DK155349B - Fremgangsmaade og integralt analytisk legeme til bestemmelse af koncentrationen af en specifik ionisk analyt i en flydende proeve og anvendelse af dette legeme - Google Patents

Description

DK 155349 B

Den foreliggende opfindelse angår et analytisk legeme i fast tilstand til fotometrisk bestemmelse af koncentrationen af en specifik ion i en vandig prøve i nærværelse af et detekterbart materiale associeret med ionen samt en frem-5 gangsmåde til fotometrisk bestemmelse af koncentrationen af en specifik ion i en vandig prøve, og opfindelsen vedrører således området omfattende diagnostiske prøvemetoder og-materialer, der f.eks. er anvendelige i manuelle og automatiserede systemer, især de prøver, der er egnede til kvali-10 tativ og kvantitativ bestemmelse af koncentrationen af ioner, f.eks. kalium- og natriumioner.

Der er blevet offentliggjort talrige artikler, der omhandler forholdet mellem ioner og ionophorer .med hensyn til deres elektromotive karakteristika og den deraf følgende bestem-15 melse af ionisk aktivitet ved hjælp af elektrodeorganer.

Når to opløsninger med forskellige ionkoncentrationer bringes i kontakt, udvikles der et potentiale eller en elektromotorisk kraft (EMK), der er proportional med: 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 35 ^0g [ionaktivitet]1 2 [ionaktivitet]2 3

De to opløsninger kan adskilles ved en barriere, der hin 4 drer sammenblanding, men tillader elektrisk kontakt, f.eks. en 5 fritte. Alternativt kan der anvendes en membran indeholdende en 6 ionophor, f.eks. valinomycin. Membranens egenskaber er sådanne, 7 at modstanden i fraværelse af ionophoren er så høj, at den opfø 8 rer sig som et åbent kredsløb (der løber ikke tilstrækkelig strøm 9 til at drive voltmeteret), og der kan ikke måles nogen EMK. I nær- 10 værelse af kalium (K ) frembringer valinomycin (V) en ledende 11 + bane tværs over membranen ved binding af K , hvorved en svag strøm tillades at løbe. Et sådant system kan illustreres som følger:

DK 155349 B

2

O

Membran

Cl" K+ Fase 2 K+

Cl" K+ Cl" V Cl" 5 κ+

Prøveopløsning Cl V K+ Referenceopløsning

Fase 1 K+ Fase 3

K+ V

Cl" 10 v+ K Cl Cl

En referencekoncentration af K+ (fase 3) eksisterer på den ene side af membranen, og den udviklede EMK måles og an-15 vendes til beregning af den ukendte koncentration ud fra j*

Nernst's ligning. Eftersom K er den eneste kation, der kan bindes til valinomycin, fremkommer den ledende bane kun for + + K -ion, og den udviklede EMK er kun afhængig af K -koncentrationsgradienten tværs over membranen. Den strøm, der løber, 20 er så ringe, at ingen signifikant mængde K eller modion transporteres gennem membranen. En væsentlig vanskelighed ved anvendelsen af sådanne ionselektive elektroder har været deres tendens til at' blive ringere med hensyn til deres respons' nøjagtighed og hastighed i tidens løb. Endvidere interpreteres deres 25 aflæsning ved en logaritmisk funktion således, at små ændringer i ionkoncentration kræver kompliceret voltmeterudstyr.

Det er kendt, at makrocycliske antibiotica såsom det ovenfor nævnte har en virkning på de elektriske egenskaber af phos-pholipid-tolagsmembraner (biologiske membraner) således, at 30 disse antibiotica opløseliggør kationer inden i membranen i form af mobile, ladede komplekser, hvorved der tilvejebringes en "bærer11 -mekanisme, ved hjælp af hvilken kationer kan krydse det isolerende carbonhydrid-indre af membranen. Sådanne komplekser har det ene formål at transportere ladningen af komplekset 35 gennem membranen,således at der kan bestemmes en spændingsforskel mellem opløsninger på hver side af membranen.

3

DK 155349 B

o

Inden for et andet felt, der er blevet studeret, har Ei-senman et al., J. Membrane Biol., 1, 294-345 (1969), beskrevet den selektive ekstraktion af et salt fra vandige opløsninger over i organiske opløsningsmidler ved hjælp af makrotetralid 5 actin antibiotica. Forsøgene omfatter blot omrystning af en organisk opløsningsmiddelfase indeholdende de omhandlede antibiotica med vandige opløsninger indeholdende forskellige salte af en lipidopløselig, farvet anion. Intensiteten af farven af den organiske fase måles dernæst spektrofotometrisk til konstate-10 ring af, hvor meget salt der er blevet ekstraheret. Eisenman har ikke forsøgt at måle ionkoncentrationen i den vandige fase. Faseoverføring er også blevet studeret af Dix et al.,

Angew. Chem. Int. Ed. Engl., 17, 857 (1978), og i tidsskrifter, herunder Burgermeister et al., Top. Curr. Chem., 69_, 91 15 (1977), Yu et al., Membrane Active Complexones, Elsevier, Am sterdam (1974) og Duncan, Calcium in Biological Systems, Cambridge University Press (1976).

Fordeling af sådanne stoffer er hurtig og effektiv mellem væsker, som vist af Eisenman, på grund af deres mobile na-20 tur, der tillader den transporterede forbindelse at diffundere hurtigt bort fra grænsefladen. En sådan mekanisme er normalt umulig i den faste fase, der er karakteristisk ved stivhed, immobilitet og en diffusion, der i det væsentlige er lig nul.

Der savnes således vedblivende et instrument eller or-25 gan i fast tilstand, ved hjælp af hvilket koncentrationen af ioner i en opløsning kan bestemmes fotometrisk. Selv med dyrt og kompliceret udstyr har der ikke været nogen visuel måling af ionkoncentration til rådighed under anvendelse af analyseteknik i fast tilstand. Specifikke bestemmelser i fast til-30 stand af ionkoncentration, egnede til klinisk kemisk anvendelse, har således hidtil ikke været mulige.

Med den foreliggende opfindelse tilvejebringes der en helt ny basis for en bestemmelse af en ion i en væskeprøve, hvilken bestemmelse for første gang tillader kvan-35 titativ analyse af en specifik ion i prøven ved hjælp af den enkle dyp - og - aflæs - metode, idet analysens nøjag-

DK 155349B

4

O

tighed ikke påvirkes af nærværelsen af ellers interfererende ioner« Opfindelsen bygger på den erkendelse, at såfremt et ikke-polært materiale, hvori der er inkorporeret en ionophor, såsom valinomycin, bringes i kontakt med en vandig prøve 5 indeholdende forskellige ioner, kan en af disse ioner (IC1- i tilfælde af valinomycin) til trods for deres polære natur selektivt overføres til det ikke-polære materiale ved hjælp af et aktivt transport fænomen, der forårsages af ionophoren.

Den mængde ion, der overføres til det ikke-polære materiale, 10 står i relation til dens koncentration i den flydende prøve.

Ionen i det ikke-polære materiale kan derefter bestemmes kvantitativt ved hjælp af et detekterbart materiale, f.eks. et modion-farvestofmateriale, der er i stand til at samvirke med ionen til frembringelse af et detekterbart respons.

15 USA-patentskrift nr. 4.042.335 vedrører problemet med ensartet fordeling af en flydende prøve i et analytisk materiale. Ioner er end ikke nævnt som mulige analytter. I modsætning til den foreliggende opfindelse er reagenslaget i det analytiske materiale ifølge det nævnte patentskrift 20 permeabelt for den flydende prøve og er derfor fremstillet af et porøst og/eller hydrofilt materiale. Reagenslag af denne art ville være uegnede til den foreliggende opfindelses formål, fordi de ikke ville tillade selektiv adskillelse af en specifik ion fra en flydende prøve.

25 Ifølge EP-offentliggørelsesskrift nr. 0.010.615 anven des der en anden metode til bestemmelse af ioner af andre polære stoffer, ved hvilken der ikke undgås interferenser med stoffer, der ligner den analyt, der skal bestemmes. Ifølge dette offentliggørelsesskrift er ionophoreme covalent 3° bundet til et chromogen, som ændrer ekstinktion, når komplekset af ion og ionophor dannes. Omend der i skriftet diskuteres inkorporering af et farvestofsalt i valinomycin, således at farvestoffet tvinges ud, når kalium fra prøven kompleksbindes, er der imidlertid i dette skrift ingen omtale 35 af de essentielle træk ved den foreliggende opfindelse og der gives ingen antydning af, hvorledes man kan overvinde 5

O

DK 155349 B

problemet med interferens med andre ioner, f.eks. natriumioner.

Opfindelsen illustreres nærmere på tegningen, på hvilken 5 fig. 1 viser en grafisk fremstilling af de data, der fremgår af tabel IV, hvor der anvendes tris-2-ethylhexylphos-phat som blødgøringsmiddel, fig. 2 viser en grafisk fremstilling af de data, der fremgår af tabel IV, hvor der anvendes di-2-ethylhexylsebacat 10 som blødgøringsmiddel, fig. 3 viser en grafisk fremstilling af de data, der fremgår af tabel V, hvor der anvendes Phloxine B som modion, fig. 4 viser en grafisk fremstilling af de data, der fremgår af tabel V, hvor der anvendes Orange IV som modion, 15 fig. 5 viser en grafisk fremstilling af de data, der fremgår af tabel V, hvor der anvendes Eosin Y som modion, og fig. 6 viser en grafisk fremstilling af de data, der fremgår af tabel VI, hvor der anvendes DCPIP som modion.

Det analytiske legeme ifølge opfindelsen er ejendom- 20 meligt ved det i den kendetegnende del af krav 1 angivne, og fremgangsmåden ifølge opfindelsen er ejendommelig véd det i den kendetegnende del af krav 7 angivne.

Nærmere bestemt går den her omhandlede fremgangsmåde ud på, at man bringer det analytiske legeme i kontakt med 25 prøven i nærværelse af et detekterbart materiale, der er associeret med den ioniske analyt, idet det analytiske legeme omfatter et lag af i det væsentlige ikke-polært materiale inkorporeret med en analyt-specifik ionophor, hvorpå man fotometrisk måler den mængde af det detekterbare materiale, 30 der er migreret til i det mindste en overfladedel af det analytiske legeme, idet den mængde af det detekterbare materiale, der er migreret, er en indikation af koncentrationen af den specifikke ioniske analyt i prøven. Legemet, der har reageret, er stabilt, og aflæsningerne er ensartet pålidelige over mindst et tidsrum på nogle dage således, at f.eks. et 35

DK 155349 B

6

O

antal legemer, der har reageret, kan samles til aflæsning på én gang.

Det analytiske legeme i fast tilstand ifølge opfindelsen omfatter et lag af i det væsentlige ikke-polært ma-5 teriale inkorporeret med en ionophor, der selektivt kan danne et kompleks med den ion, der skal bestemmes. I en særlig udførelsesform omfatter det analytiske legeme et lag af i det væsentlige ikke-polært materiale inkorporeret med en analyt-specifik ionophor samt i laminær forbindelse dermed 10 et yderligere filmlag inkorporeret med et detekterbart materiale som kan associeres med den ioniske analyt. Reference til et laminært forhold mellem et ionophor lag og ethvert yderligere lag indebærer en evne hos et fluidum, enten væske eller gas, til at passere mellem over hinanden anbragte 15 overflader af sådanne lag, der kan være sammenhængende eller adskilt ved mellemliggende lag. Ethvert mellemliggende lag skal være et sådant, der ikke hindrer passage mellem alle lag. Det analytiske legeme kan være selvbærende eller kan bæres på en understøtning, f.eks. en understøtning, der kan 20 transmittere elektromagnetisk stråling med én eller flere bølgelængder i området mellem ca. 200 nanometer (nm) og ca.

900 nm.

Som ovenfor angivet udgøres et aspekt af opfindelsen af en fremgangsmåde til bestemmelse af koncentrationen af en spe-25 cifik ionisk analyt i en flydende prøve, hvilken fremgangsmåde er ejendommelig ved, at man bringer et analytisk legeme i kontakt med prøven i nærværelse af et detekterbart materiale, der er associeret med den ioniske analyt, idet det analytiske legeme omfatter et lag af i det væsentlige ikke-polært 30 materiale inkorporeret med en analyt-specifik ionophor, hvorpå man fotometrisk måler den mængde af det detekterbare materiale, der er migreret til i det mindste en overfladedel af det analytiske legeme, idet den mængde af det detekterbare materiale, der er migreret, er et mål for koncentrationen af den specifikke io-35 niske analyt i prøven. Efter den nævnte kontakt og inden den nævnte måling kan fremgangsmåden eventuelt omfatte et yderligere

DK 155349 B

7

O

trin til fjernelse af ethvert overskud af prøve fra det analytiske legeme. Fotometrisk måling skal her omfatte kolorimetrisk og fluorometrisk måling.

I én udførelsesform omfatter kontakttrinet tilsætning til 5 den flydende prøve af et detekterbart materiale, der er associeret med den ioniske analyt, hvorpå man bringer det analytiske legeme i kontakt med prøven indeholdende det detekterbare materiale. I en anden udførelsesform omfatter kontakttrinet, at man bringer et analytisk legeme i kontakt med prøven, idet det-10 te analytiske legeme indeholder et lag af i det væsentlige ikke--polært materiale inkorporeret med en analyt-specifik ionophor samt, i laminær forbindelse dermed, et andet lag inkorporeret med et detekterbart materiale associeret med den ioniske analyt.

I ét eksempel på det ovenfor beskrevne multilags-legeme 15 har det ionophore lag et par modstående overflader, idet laget af detekterbart materiale er i laminær forbindelse med det ene af det nævnte par overflader, og idet kontakttrinet omfatter kontakt med den anden af de nævnte overflader. I et andet eksempel har det detekterbare materialelag et par modstående overflader, 20 idet ionophor-laget er i laminær forbindelse med den ene overflade, og kontakten omfatter kontakt med den anden overflade.

Det i det væsentlige ikke-polære materiale i det nævnte filmlag kan være et materiale omfattende et blødgøringsmiddel og en ikke-polær polymer, der er egnet til at give dimensions-25 stabilitet. Egnede b'lødgøringsmidler kan omfatte phthalaterne, f.eks. dipentylphthalat, sebacaterne, f.eks. di-2-ethylhexyl--sebacat, og phosphaterne, f.eks. tris-2-ethylhexyl-phosphat. Egnede ikke-polære polymere, f.eks. polyvinylchlorid og poly-urethan, kan omfatte de polymere, der kan anvendes til dannelse 30 af "blush"-polymer lag.

De ionophor/ion-par, i forbindelse med hvilke opfindelsen kan finde anvendelse, omfatter ethvert af de par, der hører til den kendte teknik, og ethvert af de par, for hvilke relationen senere kan iagttages. Eksempler på sådanne par omfatter følgende: 35

O

8

DK 1 55349 B

Valinomycin/K+, 4, 7, 13, 16, 21-pentaoxa-l,10-diazabicyclo[8.8.5]tri-cosan [Kryptofix ® 221]/Na+, 4, 7, 13, 16, 21, 24-hexaoxa-l,10-diazabicyclo[8.8.8]-5 hexacosan [Kryptofix ® 222]/K+ og 4, 7, 13, 18-tetraoxa-l,10-diazabicyclo[8.5.5]-eicosan [Kryptofix ® 211]/Li+.

Kryptofix er et registreret varemærke for MCB Reagents, der er associeret med E. Merck, 2902 Highland Avenue, Cincinna-10 ti, Ohio.

Det detekterbare materiale er fortrinsvis en modion, der f.eks. er en chromophor eller fluorophor. En egnet chromophor er dichlorphenolindophenol. Egnede fluorophorer omfatter fluoroscein og dets derivater, 8-anilino-l-naphthalensulfonsyre, Erythrosin B 15 og 7-amino-4-trifluormethyl-coumarin.

En sådan modion kan ligeledes være associeret med en anden komponent, der er interreaktiv med et reagens, som er blevet inkorporeret i ionophorlaget. På grund af nærværelsen af et interaktivt (dvs. kemisk reaktivt) materiale og en ensartet til-20 syneladende koncentration af stof i det ionophore lag, kan der fremkaldes en ensartet, kvantitativt detekterbar ændring i legemet. En sådan ændring, der kan være dannelsen eller nedbrydningen af farve eller fluorescens, kan detekteres kvantitativt ved hjælp af radiometrisk teknik og om ønsket ved hjælp af auto-25 matiske radiometriske sensororganer såsom fotometriske organer.

Ved fremstillingen af de her omhandlede analytiske legemer kan lagene dannes i forvejen hver for sig og lamineres til dannelse af det færdige legeme. Lag, der fremstilles på en sådan måde, fås typisk som overtræk fra opløsning eller disper-30 sion på en overflade, fra hvilken det tørrede lag kan fjernes fysisk. En bekvem metode, ved hvilken man kan undgå problemer med flere fjernelses- og lamineringstrin, går imidlertid ud på at overtrække et begyndelseslag på en aftrækningsoverflade eller en understøtning, alt efter hvad man ønsker, og derpå at 35 overtrække successive lag direkte på de allerede tidligere frembragte overtræk. En sådan overtrækning kan udføres manuelt

DK 155349 B

9

O

under anvendelse af et blad- eller knivovertrækningsorgan, eller maskinelt under anvendelse af sådanne metoder som f.eks. dyppe- eller perleovertrækning. Såfremt der anvendes maskinel overtrækningsteknik, er det ofte muligt at overtrække tilstø-5 dende lag samtidigt under anvendelse af fødebeholderovertrækningsteknik, der er velkendt ved fremstillingen af lysfølsomme fotografiske film og papirer.

"Blush"-polymerlag, der er omtalt i det foregående, kan dannes på et underlag ved opløsning af en polymer i en blanding 1° af to væsker, af hvilke den ene er en væske med et lavere kogepunkt og er et godt opløsningsmiddel for den polymere, medens den anden er en væske med et højere kogepunkt og er et ikke-op-løsningsmiddel eller i det mindste et dårligt opløsningsmiddel for den polymere. En sådan polymeropløsning overtrækkes derpå på 15 underlaget og tørres under kontrollerede betingelser. Opløsningsmidlet med lavere kogepunkt fordamper lettere, og overtrækket kan blive beriget på den væske, der er et ringe opløsningsmiddel eller et ikke-opløsningsmiddel. Efterhånden som fordampningen skrider frem, dannes polymeren under passende betingelser i form 20 af et porøst lag. Der kan anvendes mange forskellige polymere, enkeltvis eller i kombination, til fremstilling af porøse ,,blush"-polymerlag til anvendelse i forbindelse med opfindelsen. Typiske eksempler omfatter polycarbonater, polyamider, polyurethaner og celluloseestere såsom celluloseacetat. Til 25 lag såsom de, der indeholder en ionophor eller detekterbart materiale, kan der fremstilles en overtræksopløsning eller -dispersion omfattende matrixen og inkorporerede aktive materialer, hvorpå der overtrækkes som omtalt i det foregående og tørres til dannelse af et dimensionsstabilt lag.

30 Tykkelsen af ethvert lag og dets grad af permeabilitet kan variere i stor udstrækning og afhænger af den konkrete anvendelse. Tørtykkelser på fra ca. 5 pm til ca. 100 pm har vist sig bekvemme, skønt en mere bredt varierende tykkelse kan være at foretrække under visse omstændigheder. Hvis der f.eks. kræ-35 ves forholdsvis store mængder af interaktivt materiale, f.eks. polymere materialer såsom enzymer, kan det være ønskeligt at anvende lidt tykkere lag.

10 o

DK 155349 B

Det kan også være Ønskeligt i et legeme at inkludere ét eller flere reflekterende lag, eventuelt absorberende til detektering af stråling, f.eks. til lettelse af resultatdetektering ved reflektionsradiometri, f.eks. reflektionsfotometri 5 eller en lignende teknik. En sådan reflektans kan tilvejebringes ved hjælp af et af de ovenfor beskrevne lag, eller den kan tilvejebringes ved hjælp af et yderligere lag, som ikke behøver at have en yderligere funktion i legemet. Pigmenter såsom ti-tandioxid og bariumsulfat, der er reflekterende, kan med fordel 10 anvendes i et reflekterende lag. ,,Blush"-polymere kan også udgøre egnede reflekterende materialer. I en foretrukken udførelsesform kan der i "blush"-polymerlag også være inkorporeret et pigment til forøgelse af reflektivitet eller andre funktioner. Den mængde pigment, der kan inkluderes i et lag sammen med 15 en "blush"-polymer, er i høj grad variabel, og mængder fra ca.

1 til ca. 10 vægtdele pigment pr. vægtdel "blush"-polymer foretrækkes, idet fra ca. 3 til ca. 6 dele pigment pr. vægtdel "blush"-polymer især foretrækkes.

I lagene i legemet kan det være fordelagtigt at inkor- 20 porere ét eller flere overfladeaktive materialer, f.eks. anio-niske eller ikke-ioniske overfladeaktive materialer. Disse kan eksempelvis forøge overtrækkeligheden af lagsammensætninger og forøge graden og grænserne for befugtning i lag, som ikke let befugtes af flydende prøver i fraværelse af et hjælpemiddel så- 25 som et overfladeaktivt middel. I lag af legemet kan det også være ønskeligt at inkludere materialer, der ved den valgte analysemetode, ved kemisk reaktion eller på anden måde, kan gøre materialer, der er potentielt ødelæggende for analysen, inaktive.

30

Som allerede nævnt kan de integrale analytiske legemer være selvbærende eller overtrukket på en bærer eller understøtning. Egnede understøtningsmaterialer omfatter papir og med polyolefin overtrukket papir samt et antal forskellige polymere materialer, f.eks. celluloseacetat, poly(ethylenterephthaiat), polycarbonater og polyvinylforbindelser såsom polystyrener. Un- 35 o

DK 155349 B

11 derstøtningen kan være opak, eller den kan transmittere lys eller anden energi. Den til et bestemt legeme valgte understøtning skal være forenelig med den tilsigtede metode til resultatdetektering. Foretrukne understøtninger omfatter transparente 5 understøtningsmaterialer, der er i stand til at transmittere elektromagnetisk stråling ved en bølgelængde i området mellem ca. 200 nm og ca. 900 nm. Understøtningen behøver naturligvis ikke at transmittere over hele området fra 200 til 900 nm, omend det til fluorometrisk detektering af analyseresultater ved 10 hjælp af understøtningen er ønskeligt, at denne transmitterer over et bredere bånd eller alternativt transmitterer ved absorptions- og emissionsspektrene for de fluorescerende materialer, der anvendes til detektering. Det kan også være ønskeligt at have en understøtning, som transmitterer ét eller flere snævre 15 bølgelængdebånd og er opak i forhold til tilstødende bølgelængdebånd. Dette kan f.eks. opnås ved imprægnering eller overtrækning af understøtningen med ét eller flere farvende stoffer, der har egnede absorptionsegenskaber.

Som det vil forstås, kan der ifølge opfindelsen fremstil-20 les et udvalg af forskellige legemer, afhængigt af den valgte analysemetode. Legemerne kan have forskellige former, herunder aflange tapestykker med enhver ønsket bredde, ark eller plader eller mindre spånlignende stykker. Bestemte legemer kan være tilpasset efter én eller flere analyser af en enkelt type eller en 25 række analyser af forskellige typer. I det sidstnævnte tilfælde kan det være ønskeligt at overtrække en fælles bærer eller understøtning med én eller flere strimler eller kanaler, hver eventuelt med sin sammensætning, til dannelse af et sammensat legeme, der er egnet til gennemførelse af en række ønskede analyser.

30 Integrale analytiske legemer ifølge den foreliggende op findelse kan tilpasses til anvendelse ved udførelse af et stort antal forskellige kemiske analyser, ikke blot på den kliniske kemis områder, men også i kemisk research og i kemiske proceskontrollaboratorier. Legemerne er godt. egnede til anvendelse ved 35 klinisk undersøgelse af legemsvæsker, f.eks. blod, blodserum og urin, eftersom der på dette felt hyppigt udføres et stort antal gen- 12

O

DK 155349 B

tagne analyser, og eftersom analyseresultaterne ofte er påkrævede meget kort tid efter prøveudtagningen. På f.eks. blodanalyseområdet kan multilagslegemet tilpasses til anvendelse ved udførelse af kvantitativ analyse af mange af de ioniske blodbestandde-5 le, der måles rutinemæssigt.

De her omhandlede legemer bringes til anvendelse på den måde, at legemet påføres en prøve af den væske, der analyseres.

Ved en typisk analyseprocedure under anvendelse af de omhandlede legemer, hvilken procedure kan være manuel eller automatise-10 ret, tages legemet fra en forsyningsvalse, en spån- eller stykpakke eller en anden kilde og anbringes til modtagelse af en fri dråbe, en kontaktplet eller en anden form for væskeprøve, f.eks. fra en egnet dispenser. Efter påføring af prøven, og helst efter at væskeprøven er blevet optaget af det lag, hvormed den er 15 blevet bragt i kontakt, udsættes legemet for en vilkårlig kondit ionering, f.eks. opvarmning eller humidificering, der kan være ønskelig til fremskyndelse af eller på anden måde lettelse af opnåelsen af det ønskede analyseresultat. Hvis der anvendes en automatiseret procedure, kan det også være Ønskeligt, at legemet 20 er i stand til at udøve dets funktion i løbet af nogle sekunder. Dette kan bekvemt ske ved passende udvælgelse af forskellige parametre, f.eks. lagtykkelse og hulrumsvolumen i porøse lag.

Efter at det analytiske resultat er opnået i form af en de-25 tekterbar ændring, måles denne, sædvanligvis ved at lede legemet gennem en zone, hvori der forefindes egnet apparatur til reflektions-, transmissions- eller fluorescensfotometri. Sådant apparatur tjener til at sende en stråle af energi, f.eks. lys, gennem - i én udførelsesfom - understøtningen eller bæreren. Ly-30 set reflekteres derpå fra legemet tilbage til et detekteringsorgan eller passerer gennem legemet til en detektor i tilfælde af transmissions-detektering. I en foretrukken udførelsesform detekteres det analytiske resultat i et område af legemet, der befinder sig totalt inden for det område, i hvilket et sådant re-35 sultat frembringes. Anvendelsen af reflektions-spektrofotometri kan være fordelagtig i nogle situationer, eftersom man herved

O

13

DK 155349 B

effektivt undgår optisk interferens fra enhver form for remanenser, f.eks. blodceller, der er blevet efterladt på eller i lagene af legemet. Om ønsket kan der også anvendes konventionel fluorescens--spektrofotometrisk teknik. Når der analyseres blodserum eller til-5 vejebringes midler til elimination af uønskede rester af helblod, kan der endvidere anvendes transmissionsteknik til detektering og mængdebestemmelse af de indikerende reaktionsprodukter ved reaktion med en strøm af strålingsenergi, f.eks. ultraviolet, synlig eller infrarød stråling ved én overflade af legemet og måling af denne 10 energis output fra legemets modstående overflade. Generelt har elektromagnetisk stråling i området fra ca. 200 til ca. 900 nm vist sig nyttig til sådanne målinger, omend man kan anvende enhver stråling, for hvilken legemet ér permeabelt, og som er i stand til at mængdebestemme det produkt, der produceres i legemet.

15 Forskellige former for kalibreringsteknik kan anvendes til tilvejebringelse af en analysekontrol. Eksempelvis kan der anbringes en prøve af analyt-standardopløsning stødende op til det areal, hvor dråben af prøven anbringes, for at tillade anvendelsen af differentielle målinger ved analyserne.

20 Opfindelsen belyses næmere i de følgende eksempler.

Eksempel 1 I det forsøg, der er beskrevet i dette eksempel, fremstilles der et integralt analytisk legeme, som afprøves for dets 25 evne til kvantitativ bestemmelse af tilstedeværelsen af kaliumioner i en flydende prøve under anvendelse af reflektans-aflæs-ning.

Fremstilling af legemet.

30 Den opløsning, der anvendes til fremstilling af det for kaliumioner følsomme legeme, indeholder følgende bestanddele; 35

DK 155349 B

14

O

Slutkoncentration

Bestanddel _Mængde_ (g/lQO ml opløsning)

Polyvinylchlo- rid (PVC) 38,4 mg 3,84 5 Dipentylphtha- lat (DPP) 129,6 mg 12,96

Valinomycin 4,0 mg 0,4

Tetrahydrofu- ran (THF) 0,87 ml 89,0 10 Total værdi 1,0 ml 100 ml 1 ml af denne opløsning anbringes på en transparent polyesterfilm, Gel-Bond ^ (Marine Colloids, Inc.), på den uover-trukne side og udspredes til en dybde på 0,254 mm under anven-15 delse af en konventionel skrabekniv. Scotchpar 70 GAB 25 (3M Corporation) kan anvendes i stedet for Gel Bond. Der fremstil-les ca. 30 cm med en tykkelse på 25 μπι. Filmen lufttørres i ca. 30 minutter.

Til reflektansmålinger skæres polyesterfilmen derpå ud 20 il cm-segmenter, og den uovertrukne side anbringes mod en lysspredende polystyrenunderstøtning (hvid Trycite ®) ved hjælp af dobbeltsidet adhæsivt tape af mærket 3M. Segmenterne udskæres derpå til dannelse af et 1 cm x 0,75 cm reaktivt legeme sammensat af et transparent, kalium-sensitivt ionophorlag 25 på en polyesterunderstøtning med en lysspredende baggrund.

Analyseopløsning.

Der sættes kaliumchlorid til aliquoter af en opløsning indeholdende 35,6 mM tris-Cl og 8,89 mM Erythrosin B (pH = 7,2) 30 til frembringelse af kaliumkoncentrationer på henholdsvis 0,133, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,75, 0,9 og 1,1. Der fremstilles også en opløsning, der ikke indeholder kalium.

Analytisk procedure.

35 Analyse af hver aliquot udføres ved anbringelse af til strækkelig analyseopløsning til dannelse af en hvælvet kuppel af

O

15

DK 155349 B

væske på legemet. Efter 4 minutter fjernes væsken med en svag vandstrøm, og legemet duppes forsigtigt tørt med blødt papir.

Det tilbageholdte farvestof mængdebestemmes ud fra procenten af reflektans (% R) ved 530 nanometer (nm) som målt med reflektans-5 spektrometer. Aflæsninger taget for analyseopløsninger med kaliumkoncentrationer på 0,2 og 0,5 mM anvendes til kalibrering af spektrometeret.

Resultater.

10 De aflæsninger, der fås ved denne analyseprocedure, er i form af % R-enheder, som omregnes matematisk ved hjælp af Kubelka-Monk-ligningen og kalibreringsværdierne til enheder af kaliumkoncentration [K+], idet disse aflæsninger og de respektive iagttagne koncentrationer er angivet i den følgende tabel I.

15

Tabel I

Faktisk Iagttaget K+ (mM) (% R) K+ (mM) 0 62,9 0,03 20 0,133 40,5 0,19 0,2 36,2 0,24 0,3 30,7 0,35 0,4 27,1 0,44 0,5 24,9 0,51 ος 0,6 23,0 0,58 0,75 19,4 0,76 0,9 18,4 0,83 1,1 15,9 1,02 30 Konklusion.

De resulterende data viser, at det integrale analytiske legeme giver et kvantitativt, detekterbart respons på kaliumkoncentrationen i hver af de afprøvede aliquoter.

Eksempel 2

Dette eksempel illustrerer, at legemet indeholdende ionophoren valinomycin er selektivt for kalium og ikke giver respons 35

DK 155349B

o 16 for natrium, hvorved der tilvejebringes en differentieret test, i dette forsøg ved aflæsning af absorbans, af disse almindeligt forekommende ioner i biologiske væsker.

5 Fremstilling af legemet.

Det kalium-specifikke legeme indeholder de samme bestanddele og fremstilles som beskrevet i eksempel 1, dog med den undtagelse, at det ikke fikseres til en reflekterende understøtning.

10 Analyseopløsninger. .

Kaliumchlorid og natriumchlorid sættes til aliquoter af en opløsning indeholdende 5 mM Erythrosin B og 50 mM tris-acetat (pH = 7,2) til opnåelse af de kalium- og natriumkoncentrationer, der er angivet i den følgende tabel II.

15

Tabel II

+ +

Opløsning nr. K (mM) Na (mM) 10 4 20 2 0 10 3 0 20 4 0 50 5 0 100 6 2,2 0 25

Analyseprocedure.

Analysen af de som ovenfor beskrevet fremstillede analyseopløsninger udføres ved samme metode som anvendt i eksempel 1, dog med de undtagelser, at det tilbageholdte farvestof mængdebe-30 stemmes ud fra absorbansen i stedet for reflektansen, og at aflæsningerne foretages ved 553 nm. Der udføres tre målinger ved hvert niveau, og middelværdien bestemmes som angivet i det følgende.

35

O

17

DK 155349 B

Resultater.

De aflæsninger, der fås ved denne analytiske procedure, er i form af absorbans-enheder, der matematisk omregnes til enheder af kaliumkoncentrationer [K+], idet der anvendes den før-5 ste og den sidste værdi som kalibreringsværdier. Disse aflæsninger og de respektive iagttagne koncentrationer fremgår af den følgende tabel III:

Tabel III

10 Faktisk Faktisk Absorbans Iagttaget K+ (mM) Na+ (M) (553 nm) K+ (mM)

0 4 0,063 O

0 10 0,062 0

0 20 0,063 O

15 0 50 0,060 -0,01 O 100 0,057 -0,03 2,2 O 0,547 2,2 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 35

Konklusion.

2

De fremkomne data viser, at det integrale analytiske 3 legeme giver et kvantitativt, detekterbart respons, der er 4 specifikt for kaliumkoncentrationen i hver af de analyserede 5 aliquoter, uafhængigt af natriumionkoncentrationen.

6 7

Eksempel 3 8 I det forsøg, der beskrives i dette eksempel, foretages 9 der en ombytning af blødgøringsmidler, som anvendes til fremstil 10 lingen af ionophorlaget.

11

Fremstilling af legemet.

Den opløsning, der anvendes til fremstilling af det for kalium specifikke legeme, indeholder de følgende bestanddele:

O

18

DK 155349 B

Slutkoncentration

Bestanddel Mængde (g/100 ml opløsning) PVC 40 mg 4 5 Blødgøringsmiddel 100 mg 10

Valinomycin lf5 mg 0,15 THF 0,9 ml 90

Total værdi 1 ml 100 ml 10 De anvendte blødgøringsmidler er tris-2-ethylhexylphos- phat (TEP) og di-2-ethylhexyl-sebacat (DHS). Legemet fremstilles ved den metode, der er angivet i eksempel 1.

Analyseopløsninger.

15 Kaliumchlorid sættes til aliquoter af en opløsning inde holdende 40 mM tris-Cl og 10 mM Erythrosin B (pH = 7,2) til frembringelse af kaliumkoncentrationer på 0,2, 0,4, 0,6, 0,8 og 1,1 mM. Der fremstilles én aliquot, som ikke indeholder kalium.

20 Analyseprocedure.

Proceduren er den samme som i eksempel 1, men med den undtagelse, at bølgelængden ved målingen er 540 nm, og at kalibreringsniveauerne er 0,4 og 0,8 mM kalium. Der gennemføres analyser in triplo, og middelværdierne bestemmes som angivet i 25 det følgende.

Resultater.

Aflæsningerne af middelværdierne for reflektansen og de iagttagne koncentrationer afledt deraf fremgår af tabel IV.

30 35

DK 155349 B

19

O

Tabel IV

_tep_ _mis_

Faktisk Iagttaget Iagttaget K+ (mM) K+ (mM) %R K+ (mM)

5 0 39,8 -0,23 62,8 O

0,2 33,0 0,18 41,7 0,21 0,4 29,4 0,47 34,1 0,37 0,6 27,5 0,67 28,4 0,55 0,8 25,9 0,86 24,4 0,74 10 1,1 24,3 1,07 20,3 1,02

Grafiske fremstillinger af de data, der i tabel IV er angivet for TEP og DHS, fremgår af henholdsvis figur 1 og figur 2.

15 Konklusion.

De fremkomne data viser, at legemer, der er fremstillet således, at de indeholder ét af de ovennævnte blødgøring§midler, er effektive til kvantitativ detektering af koncentrationen af kalium i en prøve med nøjagtighed.

20

Eksempel 4 I dette eksempel anvendes der et udvalg af alternative farvestoffer til illustration af det brede område af detekterbare materialer, der er egnedé til anvendelse i forbindelse med op-25 findelsen.

Fremstilling af legemet.

Det for kalium specifikke legeme indeholder de samme be-30 standdele og fremstilles som beskrevet i eksempel 3, dog med den undtagelse, at der anvendes blødgøringsmidlet dipentylphthalat.

Analyseopløsnincr.

Der fremstilles fire analyseopløsninger som beskrevet i ek-35 sempel 3, dog med den undtagelse, at hver opløsning i stedet for Erythrosin B indeholder ét af de alternative farvestoffer 2,6-di-chlor-phenol-indophenol (DCPIP), Orange IV, Phloxine B og Eosin Y.

O

20

DK 155349 B

Analyseprocedure.

Analyseproceduren er den samme som i eksempel 3, med den undtagelse, at der for sammensætningerne indeholdende de forskellige farvestoffer foretages aflæsninger ved de følgende bølgelæng-5 der:

Phloxine B (550 nm) Orange IV (430 nm) DCPIP (680 nm) Eosin Y (550 nm)

Resultater.

10 Reflektansaflæsningerne samt de kaliumkoncentrationer, der beregnes ud fra disse, fremgår af den følgende tabel V. Grafiske fremstillinger af korrelationen mellem faktiske og iagttagne koncentrationer for analyseopløsninger indeholdende Phloxine B, Orange IV, Eosin Y og DCPIP fremgår af henholdsvis figur 3, 4, 5 og 6. 15 20 25 1 35 21

DK 155349 B

Sio i—i H m O i—i co cm in ιο σ> cn ’— ^ κ.

» O O O O O O

+ Ή tn o H h oi oa u3 in fy| < n s v ^ s o\o o σ\ oo i> r* vo vo m in in in

»-“N

Sr" i—! r~- ^ oo r-1 H sr in oo O

^ ' ft» ft» ft. *» *»> ft»

H O O O O O H

+; i <D tø iji .

C

ttS

S-ι >π oi in co O σι Q ^ ^ ^

0\o in σι cn co O

io <i η ro n 2 id O m in σ cn

]Éj i—1 i—I ID C i—I

'w' ft» ft» %. ft» ft» ft»

O O O O O H

ft + I

> H tø ft

H U

Φ Q

Λ n ro m O cn O

cd ft *·,*«.**

Eh o\o cn in in cn O Γ' m cn cn cn cn h ft g covocomsrcn

^ O cn cn co r-~ rH

Q) »»··*»» rt+ oooooh •H tø X! o t—1 n! r- O i> t-~ co h p j s s ». n ^ k.

op o'i in cn rH oo in in in in in <f 44 — tn gj +J Ocn^ioooh 44 *· - * *· »

cd + O O O O H

ft tø

DK 155349 B

22

O

Konklusion.

De fremkomne data viser, at legemer fremstillet med indhold af ethvert af de ovennævnte detekterbare materialer, er effektive til kvantitativ detektering af kaliumkoncentra-5 tionen i en prøve med nøjagtighed.

Eksempel 5

Dette eksempel viser, at det analytiske legeme har et kvantitativt og specifikt respons for kalium, når der anven-10 des en anden ionophor· (Kryptofix 222).

Fremstilling af legemet.

Den opløsning, der anvendes til fremstilling af det kalium-specifikke legeme, indeholder følgende bestanddele: 15

Slutkoncentration

Bestanddel Mængde (g/100 ml opløsning) PVC 38,40 mg 3,84 DPP 64,80 mg 6,48 20 Kryptofix ® K222 2,40 mg 0,24 THF 0,935 ml 93,50

Total værdi 1 ml 100 ml

Legemet fremstilles ved den fremgangsmåde, der er beskre-25 vet i eksempel 1.

Analyseopløsning·.

Kaliumchlorid sættes til aliquoter af en opløsning af 5 mM Erythrosin B og 20 mM tris-Cl (pH = 7,3) til fremstilling af opløs-30 ninger indeholdende henholdsvis 0, 0,1, 0,3, 1,0, 3,0 og 30 mM kalium. Der fremstilles et sæt opløsninger på samme måde under anvendelse af natriumchlorid i stedet for kaliumchlorid.

Analyseprocedure.

35 Der anvendes samme procedure som i eksempel 1, herunder den benyttede bølgelængde, men med den undtagelse, at kalibreringsop-

DK 155349 B

23

O

løsningerne indeholder 0,1 og 1,0 mM kalium. Der udføres analyser in triplo, og middelværdierne bestemmes som angivet i det følgende .

5 Resultater.

Middel-reflektansaflæsningerne og de deraf afledte, iagttagne koncentrationer for kalium- og natriumanalyseopløsningerne i forbindelse med det anvendte legeme fremgår af den følgende tabel VI.

10

Tabel VI

Faktisk %R Iagttaget Faktisk %R Iagttaget K+ (mM)_K+ (mM)_Na+ (mM)_Na+ 0 56,1 0,04 0 54,6 0,03 15 0,1 50,6 0,1 0,1 53,4 0,05 0,3 46,1 0,25 0,3 53,3 0,05 1.0 28,1 1,0 1,0 54,3 0,06 3.0 9,97 5,2 3,0 51,5 0,08 20 Konklusion.

- (g)

Legemer indeholdende en egnet ionophor, f.eks. Kryptofix w K 222, viser et specifikt og kvantitativt respons for kaliumioner.

Eksempel 6 25 Dette Eksempel viser, at det analytiske legeme har et specifikt og kvantitativt respons for natriumioner, når ionophoren Kryptofix ® K 221 anvendes.

Fremstilling af legemet og analyseprocedure.

30 Legemet fremstilles som i eksempel 5, men med den undta gelse, at der anvendes Kryptofix ® K 221 i stedet for Kryptofix® K 222.

Analyseprocedure.

35 Proceduren er den samme som i eksempel 1, herunder den be nyttede bølgelængde, men med den undtagelse, at kalibreringsop-

O

24

DK 155349 B

løsningerne indeholder 0,1 og 10,0 mM natrium. Analyserne udføres in triplo, og middelværdierne bestemmes som angivet i det følgende.

5 Resultater.

Middelværdierne for reflektans-aflæsningerne og de deraf afledte, iagttagne koncentrationer i natrium- og kaliumanalyseop-løsningerne under anvendelse af legemet fremgår af den følgende tabel VII.

10

Tabel VII

Faktisk %R Iagttaget Faktisk %R Iagttaget

Na* (mM)_Na* (mM)_K* (mM)_K* (mM) O 56,4 0,14 0 54,7 0,10 15 0,1 57,7 0,10 0,1 56,3 0 0,3 52,5 0,47 0,3 54,2 0,18 1.0 47,8 1,4 1,0 54,7 0,10 3.0 30,2 8,4 3,0 57,9 0 10,0 28,0 10 10 54,4 0,14 20 30,0 18,6 21,5 30 53,4 0,31

Konklusion.

Analytiske legemer indeholdende en egnet ionophor, såsom Kryptofix ® K 221, viser et kvantitativt og specifikt respons 25 for natriumioner. 1 35

Claims (10)

1. Analytisk legeme i fast tilstand til fotometrisk bestemmelse af koncentrationen af en specifik ion i en vandig prøve i nærværelse af et detekterbart materiale associeret 5 med ionen, kendetegnet ved, at det analytiske legeme omfatter et lag indeholdende et i det væsentlige ikke-polært materiale, i hvilket der er inkorporeret en ion-specifik ionophor, samt eventuelt et yderligere lag i laminær forbindelse med det førstnævnte lag, i hvilket yder- 10 ligere lag der er inkorporeret et detekterbart modion-mate-riale.

2. Analytisk legeme ifølge krav 1, kendetegnet ved, at det ikke-polære materiale er fastgjort til en understøtning.

3. Analytisk legeme ifølge ethvert af. kravene 1 og 2, kendetegnet ved, at det detekterbare materiale er et modion-farvestof, fortrinsvis erythrosin B.

4. Analytisk legeme ifølge ethvert af kravene 1-3, kendetegnet ved, at det detekterbare materiale 20 er en fluorophor, fortrinsvis et derivat af fluorescein, 8 -anilino-l-naphthalen-sulfonsyre eller 7-amino-4-trifluor-methyl-coumarin.

5. Analytisk legeme ifølge ethvert af kravene 1-4, kendetegnet ved, at ionophoren er valinomycin, 25 4,7,13,16,21-pentaoxa-l,10-diazabicyclo[8.8.5]tricosan, 4,7,13,16,21,24-hexaoxa-l,10-diazabicyclo[ 8.8.8 ]hexacosan eller 4,7,13,18-tetraoxa-l, 10-diazabicyclo[8.5.5leicosan, fortrinsvis valinomycin.

6. Analytisk legeme ifølge ethvert af kravene 1-5, 30 kendetegnet ved, at det ikke-polære materiale indeholder et blødgøringsmiddel og en ikke-polær polymer, der er egnet til fremkaldelse af dimensionsstabilitet.

7. Fremgangsmåde til fotometrisk bestemmelse af koncentrationen af en specifik ion i en vandig prøve, k e n - 35 detegnet ved, at man (a) til prøven sætter et fotometrisk detekterbart

26 DK 155349 B materiale associeret med ionen, hvilket materiale kan migrere som respons på kompleksdannelse mellem en ion-specifik ionophor og ion-analytten, (b) bringer et analytisk legeme ifølge ethvert af 5 kravene 1-6 i kontakt med prøven indeholdende det detekter- bare materiale og (c) fotometrisk måler den mængde af det detekterbare materiale, der er migreret i det mindste til det analytiske legemes overfladedel.

7. Fremgangsmåde ifølge krav 7, kendeteg net ved, at overskuddet af prøve indeholdende detekterbart materiale fjernes fra det analytiske legeme inden målingen af det fremkomne respons.

9. Anvendelse af et analytisk legeme ifølge ethvert 15 af kravene 1-6 til bestemmelse af natrium-, kalium- eller lithiumion.