KR19980086765A - 단백질 측정용 건식 분석 엘러먼트 - Google Patents

단백질 측정용 건식 분석 엘러먼트 Download PDF

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스타크 마이클
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Abstract

본 발명은 단백질을 신속하고 민감하게 검출하고 정량하는 데 사용할 수 있는 건식 분석 엘러먼트(dry analytical element)에 관한 것이다. 단백질 및 몰리브데이트 이온과 반응하는 염료를 사용하여 염료의 스펙트럼 흡광도에 측정할 만한 변화를 발생시켜 검정을 수행한다. 또한 본 발명은 검정의 정확도를 안정화시키고 증진시키는 중합체 및 중탄산염에 의한 간섭을 감소시키는 화합물에 관한 것이다.

Description

단백질 측정용 건식 분석 엘러먼트
본 발명은 건식 분석 엘러먼트(element) 및 이를 사용하여 유체 샘플 중의 단백질을 정량하는 방법에 관한 것이다. 더욱 특히, 본 발명은 특정 염료 및 몰리브데이트 이온, 이러한 분석 엘러먼트 중에 아크릴아미드를 포함하는 중합체 및 하이드록시카복실산의 용도에 관한 것이다.
의료 수행 및 연구 및 각종 유체, 예를 들어 생물학적 유체중에 존재하는 화학적 및 생물학적 물질의 신속하고 정확한 측정을 위한 분석 및 진단 방법에서 지속적으로 필요하다. 예를 들어, 단백질의 존재 및 양은 많은 사람의 질환의 효과적인 연구, 진단 및 치료를 위해 신속하고 정확하게 측정되어야만 한다.
최근 수십년 동안에 주지된 물질을 검출하기 위해 광범위한 분석 방법이 개발되어 왔다. 당해 방법은 매우 신임할 수 있게 되었으며 몇몇 경우에 자동화를 위해 적합할 뿐만 아니라 키트 형태로 사용하기에 적합하다.
단백질 검정은 통상적으로 용액, 또는 유체가 검정에 사용되는 시약으로부터 특정 방식으로 제거되는 테스트 장치중에서 수행되어 왔다. 용액 기술이 당해 분야에서 광범위하게 수용되어 왔다 할지라도, 이들은 흔히 용액 핸들링이 복잡하고 운송 능력을 갖는 분석 장치를 요구한다. 더욱이, 이러한 검정에서 사용되는 분석 장치는 복잡한 액체 핸들링을 포함할 수 있고 작동 및 샘플대 샘플의 오염을 방지하는데 필요할 수 있는 정밀한 세정능 모두를 위해 기술자가 필요할 수 있다.
용액 화학의 또 다른 방편은 건식 분석 엘러먼트를 사용하는 것이다. 모든 용액 기본 분석학적 검정이 피복제, 예를 들어 결합제, 계면활성제 및 물질 침착, 샘플 습윤화를 촉진시키거나 용이하게 하고 이러한 엘러먼트들의 고유 구조를 유지하는데 필요한 또 다른 시약의 간섭 때문에 건식 분석 엘러먼트중에 사용될 수 없다는 것을 이해해야 한다. 더욱이, 건식 분석 엘러먼트는 동일 반응계에서 구획화하여 비상용성 성분을 분리시켜야 한다. 이것은 분리된 액체를 저장하고 액체를 연속적으로 첨가할 수 있는 용액 화학에 해당되는 것은 아니다.
건식 분석 엘러먼트 및 이의 용도는 수많은 공보[참조: 미국 특허 제4,132,528호, 미국 특허 제4,786,605호, 미국 특허 제3,992,158호, 피어스(Pierce) 등에게 허여된 미국 특허 제4,258,001호, 프릭키(Frickey) 등에게 허여된 미국 특허 제4,670,381호, WO 82/2601(1982년 8월 5일에 공고), 유럽 특허원 제051 183호(1982년 5월 12일에 공고) 및 유럽 특허원 제066 648호(1982년 12월 15일에 공고)]에 기술되어 있고, 언급된 인용 문헌의 전체 내용은 본원에 참조로서 인용되었다.
환자 신장 기능을 평가하고 모니터링는데 유용한 진단 지표는 뇨에 존재하는 총 단백질의 농도이다. 뇨에 존재하는 단백질의 특성 및 양은 다양하고 신장이 뇨로 단백질의 통과를 차단시키지 못하는 특정 질환 상태에 따라 다양하다.
뇨중에서 발견될 수 있는 단백질의 예는 알부민, 온전한 면역글로불린, 카파 부재(kappa free) 쇄, 람다 부재(lambda free) 쇄, 레티놀 결합 단백질, 알파-1-마이크로글로불린 및 베타-1-마이크로글로불린을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 이들 단백질은 아미노산 조성 및 분자량에 있어서 상당한 차이가 있다. 뇨의 총 단백질 선별 검정을 사용하는 임상의에게 관심있는 정보는 뇨 시험편의 단위 용적당 단백질의 총 질량이다. 진단 검정, 즉 이상적으로 측정되는 신호는 존재할 수 있는 단백질의 성질 또는 유형과 무관해야만 한다. 예를 들어, 알부민 50mg/dL은 다른 단백질 50mg/dL과 동일한 신호를 산출해야만 한다. 사람 뇨 중의 정상적인 단백질 농도의 범위는 약 5 내지 100mg/dL이다.
생물학적 물질 중의 총 단백질 농도를 측정하기 위해 다양한 방법이 사용되어 왔다. 많은 분석 검정에서, 스펙트럼의 가시광선 또는 자외선 영역의 흡광도와 같은 광학 신호가 측정되는데 이는 샘플 중의 단백질 농도에 비례한다. 그러나, 일반적으로 신호는 바람직하지 못하게 샘플 중의 단백질의 성질에 대한 함수이고 단순히 존재하는 단백질의 질량과 연관되어 있지 않다. 이들 방법은 일반적으로 검출가능한 광학 신호를 발생시키기 위한 하기의 방법중 하나에 좌우된다:
1. 단백질 및 Cu(II)의 착물, 뷰렛 반응은 스펙트럼의 가시광선 영역에서 검출가능하지만 흡광도가 작다.
2. 단백질의 방향족 아미노산에 의한 스펙트럼의 자외선 영역에서의 흡광도를 측정할 수 있다.
3. 단백질의 양은 고유 흡광도 또는 형광성을 사용하여 정량화될 수 있는 발색단을 포함하는 분자로 특정 아미노산을 유도함으로써 측정될 수 있다.
4. 비공유적으로 단백질과 결합하여 염료의 흡광도 스펙트럼에 동요를 일으키는 염료-단백질 착물을 형성할 수 있는 염료를 사용하여 샘플 중의 단백질의 존재 또는 양을 측정할 수 있다. 몇몇 염료는 금속 이온, 예를 들어 몰리브덴 또는 텅스텐의 존재를 필요로 하고 각각의 경우 염료, 금속 이온 및 단백질의 비공유 착물이 형성되어 염료의 흡광도 스펙트럼의 동요를 일으켜 샘플 중의 단백질의 존재 또는 양을 측정할 수 있도록 한다.
5. Cu(II)의 배위에 대한 염료와 단백질간의 경쟁은 흡광도 신호를 발생시키고, 이는 단백질 농도[Cu(II)/염료 배위 착물은 유리된 염료, 즉 Cu(II)와 배위결합되지 않은 염료와는 상이한 흡광도 스펙트럼을 갖는다]에 비례한다.
미국 특허 제4,132,528호는 뷰렛 반응을 기초로 하는 단백질의 검정에 관한 것이다. 제4,132,528호 특허의 염료 검정 엘러먼트는 Cu(II)의 뷰렛 시약 및 킬레이팅제, 예를 들어 CuSO4 및 타르타르산, 또는 이들 2개의 착물 및 pH가 약 12이상인 완충제를 포함한다. 수성 유체 중의 단백질, 예를 들어 혈청 또는 뇌척수액(CSF)이 pH 12이상에서 뷰렛 시약과 상호 반응하는 경우, 제2구리와 단백질간의 반응은 자색을 나타내도록 한다. 색상의 강도는 혈청의 단백질 함량과 직접적으로 비례하고 단백질 농도는 널리 공지된 비색 분석 기법으로 측정할 수 있다. 불행하게도 인용된 특허의 건식 슬라이드 엘러먼트는 목적하는 것보다 감도가 낮고, 즉 이들은 농도가 약 200mg/dL이하인 단백질을 검출할 수 없다.
미국 특허 제4,786,605호는 뷰렛 시약(들)을 미리 형성된 Cu(II)/피리딜아조 염료 배위 착물(또는 유리된 Cu(II) 및 유리된 피리딜아조 염료)로 대체함으로써 제4,132,528호 특허의 엘러먼트보다 더욱 민감한 단백질의 정량화를 위한 건식 분석 엘러먼트 제형을 기술하고 있다. 수성 단백질이 검정 엘러먼트으로 첨가되는 경우, 제2구리 이온은 단백질에 의해 착물로부터 대체되고 Cu(II)/염료 착물의 흡광도 곡선은 배위되지 않은 염료의 흡광도 곡선으로 전이된다. 따라서, 단백질 첨가시 Cu(II)/염료 착물의 흡광도 피크는 첨가되는 단백질의 양과 비례하여 감소하고 공지된 농도의 단백질을 갖는 샘플을 적당히 조정하여 액체 샘플 중의 미지의 단백질 농도를 비색적으로 측정할 수 있다. 상기 특허는 이들 엘러먼트가 매우 우수한 역동적 범위 및 뷰렛 반응에 기초하는 엘러먼트보다 약 30배 이상의 감도를 갖는다는 것을 교시하고 있다.
그러나, 뇨 샘플 중의 단백질을 정량하기 위한 제4,786,605호 특허 기술의 용도는 일관적으로 뇨 샘플의 약 10 내지 20%가 참조 표준으로서 단백질 농도에 대한 코마시 블루 용액 검정(Coomassie Blue solution)을 사용하여 수득된 값과 비교하여 허용될 수 없는 랜덤 포지티브 경향을 나타낸다는 것을 보여주며, 즉 제4,786,605호 특허 기술을 사용한 특정 환자의 뇨 샘플의 평가된 단백질 농도(샘플군의 약 10 내지 20%)는 코마시 블루계 검정 방법을 사용하여 측정된 값보다 크다. 이러한 랜덤 포지티브 경향은 Cu(II) 및 질소 그룹과 같은 염료상의 환원성 그룹 모두를 환원시키는 아스코르브산과 같은 환원제가 임의의 뇨 샘플중에 존재함으로써 발생된다고 추론된다. 위에서 언급한 검정 방법의 결점에 민감하지 않은 건식 분석 엘러먼트가 목적화된다.
산성 조건하에서 용액 중의 단백질 및 금속 이온과 착물화된 특정 지시 염료의 반응이 측정 가능한 색상 변화를 산출한다는 것은 널리 공지되어 있다. 위에서 언급한 바와 같이, 용액중에서 잘 작용하는 분석 검정 방법은 본원에서 인용된 이유 때문에 건식 분석 엘러먼트에 용이하게 적용될 수 없다.
상이한 단백질이 균등하게 염료와 반응하여 샘플 중에 존재하는 단백질의 질량과 연관되고 단백질 성질에 무관한 광학 신호를 발생하는 것이 매우 바람직하다. 뇨는 매우 다양한 양의 중탄산염(약 200mM 이하)을 포함한다. 뇨 시험편 중의 고농도의 중탄산염은 샘플 전처리(분자 크기 배제 기법)에 의해 희석되거나 제거되지 않는 한, 충분한 중탄산염이 검정에 유입되어 검정을 믿을 수 없게 하거나 소용없게할 수 있는 매우 알칼리성 조건이 되게하는데, 이것은 염료-금속 이온-단백질 상호작용이 낮은 pH(1.5 내지 3.5)에서 일어나고/나거나 중탄산염이 추가로 금속이온과의 배위를 통하여 방해할 수 있기 때문이다. 환원제 또는 중탄산염의 존재에 민감하지 않고 존재하는 단백질의 질량과 실질적으로 관계된 신호 측정을 할 수 있고, 즉 이것은 단백질 성질과는 실질적으로(여기서, 실질적으로란 뇨 샘플 중의 총 단백질 척도와 같은 특이적 단백질 측정을 위해 적합하거나 허용될 수 있다는 것을 의미한다) 무관한 신호 측정이고 약 5 내지 약 300mg/dL 범위의 단백질을 정량하는데 사용할 수 있고 당해 방해물을 제거하기 위해 샘플을 예비희석, 예비농축화하거나 전처리를 필요로 하지 않는 단백질 측정용 건식 분석 엘러먼트를 제공하는 것이 필요하다.
예상치 않게, 아크릴아미드를 포함하는 중합체와 함께 몰리브데이트 이온의 존재하에 지시 염료를 포함하는 건식 분석 엘러먼트 및 생물학적 유체 중에 단백질의 존재 또는 양을 측정하는 데 사용하기에 적합한 하이드록시카복실산 화합물이 제조될 수 있다는 것이 밝혀졌다.
단백질 농도를 측정하기 위한 선행 기술의 건식 분석 엘러먼트의 문제점은 본 발명의 건식 분석 엘러먼트 중의 아크릴아미드 중합체 및 하이드록시카복실산 화합물과 배합된 몰리브데이트 이온의 존재하에 지시 염료를 사용하여 해결해 왔다. 몰리브데이트 이온은 본 발명의 양태를 위해 바람직한 금속 이온이다. 그러나, 본 발명의 양태는 단지 몰리브데이트 이온에만 국한되지 않는다. 또 다른 적합한 금속 이온, 예를 들어 텅스테이트 이온도 또한 본 발명의 범위내에 속하는 것으로 간주된다.
앞에서 기술한 바와 같이, 상이한 단백질이 염료와 균등하게 반응하여 샘플중에 존재하는 단백질의 질량과 연관되고 단백질 성질과는 무관한 광학 신호를 발생시키는 것이 매우 바람직하다. 예상치 않게, 건식 엘러먼트의 각종 시약을 피복시키는데 사용되는 중합체 비히클이 상이한 단백질과 지시 염료 시스템의 명백한 반응성에 영향을 미칠 수 있는 것으로 밝혀졌다. 따라서, 측정된 광학 신호의 강도는 존재하는 단백질의 성질 또는 유형에 좌우되지만, 이라한 단백질 유형에 대한 의존도는 아크릴아미드를 포함하는 중합체가 건식 분석 엘러먼트중에 존재하는 경우 상당히 감소된다.
샘플 중의 총 단백질의 정량화를 위한 건식 분석 엘러먼트는 본원에서 암모늄 몰리브데이트의 존재하에 지시 염료와 단백질과의 착물 형성시 적당한 파장에서 반사 밀도의 변화를 측정하는 것을 기초로 하여 기술되어 있다. 본 발명의 건식 엘러먼트는 임의의 액체 샘플, 특히 생물학적 유체 중의 단백질 양을 측정하는데 유용하다.
더욱 구체적으로는, 한 양태에서 본 발명은 다공성 분산 층(i), 다공성 분산 층과 접촉하는 유체 중의 추가의 층(ii) 하나 이상 및 지지체(iii)를 포함하는 단백질을 측정 및 정량하는 데 유용한 건식 분석 엘러먼트에 관한 것으로서, 여기서 엘러먼트는 하나 이상의 층에 아크릴아미드를 포함하는 중합체, 지시 염료 및 몰리브데이트 이온을 포함하고, 이들은 반응하여 엘러먼트와 단백질을 포함하는 것으로 추정되는 유체와 접촉시에 스펙트럼 흡광도 또는 반사 밀도에 대한 측정가능한 변화를 일으킨다(여기서, 염료, 몰리브데이트 염 및 아크릴아미드를 포함하는 중합체는 동일한 층에 함께 존재할 수 있거나, 엘러먼트의 개별적인 층에 단독으로 또는 배합물로서 존재할 수 있다).
본 발명은 하기 화학식 1의 하이드록시카복실산을 단백질을 포함하는 것으로 추정되는 유체 샘플에 첨가하는 단계(A), 하이드록시카복실산을 포함하는 유체 샘플을 분석 엘러먼트와 접촉시키는 단계(B) 및 단백질의 존재와 양의 척도로서 염료의 스펙트럼 흡광도 또는 반사 밀도의 변화를 측정하는 단계(C)를 포함하여, 단백질의 측정 및 정량화에 있어서 건식 분석 엘러먼트를 사용하는 방법을 제공한다.
상기 화학식 1에서,
R1 및 R2는 독립적으로 H, -CH3, -CH2CH3 또는 -CH2OH이고,
M은 H 또는 양(陽)으로 하전된 금속 또는 비금속 역이온이다.
바람직한 양태에서, 본 발명은 다공성 분산 층(i), 다공성 분산 층과 접촉하는 유체 중의 추가의 층(ii) 하나 이상 및 지지체(iii)를 포함하는 단백질을 측정 및 정량화하는 데 유용한 분석 엘러먼트에 관한 것으로서, 여기서, 엘러먼트는 하나 이상의 층에 아크릴아미드를 포함하는 중합체, 하기 화학식 1의 하이드록시카복실산 및 추가로 반응하여 엘러먼트와 단백질을 포함하는 것으로 추정되는 단백질과의 접촉시 염료의 스펙트럼 흡광도 또는 반사 밀도의 측정가능한 변화를 발생시키는 지시 염료 및 몰리브데이트 이온을 포함한다(여기서, 염료, 몰리브데이트 염, 아크릴아미드를 포함하는 중합체 및 하이드록시카복실산이 동일한 층에 함께 존재할 수 있거나, 엘러먼트의 개별적인 층에 단독으로 또는 배합물로서 존재할 수 있다).
화학식 1
상기 화학식 1에서,
R1 및 R2는 독립적으로 H, -CH3, -CH2CH3 또는 -CH2OH이고,
M은 H 또는 양으로 하전된 금속 또는 비금속 역이온이다.
본 발명은 단백질을 함유하는 것으로 추정되는 유체 샘플을 분석 엘러먼트와 접촉시키는 단계(A) 및 단백질의 존재 및 양의 척도로서 스펙트럼 흡광도 또는 반사 밀도의 변화를 측정하는 단계(B)를 포함하여, 단백질을 측정 및 정량화하는 데 바람직한 건식 분석 엘러먼트를 사용하는 방법을 제공한다.
본 발명은 각종 수성 유체, 예를 들어 사람 및 동물 생물학적 유체, 음식, 산업 또는 도시 하수 및 이러한 방법으로 통상 시험되는 다른 유체 중의 단백질의 존재 및/또는 농도를 측정하는데 유리하게 사용된다. 시험될 수 있는 생물학적 유체는 전혈, 혈청, 혈장, 뇨, 척수액, 누액, 활액, 조직 또는 혈소판의 현탁액, 치은액, 질액, 위액 및 당해 분야의 기술자에게 용이하게 명백한 다른 유체를 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
측정될 수 있는 단백질은 펩타이드, 폴리펩타이드, 단백질(예: 효소, 항체, 지질단백질 및 당단백질) 및 펩타이드, 폴리펩타이드 및/또는 단백질을 함유하거나 여기에 부착된(공유결합 또는 비공유결합) 화합물을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 본 발명은 특히 뇨 중의 단백질 측정에 유용하다.
본 발명은 다공성 분산 층, 일반적으로 희석되거나 희석되지 않은 시험 샘플(예를 들어, 1 내지 50㎕)을 조정하는 데 적합한 다공성을 갖는 피복층을 포함하는 분석 엘러먼트를 사용하여 수행된다. 본 발명의 엘러먼트는 당해 분야에 널리 공지된 기술을 사용하여 어셈블링된다. 바람직하게는, 다공성 분산 층은 등방성 다공성이고, 이의 특성은 층의 입자, 섬유 또는 다른 물리적 엘러먼트들의 상호연결된 공간에 의해 제공된다. 등방성 다공성이란 유체가 층 전반에 걸쳐 균일하게 분산되어 있는 것을 의미한다. 이러한 층을 위해 유용한 물질은 수불용성이고 검정동안에 이의 고유 구조를 유지한다. 엘러먼트를 어셈블링하기 위한 통상적인 물질 및 방법은, 예를 들어 프리지바일로비츠(Przybylowicz) 등에게 허여된 미국 특허 제3,992,158호, 피어스 등에게 허여된 미국 특허 제4,258,001호, 기타지마(Kitazima) 등에게 허여된 미국 특허 제4,292,272호 및 고야마(Koyama) 등에게 허여된 미국 특허 제4,430,436호에 기술되어 있고, 이들은 본원에 참조문헌으로서 인용된다. 바람직한 다공성 분산 층은 프리지바일로비츠 등에게 허여된 미국 특허 제3,992,158호에 기술된 바와 같이 에스탄 중의 황산바륨으로부터 제조된다.
엘러먼트중에 추가의 층이 하나 이상 있는데, 이들 모두는 다공성 분산 층과 접촉하는 유체중에 있다. 용어 유체 접촉은 본원에서 유체가 용이하게 한 층에서 다른 층으로 이동할 수 있다는 것을 나타내기 위해 사용되는 것으로 이해되어야만 한다. 이러한 추가되는 층, 바람직하게 피복된 중합체 층은 서브, 시약 및 방사선 차단 층을 포함하고 당해 분야에서 공지된 하나 이상의 친수성 결합제 물질, 예를 들어 젤라틴 및 비닐피롤리돈 중합체 하나 이상으로 구성된다. 몇몇 층은 수불용성인 반면에, 나머지 층은 수용성일 수 있다.
본 발명의 엘러먼트의 층은 자기 지지될 수 있지만, 바람직하게는 이들 층이 적당한 치수 안정성이며 화학적으로 불활성인 지지체상에 배치된다. 바람직하게는 지지체가 다공성이 아니며 전자기 방사선에 투과된다. 선택된 지지체는 검출의 의도된 방식(예: 투과 또는 반사 분광학)과 상용성이어야만 한다. 유용한 지지체 물질은 종이, 금속 호일, 폴리스티렌, 폴리에스테르, 폴리카보네이트 및 셀룰로즈 에스테르를 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 엘러먼트 층의 하나 이상에 단백질 및 몰리브데이트 이온과 특이적으로 반응할 수 있는 염료가 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, 단백질 및 몰리브데이트 이온과 반응하는 염료는 몰리브데이트 이온 및 단백질의 존재하에 염료의 스펙트럼 또는 광학적 흡광 특성이 단백질 부재하의 염료 및 몰리브데이트 이온의 특성으로부터 변화될 수 있는 임의의 염료 화합물임을 의미한다. 목적하는 상기 언급한 특성을 갖는 염료는 개방된 방향족 구조물 및 몰리브데이트 이온과 배위결합할 수 있는 작용성 그룹(예: 방향족 환상의 인접한 2개의 하이드록실 그룹을 포함하지만 이에 제한되지 않는다)을 갖는 트리사이클릭 방향족 구조물을 포함하는 염료이다. 이러한 염료는 피로카테콜 바이올렛, 테트라브로모페놀프탈레인 에틸 에스테르, 트리요오도페놀설폰프탈레인, 테트라브로모피로갈롤 레드 및 피로갈롤 레드를 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 바람직한 양태에서, 단백질의 존재 및/또는 양을 측정하기 위한 다층 분석 엘러먼트가 제공된다. 구체적으로, 다층 엘러먼트는 유체 접촉에서 단백질 및 몰리브데이트 이온과 반응하는 염료, 몰리브데이트 염, 아크릴아미드를 포함하는 중합체를 포함하는 제1 시약층 또는 완충층(i), 서브(sub) 층(ii) 및 다공성 분산 층(iii)을 갖는 비다공성 지지체를 포함한다.
본 발명의 엘러먼트는 당해 기술 분야에 공지된 바와 같이 적당한 층내에 다양한 첨가제를 포함하여 제조, 유체 분산 및 목적하지 않는 방사선의 흡수를 도울 수 있다.
본 발명의 엘러먼트는 선행 기술 분야에 공지된 통상적인 피복 방법 및 장치(그라비야, 커튼, 호퍼 및 또 다른 피복기법)를 사용하여 제조될 수 있다. 엘러먼트는 임의의 목적하는 넓이의 연장 테이프, 시트, 슬라이드 또는 칩을 포함하는 다양한 형태로 배치될 수 있다. 추가로, 본 발명의 방법은 수동일 수 있거나 적당한 분석 장치 및 방법을 사용하여 자동화될 수 있다. 일반적으로, 당해 방법은 시험 샘플을 다공성 분산 층상에 스폿팅(예: 1 내지 50㎕)함으로써 엘러먼트 중의 시약을 접촉시킴을 포함한다. 엘러먼트내의 유체의 이동은 발생할 반응용 시약을 효과적으로 혼합한다.
샘플 도포후에 엘러먼트는 임의의 컨디셔닝, 예를 들어 항온처리, 가열 또는 다른 과정에 노출시키고, 이는 단백질-염료-몰리브데이트 착물의 형성을 신속하게 하거나 촉진시키는 것이 바람직할 수 있다.
위에서 기술한 바와 같이, 본 발명에서 사용되는 단백질 및 몰리브데이트 이온과 반응하는 염료는 개방 방향족 구조물 및 몰리브데이트 이온과 배위결합할 수 있는 작용성 그룹(방향족 환상의 인접한 2개의 하이드록실 그룹을 포함하지만 이에 제한되지 않는다)을 갖는 트리사이클릭 방향족 구조물을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 이러한 염료는 피로카테콜 바이올렛, 테트라브로모페놀프탈레인 에틸 에스테르, 트리요오도페놀설폰프탈레인, 테트라브로모피로갈롤 레드 및 피로갈롤 레드를 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
위에서 언급한 염료 화합물은 널리 공지된 화학 공급업체(예: Eastman Organic Chimical Company, Aldrich Chemical Company, Sigma Chemical Company 등)로부터 구입할 수 있거나, 당해 분야의 기술자에 널리 공지된 통상적인 출발 물질 및 방법을 사용하여 제조될 수 있다.
다음의 지시 염료를 포함하는 건식 분석 엘러먼트를 별도로 제조한다: 피로카테콜 바이올렛(피로카테콜, 4,4'-(3H-2,1-벤족사티올-3-일리딘)-디-S,S-디옥사이드), 적색 피로칼롤(2-(4,5,6-트리하이드록시-3-옥소-3H-크산텐-9-일)벤젠설폰산), 브로모피로갈롤 건식 분석 엘러먼트의 일반적인 특징은 프리지바일로비츠 등에게 허여된 미국 특허 제3,992, 158호 및 프랭크 및 피어스에게 허여된 미국 특허 제4,258,001호에 기술되어 있다. 모든 염료는 물리-화학적 환경 변화에 민감하다.
본 발명자들은 뇨 단백질의 정량 분석은 건식 분석 엘러먼트 중의 몰리브데이트 이온과 배합된 위에서 언급한 염료를 사용하여 수행될 수 있다는 것을 밝혔다. 몰리브데이트 이온이 배합된 피로카테콜 바이올렛을 포함하는 건식 분석 엘러먼트가 사람 알부민을 포함하는 제조된 용액에서 최상의 분석 검출 감도(즉, 300mg/dL 이하의 목적하는 단백질 농도 범위에 대한 반사 밀도(Dr)의 최대 변화) 및 복제 정확도를 제공한다.
예상치 않게, 본 발명자들은 건식 엘러먼트의 각종 시약을 피복하는 데 사용되는 중합체 비히클이 지시 염료 시스템과 상이한 단백질의 명백한 반응에 영향을 끼쳐서 존재하는 단백질 유형에 대한 측정된 광학 신호의 강도의 의존성에 영향을 끼친다는 것을 밝혔다. 본 발명에 사용하기에 적합한 중합체는 광학 신호를 균등하게 하는데, 즉 중합체는 상이한 단백질의 동등한 질량 또는 중량에 대해 수득된 반사 밀도 광학 신호의 차이를 감소시킨다. 이것은 상이한 유형의 단백질이 상이한 시험편 중에 존재할 수 있고 목적하는 척도가 샘플의 단위 용적당 존재하는 단백질(총 단백질)의 총 질량이기 때문에 바람직하다. 이상적으로, 총 단백질에 대한 검정은 동일한 감도를 갖는 모든 단백질을 정량화해야 한다. 본 발명의 중합체는 대부분 아크릴아미드를 포함하는(약 40중량% 초과) 수용성 단독중합체, 공중합체 및 삼원공중합체를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 몰리브데이트 이온과 배위결합할 수 있는 작용성 그룹은, 본 발명의 중합체 중에 존재하는 경우, 단백질 측정을 방해하는 양으로 존재해서는 안된다. 바람직한 중합체는 아크릴아미드의 단독중합체, 즉 중량평균 분자량이 약 20,000 내지 250,000돌턴인 폴리아크릴아미드(이후부터 폴리A라고 함)이다. 가장 바람직한 범위는 약 100,000 내지 150,000돌턴이다.
추가로, 본 발명자들은, 매우 예기치않게, 글리콜산을 바람직하게 엘러먼트 중의 예비피복된 다층 분석 엘러먼트에 첨가하여 중탄산염으로 인한 간섭을 실질적으로 감소시킬 수 있다는 것을 밝혔다. 하기 화학식 1의 다른 하이드록시카복실산이 유사한 효과를 갖고 본 발명에 사용하기에 적합하다.
화학식 1
상기 화학식 1에서,
R1 및 R2는 독립적으로 H, -CH3, -CH2CH3 또는 -CH2OH이고,
M은 H 또는 양으로 하전된 금속 또는 비금속 역이온이다.
화학식 1의 대표적인 하이드록시카복실산은 2-하이드록시프로판산, 2-메틸-2-하이드록시프로판산 및 이들의 염을 포함한다.
뇨 단백질의 만족할만한 정량 분석은 주지된 아크릴아미드 중합체 및 하이드록시카복실산과 배합된 지시 염료 및 몰리브데이트 이온을 포함하는 건식 분석 엘러먼트를 사용하여 수득될 수 있다. 분자량이 약 20,000 내지 250,000돌턴인 폴리아크릴아미드 중합체와 배합된 및 또한 글리콜산과 배합된 몰리브데이트 이온과의 피로카테콜 바이올렛은 바람직한 건식 분석 엘러먼트로서, 300mg/dL 이하의 단백질 농도의 민감한 측정 및 매우 우수한 복제 정확도를 제공한다. 가장 바람직한 건식 엘러먼트는 시약층/완충층 내에 피복된 중합체 비히클로서 폴리A(평균 분자량 100,000 및 150,000돌턴) 및 예비피복된 글리콜산을 포함한다.
폴리아크릴아미드는 상이한 단백질과 지시 염료 피로카테콜 바이올렛/몰리브데이트 이온 시스템의 반응성을 균등화시킨다. 상이한 단백질 유형의 동일 질량 농도에 대한 반사 밀도 신호의 차이가 바람직한 중합체를 사용하여 건식 엘러먼트내에서 상당히 감소된다. 피로카테콜 바이올렛 및 몰리브데이트를 사용하는 중합체의 효과는 다른 유형의 지시 염료 및 금속 이온을 사용하여 관찰된다. 본 발명에 의해 약 5 내지 300mg/dL 범위를 갖는 뇨 중의 총 단백질 정량화를 위한 건식 엘러먼트의 제조할 수 있다. 건식 엘러먼트는 상이한 단백질에 대해 거의 동일하게 민감하여 이의 의도된 용도에 적합하고 선행 기술 용액 및 건식 엘러먼트에 기초하는 검정보다 우수한 정확도를 나타낸다. 뇨 시험편 중의 광범위하고 다양한 중탄산염의 농도의 존재로 인한 주된 간섭은 피로카테콜-몰리브데이트 화학을 사용하는 건식 엘러먼트내에 글리콜산을 첨가함으로써 극복되었다. 위에서 기술한 바와 같은 다른 하이드록시카복실산은 엘러먼트내로 도입되거나 샘플과 함께 첨가되든지 간에 유사한 효과를 갖는다. 이러한 두개의 매우 상이하고 예상치 않은 발견은 특히 액체 샘플 중의 총 단백질의 정량화에 특히 적합한, 민감하고 강력한 건식 분석 엘러먼트를 제공한다.
하기 실시예는 본 발명의 범위를 설명하기 위해 주어진다. 이들 실시예는 단지 설명을 목적으로 하는 것이기 때문에 본원에서 구현된 발명은 실시예로 제한되지 않아야 한다. 주지된 것을 제외하고는 모든 시약 및 장치는 시판 공급업체로터 구입한다.
하기 실시예 1 내지 4는 상이한 지시 염료를 포함하는 엘러먼트의 분석 검출 감도 및 봉제 정확도를 비교한 실험 결과를 기술하고 있다.
실시예 1
피로카테콜 바이올렛
피로카테콜 바이올렛을 사용하여 하기의 조성비(폴리(아크릴아미드-co-N-비닐-2-피롤리돈, 50:50 중량비))를 갖는 아크릴아미드 중합체(이후부터 중합체 AVP로 언급됨) 12g/m2, 계면활성제 조닐 FSN(0.36g/m2) 및 완충제로서 석신산(pH 2.5) 5.9g/m2, 암모늄 몰리브데이트(0.18g.m2) 및 칼륨 옥살레이트(0.15g/m2)를 추가로 포함하는 시약 층에 0.12g/m2로 피복한다. 비드(bead) 분산 층(미국 특허 제4,258,001호에 기술되고 하기에 기술된 조성을 가짐)을 사용한다. 분산 층 및 시약 층사이에는 폴리(N-비닐-2-피롤리돈) 서브 층이 있다. 엘러먼트를 한쪽 끝에서 평방 1센티미터로 절단하고 슬라이드에 올려놓는다. 슬라이드 엘러먼트를 단백질 함유 용액으로 스폿팅하고 슬라이드를 항온처리하며 반사 밀도(Dr)를 판독하기 위해 죤슨 앤드 죤슨 임상 진단 슬라이드 분석기(Johnson Johnson Clinical Diagnostic slide analyzer)를 사용한다. 엘러먼트를 평가하기 위한 이러한 방법은 담당자가 많은 엘러먼트를 시험하고 간편하게 반복적인 측정을 수행할 수 있도록 한다. 스폿팅, 항온처리 및 광학 신호의 측정을 위한 임의의 다른 방법도 또한 건식 엘러먼트를 평가하는데 적합하다. 엘러먼트의 구조는 다음과 같다:
피로카테콜 바이올렛 엘러먼트
분산 층 코폴리(비닐톨루엔 메타크릴산) 30㎛ 비드
서브 층 폴리(N-비닐-2-피롤리돈)
공중합(아크릴아미드-co-N-비닐-2-
피롤리돈)(50:50)Wt
피로카테콜 바이올렛
시약 층 석신산
암모늄 몰리브데이트
칼륨 옥살레이트
조닐 FSN
지지층 /////////////////////////////////////
Dr을 670nm에서 측정한다. 하기 표 1은 위에서 기술한 피로카테콜 엘러먼트를 사용하여 수득된 결과를 나타낸다. 단백질을 포함하는 유체는 공지된 중량의 사람 혈청 알부민을 공지된 용적의 0.15M 염화나트륨 수용액에 첨가하여 표 1에 나타낸 알부민 농도를 갖는 유체를 수득함으로써 제조한다. 알부민을 포함하는 분액(10㎕)을 엘러먼트의 분산 층상에 스폿팅한다. 스폿팅된 엘러먼트를 37℃에서 5분 동안 항온처리시킨다. 이어서 반사 밀도를 측정한다. 측정된 Dr은 6회 반복 측정(n=6)의 평균(Dr)이다. %CV는 평균 Dr에 대한 변동 계수이다.
HSA(mg/dL) Dr %CV
10 1.022 4.8
50 1.209 1.0
100 1.370 2.3
150 1.489 1.9
300 1.732 4.7
알부민 10 내지 300mg/dL에서의 반사 밀도(△Dr=0.710)의 변화에 의해 측정된 피로카테콜 엘러먼트의 검출 감도가 매우 우수하다. %CV'는 비교적 작고 우수한 복제 정확도를 나타낸다.
실시예 2
피로갈롤 레드
피로갈롤 레드 0.18g/m2을 미국 특허 제3,992,158호에 기술된 바와 같이 황산바륨 분산 층에 피복한다. 계면활성제 트리톤 X-100(0.001g/m2), 타르타르산(6.0g/m2, pH 2.5) 및 옥살산 2g/m2을 피복도 10g/m2에서 아크릴아미드의 단독중합체, 폴리A(중량평균 분자량: 100,000돌턴)를 사용하여 시약층에 피복한다. 암모늄 몰리브데이트 0.9g/m2을 황산바륨 분산 층에 피복한다. 폴리(N-이소프로필아크릴아미드)의 서브 층을 분산 층 및 시약 층사이에 피복한다. 엘러먼트의 구조는 다음과 같다:
피로갈롤 레드 엘러먼트
분산 층 황산바륨
피로갈롤 레드
암모늄 몰리브데이트
서브 층 폴리(N-이소프로필아크릴아미드)
시약 층 폴리아크릴아미드(폴리A)
타르타르산
옥살산
트리톤 X-100
에스타르 지지체 /////////////////////////////////
몇몇 완충제를 pH 2.5에서 피복시키지만, 타르타르산이 시험될 단백질 농도 범위에서 가장 선형 반응(540nm에서)을 제공한다. 실험적 프로토콜은 Dr이 540nm에서 측정된다는 것을 제외하고는 피로카테콜 바이올렛 엘러먼트에 대해 기술한 것과 동일하다. 결과(n=6)는 표 2에 나타낸다.
HSA(mg/dL) Dr %CV
100 0.281 5.0
50 0.327 4.9
150 0.363 7.1
300 0.382 4.4
피로갈롤 레드 엘러먼트를 사용하는 시험된 알부민 농도 범위에 대한 Dr의 변화는 0.101이어서 검출 감도는 피로카테콜 바이올렛 엘러먼트에서 수득한 것보다 작다. %CV'는 작지만 피로카테콜 바이올렛 엘러먼트에서 관측된 것보다 다소 크다.
실시예 3
브로모피로갈롤 레드 엘러먼트
브로모피로갈롤 레드 0.24g/m2을 폴리아크릴아미드 비히클(이후부터 중합체 AAM으로서 명명됨), 폴리(아크릴아미드-co-N-(3-아세토아세트아미도프로필)메타크릴아미드) 95:5의 중량비) 12g/m2을 포함하는 시약층에 피복한다. 또한, 계면활성제 트리톤 X-100(0.20g/m), 말론산(8.0g/m2, pH 2.5) 및 암모늄 몰리브데이트(0.4g/m2)으로 AAM 층을 피복한다. 황산바륨 분산 층을 폴리(N-이소프로필아크릴아미드) 서브층상에 피복한다. 황산바륨 분산층을 포함하는 엘러먼트의 구조는 다음과 같다:
브로모피로갈롤 레드 엘러먼트
분산 층 황산바륨
서브 층 폴리(N-이소프로필아크릴아미드)
시약 층 폴리(아크릴아미드-co-N-(3-아세토아세트아미도프로필)
메타크릴아미드 (95:5 중량)Wt
브로모피로갈롤 레드
암모늄 몰리브데이트
칼륨 옥살레이트
비스비닐설포닐메틸 에테르(BVSME)
에스타르 기제 ////////////////////////////////
브로모피로갈롤 엘러먼트는 피로카테콜 및 피로갈롤 레드 지시 염료를 포함하는 엘러먼트에 대해 위에서 기술한 바와 같이 평가한다. 브로모피로갈롤(n=6) 엘러먼트의 평가로부터의 데이터는 표 3에 나타낸다.
HSA(mg/dL) Dr %CV
10 1.482 86.1
50 1.487 20.6
100 1.547 11.3
300 1.660 2.6
알부민 농도 범위에 대한 Dr의 변화는 0.178이어서, 이는 피로카테콜 바이올렛 엘러먼트보다 검출 감도가 낮다. %CV'는 크고 상당한 복제 부정확도를 나타낸다.
실시예 4
갈레인
갈레인 0.12g/m2으로 황산바륨 분산 층을 피복한다. 계면활성제 트리톤 X-165(0.2g/m2), 말론산(8.0g/m2, pH 2.5) 및 옥살산(2.5g/m2)으로 분자 조성 폴리(아크릴아미드-co-N-비닐--2-피롤리돈)(50:50)wt을 갖는 공중합체(이후에 중합체 AVP로서 명명됨)에 피복하여 완충 층을 형성한다. 암모늄 몰리브데이트(0.90g/m2) 및 계면활성제 트리톤 X-100(1g/m2)으로 염료외에 황산바륨 분산 층을 피복한다. 엘러먼트의 구조는 다음과 같다:
갈레인 엘러먼트
분산 층 황산바륨
갈레인
암모늄 몰리브데이트
트리톤 X-100
서브 층 폴리(N-이소프로필아크릴아미드)
완충 층 폴리(아크릴아미드-co-N-비닐-2-
피롤리돈)(50:50)Wt
말론산
트리톤 X-165
옥살산
에스타르 지지체 /////////////////////////////////////////
갈레인 엘러먼트를 다른 엘러먼트에 대해 위에서 기술한 바와 같이 평가하고(n=6) Dr은 550nm에서 측정한다. 위의 결과는 표 4에 나타낸다.
HSA(mg/dL) Dr %CV
10 0.541 85.7
50 0.569 20.3
100 0.565 93.1
300 0.580 19.5
알부민 농도 범위에 대한 Dr의 변화는 0.039이고, 피로카테콜 바이올렛 엘러먼트와 비교하여 상당히 감소된 검출 감도를 나타낸다. %CV'는 매우 크고 상당한 복제 부정확도를 나타낸다.
상기 실시예에서, 피로카테콜 바이올렛, 바람직한 염료 및 암모늄 몰리브데이트를 포함하는 건식 분석 엘러먼트를 사용하여 상이한 단백질 유형의 측정에 대한 상이한 시약 층 중합체 비히클의 효과를 시험한다. 상기 실험에서 비교된 중합체는 폴리A(중량평균 분자량; 약 120,000돌턴), (폴리(아크릴아미드-co-N-비닐-2-피롤리돈, 50/50 중량비)(중합체 AVP) 및 분자 조성 (폴리(아크릴아미드-co-아크릴산, 90/10 중량비, 이후부터 중합체 PAA로서 명명됨)을 갖는 중합체이다. 모든 경우에, 분산 층은 이전에 언급한 미국 특허 제3,992,156호에 기술된 바와 같이 황산바륨이다. 당해 중합체는 동일한 건식 피복도(12g/m2)로 피복한다. 단백질을 포함하는 용액은 IgG, 레티놀 결합 단백질 및 카파 경쇄를 포함하여 관심이 되는 공지된 중량의 정제된 사람 단백질을 0.15M 염화나트륨을 포함하는 공지된 용적의 수용액에 첨가함으로써 제조한다. 엘러먼트를 위에서 언급한 바와 같이 슬라이드 속에 조립한다. 검정의 보정은 정제된 사람 알부민(이후부터 보정 유체로서 언급됨)을 포함하는 용액을 사용하여 수행한다. 시험 단백질 100mg/dL을 포함하는 각각의 용액의 10㎕ 분액을 분리된 건식 분석(슬라이드) 엘러먼트상에 각각 스폿팅한다. 37℃에서 슬라이드를 5분 동안 항온처리한 후에 670nm에서의 반사 밀도를 측정한다. 샘플 중의 총 단백질의 농도를 측정된 반사 밀도 및 위에서 언급한 보정 유체를 사용하는 검정 보정으로부터 계산한다. 위의 결과는 표 5에 나타낸다.
단백질 반응성에 대한 중합체 유형의 효과
중합체 알부민(mg/dL) 카파 경쇄(mg/dL) 람다 경쇄(mg/dL) IgG(mg/dL) 레티놀 결합단백질(mg/dL) 알파 1마이크로글로불린(mg/dL)
AVP 100 33 33 64 62 44
폴리A 100 44 52 73 73 66
PAA 100 N.D.** 34 59 N.D. N.D.
** 수행되지 않음
표 5의 데이터는 중합체가 피로카테콜 및 몰리브데이트 이온과 단백질의 상호작용에 영향을 미친다는 것을 보여준다. 특히 폴리A는 단백질 유형중에서 관측된 Dr의 차이를 감소시켜 평가된 단백질 농도를 사람 알부민을 포함하는 유체를 사용하여 보정함으로써 측정한다. 이것은 단백질 농도가 유체에 첨가되는 단백질의 양을 기준으로 예상되는 100mg/dL에 근접하는 것으로 나타난다. 시험된 단백질의 유형에 대한 측정된 신호의 최소 의존도인 최상의 성능은 폴리A에 의해 제공된다
실시예 5
본 실시예에서, 중탄산염 간섭에 대한 글리콜산의 효과를 평가한다. 글리콜산 12g/m2으로 폴리A를 또한 포함하는 시약층내를 예비피복한다. 표 6에 나타낸 농도의 글리콜산으로 시약 층에 피복한다. 울혈된 사람 뇨의 샘플에 중탄산나트륨을 첨가하여 100mM 또는 200mM의 최종 중탄산염 농도를 수득한다(모든 경우에 최종 울혈된 뇨 샘플의 pH는 8.5이다). pH를 최종 관측된 값으로 조정하지 않지만 중탄산염 첨가후에 수득한 값으로 조정한다. 처리되지 않은 울혈된 뇨 대조군의 총 단백질은 18mg/dL(총 단백질의 측정을 위해 바이오트롤(BIOTROL)TM 키트를 사용하여 측정하고, 이것은 제조원(Merck Biotrol Diagnostics, Exton, PA 19341; catalog no A01217U)으로부터 시판되는 피로갈롤 레드/암모늄 몰리브데이트 염료 결합 방법을 사용하는 용액 기초 검정이다)이다. 반사 밀도를 위의 실시예 5와 같이 측정하고, 총 단백질 농도를 실시예 5와 같이 보정 유체으로서 사람 알부민을 포함하는 유체를 사용하는 검정 엘러먼트의 보정후에 측정된 Dr을 사용하여 평가한다. 대조군 뇨에 대해 수득된 단백질 평가치를 중탄산염으로 처리된 뇨 샘플에 대해 수득된 단백질 평가치로부터 공제한다. 위의 데이터는 표 6에 나타낸다.
중탄산염 간섭에 대한 글리콜산의 효과 및 중탄산염으로 처리된 것과 중탄산염 부재 대조구간의 단백질 농도 차이
글리콜산 중탄산염
g/m2 100mM 200mM
0 35 110
0.125 22 77
0.25 13 54
0.375 8 30
0.5 4 20
0.75 N.D. 13
1.0 N.D. -2
N.D.= 측정되지 않음
중탄산염이 작용하여 단백질을 모방하는 광학 신호를 발생시킨다. 예를 들어, 글리콜산의 부재하에, 중탄산염 농도가 200mM인 뇨 시험편의 평가된 단백질 농도는 실질적인 농도보다 높은 약 110mg/dL이다. 표 6에 나타낸 바와 같이, 글리콜산은 중탄산염으로 인한 효과를 급격하게 감소시킨다. 글리콜산(또는 앞서 기술한 바와 같이 다른 적합한 하이드록시카복실산)을 실시예 6에서와 같이 건식 분석 엘러먼트에 직접 첨가할 수 있거나, 이와는 달리 건식 분석 엘러먼트를 샘플과 접촉시키기전에 샘플에 첨가할 수 있다. 엘러먼트내에 피복될 글리콜산의 유용한 농도는 약 0.125 내지 2.0g/m2이다. 바람직한 범위는 0.125 내지 1.5g/m2이고, 보다 바람직한 범위는 0.25 내지 1.25g/m2이다. 바람직한 건식 분석 엘러먼트의 구조는 다음과 같다:
분산 층 황산바륨
서브 층 폴리(N-이소프로필아크릴아미드)
시약/완충 층 폴리아크릴아미드(폴리A)
글리콜산
피로카테콜 바이올렛 염료
암모늄 몰리브데이트
칼륨 옥살레이트
조닐-FSN 계면활성제
말론산 완충제, pH=2.5
지지체
위의 실험 및 실시예는 본 발명의 범위 및 취지를 설명하기 위해 주어진다. 이들 양태 및 실시예는 당해 기술 분야의 기술자에게 명백하다. 이러한 다른 양태 및 실시예는 본 발명의 관찰에 속한다. 따라서, 본 발명은 단지 첨부된 청구의 범위에 의해서만 제한되어야 한다.
본 발명에 따르는 건식 분석 엘러먼트를 사용하여 단백질을 신속하고 민감하게 검출하고 정량화할 수 있다.

Claims (36)

  1. 다공성 분산 층(A), 단백질 및 몰리브데이트 이온과 반응하여 염료의 스펙트럼 흡광도 또는 반사 밀도를 변화시킬 수 있는 염료(i), 몰리브데이트 염(ii) 및 아크릴아미드를 포함하는 중합체(iii)(여기서, 염료, 몰리브데이트 염 및 아크릴아미드를 포함하는 중합체는 동일한 층에 함께 존재하거나, 엘러먼트의 개별적인 층에 배합물로서 또는 단독으로 존재할 수 있다)를 포함하는 추가의 층(B) 하나 이상 및 지지체(C)를 포함하는 단백질 측정용 건식 분석 엘러먼트.
  2. 제1항에 있어서, 염료가 피로카테콜 바이올렛, 피로갈롤 레드, 브로모피로갈롤 레드 및 갈레인으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 건식 분석 엘러먼트.
  3. 제2항에 있어서, 염료가 피로카테콜 바이올렛인 건식 분석 엘러먼트.
  4. 제1항에 있어서, 몰리브데이트 염이 암모늄 몰리브데이트인 건식 분석 엘러먼트.
  5. 제1항에 있어서, 아크릴아미드를 포함하는 중합체가 폴리A, 중합체 AVP, 중합체 PAA 및 중합체 AAM으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 건식 분석 엘러먼트.
  6. 제5항에 있어서, 중합체가, 분자량 범위가 100,000 내지 150,000돌턴인 폴리A인 건식 분석 엘러먼트.
  7. 제1항에 있어서, 염료가 피로카테콜 바이올렛이고, 몰리브데이트 염이 암모늄 몰리브데이트이며, 아크릴아미드를 포함하는 중합체가, 분자량 범위가 100,000 내지 150,000돌턴인 폴리A인 건식 분석 엘러먼트.
  8. 제7항에 있어서, 다공성 분산 층이 황산바륨을 포함하는 건식 분석 엘러먼트.
  9. 단백질을 함유하는 것으로 추정되는 유체를 하기 화학식 1의 하이드록시카복실산과 혼합하는 단계(A),
    하이드록시카복실산을 함유하고 단백질을 함유하는 것으로 추정되는 유체를 다공성 분산 층(a), 단백질 및 몰리브데이트 이온과 반응하여 염료의 스펙트럼 흡광도 또는 반사 밀도를 변화시킬 수 있는 염료(i), 몰리브데이트 염(ii) 및 아크릴아미드를 포함하는 중합체(iii)(여기서, 염료, 몰리브데이트 염 및 아크릴아미드를 포함하는 중합체는 동일한 층에 함께 존재하거나, 엘러먼트의 개별적인 층에 배합물로서 또는 단독으로 존재할 수 있다)를 포함하며 다공성 분산 층과 접촉하는 유체내의 추가의 층(b) 하나 이상 및 지지체(c)를 포함하는 건식 분석 엘러먼트와 접촉시키는 단계(B) 및
    단백질 척도로서 염료의 스펙트럼 흡광도 또는 반사 밀도의 변화를 측정하는 단계(C)를 포함하여, 단백질을 측정하는 방법.
    화학식 1
    상기 화학식 1에서,
    R1 및 R2는 독립적으로 H, -CH3, -CH2CH3 또는 -CH2OH이고,
    M은 H 또는 양(陽)으로 하전된 금속 또는 비금속 역이온이다.
  10. 제9항에 있어서, 염료가 피로카테콜 바이올렛, 피로갈롤 레드, 브로모피로갈롤 레드 및 갈레인으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 방법.
  11. 제10항에 있어서, 염료가 피로카테콜 바이올렛인 방법.
  12. 제9항에 있어서, 몰리브데이트 염이 암모늄 몰리브데이트인 방법.
  13. 제9항에 있어서, 아크릴아미드를 포함하는 중합체가 폴리A, 중합체 AVP, 중합체 PAA 및 중합체 AAM으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 방법.
  14. 제13항에 있어서, 중합체가, 분자량 범위가 100,000 내지 150,000돌턴인 폴리A인 방법
  15. 제9항에 있어서, 염료가 피로카테콜 바이올렛이고, 몰리브데이트 염이 암모늄 몰리브데이트이며, 아크릴아미드 중합체가, 분자량 범위가 100,000 내지 150,000돌턴인 폴리A인 방법.
  16. 제15항에 있어서, 다공성 분산 층이 황산바륨을 포함하는 방법.
  17. 다공성 분산 층(A), 단백질 및 몰리브데이트 이온과 반응하여 스펙트럼 흡광도 또는 반사 밀도를 변화시킬 수 있는 염료(i), 몰리브데이트 염(ii), 아크릴아미드를 포함하는 중합체(iii)(여기서, 염료, 몰리브데이트 염 및 아크릴아미드를 포함하는 중합체는 동일한 층에 함께 존재하거나, 엘러먼트의 개별적인 층에 배합물로서 또는 단독으로 존재할 수 있다) 및 화학식 1의 하이드록시카복실산(iv)을 포함하며 다공성 분산층과 접촉하는 유체내의 추가의 층(B) 하나 이상 및 지지체(C)를 포함하는, 단백질 측정용 건식 분석 엘러먼트.
    화학식 1
    상기 화학식 1에서,
    R1 및 R2는 독립적으로 H, -CH3, -CH2CH3 또는 -CH2OH이고,
    M은 H 또는 양으로 하전된 금속 또는 비금속 역이온이다.
  18. 제17항에 있어서, 염료가 피로카테콜 바이올렛, 피로갈롤 레드, 브로모피로갈롤 레드 및 갈레인으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 건식 분석 엘러먼트.
  19. 제18항에 있어서, 염료가 피로카테콜 바이올렛인 건식 분석 엘러먼트.
  20. 제17항에 있어서, 몰리브데이트 염이 암모늄 몰리브데이트인 건식 분석 엘러먼트.
  21. 제17항에 있어서, 아크릴아미드를 포함하는 중합체가 폴리A, 중합체 AVP, 중합체 PAA 및 중합체 AAM으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 건식 분석 엘러먼트.
  22. 제21항에 있어서, 중합체가, 분자량 범위가 100,000 내지 150,000돌턴인 폴리A인 건식 분석 엘러먼트.
  23. 제17항에 있어서, 하이드록시카복실산이 글리콜산, 2-하이드록시프로판산, 2-메틸-2-하이드록시프로판산 및 이들의 염으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 건식 분석 엘러먼트.
  24. 제23항에 있어서, 하이드록시카복실산이 글리콜산인 건식 분석 엘러먼트.
  25. 제17항에 있어서, 염료가 피로카테콜 바이올렛이고, 몰리브데이트 염이 암모늄 몰리브데이트이며, 아크릴아미드 중합체가, 분자량 범위가 100,000 내지 150,000돌턴인 폴리A이고, 하이드록시카복실산이 글리콜산인 건식 분석 엘러먼트.
  26. 제25항에 있어서, 다공성 분산 층이 황산바륨을 포함하는 건식 분석 엘러먼트.
  27. 단백질을 함유하는 것으로 추정되는 유체 샘플을 다공성 분산 층(a), 단백질 및 몰리브데이트 이온과 반응하여 염료의 스펙트럼 흡광도 또는 반사 밀도를 변화시킬 수 있는 염료(i), 몰리브데이트 염(ii), 아크릴아미드를 포함하는 중합체(iii)(여기서, 염료, 몰리브데이트 염 및 아크릴아미드를 포함하는 중합체는 동일한 층에 함께 존재하거나, 엘러먼트의 개별적인 층에 배합물로서 또는 단독으로 존재할 수 있다) 및 화학식 1의 하이드록시카복실산(iv)을 포함하며 다공성 분산 층과 접촉하는 유체내의 추가의 층(b) 하나 이상 및 지지체(c)를 포함하는 건식 분석 엘러먼트와 접촉시키는 단계(A) 및
    단백질 척도로서 염료의 스펙트럼 흡광도 또는 반사 밀도의 변화를 측정하는 단계(B)를 포함하여, 단백질을 측정하는 방법.
    화학식 1
    상기 화학식 1에서,
    R1 및 R2는 독립적으로 H, -CH3, -CH2CH3 또는 -CH2OH이고,
    M은 H 또는 양으로 하전된 금속 또는 비금속 역이온이다.
  28. 제27항에 있어서, 염료가 피로카테콜 바이올렛, 피로갈롤 레드, 브로모피로갈롤 레드 및 갈레인으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 방법.
  29. 제28항에 있어서, 염료가 피로카테콜 바이올렛인 방법.
  30. 제27항에 있어서, 몰리브데이트 염이 암모늄 몰리브데이트인 방법.
  31. 제27항에 있어서, 아크릴아미드를 포함하는 중합체가 폴리A, 중합체 AVP, 중합체 PAA 및 중합체 AAM으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 방법.
  32. 제31항에 있어서, 아크릴아미드를 포함하는 중합체가, 분자량 범위가 100,000 내지 150,000돌턴인 폴리A인 방법.
  33. 제27항에 있어서, 하이드록시카복실산이 글리콜산, 2-하이드록시프로판산, 2-메틸-2-하이드록시프로판산 및 이들의 염으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 방법.
  34. 제33항에 있어서, 하이드록시카복실산이 글리콜산인 방법.
  35. 제27항에 있어서, 염료가 피로카테콜 바이올렛이고, 몰리브데이트 염이 암모늄 몰리브데이트이며, 아크릴아미드 중합체가, 분자량 범위가 100,000 내지 150,000돌턴인 폴리A이고, 하이드록시카복실산이 글리콜산인 방법.
  36. 제35항에 있어서, 다공성 분산 층이 황산바륨을 포함하는 방법.
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