化氢测定用试剂来测定。
本发明的测定方法中，通过样品与胆固醇酯水解酶、氧化型辅酶以及胆固醇脱氢酶的反应生成的还原型辅酶，可以使用例如吸光度法或后述的还原型辅酶测定用试剂来测定。作为吸光度法，只要是能够使用吸光度测定还原型辅酶的方法，则没有特别限定，可以列举例如：在还原型辅酶的最大吸收波长(λmax=340nm)附近的波长处测定还原型辅酶的吸光度的方法等。
消耗的氧气分子可以使用例如氧电极来测定。
作为本发明的测定方法中使用的样品，可以列举例如全血、血浆、血清等，优选血浆以及血清。
作为本发明中的胆固醇酯水解酶，只要是具有水解胆固醇酯的能力的酶，则没有特别限定，除了例如来自动物、植物或微生物的胆固醇酯酶、脂蛋白脂肪酶之外，也可以使用通过基因工程的方法制造的胆固醇酯酶、脂蛋白脂肪酶等。
作为胆固醇酯水解酶，除了无修饰的胆固醇酯水解酶之外，也可以使用经过化学修饰的胆固醇酯水解酶。另外，作为胆固醇酯水解酶，也可以使用市售品。
作为市售的胆固醇酯水解酶，可以列举：胆固醇酯酶(COE-311；东洋纺织公司制)、脂蛋白脂肪酶(LPL-311；东洋纺织公司制)、胆固醇酯酶(CHE“Amano”3；天野酶株式会社制)、胆固醇酯酶(EST“Amano”2；天野酶株式会社制)等。另外，本发明中，也可以组合使用两种以上的胆固醇酯水解酶。
作为在胆固醇酯水解酶的化学修饰中修饰该酶的基团(化学修饰基团)，可以列举例如：以聚乙二醇作为主要成分的基团、以聚丙二醇作为主要成分的基团、具有聚丙二醇与聚乙二醇的共聚物的基团、含有水溶性多糖类的基团、磺丙基、磺丁基、聚氨酯基、具有螯合功能的基团等，优选为以聚乙二醇作为主要成分的基团。作为水溶性多糖类，可以列举例如葡聚糖、普鲁兰多糖、可溶性淀粉等。
作为用于对胆固醇酯水解酶进行化学修饰的试剂(化学修饰剂)，可以列举同时具有上述化学修饰基团和能与酶的氨基、羧基、巯基等反应的官能团或结构的化合物等。作为能与酶中的氨基反应的官能团或结构，可以列举例如羧基、活性酯基(N-羟基琥珀酰亚胺基等)、酸酐、酰氯、醛、环氧化物基团、1,3-丙烷磺内酯、1,4-丁烷磺内酯等。作为能与酶中的羧基反应的官能团或结构，可以列举例如氨基等。作为与酶中的巯基具有反应性的基团或结构，可以列举例如马来酰亚胺基、二硫化物、α-卤代酯(α-碘酯等)等。
作为化学修饰剂，也可以使用市售品。作为市售的化学修饰剂，可以列举：具有以聚乙二醇作为主要成分的基团和N-羟基琥珀酰亚胺基的サンブライトVFM-4101、サンブライトME-050AS、サンブライトDE-030AS(均为日油公司制)、具有以聚亚烷基二醇作为主要成分的基团和酸酐结构的サンブライトAKM系列(例如，サンブライトAKM-1510等)、サンブライトADM系列、サンブライトACM系列(均为日油公司制)、具有以聚乙二醇作为主要成分的基团和环氧化物基团的EPOX-3400、M-EPOX-5000(均为Sheawater Polymers公司制)、具备具有螯合功能的基团和酸酐结构的二亚乙基三胺-N,N,N’,N’’,N’’-五乙酸二酐(DTPA anhydride；同仁化学研究所公司制)等。
胆固醇酯水解酶的化学修饰，例如可以通过以下的方法进行，但不限于此方法。首先，将胆固醇酯水解酶溶解在pH8.0以上的缓冲液(例如HEPES缓冲液)中，在0～55℃下添加0.01～500倍摩尔量的化学修饰剂，搅拌5分钟～5小时。酶反应中，作为经过化学修饰的胆固醇酯水解酶，不仅可以使用该反应液本身，也可以使用根据需要利用超滤膜等除去未反应的化学修饰剂等后而得到的物质。
作为本发明的测定方法中的胆固醇酯水解酶的浓度，只要是能够进行本发明的HDL3-C测定的浓度，则没有特别限定，在反应液中的浓度通常为0.001～800kU/L，优选为0.01～300kU/L。
作为本发明中的胆固醇氧化酶，只要是具有将胆固醇氧化而生成过氧化氢的能力的酶，则没有特别限定，例如，除了来自动物、植物或微生物的胆固醇氧化酶之外，也可以使用通过基因工程的方法制造的胆固醇氧化酶等，还可以使用胆固醇氧化酶(CHODI；协和发酵工业公司制)、胆固醇氧化酶(CHODI；キッコーマン公司制)、胆固醇氧化酶(CHO-CE；キッコーマン公司制)、胆固醇氧化酶(COO321；东洋纺织公司制)、胆固醇氧化酶(COO322；东洋纺织公司制)等市售品。另外，本发明中，也可以组合使用两种以上的胆固醇氧化酶。
胆固醇氧化酶可以为无修饰的酶，也可以为经过化学修饰的酶。经过化学修饰的胆固醇氧化酶，例如可以使用上述的化学修饰剂通过上述的化学修饰方法来制备。
作为本发明的测定方法中的胆固醇氧化酶的浓度，只要是能够进行本发明的HDL3-C测定的浓度，则没有特别限定，在反应液中的浓度通常为0.001～800kU/L，优选为0.01～300kU/L。
作为本发明中的胆固醇脱氢酶，只要是具有在氧化型辅酶存在下将胆固醇氧化而生成还原型辅酶的能力的酶，则没有特别限定，例如，除了来自动物、植物或微生物的胆固醇脱氢酶之外，也可以使用通过基因工程的方法制造的胆固醇脱氢酶等。还可以使用胆固醇脱氢酶(CHDH“Amano”5；天野酶公司制)等市售品。另外，本发明中，也可以组合使用两种以上的胆固醇脱氢酶。胆固醇脱氢酶可以为无修饰的酶，也可以为经过化学修饰的酶。经过化学修饰的胆固醇脱氢酶，例如可以使用上述的化学修饰剂通过上述的化学修饰方法来制作。
作为本发明的测定方法中的胆固醇脱氢酶的浓度，只要是能够进行本发明的HDL3-C测定的浓度，则没有特别限定，在反应液中的浓度通常为0.001～800kU/L，优选为0.01～300kU/L。
在本发明的使用胆固醇脱氢酶的测定方法中，使用氧化型辅酶。作为氧化型辅酶，可以列举例如NAD、NADP、硫代-NAD、硫代-NADP等。
作为本发明的测定方法中的氧化型辅酶的浓度，只要是能够进行本发明的HDL3-C测定的浓度，则没有特别限定，在反应液中的浓度通常为0.01～400毫摩尔/L，优选为0.1～100毫摩尔/L。
作为本发明中的还原型辅酶，可以列举例如NADH、NADPH、硫代-NADH、硫代-NADPH等。
作为本发明中使用的2价金属盐，只要是能够进行本发明的HDL3-C测定的2价金属盐，则没有特别限定，可以列举例如镁盐、钙盐、锰盐等，优选镁盐或钙盐。另外，本发明中，也可以使用2价金属盐的水合物等。作为镁盐，只要是能够进行本发明的HDL3-C测定的镁盐，则没有特别限定，可以列举例如氯化镁、硝酸镁、硫酸镁等。作为钙盐，只要是能够进行本发明的HDL3-C测定的钙盐，则没有特别限定，可以列举例如氯化钙、硝酸钙、硫酸钙等。
作为本发明的测定方法中的2价金属盐在反应液中的浓度，只要是能够进行本发明的HDL3-C测定的浓度，则没有特别限定，通常为12～20毫摩尔/L，优选为13～19毫摩尔/L。
本发明的测定方法中的碱金属盐，为选自由硫酸盐、硝酸盐、碳酸盐、乙酸盐以及卤化物组成的组中的碱金属盐，可以列举例如：硫酸锂、硝酸锂、碳酸锂、乙酸锂、氟化锂、氯化锂、溴化锂、碘化锂、硫酸钠、硝酸钠、碳酸钠、乙酸钠、氟化钠、氯化钠、溴化钠、碘化钠、硫酸钾、硝酸钾、碳酸钾、乙酸钾、氟化钾、氯化钾、溴化钾、碘化钾等。
作为本发明的测定方法中的选自由硫酸盐、硝酸盐、碳酸盐、乙酸盐以及卤化物组成的组中的碱金属盐在反应液中的浓度，只要是能够进行本发明的HDL3-C测定的浓度，则没有特别限定，通常为5～21毫摩尔/L，优选为6～18毫摩尔/L。
本发明的测定方法中的硫酸葡聚糖或其盐，只要是能够进行本发明的HDL3-C测定的硫酸葡聚糖或其盐，则没有特别限定，优选分子量为4万～50万的硫酸葡聚糖或其盐。作为盐，只要是能够进行本发明的HDL3-C测定的盐，则没有特别限定，可以列举例如钠盐等。作为本发明的测定方法中的硫酸葡聚糖或其盐在反应液中的浓度，只要是能够进行本发明的HDL3-C测定的浓度，则没有特别限定，通常为0.75～2.6g/L，优选为1.0～2.3g/L。
本发明中使用的水性介质，只要是能够进行本发明的HDL3-C测定方法的水性介质，则没有特别限定，可以列举例如去离子水、蒸馏水、缓冲液等，优选缓冲液。
本发明的HDL3-C测定方法中的pH，只要是能够进行本发明的HDL3-C测定方法的pH即可，可以列举例如pH4～10。在使用缓冲液作为水性介质的情况下，优选使用与设定的pH对应的缓冲剂。作为缓冲液中使用的缓冲剂，可以列举例如三(羟甲基)氨基甲烷缓冲剂、磷酸缓冲剂、硼酸缓冲剂、Good's缓冲剂等。
作为Good's缓冲剂，可以列举例如：2-(N-吗啉基)乙磺酸(MES)、双(2-羟乙基)亚氨基三(羟甲基)甲烷(Bis-Tris)、N-(2-乙酰胺基)亚氨基二乙酸(ADA)、哌嗪-N,N’-双(2-乙磺酸)(PIPES)、N-(2-乙酰胺基)-2-氨基乙磺酸(ACES)、3-(N-吗啉基)-2-羟基丙磺酸(MOPSO)、N,N-双(2-羟乙基)-2-氨基乙磺酸(BES)、3-(N-吗啉基)丙磺酸(MOPS)、N-[三(羟甲基)甲基]-2-氨基乙磺酸(TES)、2-[4-(2-羟乙基)-1-哌嗪基]乙磺酸(HEPES)、3-[N,N-双(2-羟乙基)氨基]-2-羟基丙磺酸(DIPSO)、N-[三(羟甲基)甲基]-2-羟基-3-氨基丙磺酸(TAPSO)、哌嗪-N,N’-双(2-羟基丙磺酸)(POPSO)、3-[4-(2-羟乙基)-1-哌嗪基]-2-羟基丙磺酸(HEPPSO)、3-[4-(2-羟乙基)-1-哌嗪基]丙磺酸[(H)EPPS]、N-[三(羟甲基)甲基]甘氨酸(Tricine)、N,N-双(2-羟乙基)甘氨酸(Bicine)、N-三(羟甲基)甲基-3-氨基丙磺酸(TAPS)、N-环己基-2-氨基乙磺酸(CHES)、N-环己基-3-氨基-2-羟基丙磺酸(CAPSO)、N-环己基-3-氨基丙磺酸(CAPS)等。
缓冲液的浓度只要是适于测定的浓度，则没有特别限定，优选为0.001～2.0摩尔/L，更优选为0.005～1.0摩尔/L。
本发明的HDL3-C测定方法中的反应温度，只要是能够进行本发明的HDL3-C测定方法的温度，则没有特别限定，优选为10～50℃，更优选为30～40℃。通过广泛使用的自动分析装置设定的反应温度通常为37℃。
本发明的HDL3-C测定方法中的反应时间，只要是能够进行本发明的HDL3-C测定方法的反应时间，则没有特别限定，优选为1～60分钟，更优选为2～30分钟。
本发明的HDL3-C测定方法中，在使用胆固醇酯水解酶和胆固醇氧化酶的组合作为胆固醇测定用酶的情况下，HDL3-C的测定可以通过测定由反应生成的过氧化氢的量来进行。
生成的过氧化氢的量，可以使用例如过氧化氢电极或过氧化氢测定用试剂来测定。过氧化氢测定用试剂是用于将生成的过氧化氢转化为能够检测的物质的试剂。作为能够检测的物质，可以列举例如色素、发光等，优选色素。在能够检测的物质为色素的情况下，过氧化氢测定用试剂含有氧化发色型色原体以及过氧化物酶等过氧化活性物质。作为氧化发色型色原体，可以列举例如后述的氧化发色型色原体。在能够检测的物质为发光的情况下，过氧化氢测定用试剂含有化学发光物质。作为化学发光物质，可以列举例如鲁米诺、异鲁米诺、光泽精、吖啶酯等。
在使用含有氧化发色型色原体以及过氧化物酶等过氧化活性物质的试剂作为过氧化氢测定用试剂的情况下，过氧化氢可以通过在过氧化活性物质存在下与氧化发色型色原体反应生成色素并测定生成的色素来进行测定。另外，在使用含有化学发光物质的过氧化氢测定用试剂的情况下，过氧化氢可以通过与化学发光物质反应产生光子并测定产生的光子来进行测定。
作为氧化发色型色原体，可以列举例如无色型色原体、氧化偶联发色型色原体等。无色型色原体是能够在过氧化氢以及过氧化物酶等过氧化活性物质存在下单独转变成色素的物质。具体而言，可以列举四甲基联苯胺、邻苯二胺、10-N-羧甲基氨基甲酰基-3,7-双(二甲基氨基)-10H-吩噻嗪(CCAP)、10-N-甲基氨基甲酰基-3,7-双(二甲基氨基)-10H-吩噻嗪(MCDP)、N-(羧甲基氨基羰基)-4,4’-双(二甲基氨基)二苯胺钠盐(DA-64)、10-N-(羧甲基氨基羰基)-3,7-双(二甲基氨基)-10H-吩噻嗪钠盐(DA-67)、4,4’-双(二甲基氨基)二苯胺、双[3-双(4-氯苯基)甲基-4-二甲基氨基苯基]胺(BCMA)等。
氧化偶联发色型色原体是在过氧化氢以及过氧化物酶等过氧化活性物质存在下由两种化合物氧化偶联而生成色素的物质。作为两种化合物的组合，可以列举偶联剂与苯胺类的组合、偶联剂与酚类的组合等。
作为偶联剂，可以列举例如4-氨基安替比林(4-AA)、3-甲基-2-苯并噻唑啉酮腙等。
作为苯胺类，可以列举N-(3-磺丙基)苯胺、N-乙基-N-(2-羟基-3-磺丙基)-3-甲基苯胺(TOOS)、N-乙基-N-(2-羟基-3-磺丙基)-3,5-二甲基苯胺(MAOS)、N-乙基-N-(2-羟基-3-磺丙基)-3,5-二甲氧基苯胺(DAOS)、N-乙基-N-(3-磺丙基)-3-甲基苯胺(TOPS)、N-(2-羟基-3-磺丙基)-3,5-二甲氧基苯胺(HDAOS)、N,N-二甲基-3-甲基苯胺、N,N-二(3-磺丙基)-3,5-二甲氧基苯胺、N-乙基-N-(3-磺丙基)-3-甲氧基苯胺、N-乙基-N-(3-磺丙基)苯胺、N-乙基-N-(3-磺丙基)-3,5-二甲氧基苯胺、N-(3-磺丙基)-3,5-二甲氧基苯胺、N-乙基-N-(3-磺丙基)-3,5-二甲基苯胺、N-乙基-N-(2-羟基-3-磺丙基)-3-甲氧基苯胺、N-乙基-N-(2-羟基-3-磺丙基)苯胺、N-乙基-N-(3-甲基苯基)-N’-琥珀酰基乙二胺(EMSE)、N-(3,5-二甲氧基苯基)-N’-琥珀酰基乙二胺(DOSE)、N-乙基-N-(3-甲基苯基)-N’-乙酰基乙二胺、N-乙基-N-(2-羟基-3-磺丙基)-4-氟-3,5-二甲氧基苯胺(F-DAOS)、N-[2-(琥珀酰基氨基)乙基]-2-甲氧基-5-甲基苯胺(MASE)、N-乙基-N-[2-(琥珀酰基氨基)乙基]-2-甲氧基-5-甲基苯胺(Et-MASE)等。
作为酚类，可以列举苯酚、4-氯苯酚、3-甲基苯酚、3-羟基-2,4,6-三碘苯甲酸(HTIB)等。
在过氧化氢的测定中，过氧化活性物质的浓度只要是适于测定的浓度，则没有特别限定，在使用过氧化物酶作为过氧化活性物质的情况下，优选为1～100kU/L。另外，氧化发色型色原体的浓度，只要是适于过氧化氢的测定的浓度，则没有特别限定，优选为0.01～10g/L。
本发明的HDL3-C测定方法中，在使用胆固醇酯水解酶、氧化型辅酶和胆固醇脱氢酶的组合作为胆固醇测定用酶的情况下，HDL3-C的测定可以通过测定由反应生成的还原型辅酶的量来进行。
生成的还原型辅酶的量，可以使用例如吸光度法或还原型辅酶测定用试剂进行测定。作为吸光度法，可以列举例如上述的吸光度法等。还原型辅酶测定用试剂是用于将生成的还原型辅酶转化为能够检测的物质的试剂。作为能够检测的物质，可以列举例如色素等。
作为还原型辅酶测定用试剂，可以列举例如含有心肌黄酶、电子载体以及还原发色型色原体的试剂、含有还原型辅酶氧化酶的试剂、含有还原型辅酶氧化酶以及过氧化氢测定用试剂的试剂等。
在使用含有心肌黄酶、电子载体以及还原发色型色原体的试剂作为还原型辅酶测定用试剂的情况下，通过定量还原发色型色原体发生转化而生成的色素，能够定量还原型辅酶。作为电子载体，可以列举例如1-甲氧基-5-甲基酚嗪
硫酸甲酯盐等。
作为还原发色型色原体，可以列举例如3-(4,5-二甲基-2-噻唑基)-2,5-二苯基-2H-四氮唑溴化物(MTT)、2-(4-碘苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-(2,4-二磺苯基)-2H-四氮唑单钠盐(WST-1)、2-(4-碘苯基)-3-(2,4-二硝基苯基)-5-(2,4-二磺苯基)-2H-四氮唑单钠盐(WST-3)等。
在使用含有还原型辅酶氧化酶的试剂作为还原型辅酶测定用试剂的情况下，通过测定由还原发色型色原体与还原型辅酶氧化酶的反应生成的过氧化氢，能够测定还原型辅酶。生成的过氧化氢可以通过例如上述使用过氧化氢电极的方法、上述使用过氧化氢测定用试剂的方法等来测定。在利用使用过氧化氢测定用试剂的方法来测定还原型辅酶的情况下，还原型辅酶测定用试剂含有还原型辅酶氧化酶以及过氧化氢测定用试剂。
<HDL2中的胆固醇的测定方法>
HDL是由HDL2和HDL3两个亚组分构成的脂蛋白，因此，通过测定样品中的HDL胆固醇(总HDL胆固醇)，并从该总HDL胆固醇浓度中减去通过本发明的HDL3-C测定方法测定的样品中的HDL3-C浓度，能够测定该样品中的HDL2胆固醇(以下，记为HDL2-C)浓度。
即，本发明的样品中的HDL2-C的测定方法是包括以下步骤的方法。
(1)测定样品中的HDL中的胆固醇的步骤；
(2)通过本发明的HDL3-C的测定方法来测定样品中的HDL3-C的步骤；
(3)从上述(1)步骤中测定的测定值中减去(2)步骤中测定的测定值的步骤。
步骤(1)中的HDL中的胆固醇(以下，记为HDL-C)的测定，只要是能够进行样品中的总HDL中的胆固醇的测定的方法，则没有特别限定，可以通过例如日本特开平8-131197号公报、WO2004/035816号小册子、WO2006/118199号小册子等中记载的方法进行。另外，HDL-C的测定也可以使用市售的HDL-C测定用试剂以及HDL-C测定用试剂盒进行。作为市售的HDL-C测定用试剂以及HDL-C测定试剂盒，可以列举例如“メタボリードHDL-C”(协和梅迪克斯公司制)、“デタミナーLHDL-C”(协和梅迪克斯公司制)等。
步骤(2)中的HDL3-C的测定可以通过上述HDL3-C测定方法来进行。
<HDL3-C测定用试剂>
本发明的HDL3-C测定用试剂是在本发明的HDL3-C测定方法中使用的试剂。
以下记述本发明的HDL3-C测定用试剂的方式。
测定用试剂1
含有胆固醇酯水解酶、胆固醇氧化酶、(a)2价金属盐、(b)选自由硫酸盐、硝酸盐、碳酸盐、乙酸盐和卤化物组成的组中的碱金属盐、以及(c)硫酸葡聚糖或其盐的试剂
测定用试剂2
含有胆固醇酯水解酶、胆固醇氧化酶、(a)2价金属盐、(b)选自由硫酸盐、硝酸盐、碳酸盐、乙酸盐和卤化物组成的组中的碱金属盐、(c)硫酸葡聚糖或其盐、以及过氧化氢测定用试剂的试剂
测定用试剂3
含有胆固醇酯水解酶、氧化型辅酶、胆固醇脱氢酶、(a)2价金属盐、(b)选自由硫酸盐、硝酸盐、碳酸盐、乙酸盐和卤化物组成的组中的碱金属盐、以及(c)硫酸葡聚糖或其盐的试剂
测定用试剂4
含有胆固醇酯水解酶、氧化型辅酶、胆固醇脱氢酶、(a)2价金属盐、(b)选自由硫酸盐、硝酸盐、碳酸盐、乙酸盐和卤化物组成的组中的碱金属盐、(c)硫酸葡聚糖或其盐、以及还原型辅酶测定用试剂的试剂
本发明的HDL3-C测定用试剂可以为冷冻干燥的状态，也可以为溶解在水性介质中的状态。在使用冷冻干燥状态的试剂测定样品中的HDL3-C时，将该试剂溶解在水性介质中后使用。
本发明的HDL3-C测定用试剂为溶解在水性介质中的状态时，试剂中的各要素的浓度，只要是能够进行本发明的HDL3-C测定的浓度，则没有特别限定，例如，为在反应液中的浓度达到以下所示的浓度的浓度。
胆固醇酯水解酶：通常为0.001～800kU/L、优选为0.01～300kU/L。
胆固醇氧化酶：通常为0.001～800kU/L、优选为0.01～300kU/L。
胆固醇脱氢酶：通常为0.001～800kU/L、优选为0.01～300kU/L。
氧化型辅酶：通常为0.01～400毫摩尔/L、优选为0.1～100毫摩尔/L。
2价金属盐：通常为12～20毫摩尔/L、优选为13～19毫摩尔/L。
选自由硫酸盐、硝酸盐、碳酸盐、乙酸盐和卤化物组成的组中的碱金属盐：通常为5～21毫摩尔/L、优选为6～18毫摩尔/L。
硫酸葡聚糖或其盐：通常为0.75～2.6g/L、优选为1.0～2.3g/L。
本发明的HDL3-C测定用试剂为冷冻干燥状态时，试剂中的各要素的含量，只要是能够进行本发明的HDL3-C测定的含量，则没有特别限定，例如，为在反应液中的浓度达到上述浓度的含量。
作为本发明的HDL3-C测定用试剂中的各要素的含量，是溶解在水性介质中的状态下的各要素的浓度达到例如以下的浓度的含量。
胆固醇酯水解酶：通常为0.001～800kU/L、优选为0.01～300kU/L。
胆固醇氧化酶：通常为0.001～800kU/L、优选为0.01～300kU/L。
胆固醇脱氢酶：通常0.001～800kU/L、优选为0.01～300kU/L。
氧化型辅酶：通常为0.01～400毫摩尔/L、优选为0.1～100毫摩尔/L。
2价金属盐：通常为12～20毫摩尔/L、优选为13～19毫摩尔/L。
选自由硫酸盐、硝酸盐、碳酸盐、乙酸盐和卤化物组成的组中的碱金属盐：通常为5～21毫摩尔/L、优选为6～18毫摩尔/L。
硫酸葡聚糖或其盐：通常为0.75～2.6g/L、优选为1.0～2.3g/L。
<HDL3-C测定用试剂盒>
本发明的HDL3-C测定用试剂用于本发明的HDL3-C测定方法，可以采用适于保存、流通以及使用的试剂盒的形态。作为本发明的HDL3-C测定用试剂盒，可以列举例如双试剂型试剂盒、三试剂型试剂盒等，优选由第一试剂和第二试剂构成的双试剂型试剂盒。
在由第一试剂和第二试剂构成的双试剂型HDL3-C测定用试剂盒中，胆固醇酯水解酶在第一试剂和第二试剂中的任意一者或两者中含有。胆固醇氧化酶优选在第二试剂中含有。氧化型辅酶在第一试剂和第二试剂中的任意一者或两者中含有。胆固醇脱氢酶优选在第二试剂中含有。2价金属盐优选在第一试剂中含有。选自由硫酸盐、硝酸盐、碳酸盐、乙酸盐和卤化物组成的组中的碱金属盐优选在第一试剂中含有。硫酸葡聚糖或其盐优选在第一试剂中含有。
过氧化氢测定用试剂可以在第一试剂和第二试剂中的任意一者或两者中含有，在该试剂含有氧化偶联型色原体时，优选氧化偶联型色原体的两种化合物、即偶联剂与苯胺类、或偶联剂与酚类分别在不同的试剂中含有的方式。
还原型辅酶测定用试剂在第一试剂和第二试剂中的任意一者或两者中含有。
以下记述本发明的HDL3-C测定用试剂盒的方式。
测定用试剂盒1
第一试剂
含有(a)2价金属盐、(b)选自由硫酸盐、硝酸盐、碳酸盐、乙酸盐和卤化物组成的组中的碱金属盐、以及(c)硫酸葡聚糖或其盐的试剂
第二试剂
含有胆固醇酯水解酶、以及胆固醇氧化酶的试剂
测定用试剂盒2
第一试剂
含有(a)2价金属盐、(b)选自由硫酸盐、硝酸盐、碳酸盐、乙酸盐和卤化物组成的组中的碱金属盐、(c)硫酸葡聚糖或其盐、以及过氧化氢测定用试剂的试剂
第二试剂
含有胆固醇酯水解酶、胆固醇氧化酶的试剂、以及含有过氧化氢测定用试剂的试剂
测定用试剂盒3
第一试剂
含有(a)2价金属盐、(b)选自由硫酸盐、硝酸盐、碳酸盐、乙酸盐和卤化物组成的组中的碱金属盐、以及(c)硫酸葡聚糖或其盐的试剂
第二试剂
含有胆固醇酯水解酶、氧化型辅酶、以及胆固醇脱氢酶的试剂
测定用试剂盒4
第一试剂
含有(a)2价金属盐、(b)选自由硫酸盐、硝酸盐、碳酸盐、乙酸盐和卤化物组成的组中的碱金属盐、(c)硫酸葡聚糖或其盐、以及还原型辅酶测定用试剂的试剂
第二试剂
含有胆固醇酯水解酶、氧化型辅酶、胆固醇脱氢酶、以及还原型辅酶测定用试剂的试剂
本发明的HDL3-C测定用试剂盒可以为冷冻干燥的状态，也可以为溶解在水性介质中的状态。在使用冷冻干燥状态的试剂盒测定样品中的HDL3-C时，将该试剂盒溶解在水性介质中后使用。作为该水性介质，可以列举例如上述的水性介质等。
本发明的HDL3-C测定用试剂盒为在溶解水性介质中的状态时，试剂盒的第一试剂或第二试剂中的各要素的浓度，只要是能够进行本发明的HDL3-C测定的浓度，则没有特别限定，例如，为在反应液中的浓度达到以下所示的浓度的浓度。
胆固醇酯水解酶(第一试剂或第二试剂)：通常为0.001～800kU/L、优选为0.01～300kU/L。
胆固醇氧化酶(第二试剂)：通常为0.001～800kU/L、优选为0.01～300kU/L。
胆固醇脱氢酶(第二试剂)：通常为0.001～800kU/L、优选为0.01～300kU/L。
氧化型辅酶(第一试剂或第二试剂)：通常为0.01～400毫摩尔/L、优选为0.1～100毫摩尔/L。
2价金属盐(第一试剂)：通常为12～20毫摩尔/L、优选为13～19毫摩尔/L。
选自由硫酸盐、硝酸盐、碳酸盐、乙酸盐和卤化物组成的组中的碱金属盐(第一试剂)：通常为5～21毫摩尔/L、优选为6～18毫摩尔/L。
硫酸葡聚糖或其盐(第一试剂)：通常为0.75～2.6g/L、优选为1.0～2.3g/L。
本发明的HDL3-C测定用试剂盒为冷冻干燥状态时，试剂盒的第一试剂或第二试剂中的各要素的含量，只要是能够进行本发明的HDL3-C测定的含量，则没有特别限定，例如，为在反应液中的浓度达到上述浓度的含量。
作为本发明的HDL3-C测定用试剂盒的第一试剂或第二试剂中的各要素的含量，为溶解在水性介质中的状态下的各要素的浓度达到例如以下的浓度的含量。
胆固醇酯水解酶(第一试剂或第二试剂)：通常为0.001～800kU/L、优选为0.01～300kU/L。
胆固醇氧化酶(第二试剂)：通常为0.001～800kU/L、优选为0.01～300kU/L。
胆固醇脱氢酶(第二试剂)：通常为0.001～800kU/L、优选为0.01～300kU/L。
氧化型辅酶(第一试剂或第二试剂)：通常为0.01～400毫摩尔/L、优选为0.1～100毫摩尔/L。
2价金属盐(第一试剂)：通常为16～27毫摩尔/L、优选为17～25毫摩尔/L。
选自由硫酸盐、硝酸盐、碳酸盐、乙酸盐和卤化物组成的组中的碱金属盐(第一试剂)：通常为7～28毫摩尔/L、优选为8～25毫摩尔/L。
硫酸葡聚糖或其盐(第一试剂)：通常为1.0～3.5g/L、优选为1.3～3.1g/L。
在本发明的HDL3-C测定用试剂以及测定用试剂盒中，可以根据需要含有水性介质、稳定剂、防腐剂、影响物质除去剂、反应促进剂等。作为水性介质，可以列举例如上述的水性介质等。作为稳定剂，可以列举例如乙二胺四乙酸(EDTA)、蔗糖、氯化钙、胆酸或其盐等。作为防腐剂，可以列举例如叠氮化钠、抗生素等。作为影响物质除去剂，可以列举例如用于消除抗坏血酸的影响的抗坏血酸氧化酶等。作为反应促进剂，可以列举例如共脂肪酶、磷脂酶等。
在本发明的HDL3-C测定用试剂以及测定用试剂盒中，可以使用上述的胆固醇酯水解酶、胆固醇氧化酶、氧化型辅酶、胆固醇脱氢酶、2价金属盐、碱金属盐(选自由硫酸盐、硝酸盐、碳酸盐、乙酸盐和卤化物组成的组中的碱金属盐)、硫酸葡聚糖或其盐、过氧化氢测定用试剂、还原型辅酶测定用试剂。
<HDL2-C测定用试剂盒>
本发明的HDL2-C测定用试剂盒是用于本发明的HDL2-C测定方法的试剂盒。作为本发明的HDL2-C测定用试剂盒，可以列举例如含有本发明的HDL3-C测定用试剂和HDL-C测定用试剂的试剂盒；含有本发明的HDL3-C测定用试剂盒的第一试剂和第二试剂、以及HDL-C测定用试剂的试剂盒等。作为本发明的HDL2-C测定用试剂盒中的本发明的HDL3-C测定用试剂，也可以为本发明的HDL3-C测定用试剂盒。
本发明的HDL2-C测定用试剂盒中的HDL-C测定用试剂也可以HDL-C测定用试剂盒。HDL-C测定用试剂以及HDL-C测定用试剂盒，只要是能够进行HDL-C测定的试剂以及试剂盒，则没有特别限定，可以列举例如日本特开平8-131197号公报、WO2004/035816号小册子、WO2006/118199号小册子等中记载的HDL-C测定用试剂以及HDL-C测定用试剂盒等。另外，作为HDL-C测定用试剂以及HDL-C测定用试剂盒，也可以使用市售的HDL-C测定用试剂以及测定用试剂盒。作为市售的HDL-C测定用试剂以及测定用试剂盒，可以列举例如上述市售的HDL-C测定用试剂以及HDL-C测定用试剂盒等。
以下，通过实施例对本发明更加详细地进行说明，但这些实施例对本发明的范围没有任何限定。另外，本实施例以及比较例中，使用下述制造商的试剂以及酶。
HEPES(VWR公司制)、HSDA(同仁化学研究所公司制)、PIPES(同仁化学研究所公司制)、胆酸钠(アクロス公司制)、牛血清白蛋白(BSA；セルライアンス公司制)、4-氨基安替比林(埼京化成公司制)、硫酸葡聚糖钠分子量50万(名糖产业公司制)、硫酸葡聚糖钠分子量4万(ICN公司制)、硝酸镁六水合物(关东化学公司制)、氯化钙二水合物(和光纯药公司制)、硫酸钠(关东化学公司制)、氯化钠(和光纯药公司制)、氯化钾(和光纯药公司制)、氯化锂(和光纯药公司制)、硝酸钠(ナカライテスク公司制)、碳酸钠(关东化学公司制)、溴化钠(和光纯药公司制)、乙酸钠三水合物(关东化学公司制)、氟化钠(和光纯药公司制)
COO322(胆固醇氧化酶；东洋纺织公司制)、LPL311(胆固醇酯水解酶；东洋纺织公司制)、过氧化物酶(东洋纺织公司制)
另外，化学修饰LPL311使用如下制备的物质。
在HEPES缓冲液(pH8.5，0.15摩尔/L)中加入LPL311以使其达到33g/L，冷却至5℃后，加入サンブライトVFM-4101(日油公司制)以使其达到330g/L，进一步反应3小时。将所得到的修饰酶溶液不进行纯化分离而直接作为化学修饰LPL311使用。
化学修饰COO322使用如下制备的物质。
在HEPES缓冲液(pH8.0，0.1摩尔/L)中加入COO322以使其达到50g/L，冷却至15℃后，加入サンブライトVFM-4101(日油公司制)以使其达到6.25g/L，进一步反应2小时。将所得到的修饰酶溶液不进行纯化分离而直接作为化学修饰COO322使用。
实施例1
利用2价金属盐与硫酸钠的组合的HDL3-C的测定
制备由以下的第一试剂和第二试剂构成的HDL3-C测定用试剂盒。将含有表1所示浓度的2价金属盐(硝酸镁六水合物或氯化钙二水合物)以及硫酸钠的试剂盒作为实施例1(1)～1(11)的试剂盒。
第一试剂
第二试剂
[比较例1]
制备由以下的第一试剂和第二试剂构成的HDL3-C测定用试剂盒。将含有表1所示浓度的硝酸镁六水合物的试剂盒作为比较例1(1)～1(3)的试剂盒。
第一试剂
第二试剂
实施例2
使用实施例1(a)的试剂盒，如下操作，对于甘油三酯为200mg/dL以下的人血清42样品，测定各样品中的HDL3-C，计算与分级法的相关系数。
(1)利用人血清样品与实施例1(a)的试剂盒的反应的该样品中的“反应吸光度”的计算
使用日立7170S型自动分析装置，通过以下的操作计算“反应吸光度”。
将人血清作为样品，向反应池中添加(2μL)，接着，分别添加实施例1(a)的试剂盒的第一试剂(0.15mL)而使其开始反应(第一反应)，在37℃下加温5分钟，在主波长600nm、副波长700nm处测定反应5分钟后的反应液的吸光度(E1)。接着，在该反应液中分别添加实施例1(a)的试剂盒的第二试剂(0.05mL)，进一步在37℃下加温5分钟而进行反应(第二反应)，在主波长600nm、副波长700nm处测定第二反应5分钟后的反应液的吸光度(E2)，从E2中减去E1而计算出吸光度变化(ΔE血清样品)。另外，使用生理盐水代替人血清作为样品，进行同样的测定，计算吸光度变化(ΔE空白)。最后，通过下述(式1)，计算各人血清样品中的“反应吸光度”。
反应吸光度=ΔE血清样品-ΔE空白
(2)利用分级法的人血清样品中的HDL3-C的测定
使用与上述(1)相同的人血清样品，通过Journal of Lipid Researchvol.49,p.1130-1136(2008)中记载的方法(分级法)，分离各样品中的HDL3，使用デタミナーL TCII(协和梅迪克斯公司制)对所得到的HDL3组分中的胆固醇量进行测定。
另外，作为参考，使用相同的人血清样品，通过Clinical Chemistry,Vol.45,No.10,pp.1803-1812(1999)中记载的DCM(指定比对方法，Designated Comparison Method)，分离各样品中的HDL，使用デタミナーL TCII(协和梅迪克斯公司制)对所得到的HDL组分中的胆固醇进行测定。
(3)本发明的测定方法与分级法的相关
将使用实施例1(1)的试剂盒的测定中的“反应吸光度”与(2)的利用分级法的测定值之间的相关系数示于表1。
使用实施例1(2)～1(11)的试剂盒代替实施例1(1)的试剂盒，同样地确定与利用分级法的测定值之间的相关系数。将相关关系示于表1。
[比较例2]
除了使用比较例1(1)～1(3)的各试剂盒代替实施例1(1)的以外，通过与实施例2的方法同样的方法，确定使用比较例1(1)～1(3)的各试剂盒的测定中的“反应吸光度”与利用分级法的测定值之间的相关系数。将相关系数示于表1。
由表1明确了：在使用第一试剂中不含作为碱金属盐的硫酸钠的比较例1(1)～1(3)的试剂盒的测定中，在与利用分级法的HDL3-C测定之间没有观察到良好的相关关系，反而在与HDL-C测定之间观察到良好的相关关系。
另一方面明确了：在使用第一试剂中含有硫酸钠以及2价金属盐的实施例1(1)～1(11)的试剂盒的测定中，在与利用分级法的HDL3-C测定之间观察到良好的相关关系。
实施例3
镁盐浓度与硫酸钠浓度的研究
制备由以下的第一试剂和第二试剂构成的HDL3-C测定用试剂盒。将含有表2所示浓度的硝酸镁六水合物以及硫酸钠的试剂盒作为实施例3(1)～3(12)的试剂盒。
第一试剂
第二试剂
实施例4
除了使用实施例3(1)～3(12)的各试剂盒代替实施例1(1)的以外，通过与实施例2的方法同样的方法，确定使用实施例3(1)～3(12)的各试剂盒的测定中的反应吸光度与利用分级法的测定值之间的相关系数。将相关系数示于表2。
表2
由表2明确了：在使用第一试剂中含有镁盐以及硫酸钠的实施例3(1)～3(12)的试剂盒的测定中，在与利用分级法的HDL3-C测定之间观察到良好的相关关系。
实施例5
碱金属盐的研究
制备由以下的第一试剂和第二试剂构成的HDL3-C测定用试剂盒。将使用表3所示的碱金属盐及其浓度的试剂盒作为实施例5(1a)～5(9c)的试剂盒。
第一试剂
第二试剂
实施例6
除了使用实施例5(1a)～5(9c)的各试剂盒代替实施例1(1)的以外，通过与实施例2的方法同样的方法，确定使用实施例5(1a)～5(9c)的各试剂盒的测定中的反应吸光度与利用分级法的测定值之间的相关系数。将相关系数示于表3。
表3
由表3可明确了：在使用第一试剂中含有选自由硫酸盐、硝酸盐、碳酸盐、乙酸盐和卤化物组成的组中的碱金属盐的试剂盒的测定中，在与利用分级法的HDL3-C测定之间观察到良好的相关关系。
实施例7
样品中的HDL3-C的定量
对于人新鲜血清5样品，通过分级法以及使用本发明的实施例3(6)和实施例3(11)的试剂盒的方法，依照以下的步骤确定各样品中的HDL3-C浓度。
(1)使用分级法的HDL3-C的定量
通过Journal of Lipid Research vol.49,p.1130-1136(2008)中记载的方法(分级法)分离各样品中的HDL3，使用デタミナーL TCII(协和梅迪克斯公司制)测定所得到的HDL3组分中的胆固醇，确定各样品中的HDL3-C浓度。
(2)使用实施例3(6)和实施例3(11)的试剂盒的HDL3-C的定量
由利用分级法的测定，将判明HDL3-C浓度为16.1mg/dL的血清标准溶液作为标准曲线制作用试样。与实施例2的(1)记载的测定方法同样，通过日立7170S自动分析装置，使用实施例3(6)的试剂盒，测定标准曲线制作用试样样品的反应吸光度，制作表示HDL3-C浓度与反应吸光度之间的关系的标准曲线。
使用人血清5样品代替上述标准曲线制作用试样，通过与实施例2的(1)记载的方法同样的方法进行测定，由所得到的测定值和之前制作的标准曲线，确定各样品中的HDL3-C浓度。
使用实施例3(11)的试剂盒代替实施例3(6)的试剂盒，通过同样的方法，确定相同的人血清5样品中的HDL3-C浓度。
将使用分级法确定的HDL3-C浓度、使用实施例3(6)和实施例3(11)的试剂盒确定的HDL3-C浓度示于表4。
表4
由表4明确了：通过使用本发明的试剂盒的测定方法确定的HDL3-C浓度，与利用分级法确定的HDL3-C浓度几乎一致。因此明确了：通过使用本发明的试剂盒的测定方法，能够准确地测定人血清中的HDL3-C。
产业上的可利用性
通过本发明，能够提供对冠状动脉疾病等的诊断有效的HDL亚组分中的胆固醇的测定方法、测定用试剂以及测定用试剂盒。
Claims (19)
1.一种样品中的HDL3中的胆固醇的测定方法，其特征在于，使样品与(1)胆固醇酯水解酶和胆固醇氧化酶的组合或(2)胆固醇酯水解酶、氧化型辅酶和胆固醇脱氢酶的组合在水性介质中反应，在没有分离除去HDL3以外的脂蛋白的情况下测定生成的物质或消耗的物质，所述水性介质含有(a)2价金属盐、(b)选自由硫酸盐、硝酸盐、碳酸盐、乙酸盐和卤化物组成的组中的碱金属盐以及(c)硫酸葡聚糖或其盐。
2.如权利要求1所述的方法，其中，2价金属盐为镁盐或钙盐。
3.如权利要求1或2所述的方法，其中，硫酸葡聚糖或其盐在反应液中的浓度为0.75～2.6g/L。
4.如权利要求1～3中任一项所述的方法，其中，反应液中的来自2价金属盐的2价金属离子的浓度为12～20毫摩尔/L，反应液中的来自碱金属盐的碱金属离子的浓度为5～21毫摩尔/L。
5.一种样品中的HDL2中的胆固醇的测定方法，其特征在于，包括以下的步骤：
(1)测定样品中的高密度脂蛋白(HDL)中的胆固醇的步骤；
(2)通过权利要求1～4中任一项所述的测定方法测定样品中的HDL3中的胆固醇的步骤；和
(3)从所述(1)步骤中测定的测定值中减去(2)步骤中测定的测定值的步骤。
6.一种样品中的HDL3中的胆固醇的测定用试剂，用于通过权利要求1～4中任一项所述的测定方法在没有分离除去HDL3以外的脂蛋白的情况下测定样品中的HDL3中的胆固醇，其特征在于，含有胆固醇酯水解酶、胆固醇氧化酶、过氧化氢测定用试剂、(a)2价金属盐、(b)选自由硫酸盐、硝酸盐、碳酸盐、乙酸盐和卤化物组成的组中的碱金属盐以及(c)硫酸葡聚糖或其盐。
7.一种样品中的HDL3中的胆固醇的测定用试剂，用于通过权利要求1～4中任一项所述的测定方法在没有分离除去HDL3以外的脂蛋白的情况下测定样品中的HDL3中的胆固醇，其特征在于，含有胆固醇酯水解酶、氧化型辅酶、胆固醇脱氢酶、(a)2价金属盐、(b)选自由硫酸盐、硝酸盐、碳酸盐、乙酸盐和卤化物组成的组中的碱金属盐以及(c)硫酸葡聚糖或其盐。
8.如权利要求7所述的试剂，其中，还含有还原型辅酶测定用试剂。
9.如权利要求6～8中任一项所述的试剂，其中，2价金属盐为镁盐或钙盐。
10.如权利要求6～9中任一项所述的试剂，其中，硫酸葡聚糖或其盐以在反应液中的浓度达到0.75～2.6g/L的含量含有。
11.如权利要求6～10中任一项所述的试剂，其中，2价金属盐以在反应液中的来自2价金属盐的2价金属离子的浓度达到12～20毫摩尔/L的含量含有，碱金属盐以在反应液中的来自碱金属盐的碱金属离子的浓度达到5～21毫摩尔/L的含量含有。
12.一种试剂盒，含有第一试剂和第二试剂，用于通过权利要求1～4中任一项所述的测定方法在没有分离除去HDL3以外的脂蛋白的情况下测定样品中的HDL3中的胆固醇，其特征在于，在第一试剂中含有(a)2价金属盐、(b)选自由硫酸盐、硝酸盐、碳酸盐、乙酸盐和卤化物组成的组中的碱金属盐以及(c)硫酸葡聚糖或其盐，在第二试剂中含有胆固醇氧化酶，在第一试剂和第二试剂中的任意一者或两者中含有过氧化氢测定用试剂，在第一试剂和第二试剂中的任意一者或两者中含有胆固醇酯水解酶。
13.一种试剂盒，含有第一试剂和第二试剂，用于通过权利要求1～4中任一项所述的测定方法在没有分离除去HDL3以外的脂蛋白的情况下测定样品中的HDL3中的胆固醇，其特征在于，在第一试剂中含有(a)2价金属盐、(b)选自由硫酸盐、硝酸盐、碳酸盐、乙酸盐和卤化物组成的组中的碱金属盐以及(c)硫酸葡聚糖或其盐，在第二试剂中含有胆固醇脱氢酶，在第一试剂和第二试剂中的任意一者或两者中含有氧化型辅酶，在第一试剂和第二试剂中的任意一者或两者中含有胆固醇酯水解酶。
14.如权利要求13所述的试剂盒，其中，在第一试剂和第二试剂中的任意一者或两者中还含有还原型辅酶测定用试剂。
15.如权利要求12～14中任一项所述的试剂盒，其中，2价金属盐为镁盐或钙盐。
16.如权利要求12～15中任一项所述的试剂盒，其中，硫酸葡聚糖或其盐以在反应液中的浓度达到0.75～2.6g/L的含量含有。
17.如权利要求12～16中任一项所述的试剂盒，其中，2价金属盐以在反应液中的来自2价金属盐的2价金属离子的浓度达到12～20毫摩尔/L的含量含有，碱金属盐以在反应液中的来自碱金属盐的碱金属离子的浓度达到5～21毫摩尔/L的含量含有。
18.一种样品中的HDL2中的胆固醇的测定用试剂盒，其特征在于，含有权利要求6～11中任一项所述的HDL3中的胆固醇测定用试剂和HDL胆固醇测定用试剂。
19.一种样品中的HDL2中的胆固醇的测定用试剂盒，其特征在于，含有权利要求12～17中任一项所述的HDL3中的胆固醇测定用试剂盒的第一试剂和第二试剂以及HDL胆固醇测定用试剂。
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