CN109813921B - 基于多克隆抗体制备的hdl3免疫比浊法检测试剂盒及其制备使用方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种基于多克隆抗体制备的HDL3免疫比浊法检测试剂盒，包括试剂R1和试剂R2，试剂R1：Tris‑HCl、PEG 6000、BSA、NaCl、NaN3、EDTA、Polyoxyethylene styrenated phenyl ether derivative、鸡抗人HDL3多克隆抗体；试剂R2：Tris‑HCl、PEG 6000、BSA、NaCl、NaN3、EDTA、Polyoxyethylene polycyclic phenyl ether。本发明还提供了一种上述试剂盒的制备与使用方法。本发明试剂盒利用免疫比浊法测定HDL3，能直接测定HDL3含量，测试结果更可靠。
Description
技术领域
本发明属于免疫学测定分析领域，涉及蛋白质的测量测试，尤其涉及一种基于多克隆抗体制备的HDL3免疫比浊法检测试剂盒及其制备使用方法。
背景技术
高密度脂蛋白3(High-density lipoprotein 3，HDL3)是高密度脂蛋白(High-density lipoprotein，HDL)的亚组分之一。HDL是血浆中主要脂蛋白之一，其密度最高，颗粒直径最小，蛋白组成以载脂蛋白为主，有HDL1、HDL2和HDL3 3种亚型。人类HDL颗粒大小为7.2-12.9nm，水合密度介于(1.063-1.210)g/mL之间，相对分子质量为200-400kD。HDL3的密度为1.125g/mL-1.210g/mL。
HDL主要由肝脏产生，而且主要又是由肝脏分解，小肠亦可合成。首先ApoA-I初步酯化，在LPL介导的脂解作用下，从CM、VLDL获得载脂蛋白，形成盘状新生HDL。新生HDL在LCAT的作用下先转变为HDL3，然后酯化胆固醇继续增加，逐步变为密度较小、颗粒较大的HDL2。HDL的重要生理功能是介导胆固醇逆转运，还为其他脂蛋白提供多种必需成分，具有抗动脉粥样硬化和血管保护作用，可减少心血管事件的发生。流行病学调查显示，血浆HDL-C水平与动脉粥样硬化等心血管疾病的危险性呈高度负相关。HDL-C可对抗由血脂代谢紊乱引起的心血管疾病，升高HDL-C有可能成为冠心病防治的有效措施。且有报道动物实验证明，HDL中起作用的亚组分为HDL3，而HDL2在调节血脂(及逆向胆固醇转运)方面并没有可观测到的作用。所以，HDL3可以用作心血管疾病的治疗剂，也可以用于心血管疾病、糖尿病、肾脏疾病的检测标志物。
抗体是由抗原刺激机体，产生的免疫球蛋白。抗原通常是由多个抗原决定簇组成的，由一种抗原决定簇刺激机体，由一个B淋巴细胞接受该抗原刺激所产生的抗体称之为单克隆抗体(Monoclone antibody)。由多种抗原决定簇刺激机体，相应地就产生各种各样的单克隆抗体，这些单克隆抗体混杂在一起就是多克隆抗体，机体内所产生的抗体就是多克隆抗体；除了抗原决定簇的多样性以外，同样一种抗原决定簇，也可刺激机体产生IgG、IgM、IgA、IgE和IgD等五类抗体。
免疫比浊法(Turbidimetric inhibition immuno assay)是抗原抗体结合动态测定方法。其基本原理是：当抗原与抗体在特殊稀释系统中反应而且比例合适(一般规定抗体过量)时，形成的可溶性免疫复合物在稀释系统中的促聚剂的作用下，自液相析出，形成微粒，使反应液出现浊度；当抗体浓度固定时，形成的免疫复合物的量随着检样中抗原量的增加而增加，反应液的浊度也随之增加。通过测定反应液的浊度与一系列标准品对照，即可计算出检样中抗原的含量。
目前，高密度脂蛋白亚组分测定的方法有：超速离心法、高效液相色谱(HPLC)法、沉淀法、核磁共振波谱(NMR)法等。其中，超速离心法通过离心，并利用脂蛋白的比重之差来进行分型；其缺点很明显：操作技术要求高、成本高、耗时长。冈崎等人提出的利用HPLC来区分HDL2和HDL3的方法也存在上述问题。沉淀法为通过含有2价金属离子和硫酸葡聚糖的试剂将HDL3以外聚集，通过离心来回收上清液部分的HDL3并用自动分析装置进行测定的方法；其仍然存在下述缺点：作业需要熟练，另外需要手工操作，有时需要检样的前处理操作，耗时过长，且非通用。NMR法为通过磁共振来测定脂蛋白的颗粒数，非一般性的方法，需要有特定的设备和相应的技术人员。日本某公司专利(国内公开号为CN104169432A)公开了一种高密度脂蛋白3中的胆固醇的定量方法，用酶促反应法通过检测HDL3中胆固醇来间接检测HDL3的含量。该方法同市场上众多的高密度脂蛋白胆固醇检测方法一样，通过苯醌亚胺络合物显色。但此方法具有以下缺陷：①无法对高密度脂蛋白胆固醇亚型进行鉴别；②易受血清中血红蛋白、胆红素及甘油三酯的影响。其虽然通过采用特异性识别HDL3-C的表面活性剂来对其他脂蛋白组分进行遮蔽，提高了鉴别的特异性，但其无法避免血清中高血红蛋白、胆红素及甘油三酯的影响，且由于遮蔽HDL3-C，血清中游离胆固醇的影响就更加凸显，由此造成R1试剂的使用量加大，检测的重复性不高。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于提供一种能直接测定HDL3含量的基于多克隆抗体制备的HDL3免疫比浊法检测试剂盒及其制备、使用方法，直接测定蛋白含量，不需要通过胆固醇的测定来间接反映HDL3的含量，测试结果可靠，重复性高。
本发明采用以下技术方案解决上述技术问题：
一种基于多克隆抗体制备的HDL3免疫比浊法检测试剂盒，包括彼此独立的试剂R1和试剂R2双液体组分，包括的成分及相应含量为：
试剂R1：
其溶剂为纯化水；
其溶剂为纯化水。
作为本发明的优选方式之一，还包括HDL3校准品，包括的成分及相应含量为：
其溶剂为纯化水。
作为本发明的优选方式之一，所述Polyoxyethylene styrenated phenyl etherderivative由一种或几种HBL值13.0-14.0的聚氧乙烯苯乙烯化苯基醚衍生物构成。
作为本发明的优选方式之一，所述HBL值13.0-14.0的聚氧乙烯苯乙烯化苯基醚衍生物具体为花王公司产品EMULGEN B-66、EMULGEN A-90或日光化学公司产品NIKKOL BC-10。
作为本发明的优选方式之一，所述Polyoxyethylene polycyclic phenyl ether由一种或几种HBL值15.0-15.6的聚氧乙烯多环苯基醚构成。
作为本发明的优选方式之一，所述HBL值15.0-15.6的聚氧乙烯多环苯基醚具体为日光化学公司产品NIKKOL BC-15、NIKKOL BO-15V或NIKKOL BD-10。
作为本发明的优选方式之一，所述鸡抗人HDL3多克隆抗体的获取方法如下：
①鸡的免疫：
选择30日龄、体重400g以上公鸡，取1mL 2.0mg/mL HDL3抗原与等量弗氏佐剂充分匀浆形成稳定乳液，记为乳化抗原；每只鸡于脖外侧注射共2mL乳化抗原；7日后进行第二次免疫，免疫方案如前；21日后进行第三次免疫，免疫方案如前；42日后进行第四次免疫，采用翅静脉注射2mL 1.0mg/mL HDL3抗原；49日取翅静脉血分离血清，并使用琼脂双扩散法测抗体效价，测得效价1:32及以上,终止免疫；采用心脏无菌采血法获得全血；
②多克隆抗体的纯化：
将上述步骤获得的全血于室温划十字口静置1h，再取上清获得粗制血清，粗制血清于4℃、1000r/min的条件下离心30min，得血清；加入等体积的PBS混匀得混合液，并向混合液中缓慢滴加同等体积的饱和硫酸铵，4℃静置5h；接着，于4℃、4500r/min条件下离心30min，弃去上清，沉淀用200mL的PBS溶解，加入总体积量33％的饱和硫酸铵，4℃下静置5h后，再于4℃、4500r/min条件下离心30min；此时，弃去上清，并将沉淀用200mL的PBS溶解，加入总体积量33％的饱和硫酸铵，4℃下静置5h后，4℃、4500r/min离心30min；离心后的沉淀再用200mL的PBS溶解，并进一步装入10kD透析袋中；最后，将其置于4℃环境下，采用20倍体积的PBS透析液透析6h除盐，即得鸡抗人HDL3多克隆抗体。
作为本发明的优选方式之一，所述HDL3的获取方法如下：
①HDL分离液的配制：
称取分子量50000的硫酸葡聚糖9g、MgCl2·6H2O 105g、NaN3 250mg，并用900mL的蒸馏水溶解，然后用1mol/L的NaOH液调节pH至7.0，最后用蒸馏水加至1000mL，备用；
②HDL3分离液的配制：
称取分子量50000的硫酸葡聚糖9g、MgCl2·6H2O 315g、NaN3 250mg，并用900mL蒸馏水溶解，接着用1mol/L的NaOH调节pH至7.0，最后用蒸馏水加至1000mL，备用；
③分离：
吸取人血清50mL，加HDL分离液5mL，混匀；室温静置15min，然后于2000r/min条件下离心20min；取上清液20mL，并加入HDL3分离液2mL，混匀；接着，室温静置15min后，再于2000r/min条件下离心20min，此上清即为HDL3产物；
④浓度标定：
用Tris-HCl缓冲液稀释HDL3产物，使用微量定量仪标定到10mg/mL，备用。
一种基于多克隆抗体制备的HDL3免疫比浊法检测试剂盒的制备方法，包括如下具体步骤：
(1)制备人HDL3：
①HDL分离液的配制：称取分子量50000的硫酸葡聚糖9g、MgCl2·6H2O 105g、NaN3250mg，并用900mL的蒸馏水溶解，然后用1mol/L的NaOH液调节pH至7.0，最后用蒸馏水加至1000mL，备用；
②HDL3分离液的配制：称取分子量50000的硫酸葡聚糖9g、MgCl2·6H2O 315g、NaN3250mg，并用900mL蒸馏水溶解，接着用1mol/L的NaOH调节pH至7.0，最后用蒸馏水加至1000mL，备用；
③分离：吸取人血清50mL，加HDL分离液5mL，混匀；室温静置15min，然后于2000r/min条件下离心20min；取上清液20mL，并加入HDL3分离液2mL，混匀；接着，室温静置15min后，再于2000r/min条件下离心20min，此上清即为HDL3产物；
④浓度标定：用Tris-HCl缓冲液稀释HDL3产物，使用微量定量仪标定到10mg/mL，备用；
(2)制备鸡抗人HDL3多克隆抗体：
①鸡的免疫：选择30日龄、体重400g以上公鸡，取1mL 2.0mg/mL HDL3抗原与等量弗氏佐剂充分匀浆形成稳定乳液，记为乳化抗原；每只鸡于脖外侧注射共2mL乳化抗原；7日后进行第二次免疫，免疫方案如前；21日后进行第三次免疫，免疫方案如前；42日后进行第四次免疫，采用翅静脉注射2mL 1.0mg/mL HDL3抗原；49日取翅静脉血分离血清，并使用琼脂双扩散法测抗体效价，测得效价1:32及以上，终止免疫；采用心脏无菌采血法获得全血；
②多克隆抗体的纯化：将上述步骤获得的全血于室温划十字口静置1h，再取上清获得粗制血清，粗制血清于4℃、1000r/min的条件下离心30min，得血清；接着，加入等体积的PBS混匀得混合液，并向混合液中缓慢滴加同等体积的饱和硫酸铵，4℃静置5h；接着，于4℃、4500r/min条件下离心30min，弃去上清，沉淀用200mL的PBS溶解，加入总体积量33％的饱和硫酸铵，4℃下静置5h后，再于4℃、4500r/min条件离心30min；此时，弃去上清，并将沉淀用200mL的PBS溶解，加入总体积量33％的饱和硫酸铵，4℃下静置5h后，4℃、4500r/min离心30min；离心后的沉淀再用200mL的PBS溶解，并进一步装入10kD透析袋中；最后，将其置于4℃环境下，采用20倍体积的PBS透析液透析6h除盐，即得鸡抗人HDL3多克隆抗体；
(3)配制试剂R1：
按照试剂R1的组分含量，将步骤(2)制得的鸡抗人HDL3多克隆抗体以及余下的其他组分物质于同一容器中混合，混合均匀后，制得试剂R1；
(4)配制试剂R2：
按照试剂R2的组分含量，将各组分物质于同一容器中混合，混合均匀后，制得试剂R2。
作为本发明的优选方式之一，所述步骤(2)中还包括“多克隆抗体的验证”，具体验证方法为：使用步骤(1)中制备的HDL3为抗原，使用abcam公司山羊多克隆抗体to APOA1BP为阳性对照，以HDL3蛋白为检测抗原，使用琼脂双扩散法验证纯化后鸡抗人HDL3多克隆抗体的特异性及效价。
一种基于多克隆抗体制备的HDL3免疫比浊法检测试剂盒的使用方法，包括如下具体步骤：
(1)吸取2μL样本，加入150μL试剂R1，37℃孵育5min；
(2)再加入50μL试剂R2进行混合，并使其充分反应；
(3)1min后读取吸光值A1，3min后读取吸光值A2，计算ΔA；
(4)定标方法：6点定标；采用全自动生化分析仪进行检测，并设置校准品浓度分别为：0μg/mL、11.8μg/mL、46.9μg/mL、187.5μg/mL、375μg/mL、1500μg/mL；
(5)依据定标值，根据ΔA测算样本中HDL3含量。
检测原理：
目前，国内外没有直接检测HDL3的试剂盒，通常是通过检测HDL3胆固醇来间接反应蛋白的量；该方法存在诸多弊端，且血脂中胆固醇的量不能够代替脂蛋白的量，其在分子结构上非特定的比例是动态变化的。本发明提供的基于多克隆抗体直接检测HDL3的免疫比浊法试剂盒，其通过表面活性剂(Polyoxyethylene styrenated phenyl etherderivative)与HDL3特异性结合生成胶束结构从而达到屏蔽HDL3的目的，而试剂R1中的抗体(鸡抗人HDL3多克隆抗体)先与血清中的其他脂蛋白反应获得吸光度1；加入R2后，R2所含的增溶剂(Polyoxyethylene polycyclic phenyl ether)可以解除表面活性剂(Polyoxyethylene styrenated phenyl ether derivative)与HDL3所形成的胶束，释放HDL3，试剂中过量的抗体再与HDL3反应，获得吸光度2；接着，通过吸光度差与标准品比对，即可从血清或血浆中直接检测HDL3的量，且不受高血红蛋白、胆红素及甘油三酯的干扰。
本发明相比现有技术的优点在于：
(1)本发明试剂盒由多克隆抗体(鸡抗人HDL3多克隆抗体)、表面活性剂(Polyoxyethylene styrenated phenyl ether derivative)、促聚剂(PEG 6000)、缓冲液(Tris-HCl)、防腐剂(NaN3)、增溶剂(Polyoxyethylene polycyclic phenyl ether)、蛋白保护剂(BSA)等构成，可直接测得血清或血浆中HDL3的含量，且不受高血红蛋白、胆红素及甘油三酯的干扰；相对于间接测定的试剂盒而言，本发明试剂盒中加入了抗干扰蛋白和表面活性剂，具有更高的抗干扰能力，以保证试剂盒的稳定性和精密度；
(2)本发明试剂盒基于免疫透射比浊法，适用于各类全自动生化分析仪分析；其使用方便、成本低廉，且自动化程度高，可大大节省检测时间；同时，相比于同类产品，本发明试剂盒具有更好地稳定性。
附图说明
图1是实施例4中从abcam公司购入羊抗人APOA1BP作为阳性对照琼脂双扩散试验12h结果图(图中，孔1：HDL3抗原，10mg/mL，加入10μL；孔2：APOA1BP 1：4稀释后加入10μL；孔3：APOA1BP 1：8稀释后加入10μL；孔4：APOA1BP 1：16稀释后加入10μL；孔5：APOA1BP 1：32稀释后加入10μL；孔6：APOA1BP 1：64稀释后加入10μL；孔7：缓冲液对照)；
图2是实施例4中纯化后的鸡抗人HDL3多克隆抗体琼脂双扩散试验12h结果图(图中，孔1：HDL3抗原，10mg/mL，加入10μL；孔2：纯化后的鸡抗人HDL3血清1：4稀释后加入10μL；孔3：纯化后的鸡抗人HDL3血清1：8稀释后加入10μL；孔4：纯化后的鸡抗人HDL3血清1：16稀释后加入10μL；孔5：纯化后的鸡抗人HDL3血清1：32稀释后加入10μL；孔6：纯化后的鸡抗人HDL3血清1：64稀释后加入10μL；孔7：缓冲液对照)；
图3是实施例6中本发明试剂盒与离心法线性关系曲线图；
图4是实施例6中本发明试剂盒线性范围线性回归图。
具体实施方式
下面对本发明的实施例作详细说明，本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。
实施例1
本实施例的一种基于多克隆抗体制备的HDL3免疫比浊法检测试剂盒，包括彼此独立的试剂R1和试剂R2双液体组分，包括的成分及相应含量为：
试剂R1：
其溶剂为纯化水；
试剂R2：
其溶剂为纯化水。
此外，所述试剂盒中还附带有HDL3校准品，该校准品包括的成分及相应含量如下：
其溶剂为纯化水。
进一步地，所述Polyoxyethylene styrenated phenyl ether derivative具体为花王公司产品EMULGEN B-66。
进一步地，所述Polyoxyethylene polycyclic phenyl ether具体为日光化学公司产品NIKKOL BC-15。
实施例2
本实施例的一种基于多克隆抗体制备的HDL3免疫比浊法检测试剂盒，包括彼此独立的试剂R1和试剂R2双液体组分，包括的成分及相应含量为：
试剂R1：
其溶剂为纯化水；
试剂R2：
其溶剂为纯化水。
此外，所述试剂盒中还附带有HDL3校准品，该校准品包括的成分及相应含量如下：
其溶剂为纯化水。
进一步地，所述Polyoxyethylene styrenated phenyl ether derivative具体为日光化学公司产品NIKKOL BC-10。
进一步地，所述Polyoxyethylene polycyclic phenyl ether具体为日光化学公司产品NIKKOL BD-10。
实施例3
本实施例的一种基于多克隆抗体制备的HDL3免疫比浊法检测试剂盒，包括彼此独立的试剂R1和试剂R2双液体组分，包括的成分及相应含量为：
试剂R1：
其溶剂为纯化水；
试剂R2：
其溶剂为纯化水。
此外，所述试剂盒中还附带有HDL3校准品，该校准品包括的成分及相应含量如下：
其溶剂为纯化水。
进一步地，所述Polyoxyethylene styrenated phenyl ether derivative具体为花王公司产品EMULGEN B-66、EMULGEN A-90和日光化学公司产品NIKKOL BC-10的混合物。
进一步地，所述Polyoxyethylene polycyclic phenyl ether具体为日光化学公司产品NIKKOL BC-15、NIKKOL BO-15V和NIKKOL BD-10的混合物。
实施例4
本实施例的一种上述实施例中检测试剂盒的制备方法，包括如下具体步骤：
(1)制备人HDL3：
①HDL分离液的配制：称取分子量50000的硫酸葡聚糖9g、MgCl2·6H2O 105g、NaN3250mg，并用900mL的蒸馏水溶解，然后用1mol/L的NaOH液调节pH至7.0，最后用蒸馏水加至1000mL，备用；
②HDL3分离液的配制：称取分子量50000的硫酸葡聚糖9g、MgCl2·6H2O 315g、NaN3250mg，并用900mL蒸馏水溶解，接着用1mol/L的NaOH调节pH至7.0，最后用蒸馏水加至1000mL，备用；
③分离：吸取人血清50mL(来自于健康捐献者)，加HDL分离液5mL，混匀；室温静置15min，然后于2000r/min离心条件下离心20min；取上清液20mL，并加入HDL3分离液2mL，混匀；接着，室温静置15min后，再于2000r/min离心条件下离心20min，此上清即为HDL3产物；
④浓度标定：用Tris-HCl缓冲液稀释HDL3产物，使用微量定量仪标定到10mg/mL，备用。
(2)制备鸡抗人HDL3多克隆抗体：
①鸡的免疫：选择30日龄、体重400g以上公鸡，取1mL 2.0mg/mL HDL3抗原与等量弗氏佐剂充分匀浆形成稳定乳液，记为乳化抗原；每只鸡于脖外侧注射共2mL乳化抗原；7日后进行第二次免疫，免疫方案如前；21日后进行第三次免疫，免疫方案如前；42日后进行第四次免疫，采用翅静脉注射2mL 1.0mg/mL HDL3抗原；49日取翅静脉血分离血清，并使用琼脂双扩散法测抗体效价，测得效价1:32及以上，终止免疫；采用心脏无菌采血法获得全血；
②多克隆抗体的纯化：将上述步骤获得的全血于室温划十字口静置1h，再取上清获得粗制血清，粗制血清于4℃、1000r/min的条件下离心30min，得血清；接着，加入等体积的PBS混匀得混合液，并向混合液中缓慢滴加同等体积的饱和硫酸铵，4℃静置5h；接着，于4℃、4500r/min条件下离心30min，弃去上清，沉淀用200mL的PBS溶解，加入总体积量33％的饱和硫酸铵，4℃下静置5h后，再于4℃、4500r/min条件离心30min；此时，弃去上清，并将沉淀用200mL的PBS溶解，加入总体积量33％的饱和硫酸铵，4℃下静置5h后，4℃、4500r/min离心30min；离心后的沉淀再用200mL的PBS溶解，并进一步装入10kD透析袋中；最后，将其置于4℃环境下，采用20倍体积的PBS透析液透析6h除盐，即得鸡抗人HDL3多克隆抗体；
③多克隆抗体的验证：使用上述制备的HDL3为抗原，使用abcam公司山羊多克隆抗体to APOA1BP(ab81907)为阳性对照，以上述HDL3蛋白为检测抗原，使用琼脂双扩散法验证多抗特异性及效价，验证结果见图1、图2；
图1为从abcam公司购入羊抗人APOA1BP作为阳性对照琼脂双扩散试验12h结果图(图1中，孔1：HDL3抗原，10mg/mL，加入10μL；孔2：APOA1BP 1：4稀释后加入10μL；孔3：APOA1BP 1：8稀释后加入10μL；孔4：APOA1BP 1：16稀释后加入10μL；孔5：APOA1BP 1：32稀释后加入10μL；孔6：APOA1BP 1：64稀释后加入10μL；孔7：缓冲液对照)；从图1中可以看出明显的免疫沉淀线，表明对照设置成立；
图2为纯化后的鸡抗人HDL3多克隆抗体琼脂双扩散试验12h结果图(图2中，孔1：HDL3抗原，10mg/mL，加入10μL；孔2：纯化后的鸡抗人HDL3血清1：4稀释后加入10μL；孔3：纯化后的鸡抗人HDL3血清1：8稀释后加入10μL；孔4：纯化后的鸡抗人HDL3血清1：16稀释后加入10μL；孔5：纯化后的鸡抗人HDL3血清1：32稀释后加入10μL；孔6：纯化后的鸡抗人HDL3血清1：64稀释后加入10μL；孔7：缓冲液对照)；从图2中可以看出明显的免疫融合型免疫沉淀线，效价达到1：32，效价较高。与图1综合比较可知，所得的鸡免疫血清含有同APOA1BP相似的抗体，由于APOA1BP为高密度脂蛋白的蛋白组成部分，判定所得抗血清为鸡抗HDL3阳性血清。
(3)配制试剂R1：
按照上述实施例中试剂R1的组分含量，将步骤(2)制得的鸡抗人HDL3多克隆抗体以及余下的其他组分物质于同一容器中混合，混合均匀后，制得试剂R1。
(4)配制试剂R2：
按照上述实施例中试剂R2的组分含量，将各组分物质于同一容器中混合，混合均匀后，制得试剂R2。
(5)配制HDL3校准品：
按照上述实施例中试剂HDL3校准品的组分含量，将各组分物质于同一容器中混合，混合均匀后，制得HDL3校准品。
实施例5
本实施例的一种上述实施例中检测试剂盒的使用方法：
分析方法：两点终点法；
反应方向：上升反应；
校准方式：Logit-Log(4P)；
测定波长：340nm/700nm；
测定温度：37℃；
样本：试剂R1：试剂R2＝2：150：50(μL)；
使用步骤：吸取2μL样本，加入150μL试剂R1，37℃孵育5min；再加入50μL试剂R2进行混合，并使其充分反应；1min后读取吸光值A1，3min后读取吸光值A2，计算ΔA。
定标方法：6点定标，采用贝克曼AU680全自动生化分析仪(或其他品牌型号)进行检测，并设置校准品浓度分别为：0μg/mL、11.8μg/mL、46.9μg/mL、187.5μg/mL、375μg/mL、1500μg/mL；
依据定标值，根据ΔA测算样本中HDL3含量。
检测原理：
本发明试剂盒通过表面活性剂与HDL3特异性结合生成胶束结构从而达到屏蔽HDL3的目的，而试剂R1中的抗体先与血清中的其他脂蛋白反应获得吸光度1；加入R2后，R2所含的增溶剂可以解除表面活性剂与HDL3所形成的胶束，释放HDL3，试剂中过量的抗体再与HDL3反应，获得吸光度2；接着，通过吸光度差与标准品比对，即可从血清或血浆中直接检测HDL3的量。
实施例6
本实施例用以评价上述实施例中HDL3免疫比浊试剂盒：
(1)线性相关性验证：
利用实施例1-3配方配制试剂，并与超速离心方法进行对照检测，检测30份临床血清样本，检测结果如表1所示，获得了本发明试剂盒与超速离心方法的相关性曲线(见图3)。通过检测结果显示，两试剂盒的线性相关曲线为y＝2.2396+0.9549X，相关系数R2＝0.97004，说明两者具有较大的相关性。
表1本发明试剂盒与离心法相关性比对值
| 序号 | 测试值 | 对照值 | 序号 | 测试值 | 对照值 | 序号 | 测试值 | 对照值 |
| 1 | 25.4 | 26.6 | 11 | 26.5 | 27.5 | 21 | 27.5 | 29.1 |
| 2 | 28.5 | 29.3 | 12 | 34.2 | 35.6 | 22 | 28.8 | 29.5 |
| 3 | 33.6 | 34.1 | 13 | 28.5 | 27.9 | 23 | 31.2 | 31.5 |
| 4 | 24.3 | 25.6 | 14 | 31.6 | 32.3 | 24 | 33.6 | 34.4 |
| 5 | 26.9 | 27 | 15 | 29.9 | 31.5 | 25 | 29.3 | 30.6 |
| 6 | 27.8 | 29.2 | 16 | 29.8 | 30.9 | 26 | 33.3 | 34.2 |
| 7 | 30.2 | 31 | 17 | 38.5 | 38.7 | 27 | 33.5 | 34.3 |
| 8 | 33.6 | 33.9 | 18 | 33.9 | 34.2 | 28 | 27.4 | 28 |
| 9 | 30.1 | 31.4 | 19 | 32.7 | 33.5 | 29 | 28.8 | 31 |
| 10 | 28.7 | 28.7 | 20 | 25.3 | 26.9 | 30 | 35.5 | 36.7 |
(2)线性范围验证：
使用重组HDL3纯化品和生理盐水配制成浓度400mg/L、200mg/L、100mg/L、50mg/L、25mg/L、12.5mg/L、6.25mg/L、3.125mg/L和0mg/L(生理盐水对照)的测试品，并使用本发明试剂盒测定各测试品浓度；以稀释浓度为自变量，以测定结果为因变量求出线性回归方程，计算测定结果的相对偏差。检测与计算结果如表2所示，结果显示，测定结果与稀释浓度之间的线性回归方程为方程:y＝-1.20481+0.99005X，相关系数R2＝0.99986(线性回归图见图4)，说明线性关系良好，线性范围可达6.25-400mg/L。
表2本发明试剂盒线性范围验证
| 序号 | 稀释浓度 | 测试值1 | 测试值2 | 测试值3 | 平均数 | 绝对偏差 | 相对偏差 |
| 1 | 400 | 391.80 | 402.10 | 394.00 | 395.97 | 4.03 | 1.01％ |
| 2 | 200 | 194.30 | 198.50 | 196.60 | 196.47 | 3.53 | 1.77％ |
| 3 | 100 | 91.20 | 93.30 | 97.80 | 94.10 | 5.90 | 5.90％ |
| 4 | 50 | 47.00 | 45.90 | 49.20 | 47.37 | 2.63 | 5.27％ |
| 5 | 25 | 24.10 | 23.70 | 23.80 | 23.87 | 1.13 | 4.53％ |
| 6 | 12.5 | 12.00 | 11.30 | 11.50 | 11.60 | 0.90 | 7.20％ |
| 7 | 6.25 | 5.90 | 6.00 | 5.80 | 5.90 | 0.35 | 5.60％ |
| 8 | 3.13 | 2.80 | 2.80 | 2.70 | 2.77 | 0.36 | 11.61％ |
| 10 | 0 | 0.10 | 0.00 | 0.00 | 0.00 | 0.00 |
(3)重复性验证：
由于该产品无质控血清，取具有溯源性的HDL-C高值血清质控和低值血清质控各一份，使用所述试剂盒对同一份血清样本连续检测10次，计算所述试剂盒的变异系数。检测数据如表3所示，检测结果表明，本发明试剂盒在检测高值和低值样本时的变异系数较小，分别为1.44％和4.69％，重复性较好。
表3本发明试剂盒的精密度(重复性)验证结果
(5)干扰试验：
使用上述质控血清样本，分别混入血红蛋白、胆红素和甘油三酯，使三者最终浓度达到：480g/L、60μmol/L和5.1mmol/L，均是正常人血清含量的三倍。使用本发明试剂进行检测，检测结果见表4。结果表明，所述试剂盒具有较强的抗干扰能力。本发明的突出优点是抗干扰性较强，直接测定HDL3的含量，从而大大地提高临床检测的准确性，以满足临床检测的需求。
表4干扰试验检测结果
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (6)
1.一种基于多克隆抗体制备的HDL3免疫比浊法检测试剂盒，其特征在于，包括彼此独立的试剂R1和试剂R2双液体组分，包括的成分及相应含量为：
试剂R1：
Tris-HCl 5-100 mM/L
PEG 6000 25-225 g/L
BSA 1-50 g/L
NaCl 0.9-18 g/L
NaN3 0.1-1.0 g/L
EDTA 0.1-1 g/L
Polyoxyethylene styrenated phenyl ether derivative 0.01-0.1%
鸡抗人HDL3多克隆抗体 0.1-20 g/L
其溶剂为纯化水；
试剂R2：
Tris-HCl 5-100 mM/L
PEG 6000 25-225 g/L
BSA 1-50 g/L
NaCl 0.9-18 g/L
NaN3 0.1-1.0 g/L
EDTA 0.1-1.0 g/L
Polyoxyethylene polycyclic phenyl ether 0.03-0.5 %
其溶剂为纯化水；
其中，所述Polyoxyethylene styrenated phenyl ether derivative由一种或几种HBL值13.0-14.0的聚氧乙烯苯乙烯化苯基醚衍生物构成；所述Polyoxyethylenepolycyclic phenyl ether由一种或几种HBL值15.0-15.6的聚氧乙烯多环苯基醚构成。
2.根据权利要求1所述的基于多克隆抗体制备的HDL3免疫比浊法检测试剂盒，其特征在于，还包括HDL3校准品，包括的成分及相应含量为：
Tris-HCl 5-100 mM/L
BSA 1-50 g/L
HDL3 1-10 mg/L
NaN3 0.1-1.0 g/L
其溶剂为纯化水。
3.根据权利要求1所述的基于多克隆抗体制备的HDL3免疫比浊法检测试剂盒，其特征在于，所述HBL值13.0-14.0的聚氧乙烯苯乙烯化苯基醚衍生物具体为花王公司产品EMULGEN B-66、EMULGEN A-90或日光化学公司产品 NIKKOL BC-10。
4.根据权利要求1所述的基于多克隆抗体制备的HDL3免疫比浊法检测试剂盒，其特征在于，所述HBL值15.0-15.6的聚氧乙烯多环苯基醚具体为日光化学公司产品NIKKOL BC-15、NIKKOL BO-15V或NIKKOL BD-10。
5.一种如权利要求1-4任一所述的基于多克隆抗体制备的HDL3免疫比浊法检测试剂盒的制备方法，其特征在于，包括如下具体步骤：
（1）制备人HDL3：
（2）制备鸡抗人HDL3多克隆抗体：
（3）配制试剂R1：
按照试剂R1的组分含量，将步骤（2）制得的鸡抗人HDL3多克隆抗体以及余下的其他组分物质于同一容器中混合，混合均匀后，制得试剂R1；
（4）配制试剂R2：
按照试剂R2的组分含量，将各组分物质于同一容器中混合，混合均匀后，制得试剂R2。
6.一种如权利要求1-4任一所述的基于多克隆抗体制备的HDL3免疫比浊法检测试剂盒的使用方法，其特征在于，包括如下具体步骤：
（1）吸取2 μL样本，加入150 μL试剂R1，37℃孵育5 min；
（2）再加入50 μL试剂R2进行混合，并使其充分反应；
（3）1 min后读取吸光值A1，3 min后读取吸光值A2，计算ΔA；
（4）定标方法： 6点定标；采用全自动生化分析仪进行检测，并设置校准品浓度分别为：0 μg/mL、11.8 μg/mL、46.9 μg/mL、187.5 μg/mL、375 μg/mL、1500 μg/mL；
（5）依据定标值，根据ΔA测算样本中HDL3含量。
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