CN102680701A - 一种尿蛋白液体定量检测试剂及方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种尿蛋白的液体定量检测试剂及方法，由焦酚溶液与一种中间溶液混合制得；所述中间溶液由蒸馏水溶解一定量的琥珀酸、苯甲酸钠、钼酸钠得到；利用自主研发的尿蛋白液体定量检测试剂结合自动化分析仪，能准确定量尿样本中蛋白质的含量，给临床医生提供准确的信息，为实现定量、自动化、快速检测尿液样本提供了可能。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及一种尿蛋白（Urinary Protein）液体定量检测试剂和方法。
背景技术
尿液是由某些血液成分经过肾小球滤过作用，肾小管重吸收、集合、排泌形成的。临床尿液检测可以帮助医生了解病患的泌尿生理功能和病理功能的变化，也可以间接反映全身多脏器及系统的功能情况。
蛋白尿指的是尿液中含有非正常高浓度蛋白质的病症，尿蛋白主要为白蛋白，同时也包含一些球蛋白和肾元分泌的蛋白质。在正常情况下，大多数蛋白质是不可以通过肾小球的滤过作用而进入尿液的，但是在肾脏功能受到损坏的情况下，一些蛋白质会进入尿液，形成蛋白尿。对尿中蛋白质含量进行检测的意义在于可以诊断和治疗肾脏及相关系统疾病，帮助医生清晰地了解病人病情的严重程度。
国内外临床尿检验非常普遍，许多与肾功能，心血管，代谢病，感染病等有关领域的检验都需要进行尿液检测。常规的尿检验包括以下10项：葡萄糖（GLU)、胆红素(BIL)、尿胆原(URO)、酮体(KET)、白细胞(LEC)、亚硝酸盐（NIT)、蛋白质(PRO)、酸碱度（pH）、潜血（BLD）和比重（SG），若是12项检验还包括维生素C（VC）和微量白蛋白（Microalbumin）。
国内目前应用的尿检验技术主要是干化学试纸定性检验系统，只能提供定性分析结果如阴性或阳性，不能定量。此外，干化学试纸法受影响因素也较多，临床工作中不可避免地会出现假阴性和假阳性，很难为临床医生提供准确的诊断信息。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是弥补现有的干化学试剂系统存在的缺陷，提供一种尿蛋白液体定量检测试剂及方法。
本发明解决上述技术问题所采用的技术方案是该尿蛋白液体定量检测试剂的制备方法包含以下制备步骤：
a、往0.1－0.7L有机溶剂中加入0.1－1.0g焦酚，搅拌至完全溶解，形成焦酚溶液；
b、用蒸馏水溶解下列化合物： 0.1－0.5g琥珀酸、 0.01－0.1g苯甲酸钠、0.01－1.0g 钼酸钠，完全溶解，得到中间溶液；
c、将中间溶液与焦酚溶液混合，搅拌混匀后定容至1L，形成尿蛋白液体定量检测试剂。
本发明所述的有机溶剂为甲醇或乙醇或二甲基甲酰胺。
本发明所述的有机溶剂优选为甲醇。
本发明所述尿蛋白液体定量检测试剂的制备步骤的优选配比为：
a、往0.5L有机溶剂中加入0.4g焦酚，搅拌至完全溶解，形成焦酚溶液；
b、用0.4L蒸馏水溶解下列化合物：0.5g琥珀酸、0.09g苯甲酸钠、0.06g 钼酸钠，完全溶解，得到中间溶液；
c、将中间溶液与焦酚溶液混合，搅拌混匀后定容至1L，形成尿蛋白液体定量检测试剂。
本发明所述的任意一种试剂的尿蛋白液体定量检测方法，包含以下步骤：
a、把所述尿蛋白液体定量检测试剂分装后放入自动化分析仪的R1试剂仓，然后进行尿蛋白检测项目的参数设置；样品体积：2－10ml，R1试剂：50－150ml，校准类型：4AB，波长：600nm，检测方法：终点法，测光点：0－20；
b、设定4个标准品浓度：0mg/dL、30mg/dL、100mg/dL、250mg/dL，测定不同浓度标准品的吸光值，制作浓度对吸光值的标准曲线；
c、根据标准曲线进行试剂检测灵敏度分析；
d、根据标准曲线进行样品的精密度和回收率试验；
e、根据标准曲线进行常用内源性物质的干扰分析试验。
本发明所述的尿蛋白液体定量检测方法，灵敏度为1mg/dL。
本发明所述的尿蛋白液体定量检测方法，检测尿液样本里的尿蛋白与内源性物质抗坏血酸、肌酐和葡萄糖无交叉反应。
本发明所述的自动化分析仪为Hitachi7180、Olympus5400或迈瑞BS-800。
本发明所述的自动化分析仪优选为Olympus5400。
本发明同现有技术相比具有以下优点及效果：该液体定量检测试剂及方法是利用生化反应原理，采用液体试剂系统，借助自动化分析仪对尿液中的蛋白质进行定量检测的方法，同时具有定量、准确、快速和操作简便的优点。
附图说明
图1为Olympus5400自动化分析仪测定尿蛋白的标准曲线。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步的详细说明，以下实施例是对本发明的解释而本发明并不局限于以下实施例。
实施例1：一种尿蛋白液体定量检测试剂的制备步骤：
a、往0.5L有机溶剂中加入0.4g焦酚，搅拌至完全溶解，形成焦酚溶液；
b、用0.4L蒸馏水溶解下列化合物： 0.5g琥珀酸、 0.09g苯甲酸钠、0.06g 钼酸钠，完全溶解，得到中间溶液；
c、将中间溶液与焦酚溶液混合，搅拌混匀后定容至1L，形成尿蛋白液体定量检测试剂。
其它实施例2－13：其它实施例的制备步骤与实施例1相同，区别仅在于配比，故将其它实施例的配比列表如下：
| 实施例 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 | 11 | 12 | 13 |
| 有机溶剂（L） | 0.1 | 0.1 | 0.2 | 0.2 | 0.35 | 0.35 | 0.5 | 0.5 | 0.6 | 0.6 | 0.7 | 0.7 |
| 焦酚（g） | 0.1 | 0.1 | 0.35 | 0.35 | 0.35 | 0.4 | 0.4 | 0.4 | 0.7 | 0.7 | 1.0 | 1.0 |
| 琥珀酸（g） | 0.1 | 0.1 | 0.1 | 0.1 | 0.25 | 0.25 | 0.25 | 0.5 | 0.5 | 0.5 | 0.5 | 0.5 |
| 苯甲酸钠（g） | 0.01 | 0.01 | 0.03 | 0.03 | 0.06 | 0.06 | 0.06 | 0.09 | 0.09 | 0.09 | 0.09 | 0.1 |
| 钼酸钠（g） | 0.01 | 0.04 | 0.04 | 0.06 | 0.06 | 0.06 | 0.06 | 0.08 | 0.08 | 1.0 | 1.0 | 1.0 |
实施例14 ：一种尿蛋白液体试剂定量检测方法，本发明所述的尿蛋白液体定量检测方法是基于一种生化反应原理，当尿液中的蛋白质与液体检测试剂中的邻苯三酚红钼络合物接触时，蛋白质的氨基基团可与其形成一种蓝色化合物，该化合物在600nm波长处有吸收峰。可以通过制作蛋白浓度对吸光值剂量效应的标准曲线来定量尿液中的蛋白质或者质控品的浓度。样本中的蛋白质含量越高，吸光值的信号越强。
本发明所述的任意一种试剂的尿蛋白液体定量检测方法，包含以下步骤：
a、把所述尿蛋白液体定量检测试剂分装后放入自动化分析仪Olympus5400的R1试剂仓，然后进行尿蛋白检测项目的参数设置；样品体积：5ml，R1试剂：120ml，校准类型：4AB，波长：600nm，检测方法：终点法，测光点：0－10。
b、设定4个标准品浓度：0mg/dL、30mg/dL、100mg/dL、250mg/dL，测定不同浓度标准品的吸光值，制作浓度对吸光值的标准曲线；如图1所示。
c、根据标准曲线进行试剂检测灵敏度分析；为了确定该尿蛋白液体定量检测方法的最低检测限值（Limit of detection，LOD），进行了灵敏度实验，其方法如下：根据尿蛋白浓度对吸光值的标准曲线，重复测定一份含尿蛋白浓度为0mg/dL的尿液标本20次，记录得到的浓度值并计算平均值，记为 
，则LOD=+3SD。经实验结果计算得到的灵敏度为1mg/dL。
d、根据标准曲线进行样品的精密度和回收率试验；为了确定所建立的尿蛋白液体定量检测方法可以用于尿液样本尿蛋白的检验，进行了样本的精密度和回收率实验。通过尿蛋白的定标曲线及方法，重复测定空白、低、中、高三种浓度的样本各5次（将尿蛋白标准品加入空白尿基质中，至终浓度分别为0.0、20.0、50.0、200.0mg/dL），计算精密度和回收率，结果如表1所示。
表1.精密度和回收率试验结果
| 样本 | 1 | 2 | 3 | 4 |
| 样品浓度（mg/dL） | 0.0 | 20.0 | 50.0 | 200.0 |
| test 1 | 0.0 | 20.0 | 49.0 | 203.0 |
| Test 2 | 0.0 | 19.0 | 50.0 | 198.0 |
| test 3 | 0.0 | 19.0 | 50.0 | 205.0 |
| test 4 | 0.0 | 19.0 | 50.0 | 202.0 |
| test 5 | 0.0 | 20.0 | 49.0 | 209.0 |
| 平均值Mean(mg/dL) | 0.0 | 19.4 | 49.6 | 203.4 |
| 标准差SD(mg/dL) | － | 0.5 | 0.5 | 4.0 |
| 回收率Recovery% | － | 97.0 | 99.2 | 101.7 |
| 变异系数CV% | － | 2.8 | 1.1 | 2.0 |
该检测结果表明，所建立的系统可以用于尿蛋白样本的检测，检测回收率为99.3±2.4%，说明检测结果准确；变异系数（CV%）在1－5之间，满足液体试剂定量检测尿蛋白的要求，说明该定量检测方法稳定。
e、根据标准曲线进行常用内源性物质的干扰分析试验；为了验证其他内源性物质对该尿蛋白液体定量检测方法无干扰，特选取3种物质对其进行干扰试验的测定。这三种物质分别为：抗坏血酸（Ascorbic Acid）、肌酐（Creatinine）和葡萄糖（Glucose）。干扰试验的方法如下：
（a）.选取2份已知尿蛋白浓度的尿液分别为：A，0mg/dL，将A等分为两份A1和A2；B，200mg/dL，将B等分为两份B1和B2。
（b）.向A1和B1中依次加入抗坏血酸、肌酐和葡萄糖，使其终浓度分别为20mg/dL、300mg/dL和300mg/dL，然后根据标准曲线依次测定含有抗坏血酸、肌酐和葡糖糖的尿液A1和B1，将其结果与A2和B2检测结果进行对比。
检测结果显示：A1结果与A2结果差异小于3mg/dL，B1与B2的结果差异小于5%，均属于误差范围，说明上述化合物对所述尿蛋白液体定量检测方法测定结果无干扰。
此外，需要说明的是，本说明书中所描述的具体实施例，其配比可以不同，凡依本发明专利构思所述的构造、特征及原理所做的等效或简单变化，均包括于本发明专利的保护范围内。本发明所属技术领域的技术人员可以对所描述的具体实施例做各种各样的修改或补充或采用类似的方式替代，只要不偏离本发明的结构或者超越本权利要求书所定义的范围，均应属于本发明的保护范围。
虽然本发明已以实施例公开如上，但其并非用以限定本发明的保护范围，任何熟悉该项技术的技术人员，在不脱离本发明的构思和范围内所作的更动与润饰，均应属于本发明的保护范围。
Claims (9)
1.一种尿蛋白液体定量检测试剂，其特征在于所述尿蛋白液体定量检测试剂的制备方法包含以下制备步骤：
a、往0.1－0.7L有机溶剂中加入0.1－1.0g焦酚，搅拌至完全溶解，形成焦酚溶液；
b、用蒸馏水溶解下列化合物： 0.1－0.5g琥珀酸、 0.01－0.1g苯甲酸钠、0.01－1.0g 钼酸钠，完全溶解，得到中间溶液；
c、将中间溶液与焦酚溶液混合，搅拌混匀后定容至1L，形成尿蛋白液体定量检测试剂。
2.根据权利要求1所述的尿蛋白液体定量检测试剂，其特征在于：所述的有机溶剂为甲醇或乙醇或二甲基甲酰胺。
3.根据权利要求2所述的尿蛋白液体定量检测试剂，其特征在于：所述的有机溶剂为甲醇。
4.根据权利要求1或2或3所述的尿蛋白液体定量检测试剂，其特征在于所述制备步骤的配比为：
a、往0.5L有机溶剂中加入0.4g焦酚，搅拌至完全溶解，形成焦酚溶液；
b、用0.4L蒸馏水溶解下列化合物： 0.5g琥珀酸、 0.09g苯甲酸钠、0.06g 钼酸钠，完全溶解，得到中间溶液；
c、将中间溶液与焦酚溶液混合，搅拌混匀后定容至1L，形成尿蛋白液体定量检测试剂。
5.一种用权利要求1、2、3、4中所述的任意一种试剂的尿蛋白液体定量检测方法，其特征在于包含以下步骤：
a、把所述尿蛋白液体定量检测试剂分装后放入自动化分析仪的R1试剂仓，然后进行尿蛋白检测项目的参数设置；样品体积：2－10ml，R1试剂：50－150ml，校准类型：4AB，波长：600nm，检测方法：终点法，测光点：0－20；
b、设定4个标准品浓度：0mg/dL、30mg/dL、100mg/dL、250mg/dL，测定不同浓度标准品的吸光值，制作浓度对吸光值的标准曲线；
c、根据标准曲线进行试剂检测灵敏度分析；
d、根据标准曲线进行样品的精密度和回收率试验；
e、根据标准曲线进行常用内源性物质的干扰分析试验。
6.根据权利要求5所述的尿蛋白液体定量检测方法，其特征在于：灵敏度为1mg/dL。
7.根据权利要求5所述的尿蛋白液体定量检测方法，其特征在于：检测尿液样本里的尿蛋白与内源性物质抗坏血酸、肌酐和葡萄糖无交叉反应。
8.根据权利要求5所述的尿蛋白液体定量检测方法，其特征在于：所述的自动化分析仪为Hitachi7180、Olympus5400或迈瑞BS－800。
9.根据权利要求8所述的尿蛋白液体定量检测方法，其特征在于：所述的自动化分析仪为Olympus5400。
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