JPH06197793A - 微量成分の定量法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】 生体試料等の検体に酸化酵素を作用させ生成
した過酸化水素をさらにペルオキシダーゼにより色原体
の発色に変換し、吸光度検出器で検出するフローインジ
ェクション分析法による検体中の微量成分の定量法。 【構成】 検体中の微量成分に酸化酵素を作用させ発生
した過酸化水素をペルオキシダーゼを用いて検出するフ
ローインジェクション分析法において、色原体としてロ
イコ型の色原体またはその塩を用いることを特徴とする
微量成分の定量法。 【効果】 本発明の方法によれば吸光度検出器を用いた
フローインジェクション分析法で、酸化酵素により過酸
化水素を発生する生体試料中の微量物質などを高感度に
再現性良く定量できる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は臨床化学の分野における
吸光光度法を検出原理とするフローインジェクション分
析法に関し、詳しくは生体試料等の検体に酸化酵素を作
用させ生成した過酸化水素をさらにペルオキシダーゼに
より色原体の発色に変換し、吸光度検出器で検出するフ
ローインジェクション分析法による検体中の微量成分の
定量法に関する。

【０００２】

【従来の技術】従来から、フローインジェクション分析
法は信頼性の高い自動分析法として様々な分野で利用さ
れている。なかでも臨床化学の分野において、測定対象
物質と特異的に反応する酵素と組み合わせて、血清や血
漿など生体試料中の微量成分を定量する方法として重要
である。

【０００３】フローインジェクション分析法における検
出方法としては吸光光度法、蛍光光度法、化学発光法な
どの光学的検出法や電気化学的検出法が利用できる。生
体試料中の微量成分を定量する場合、高感度が要求され
ることから、化学発光法や蛍光光度法が用いられてきた
が、測定の再現性や安定性には問題があった。

【０００４】一方、吸光光度法は測定の再現性や安定性
という観点では最も信頼性の高い検出方法であるが、感
度が低く、生体試料中に比較的高濃度に存在する成分の
定量に適用範囲が限定されていた。

【０００５】

【発明が解決しようとする課題】フローインジェクショ
ン分析法は測定試薬溶液を細いチューブの中を流し、測
定試薬溶液の流れの中に試料を注入し、反応生成物を検
出装置に導くもので、試料と試薬溶液の物理的に均一な
混合や反応の平衡状態への到達は必要とされない。反応
はチューブの中で検出装置に到達するまでの間に行わ
れ、反応時間は比較的短時間に制限される。さらに、固
定化酵素リアクターを用いる場合、酵素と接触している
間のみ反応は進行する。一般に、フローインジェクショ
ン分析法はバッチ反応に比べて反応時間の制約が大き
い。

【０００６】又、固定化酵素リアクターを用いる微量成
分のフローインジェクション分析法では、固定化酵素リ
アクターを用いる場合に、固定化した酵素の活性変化あ
るいは色素生成量が経時的に変化することは測定値の変
動の原因となり好ましくない。従って、酵素活性あるい
は色素生成量に影響しない試薬溶液組成物であることが
必要となる。

【０００７】このように、吸光光度法によるフローイン
ジェクション分析法では、種々の制約があり、特に、測
定対象物質が試料中に微量しか存在しない場合には、該
分析法は不適当であると考えられていた。

【０００８】本発明は、吸光光度法を検出原理とするフ
ローインジェクション分析法で、高感度、再現性の高い
定量法であり、試料中の微量成分の定量を可能とする方
法を提供することにある。

【０００９】

【課題を解決するための手段】本発明者らは吸光光度法
を検出原理とするフローインジェクション分析法に使用
できる試薬について鋭意研究した結果、高い再現性を有
し、化学発光法や蛍光光度法に匹敵する高感度測定を可
能とする色原体を見いだし、本発明を完成した。

【００１０】即ち、本発明は、（１） 検体中の微量成
分に酸化酵素を作用させ発生した過酸化水素をペルオキ
シダーゼを用いて検出するフローインジェクション分析
法において、色原体としてロイコ型の色原体またはその
塩を用いることを特徴とする微量成分の定量法，（２）
酸化酵素とペルオキシダーゼの一方または両方が固定
化担体に担持されている上記（１）記載の定量法，
（３） 色原体がＮ−（カルボキシメチルアミノカルボ
ニル）−４，４’−ビス（ジメチルアミノ）−ジフェニ
ルアミンまたはその塩である上記（１）または（２）記
載の定量法，（４） 酸化酵素がピラノースオキシダー
ゼである上記（１）、（２）または（３）記載の定量
法，（５） 微量成分が１，５−アンヒドロ−Ｄ−グル
シトールである上記（１）、（２）、（３）または
（４）記載の定量法，に関する。以下に本発明について
詳細に説明する。

【００１１】本発明において使用されるフローインジェ
クション分析装置システムは少なくとも送液装置、試料
（検体）注入装置、吸光度検出器、およびそれらをつな
ぎ試薬溶液などを移送するチューブ類やジョイント類と
吸光度検出器で得られたシグナルを指示・記録する装置
より構成される。

【００１２】送液装置としては、シリンジタイプのポン
プ、しごきチューブポンプ、ダイヤフラムポンプ、ギヤ
ポンプ、プランジャー型ポンプなど種々のものが使用さ
れるが、脈流が少ないプランジャーポンプが好ましい。

【００１３】試料注入装置としては種々のものが使用で
き、特に限定されないが、オートサンプラーとして広く
使用されている六方バルブを用いた試料注入装置が好ま
しい。

【００１４】吸光度検出器は発色した色原体の吸収波長
の測定が可能なものであればいずれでもよく、例えば公
知の微小フローセルが使用できる。

【００１５】また、反応時間を調節するため適当な長さ
のチューブを巻いた反応コイルなども設置することがで
きる。

【００１６】酸化酵素および／またはペルオキシダーゼ
は、試薬溶液として送液してもよく、又、固定化担体に
担持し、酵素リアクターにしてフローインジェクション
分析装置システムにセットして使用することもできる。

【００１７】酸化酵素およびペルオキシダーゼを試薬溶
液として用いる場合、混合試薬溶液として送液しても、
別々の送液装置により送液して検出器に入る前の配管上
で合流させてもよい。さらに、検査試料（検体）を移送
する送液装置を試薬溶液を移送する送液装置とは別に設
け、検査試料をキャリアー液で移送し、試薬溶液とキャ
リアー液を検出装置に入る前の配管上で合流させてもよ
い。もちろん検査試料を移送するキャリアー液として試
薬溶液を用い、試薬溶液中に検査試料を注入してもよ
い。

【００１８】また、酸化酵素及び／またはペルオキシダ
ーゼが固定化担体やチューブ内壁に固定化された酵素リ
アクターを用いる場合には、それらも装置配管上に設置
される。

【００１９】図１に酸化酵素およびペルオキシダーゼを
試薬溶液で送液するシステムの一例を示す。即ち、検査
試料移送用キャリアー溶液槽１中の検査試料移送用キャ
リアーをポンプ３により吸光度検出器５に通液する。
又、試薬溶液槽２中の試薬溶液はポンプ３’により吸光
度検出器５に至る前に試料移送用キャリアーと合流させ
る。検査試料は、試料注入器４より注入し、吸光度検出
器５で得られるシグナルは、指示・記録装置６において
記録される。

【００２０】図２に酸化酵素およびペルオキシダーゼを
固定化担体に担持した酵素リアクターを用いるシステム
の一例を示す。即ち、図２において、試薬溶液槽１１か
ら試薬溶液をポンプ１２により酸化酵素リアクター１
４、続いてペルオキシダーゼリアクター１５に、更に吸
光度検出器１６に通液する。検査試料は試料注入器１３
より注入し、吸光度検出器１６で得られるシグナルは、
指示・記録装置１７において記録される。酵素の使用さ
れる形態や検査試料、試薬溶液の移送方法により種々の
システムが可能であり、特にこれらに限定されるもので
はない。

【００２１】さらに、検査試料中に測定に影響を及ぼす
物質が含まれる場合、これらの物質を除去したものを検
査試料（検体）として用いるか、又は、配管の途中にこ
れらの物質の除去用カラムやフィルターなどを設置する
ことも可能である。

【００２２】本発明の方法は過酸化水素を化学量論的に
生成する酸化酵素に反応する基質（微量成分）の定量に
応用でき、該基質（微量成分）は特に限定されない。た
とえば、生体試料中のグルコースや１，５−アンヒドロ
グルシトールなどの糖類、コレステロール、グリセリ
ン、トリグリセライド、中性脂肪酸、遊離脂肪酸、尿
酸、リン脂質、胆汁酸、ポリアミンなどが挙げられる
が、これらに限定されるものではない。

【００２３】検体としては種々のものが使用でき、特に
限定されない。例えば血清、血漿、血液、髄液などの体
液や尿などの排泄物、便などの希釈物から固形分を除去
したもの、各種組織の抽出液などの生体試料や、これら
生体試料から、微量成分の検出を妨害する物質を除去し
た処理液等が挙げられる。

【００２４】本発明において、フローインジェクション
分析法は常法により行なうことができる。

【００２５】酸化酵素としては、例えば、グルコースオ
キシダーゼ（ＥＣ１．１．３．４）、コレステロールオ
キシダーゼ（ＥＣ１．１．３．６）、ピラノースオキシ
ダーゼ（ＥＣ１．１．３．１０）、Ｌ−ソルボースオキ
シダーゼ（ＥＣ１．１．３．１１）、ウリカーゼ（ＥＣ
１．７．３．３）、プトレシンオキシダーゼ（ＥＣ１．
４．３．１０）等が挙げられる。

【００２６】酸化酵素は、測定すべき検体中の微量成分
の種類に応じて適宜選択される。又、測定する微量成分
の種類によっては、酸化酵素を該微量成分に作用させる
前に、常法により検体を他の酵素等で処理して、酸化酵
素の基質となるように変換処理してもよい。

【００２７】本発明で用いられるペルオキシダーゼとし
ては、その起源、由来は特に限定されない。植物、動
物、微生物由来のペルオキシダーゼ（ＥＣ１．１１．
１．７）およびペルオキシダーゼ様活性物質等が挙げら
れる。これらのペルオキシダーゼは単独あるいは組み合
わせて使用できる。

【００２８】酸化酵素及びペルオキシダーゼの使用量
は、測定すべき検体中の微量成分の種類、量、酵素の種
類、測定条件により適宜決定される。酸化酵素及びペル
オキシダーゼは試薬溶液として供給でき、又、固定化担
体に担持して酵素リアクターとして使用してもよい。

【００２９】本発明で酸化酵素および／またはペルオキ
シダーゼを固定化担体や中空チューブに担持して酵素リ
アクターとして用いる場合、固定化方法は特に限定され
ない。吸着法、包括法、架橋法、共有結合法などの公知
の固定化方法が適用できる。なかでも反応中に酵素の脱
離の起こらない共有結合法が好ましい。共有結合法にお
いても種々の方法が適用される。たとえば、シアン化ブ
ロム法、グルタルアルデヒド法、過ヨウ素酸法、シラン
化法、カルボキシル基を活性エステルにした後結合する
方法、エポキシ基、ホルミル基、トレシル基などの官能
基を有する担体と結合させる方法が適用できる。担体の
材質も特に限定されない。たとえば、セルロース、デキ
ストラン、多孔質ガラス、シリカゲル、キサントン、ア
ガロース、ポリアクリルアミド、セラミック、ナイロ
ン、アミノ酸共重合体などが挙げられる。

【００３０】本発明で使用される色原体としてはロイコ
インドフェノール類誘導体、ロイコメチレンブルー類誘
導体、トリフェニルメタン系ロイコ色素等が挙げられ
る。たとえば、Ｎ−（カルボキシメチルアミノカルボニ
ル）−４，４’−ビス（ジメチルアミノ）−ジフェニル
アミン ナトリウム塩（ＤＡ−６４）、１０−（カルボ
キシメチルアミノカルボニル）−３，７−ビス（ジメチ
ルアミノ）−フェノチアジン ナトリウム塩（ＤＡ−６
７）、４，４’−ビス（ジメチルアミノ）ジフェニルア
ミン，１０−Ｎ−メチルカルバミル−３，７−ビス（ジ
メチルアミノ）−１０Ｈ−フェノチアジン（ＭＣＤ
Ｐ）、ビス（３−ビス（４−クロロフェニル）メチル−
４−ジメチル−アミノフェニル）アミン（ＢＣＭＡ）な
どが挙げられる。特に好まれるものとしてＮ−（カルボ
キシメチルアミノカルボニル）−４，４’−ビス（ジメ
チルアミノ−ジフェニルアミン ナトリウム塩（ＤＡ−
６４）、１０−（カルボキシメチルアミノカルボニル）
−３，７−ビス（ジメチルアミノ）−フェノチアジン
ナトリウム塩（ＤＡ−６７）が使用できる。しかし、特
にこれらに限定するものではない。使用する濃度は、特
に限定されないが、通常ペルオキシダーゼを作用させる
液流中に０．１〜１０００μＭの範囲で、好ましくは１
〜５０μＭの範囲で色原体を存在させる。

【００３１】測定は通常ｐＨ２〜１０で実施され、試薬
溶液に使用される緩衝剤としてはリン酸塩、クエン酸
塩、ホウ酸塩、炭酸塩、酢酸塩、コハク酸塩、シュウ酸
塩、トリス緩衝液、グッド緩衝液などが使用できる。色
原体の溶解性を向上させるためにジメチルホルムアミ
ド、ジメチルスルホキシドなどの有機溶媒も添加でき
る。

【００３２】フローインジェクション分析装置システム
が試薬溶液やキャリアー液として２種類以上の緩衝液を
送液する場合、それぞれ種類やｐＨの異なる緩衝液を使
用できる。酸化酵素、ペルオキシダーゼ、その他酵素、
酵素反応に関与する基質や物質を溶液として使用する場
合、これらの緩衝液のいずれかに添加する。

【００３３】緩衝液には必要に応じて界面活性剤が用い
られる。界面活性剤としては、たとえば、ポリオキシエ
チレンアルキルエーテル、ポリオキシエチレンアルキル
フェニルエーテル、ポリオキシエチレン脂肪酸エステ
ル、ソルビタン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンソ
ルビタン脂肪酸エステルなどが挙げられる。

【００３４】試薬を含む緩衝液（試薬溶液）及びキャリ
アー液は通常０．００１〜２０ml／min で送液される。

【００３５】注入する検体の量は特に限定されないが、
通常は１回あたり０．１〜１００μｌである。

【００３６】反応は通常０〜８０℃、好ましくは４〜４
０℃で行う。

【００３７】吸光度測定は色素の生成によって生じる吸
収波長領域、好ましくは極大吸収波長付近で行う。定量
はシグナルの面積または高さを測定し、あらかじめ既知
濃度の標準物質から求めた検量線を利用して未知濃度試
料の濃度を定量できる。

【００３８】

【実施例】以下に実施例によって本発明を具体的に説明
するが、これらによって本発明が限定されるものではな
い。

【００３９】実施例１ １，５−アンヒドロ−Ｄ−グ
ルシトール標品の検出 Ｎ−（カルボキシメチルアミノカルボニル）−４，４’
−ビス（ジメチルアミノ）−ジフェニルアミン ナトリ
ウム塩（ＤＡ−６４）を色原体として１，５−アンヒド
ロ−Ｄ−グルシトール標品により検出されるピーク面積
を調べた。

【００４０】使用したフローインジェクションシステム
を図１に示す。ポンプは東ソー社製ＣＣＰＭ、試料注入
装置は東ソー社製ＡＳ−８０１０、吸光度検出器は島津
製作所ＳＰＤ−１０ＡＶ、指示・記録装置は東ソー社製
ＳＣ−８０１０を用いた。反応コイル（内径０．５mm、
長さ６００cm）は吸光度検出器の前に設置された。ＤＡ
−６４を表１に示される濃度で含む緩衝液を検査試料移
送用キャリアーとして１ml／min で送液した。ピラノー
スオキシダーゼおよびホースラディシュペルオキシダー
ゼはそれぞれ２０ｕ／ml、２ｕ／mlになるように蒸留水
に溶解し、試薬溶液として１ml／min で送液した。

【００４１】試料は１０μｇ／mlの１，５−アンヒドロ
−Ｄ−グルシトール水溶液を１５μｌ注入し、７２５ｎ
ｍの吸光度でピーク面積を測定した。測定は室温で行っ
た。試料のピークは注入後２分以内に検出された。

【００４２】比較例１ １，５−アンヒドロ−Ｄ−グ
ルシトール標品の検出 実施例１と同様にして、種々の色原体を用いた場合の
１，５−アンヒドロ−Ｄ−グルシトール標品により検出
されるピーク面積を調べた。各色原体の使用濃度、緩衝
液、測定波長を表１に示す。

【００４３】実施例１および比較例１の結果を表１に併
せて示す。

【００４４】

【表１】

【００４５】ＤＡ−６４は１０μｇ／mlの１，５−アン
ヒドロ−Ｄ−グルシトールを検出することができたが、
試験した他の色原体では検出できなかった。

【００４６】参考例１ バッチ法による１，５−アン
ヒドロ−Ｄ−グルシトール標品の検出 フローインジェクション分析法で１，５−アンヒドロ−
Ｄ−グルシトールを検出できなかった色原体ＡＢＴＳを
用いバッチ法で試験した。

【００４７】１６０μＭのＡＢＴＳおよびピラノースオ
キシダーゼとホースラディッシュペルオキシダーゼをそ
れぞれ１０ｕ／ml，１ｕ／ml含有する０．１Ｍクエン酸
緩衝液ｐＨ６．０を試験管に１ml取り、１０μｇ／mlの
１，５−アンヒドロ−Ｄ−グルシトール水溶液を１５μ
ｌを加え、良く混合した後室温で１時間４２０ｎｍの吸
光度の経時変化を測定した。ブランクとして蒸留水１５
μｌを添加したものを同時に測定した。結果を表２に示
す。

【００４８】

【表２】

【００４９】バッチ法では吸光度変化が十分検出できる
ことがわかる。

【００５０】実施例２ １，５−アンヒドロ−Ｄ−グ
ルシトール標品の検出限界 色原体ＤＡ−６４、ＤＡ−６７、ＭＣＤＰについて１，
５−アンヒドロ−Ｄ−グルシトール標品の検出限界を調
べた。使用したフローインジェクション分析装置システ
ムを図２に示す。ピラノースオキシダーゼはグルタルア
ルデヒド法でアミノトヨパール（東ソー株式会社製）に
固定化し、内径２．０mm、長さ７．５cmのカラムに充填
し酸化酵素リアクターとして使用した。カラム当たり酵
素量は６００ユニットであった。ホースラディッシュペ
ルオキシダーゼは過ヨウ素酸法でアミノトヨパールに固
定化し、内径２．０mm、長さ３．５cmのカラムに充填し
ペルオキシダーゼリアクターとして使用した。カラム当
たり酵素量は６００ユニットであった。

【００５１】２０μＭの色原体を含む０．１Ｍトリス塩
酸緩衝液ｐＨ７．０を試薬溶液とした。

【００５２】１０μｇ／mlの１，５−アンヒドロ−Ｄ−
グルシトール水溶液を倍々希釈し、各種濃度の１，５−
アンヒドロ−Ｄ−グルシトール水溶液を試料とした。試
薬溶液を１ml／min で送液しながら、試料を１５μｌ注
入し、ピーク面積を室温で測定した。ＳＮ比２を検出限
界として各種色原体の検出感度を検討した。測定波長と
結果を表３に示す。

【００５３】比較例２ 実施例２と同様にして、４−ＡＡ（４−アミノアンチピ
リン）とｐ−クロロフェノール又はＮ，Ｎ−ジエチルア
ニリンについて検討した。

【００５４】２０μＭの４−ＡＡと２０μＭのｐ−クロ
ロフェノールまたはＮ，Ｎ−ジエチルアニリンを含む
０．１Ｍトリス塩酸緩衝液ｐＨ７．０を試薬溶液としそ
の他は実施例２と同様にして測定を行った。結果を表３
に示す。

【００５５】

【表３】

【００５６】本発明の色原体を用いる測定法は、他の色
原体を用いた場合に比べて非常に高感度である。

【００５７】参考例２ 化学発光法による１，５−ア
ンヒドロ−Ｄ−グルシトール標品の検出限界 図３に示すフローインジェクション分析装置システムを
用い、ルミノールとペルオキシダーゼ（ＡＲＰ：Arther
omyces ramosus由来）による１，５−アンヒドロ−Ｄ−
グルシトール標品の検出限界を調べた。

【００５８】試料は実施例２と同様に調製した。キャリ
アー液は５ｍＭのホウ酸を用い、キャリアー槽２１から
１ml／min の流速で送液した。１５μｌの試料をキャリ
アー中に注入し、実施例２と同じピラノースオキシダー
ゼリアクターに移送し過酸化水素を発生させた。

【００５９】試薬溶液槽２１−１の０．１４７ｍＭルミ
ノール０．２Ｍホウ酸緩衝液ｐＨ１０．９および試薬液
槽２１−２の２５μｇ／mlＡＲＰ水溶液はそれぞれ０．
５ml／min で送液し、混合後、化学発光検出器２６（日
音社製）に導いた。ピラノースオキシダーゼの作用によ
り生成した過酸化水素と、ルミノールとＡＲＰの混合液
は検出セル直前で混合し、セル内に入るようにした。

【００６０】ＳＮ比２での検出限界は０．００９８μｇ
／mlであった。

【００６１】本発明の方法による１，５−アンヒドロ−
Ｄ−グルシトール標品の検出感度は化学発光にほぼ匹敵
する高感度を有することが判った。

【００６２】実施例３ ＤＡ−６４の酵素リアクター
への影響 ＤＡ−６４を用い、試料を連続注入した場合のピーク面
積の変動を調べた。フローインジェクション分析装置シ
ステムは実施例２と同様である。試薬溶液はＤＡ−６４
を２０μＭになるように０．０２％ Triton X-100 を含
む０．１Ｍトリス塩酸緩衝液ｐＨ７．０に溶解し調製し
た。測定は７２５ｎｍ、室温、送液速度１ml／min で行
った。未使用の酵素リアクター（実施例２と同様にして
作成したものを使用）を装置システムに装着し、試薬溶
液を３０分送液した後、１０μｇ／mlの１，５−アンヒ
ドロ−Ｄ−グルシトール水溶液１５μｌを２．５分間隔
で５０連続注入しピーク面積の変動を調べた。

【００６３】結果は図４に、１回目のピーク面積を１０
０にしたときの相対的値で示す。１回目からほとんど変
動がなく安定な測定が可能であった。

【００６４】比較例３ ４−ＡＡとｐ−クロロフェノ
ールを色原体としたときの酵素リアクターへの影響 ４−ＡＡとｐ−クロロフェノールを用いて実施例３と同
一の試験を行った。

【００６５】試薬溶液は４−ＡＡとｐ−クロロフェノー
ルをそれぞれ２０μＭになるように０．０２％ Triton
X-100 を含む０．１Ｍトリス塩酸緩衝液ｐＨ７．０に溶
解し調製した。測定は測定波長５０５ｎｍである以外、
実施例３と同じである。

【００６６】結果を図４に、１回目のピーク面積を１０
０にしたときの相対的値で示す。注入回数が増すにつれ
ピーク面積の増加が見られ、測定間の変動も大きかっ
た。

【００６７】試験終了後、未使用の酵素リアクターに交
換しピーク面積を比較したところ、ペルオキシダーゼリ
アクターの活性が変化していることが判った。

【００６８】実施例４ 血清中の１，５−アンヒドロ
−Ｄ−グルシトールの定量 使用したフローインジェクション分析装置システムを図
２に示す。５μＭのＤＡ−６４と０．０２％の Triton
X-100 を含む０．１Ｍ ＰＩＰＥＳ（ピペラジン−１，
４−ビス（２−エタンスルホン酸））ｐＨ６．８を試薬
溶液として、１ml／min で送液した。試料はグルコース
およびタンパクを除去するため、市販のキット（ラナＡ
Ｇ（アンヒドログルシトール）日本化薬株式会社製）に
添付されている前処理カラムで処理して調製した。即
ち、ヒト血清５０μｌを前処理カラムに注入し、その後
２回５００μｌの蒸留水を注入して溶出したものを試料
とした。５０μｇ／mlおよび５μｇ／mlの１，５−アン
ヒドロ−Ｄ−グルシトール標準液（標準）も同様の操作
をした。測定は室温、測定波長は７２５ｎｍで、前処理
した試料および標準を２０μｌ注入して行った。標準の
ピーク面積から得られた検量線を用いて試料の濃度を求
めた。

【００６９】参考例３ 血清中の１，５−アンヒドロ
−Ｄ−グルシトールの定量 実施例４と同じ試料を用い、用手法の市販のキット（ラ
ナＡＧ（アンヒドログルシトール）日本化薬株式会社
製）を使用して、血清中の１，５−アンヒドロ−Ｄ−グ
ルシトール濃度を測定した。

【００７０】実施例４および参考例３の結果を表４に併
せて示す。表４から明らかなように、両者は良い一致を
示した。

【００７１】

【表４】

【００７２】実施例５ 血清中のグルコースの定量 酸化酵素がグルコースオキシダーゼである以外は実施例
４と同一の測定装置、試薬溶液を用いて測定した。グル
コースオキシダーゼはエポキシトヨパール（東ソー株式
会社製）に担持し、内径２．０mm、長さ７．５cmのカラ
ムに充填し、酵素リアクターとした。カラム当たりの活
性は１０００ユニットであった。

【００７３】試料（ヒト血清）は蒸留水で５０倍に希釈
して１０μｌ注入した。あらかじめ既知濃度の標準を測
定して作成した検量線より濃度を求めた。

【００７４】参考例４ 血清中のグルコースの定量 実施例５と同じ試料を用い、バッチ法用の市販のキット
（グルコースＢ−テストワコー 和光純薬（株）社製）
を使用して、グルコース濃度を測定した。

【００７５】実施例５および参考例４の結果を表５に併
せて示す。表５から明らかなように、両者は良い一致を
示した。

【００７６】

【表５】

【００７７】実施例６ 血清中の尿酸の定量 酸化酵素がウリカーゼである以外は実施例４と同一の測
定装置、試薬溶液を用いて測定した。ウリカーゼはエポ
キシトヨパール（東ソー株式会社製）に担持し、内径
２．０mm、長さ１０cmのカラムに充填し、酵素リアクタ
ーとした。カラム当たりの活性は１００ユニットであっ
た。

【００７８】試料（ヒト血清）は蒸留水で１０倍に希釈
して１０μｌ注入した。あらかじめ既知濃度の標準を測
定して作成した検量線より濃度を求めた。

【００７９】参考例５ 血清中の尿酸の定量 実施例６と同じ試料を用い、バッチ法用の市販のキット
（尿酸Ｃ−テストワコー 和光純薬（株）社製）を使用
して、尿酸濃度を測定した。

【００８０】実施例６および参考例５の結果を表６に併
せて示す。表６から明らかなように、両者は良い一致を
示した。

【００８１】

【表６】

【００８２】

【発明の効果】本発明の方法によれば吸光度検出器を用
いたフローインジェクション分析法で、酸化酵素により
過酸化水素を発生する生体試料中の微量物質などを高感
度に再現性良く定量できる。

【図面の簡単な説明】

【図１】酸化酵素およびペルオキシダーゼを試薬溶液と
して送液するフローインジェクション分析装置システム
の一例を示す概略図。

【図２】酸化酵素およびペルオキシダーゼを固定化担体
に担持した酵素リアクターを用いるフローインジェクシ
ョン分析装置システムの一例を示す概略図。

【図３】参考例２で用いた化学発行検出器を用いたフロ
ーインジェクション分析装置システムの概略図。

【図４】未使用の酵素カラムリアクターに試料を連続注
入したときのピーク面積の変化を示す。

【符号の説明】

１，２１……試料移送用キャリアー溶液槽 ２，１１……試薬溶液槽 ３，３’，１２，２３，２３’，２３”……ポンプ ４，１３，２４……試料注入器 ５，１６，２６……吸光度検出器 ６，１７，２７……指示・記録装置 １４，２５……酸化酵素リアクター １５……ペルオキシダーゼリアクター ２１−１……試薬溶液槽（ルミノール） ２１−２……試薬液槽（ＡＲＰ）

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 長谷川 みどり 群馬県太田市大字由良1133−２ (72)発明者 梅香家 佳彦 神奈川県藤沢市湘南台４丁目26−５−205 (72)発明者 古屋敷 佳久 神奈川県藤沢市湘南台４丁目26−５−304 (72)発明者 北村 隆司 山口県熊毛郡熊毛町西勝間原1100−179

Claims (5)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 検体中の微量成分に酸化酵素を作用させ
   発生した過酸化水素をペルオキシダーゼを用いて検出す
   るフローインジェクション分析法において、色原体とし
   てロイコ型の色原体またはその塩を用いることを特徴と
   する微量成分の定量法。
2. 【請求項２】 酸化酵素とペルオキシダーゼの一方また
   は両方が固定化担体に担持されている請求項１記載の定
   量法。
3. 【請求項３】 色原体がＮ−（カルボキシメチルアミノ
   カルボニル）−４，４’−ビス（ジメチルアミノ）−ジ
   フェニルアミン又はその塩である請求項１又は２記載の
   定量法。
4. 【請求項４】 酸化酵素がピラノースオキシダーゼであ
   る請求項１、２または３記載の定量法。
5. 【請求項５】 微量成分が１，５−アンヒドロ−Ｄ−グ
   ルシトールである請求項１、２、３又は４記載の定量
   法。