FI74817B - Foerfarande och integralt analytiskt element foer bestaemning av koncentrationen av en specifik jonisk analyt i ett vaetskeprov. - Google Patents

Description

1 7481 7

Menetelmä ja yhtenäinen analyyttinen laite määrätyn ionisen analyytin pitoisuuden määrittämiseksi nestenäytteessä

Keksintö koskee menetelmää ja yhtenäistä analyyttis-5 tä laitetta määrätyn ionisen analyytin pitoisuuden määrittämiseksi nestenäytteessä.

Keksinnön mukaiset diagnostiset testimenetelmät ja -välineet voidaan käyttää käsikäyttöisissä ja automaattisissa järjestelmissä niissä testeissä, jotka soveltuvat 10 ionien, kuten kalium- ja natriumionien pitoisuuksien kvalitatiiviseen ja kvantitatiiviseen määräämiseen.

On julkaistu useita kirjoituksia, joissa esitetään ionien ja ionoforien sekä niiden sähkömotoristen ominaisuuksien välisiä suhteita ja ioniaktiivisuuden määrittämis-15 tä tämän perusteella elektrodeja käyttäen.

Jos kaksi erilaisen ionipitoisuuden omaavaa liuosta saatetaan kosketukseen keskenään, muodostuu jännite tai sähkömotorinen voima (EMF), joka on verrannollinen lausekkeeseen: 20 2_0g (ioniaktiivisuus) 1 (ioniaktiivisuus) 2

Kaksi liuosta voidaan erottaa toisistaan estokerrok-25 sen avulla, joka estää niiden sekoittumisen, mutta sallii sähköisen yhteyden, esimerkiksi sintratun lasin avulla. Vaihtoehtoisesti voidaan käyttää ionoforia, kuten valinomy-siiniä, sisältävää membraania. Membraanin ominaisuudet ovat sellaiset, että ilman ionoforin läsnäoloa vastus on niin 30 suuri, että membraani käyttäytyy avoimen piirin tavoin (virta ei riitä osoitettavaksi mittarilla eikä jännitettä voida mitata. Kaliumionin (K+) läsnäollessa valinomysiini (V) muodostaa johtavan tien membraanin lävitse sitomalla K+-ionin sallien tällöin pienen virrankulun. Tämä järjestelmä voidaan 35 esittää seuraavasti: 7481 7 2

Cl" K+ Membraani, faasi 2 K+

Cl" K+ Cl" V Cl" 5 K+

Testiliuos, Cl V K+ vertailuliuos, faasi 1 K+ faasi 3

K+ V

Cl" 10 K+

Cl" Cl"

Membraanin toisella puolella on K+-ionien vertailu-pitoisuus (faasi 3) ja muodostunut EMF mitataan ja sitä käy-15 tetään laskettaessa tuntematonta pitoisuutta Nernst'in yhtälöstä. Koska K+ on ainoa valinomysiinin liittynyt kationi, esiintyy johtava tie vain K+-ionille ja muodostunut EMF riippuu vain K+-pitoisuusgradientista membraanin lävitse. Kulkeva sähkövirta on niin vähäinen, ettei merkittävää määrää 20 K+-ioneja tai vastaioneja siirry membraanin lävitse. Tällaisten ioniselektiivisten elektrodien käytön päävaikeuteuna on ollut niiden taipumus heikentyä vasteen tarkkuuden ja nopeuden suhteen ajan kuluessa. Lisäksi niiden avulla saatu näyttö on logaritminen, niin että pienet muutokset ionipitoi-25 suuksissa vaativat monimutkaisen jännitemittarin.

On tunnettua, että makrosykliset antibiootit, kuten edellä esitetty, vaikuttavat fosfolipidiä olevien kaksiker-rosmembraanien, biologisten membraanien, sähköisiin ominaisuuksiin siten, että nämä antibiootit liuottavat membraanis-30 sa olevia kationeja liikkuvien varattujen kompleksien muodossa, muodostaen siten "kantaja"-mekanismin, jonka avulla kationit voivat siirtyä membraanin eristävän hiilivetysisus-tan lävitse. Näiden kompleksien ainoana tarkoituksena on kompleksin varauksen siirtäminen membraanin lävitse niin, 35 että jännite-ero voidaan mitata membraanin molemmin puolin olevien liuosten välillä.

3 74817

Toisella tutkimusalueella Eisenman et ai., J. Membrane Biol. 1 (1969) 294-345 esittävät kationien selektiivisen uuton vesiliuoksista orgaanisiin liuottimiin makrotetrali-diaktiiniantibioottien avulla. Kokeet käsittävät pelkästään 5 antibiootteja sisältävän orgaanisen liuotinfaasin ravistelun vesiliuosten kanssa, jotka sisältävät erilaisia lipidi-liukoisen, värillisen anionin kationisuoloja. Värin voimakkuus orgaanisessa faasissa mitataan sitten spektrofotometri-sesti sen osoittamiseksi, kuinka paljon suolaa on uuttau-10 tunut. Eisenman ei pyri mittaamaan ionipitoisuutta vesifaasissa. Faasisiirtoa on tutkinut myös Dix et ai., Engew.

Chem. Int. Ed. Engl. 12 (1978) 857 ja on sitä esitetty myös katsauksissa mukaan luettuna Burgermeister et ai., Top.

Curr. Chem. 69 (1977) 91, Yu et ai., Membrane Active 15 Complexones, Elsevier, Amsterdam (1974) ja Duncan, Calsium in Biological Systems, Cambridge Unversity Press (1976).

Yhdisteen jakautuminen nesteiden välille on nopea ja tehokas, kuten Eisenman on osoittanut, niiden liikkumistavan vuoksi, mikä sallii siirtyvän yhdisteen diffundoitumi-20 sen nopeasti rajapinnalta. Tällainen mekanismi on tavallisesti mahdoton kiinteässä fasissa, jolle on ominaista jäykkyys ja liikkumattomuus ja oleellisesti diffundoitumatto-muus.

Täten ei ole olemassa mitään kiinteässä tilassa toi-25 mivaa välinettä tai laitetta, jonka avulla voidaan määrittää fotometrisesti ionien pitoisuudet liuoksessa. Edes kalliilla ja hankalalla laitteella ei ole mahdollista mitata visuaalisesti ionipitoisuuksia käyttäen analyyttisiä kiinteän tilan menetelmiä. Ionipitoisuuden määrittämistapaa kiinteäs-30 sä tilassa, joka soveltuisi kliinisen kemian käyttöön, ei näin ollen tähän mennessä ole ollut käytettävissä.

Kuvio 1 esittää graafisesti saatuja arvoja käytettäessä tris-2-etyyliheksyylifosfaattia pehmentimenä taulukossa 4 esitetyllä tavalla.

35 Kuvio 2 esittää graafisesti saatuja arvo ja käytettäessä di-2-etyyliheksyylisebasaattia pehmentimenä taulukossa 4 esitetyllä tavalla.

. 74817 4

Kuvio 3 esittää graafisesti saatuja arvoja käytettäessä Phloxine B:tä vastaionina taulukossa 5 esitetyllä tavalla.

Kuvio 4 esittää graafisesti saatuja arvoja käytettäes-5 sä Orange IV:ää vastaionina taulukossa 5 esitetyllä tavalla.

Kuvio 5 esittää graafisesti saatuja arvo ja käytettäessä Eosin Y:tä vastaionina taulukossa 5 esitetyllä tavalla.

Kuvio 6 esittää graafisesti saatuja arvoja käytettäessä DCPIP:tä vastaionina taulukossa 6 esitetyllä tavalla.

10 Keksinnön mukaisesti saadaan menetelmä ionin määrittä miseksi nestemäisessä näytteessä sekä yhtenäinen analyyttinen laite näissä määrityksissä käytettäväksi.

Keksinnön mukaiselle menetelmälle määrätyn ionisen analyytin pitoisuuden määrittämiseksi nestenäytteessä on 15 tunnusomaista, että menetelmä käsittää yhtenäisen analyyttisen laitteen saattamisen kosketukseen näytteen kanssa ioniseen analyyttiin liittyvän ilmaistavan ionilajin läsnäollessa, jolloin analyyttinen laite käsittää oleellisesti ei-polaarista materiaalia olevan 20 kerroksen, johon on lisätty analyytille spesifistä ionofo-ria, mahdollisen ylimääräisen näytteen poistamisen analyyttisestä laitteesta, ja ilmaistavan ionilajin sen määrän mittaamisen foto-25 metrisesti, joka on siirtynyt vähintään analyyttisen laitteen pinnan osalle, jolloin siirtynyt määrä ilmaistavaa io-nilajia osoittaa määrätyn ionisen analyytin pitoisuuden näytteessä. Reagoinut laite on stabiili ja lukemat ovat luotettavia vähintään vuorokauden ajan, niin että esimerkiksi 30 useita reagoineita elementtejä voidaan taltioida luettaviksi yhdellä kertaa.

Keksinnön mukaiselle yhtenäiselle analyyttiselle laitteelle määrätyn ionisen analyytin pitoisuuden määrittämiseksi nestenäytteessä on tunnusomaista, että laite käsittää 35 oleellisesti ei-polaarista materiaalia olevan kerrok sen, johon on lisätty analyytille spesifistä ionoforia ja sen suhteen laminaarisesti sijoitettuna 5 74817 toisen kerroksen, johon on lisätty ioniseen analyyt-tiin liittyvää ilmaistavaa ionilajia.

Laminaarinen rakenne ionoforikerroksen ja lisäkerroksen (-kerrosten) välillä sallii väliaineen, joko nesteen 5 tai kaasun, siirtymisen näiden kerrosten päällekkäin olevien pintojen välitse. Nämä kerrokset voivat rajoittua toisiinsa tai ne voivat olla välikerrosten erottamia. Mahdollinen välikerros on sellainen, että se ei estä siirtymistä kaikkien kerrosten välitse. Analyyttinen laite voi olla 10 itsetukeva tai sijoitettu tukialustalle, esimeriksi alustalle, joka läpäisee sähkömagneettista säteilyä yhdellä tai useammalla aallonpituudella alueella noin 200-900 nanomet-riä.

Vaikka määrättyjä termejä käytetään seuraavassa esi-15 tyksessä selvyyden vuoksi, on näiden termien tarkoitettu kohdistuvan vain keksinnön esiteltäväksi valittuun määrättyyn toteutukseen.

Kuten edellä on mainittu, keksinnön eräs kohde on menetelmä määrätyn ionisen analyytin pitoisuuden mittaami-20 seksi nestemäisestä näytteestä, mikä menetelmä käsittää yhtenäisen analyyttisen laitteen saattamisen kosketukseen näytteen kanssa ioniseen analyyttiin liittyvän ilmaistavan ionilajin läsnäollessa, jolloin analyyttinen laite käsittää oleellisesti ei-polaarista materiaalia olevan 25 kerroksen, johon on lisätty analyytille spesifistä ionofo-ria, mahdollisen ylimääräisen näytteen poistamisen analyyttisestä laitteesta, ja ilmaistavan ionilajin sen määrän mittaamisen foto-30 metrisesti, joka on siirtynyt vähintään analyyttisen laitteen pinnan osalle, jolloin siirtynyt määrä ilmaistavaa ionilajia osoittaa määrätyn ionisen analyytin pitoisuuden näytteessä. Fotometrisen mittauksen on tarkoitettu käsittävän kolorimetrisen ja fluorometrisen mittauksen.

35 Eräässä toteutuksessa kosketusvaihe käsittää ioniseen analyyttiin liittyvän ilmaistavan ionilajin lisäämisen nes- 6 74817 tenäytteeseen ja analyyttisen laitteen saattamisen sitten kosketukseen ilmaistavaa ionilajia sisältävän näytteen kanssa. Toisessa toteutuksessa kosketus käsittää analyyttisen laitteen saattamisen kosketukseen näytteen kanssa, jol-5 loin analyyttinen laite käsittää oleellisesti ei-polaarista materiaalia olevan kerroksen, johon lisätty analyytille spesifistä ionoforia sekä siihen nähden laminaarisesti olevan toisen kerroksen, johon on lisätty ioniseen analyyttiin liittyvää ilmaistavaa ionilajia.

10 Eräässä edellä esitetyssä monikerroksisessa laittees sa ionoforikerros käsittää kaksi vastakkaista pintaa, jolloin ilmaistavaa ionilajia sisältävä kerros on sijoitettu kerrokseksi toisella näistä pinnoista ja kosketukseen saattaminen käsittää kosketuksen muodostamisen toiseen pintaan.

15 Toisessa esimerkissä ilmaistavaa ionilajia sisältävässä kerroksessa on kaksi vastakkaista pintaa, jolloin ionoforia sisältävä kerros on sijoitettu kerroksena toisella näistä pinnoista ja kosketuksen suorittaminen käsittää kosketuksen muodostamisen toisen pinnan kanssa.

20 Kalvokerroksen oleellisesti ei-polaarinen materiaali voi muodostua koostumuksesta, joka sisältää pehmennintä ja ei-polaarista polymeeriä, joka antaa dimensionaalisen sta-biilisuuden. Sopiviin pehmentimiin kuuluvat ftalaatit, kuten dipentyyliftalaatti ja sebasaatit, kuten di-2-etyyli-25 heksyylisebasaatti ja fosfaatit, kuten tris-2-etyyliheksyy-lifosfaatti. Sopiviin ei-polaarisiin polymeereihin, kuten polyvinyylikloridi ja polyuretaani, voivat kuulua ne, jotka soveltuvat kalvonmuodostaviksi polymeereiksi.

Ionofori/ioni-pareihin, joihin esiteltävää keksintöä 30 voidaan soveltaa, kuuluvat sekä alalla tunnetut että myös ne, joissa vastaavaisuus voidaan myöhemmin todeta. Esimerkkeihin näistä pareista kuuluvat: valinomysiini/K+; 4,7,13,16,21-pentaoksa-l,10-diatsabisyklo-(8,8,5)— 35 trikosaani (KryptofixR 221)/Na+f 4,7,13,16,21,24-heksaoksa-l,10-diatsabisyklo-(8,8,8)— heksaoksaani (KryptofixR 222)/K+; ja 7 74817 4,7,13,18-tetraoksa-l,1O-diatsabisyklo-(8,8,5)-eikosaani (KryptofixR 211)/Na+.

Kryptofix on E. Merck'in tytäryhtiön MCB Reagents'in kauppanimi, 2902 Highland Avenue, Cincinnati, Ohio.

5 Ilmaistava ionilaji on edullisesti vastaioni, joka on edullisesti kromofori tai fluorofori. Sopiva kromofori on dikloorifenolindofenoli. Sopiviin fluoroforeihin kuuluvat fluoreseiini ja sen johdannaiset, 8-anilino-l-nafta-leenisulfonihappo, Erythrosin B ja 7-amino-4-trifluorimetyy-10 likumariini.

Vastaioni voi liittyä myös toiseen komponenttiin, joka toimii vuorovaikutteisesti sen reagenssin kanssa, jota on lisätty ionoforikerrokseen. Vuorovaikutteisen (so. kemiallisesti reagoivan) materiaalin ja ionoforikerroksen an-15 tämän tasaisen pitoisuuden vuoksi voidaan laitteeseen muodostaa tasainen, kvantitatiivisesti ilmaistava muutos. Tämä muutos, joka voi olla värittymisen tai fluoresenssin muodostuminen tai häviäminen, voidaan ilmaista kvantitatiivisesti säteilynmittausmenetelmien ja haluttaessa automaattisten 20 säteilymittauslaittieden, kuten fotometristen mittauslaitteiden avulla.

Tämän keksinnön mukaista yhtenäistä, analyyttista laitetta valmistettaessa voidaan kerrokset muodostaa etukäteen ja laminoida sitten yhtenäisen laitteen muodostamiseksi.

25 Tällä tavalla valmistetut kerrokset ovat tavallisesti päällystämällä muodostettuja liuoksesta tai dispersiosta pinnalle, jolta kuivunut kerros voidaan poistaa fysikaalisesti vetämällä. Kuitenkin sopiva menetelmä, jonka avulla voidaan välttyä moninkertaisilta irrotus- ja laminointivaiheilta, 30 on levittää ensimmäinen kerros irrotuspinnalle tai haluttaessa tukialustalle ja levittää sitten peräkkäiset kerrokset suoraan aikaisemmin levitetyille. Tällainen levitys voidaan suorittaa käsin, teräpäällystyslaitetta tai -konetta käyttäen tai käyttäen kasto- tai peittopäällystysmenetelmiä.

35 Jos käytetään koneellista päällystysmenetelmiä, on usein mahdollista levittää vierekkäiset kerrokset samanaikaisesti 8 74817 käyttäen syöttösuppilomenetelmiä, jotka ovat hyvin tunnettuja valonherkkien valokuvausfilmien ja -papereiden valmistuksessa .

Kalvopolymeerikerrokset voidaan muodostaa alustalle 5 liuottamalla polymeeriä kahden nesteen seokseen, joista toisen kiehumispiste on alempi ja joka liuottaa polymeeriä hyvin ja joista toisen kiehumispiste on korkeampi ja joka ei liuota tai liuottaa korkeintaan heikosti polymeeriä. Tätä polymeeriliuosta levitetään sitten alustalle ja kuiva-10 taan valvotuissa olosuhteissa. Alemman kiehumispisteen omaava liuotin haihtuu helpommin ja päällysteeseen rikastuu siten nestettä, joka on heikko liuotin tai joka ei liuota lainkaan. Haihtumisen jatkuessa sopivissa olosuhteissa, muodostaa polymeeri huokoisen kerroksen. Useita erilaisia 15 polymeerejä voidaan käyttää, yksittäin tai yhdistettyinä, huokoisten kalvopolymeerikerrosten valmistamiseksi tässä keksinnössä käytettäviksi. Tyypillisiin esimerkkeihin kuuluvat polykarbonaatit, polyamidit, polyuretaanit ja selluloo-saesterit, kuten selluloosa-asetaatti. Ionoforia tai ilmais-20 tavaa ionilajia sisältäviä kerroksia varten voidaan valmistaa liuos tai dispersio, joka sisältää sideaineen ja johon on lisätty aktiiviset materiaalit, levittää sitä tässä esitetyllä tavalla ja kuivata se dimensionaalisesti stabiilin kerroksen muodostamiseksi.

25 Jokaisen kerroksen paksuutta ja sen läpäisykykyä voi daan vaihdella laajasti ja todellisesta käytöstä riippuen. Välillä noin 5-100 mikrometriä oleva paksuus kuivana on sopiva, vaikka vieläkin suurempi paksuusvaihtelu voi olla edullista määrätyissä tapauksissa. Jos esimerkiksi vaaditaan 30 verrattain suuri määrä vuorovaikuttavaa materiaalia, esimerkiksi polymeerisiä materiaaleja, kuten entsyymejä, voi olla edullista käyttää hieman paksumpia kerroksia.

Voi myös olla edullista lisätä laitteeseen yksi tai useampia heijastavia kerroksia, jotka haluttaessa absorboi-35 vat ilmaistavaa säteilyä niin, että helpotetaan tuloksen ilmaisua hejiastussäteilymittauksen avulla, esimerkiksi hei- 7481 7 9 jastusfotometristä tai vastaavaa menettelyä käyttäen. Tällainen heijastus voidaan muodostaa yhden edellä esitetyn kerroksen avulla tai se voidaan muodostaa lisäkerroksen avulla, jolla ei ole muuta toimintaa laitteessa. Pigmentte-5 jä, kuten titaanidioksidia ja bariumsulfaattia, jotka ovat heijastavia, voidaan edullisesti käyttää heijastavassa kerroksessa. Kalvopolymeerit voivat myös muodostaa sopivan heijastavan materiaalin. Erään suositeltavan tavan mukaan voi kalvon muodostavaa polymeeriä olevaan kerrokseen sisäl-10 tyä pigmenttiä heijastuskyvyn tai muun toiminnan parantamiseksi. Pigmentin määrä, joka voidaan lisätä kerrokseen yhdessä kalvonmuodostavan polymeerin kanssa, vaihtelee suuresti ja noin 1-10 paino-osaa olevat määrät pigmenttiä yhtä osaa kohti kalvonmuodostavaa polymeeriä ovat suositel-15 tavia ja kaikkein edullisin on noin 3-6 paino-osaa pigmenttiä yhtä paino-osaa kohti kalvonmuodostavaa polymeeriä.

Voi olla edullista lisätä laitteen kerroksiin yhtä tai useampaa pinta-aktiivista materiaalia, kuten anionista tai ei-anionista pinta-aktiivista materiaalia. Ne voivat 20 esimerkiksi parantaa kalvovalmisteiden päällystettävyyttä sekä kerrosten kostuvuuden määrää ja aluetta, joita neste-näytteet eivät helposti kostutailman avustavan aineen, kuten pinta-aktiivisen aineen käyttöä. Laitteen kerroksiin voi olla edullista lisätä myös materiaaleja, jotka tekevät 25 valitussa analyysissä epäaktiiviseksi kemiallisen reaktion vaikutuksesta tai muutoin materiaalit, jotka saattavat vaikuttaa haitallisesti näissä analyyseissä.

Kuten edellä on mainittu, yhtenäinen analyyttinen laite voi olla itsetukeva tai se voi olla levitetty tukialus-30 talle. Sopiviin tukimateriaaleihin kuuluvat paperi ja poly-olefiinilla päällystetty paperi sekä lukuisat polymeerimateriaalit , kuten selluloosa-asetaatti, polyetyleeniterefta-laatti, polykarbonaatit ja polyvinyyliyhdistet, kuten poly-styreenit jne. Tukialusta voi olla läpinäkymätön tai se voi 35 läpäistä valoa tai muuta energiaa. Kuhunkin määrättyyn tarkoitukseen valitun tukialustan täytyy olla yhteensopiva tu- 10 7481 7 losten ilmaisuun käytetyn tavan kanssa. Suositeltaviin tuki-alustoihin kuuluvat läpinäkyvät tukimateriaalit, jotka pystyvät läpäisemään sähkömagneettista säteilyä aallonpituudella noin 200-900 nanometriä. Tukialustan ei luonnollises-5 tikaan tarvitse läpäistä koko 200-900 nm aluetta, vaikkakin analyyttisten tulosten fluorometrisessä ilmaisussa on edullista, jos tukialusta läpäisee leveän kaistan tai vaihtoehtoisesti läpäisee ilmaisussa käytettyjen fluoresoivien aineiden absorptio- ja emissiospektrit. Voi myös olla edul-10 lista käyttää tukialustaa, joka läpäisee yhden tai useampia kapeita aallonpituuskaistoja ja joka on läpinäkymätön viereisille aallonpituuskaistoille. Tämä voidaan saada aikaan esimeriksi kyllästämällä tai päällystämällä tukialusta yhdellä tai useammalla väriaineella, joiden absorptio-ominai-15 suudet ovat sopivat.

Kuten voidaan huomata, useita erilaisia laitteita, valitusta analyysistä riippuen, voidaan valmistaa tämän keksinnön avulla. Laitteet voivat olla muodoltaan erilaisia, kuten mielivaltaisen leveyden omaavia pitkänomaisia nauho-20 ja, arkkeja tai pieniä liuskoja. Tässä jälkimmäisessä tapauksessa voi olla edullista päällystää yhteiselle tuki-alustalle yksi tai useampia liuskoja tai kanavia, joissa jokaisessa on haluttaessa erilainen koostumus yhdistetyn laitteen muodostamiseksi, joka soveltuu useiden haluttujen 25 testien suorittamiseen.

Tämän keksinnön mukainen yhtenäinen analyyttinen laite voidaan sovittaa käytettäväksi lukuisten kemiallisten analyysien suorittamiseksi, ei yksinomaan kliinisessä kemiassa, vaan myös kemiallisessa tutkimustyössä ja kemialli-30 siä prosesseja valvovissa laboratorioissa. Ne soveltuvat hyvin käytettäviksi kehon nesteiden, kuten veren, veren seerumin ja virtsan kliinisessä tutkimuksessa, koska tämäntapaisessa työssä suoritetaan usein toistuvia testejä ja testituloksia tarvitaan usein erittäin nopeasti näytteenoton 35 jälkeen. Esimerkiksi veren analyysissä, monikerroksinen laite voidaan sovittaa käytettäväksi kvantitatiivisessa analyy- u 74817 sissä useita veren ionisia aineosia varten, joita mitataan rutiininomaisesti.

Keksinnön mukaisia laitteita käytetään siten, että niille levitetään analysoitava nestemäinen näyte. Tyypilli-5 sessä analyyttisessä menettelyssä, joka voi tapahtua käsin tai automaattisesti, laite otetaan syöttörullalta, liuska-paketista tai muusta säilytyslähteestä ja sijoitetaan siten, että sille voidaan asettaa vapaasti putoava tippa, koske-tustäplä tai muuta muotoa oleva nestenäyte sopivasta annos-10 tuslaitteesta saatuna. Näytteen levittämisen jälkeen ja edullisesti sen jälkeen, kun nestenäyte on siirtynyt koskettamaansa kerrokseen, suoritetaan laitteelle mahdollinen käsittely, kuten kuumennus, kostutus tai vastaava käsittely, joka voi olla suotava halutun testituloksen saamisen nopeut-15 tamiseksi tai helpottamiseksi muuten. Jos käytetään automaattista menettelyä, voi olla myös suotavaa käyttää laitetta, joka suorittaa tehtävänsä useiden sekuntien aikana. Tämä voidaan saada sopivasti aikaan valitsemalla asianmukaisesti eri parametrit, kuten kerroksen paksuus, huokoi-20 sissa kerroksissa olevien onteloiden tilavuus jne.

Kun analyyttinen tulos on saatu ilmaistavana muutoksena, mitataan se tavallisesti siirtämällä laite alueen lävitse, jossa käytetään mittalaitetta heijastavaa, läpäisevää tai fluoresoivaa fotometristä mittausta varten. Täl-25 lainen laite kohdistaa energiasäteen, kuten valoa, eräässä toteutuksessa tukialustan lävitse. Valo heijastuu sitten laitteesta takaisin ilmaisimeen tai kulkee laitteen läpi ilmaisimeen tapauksessa, jossa ilmaistaan läpäisy. Suositeltavassa toteutuksessa analyyttinen tulos ilamistaan 30 alueella, joka on täysin sillä alueella, jolla tulos muodostetaan. Heijastusspektrometrian käyttö voi eräissä tapauksissa olla edullista, koska tällöin tehokkaasti vältytään mahdollisten jäännösten, kuten verisolujen, jotka ovat jääneet laitteen kerrokselle tai kerroksiin, 35 aiheuttamalta optisilta interferensseiltä. Tavanomaisiä fluoresenssispektrometrisiä menetelmiä voidaan myös haluttaessa käyttää. Edelleen veren seerumia tutkit- 12 7481 7 taessa tai jos käytetään välineitä epäsuotavien täysveri-näytejäännösten poistamiseksi, voidaan läpäisymenettelyjä käyttää haluttujen reaktiotuotteiden ilmaisemiseksi ja mittaamiseksi antamalla säteilyenergiavirtauksen, esimerkiksi 5 ultraviolettisäteilyn, näkyvän valon tai infrapunasäteilyn, reagoida laitteen toisella pinnalla ja mittaamalla energia laitteen vastakkaiselta pinnalta. Yleensä alueella noin 200-900 nm olevan sähkömagneettisen säteilyn on havaittu olevan käyttökelpoinen näissä mittauksissa, vaikkakin jo-10 kaista säteilyä, jolle laite on läpäisevä ja joka pystyy mittaamaan laitteen pinnalla muodostuneen tuotteen määrän, voidaan käyttää. Erilaisia kalibrointimenetelmiä voidaan käyttää analyysin valvomiseksi. Esimerkiksi analyytin stand-ardiliuosnäyte voidaan levittää sen alueen viereen, jolle 15 näytetippa sijoitetaan eromittausten käytön sallimiseksi analyysissä.

Seuraavat esimerkit ovat pelkästään esitteleviä eikä niitä ole pidettävä keksintöä rajoittavina. Alan asiantuntijat pystyvät suorittamaan haluamiaan vaihteluita, kor-20 vauksia ja muutoksia.

Esimerkki 1 Tässä esimerkissä esitetyssä kokeessa valmistettiin yhtenäinen analyyttinen laite ja tutkittiin sen kyky määrittää kvantitatiivisesti, heijastumana luettuna, kaliumin 25 määrä nestemäisessä näytteessä.

Kaliumille herkän laitteen valmistuksessa käytetty liuos sisälsi seuraavat aineosat:

Aineosa Määrä Lopullinen pitoisuus _(q/100 ml liuosta) 30 polyvinyylikloridi (PVC) 38,4 mg 3,84 dipentyyliftalaatti (DPP) 129,6 mg 12,96 valinomysiini 4,0 mg 0,4 tetrahydrofuraani (THF) 0,87 ml 89,0 kokonaistilavuus 1,0 ml 100 ml 13 7481 7 1 ml tätä liuosta sijoitettiin läpinäkyvän polyeste-rikalvon (Gel Bond™, Marine Colloids, Inc.) päällystämättömälle pinnalle ja levitettiin 0,254 mm paksuiseksi kerrokseksi tavanomaista levitysterää käyttäen. Scotchpar 7 0 5 GAB 25 kalvoa (3M Corporation) voidaan käyttää Gel Bond

O

kalvon asemesta. Saatiin noin 30 cm suuruinen ala, jonka paksuus oli 25 mikrometriä. Kalvo kuivattiin ilmassa noin 30 minuutin aikana.

Heijastusmittauksia varten polyesterikalvo leikattiin 10 sitten 1 cm levyisiksi liuskoiksi ja päällystämätön pinta sijoitettiin sitten valoa hajottavaa polystyreenitukialus- p taa vastaan (valkoinen Trycite ) kaksipuolisen 3M:n liima-nauhan avulla. Liuskat leikattiin sitten kooltaan 1 x 0,75 cm olevien reaktiivisten elementtien saamiseksi, jotka ποιοι 5 dostuivat kaliumherkästä ionoforikerroksesta polyesterituki-alsutalla, jonka tausta oli valoa sirontavaa.

Testiliuoksen valmistamiseksi kaliumkloridia lisättiin näytteisiin liuoksesta, joka sisälsi 35,6 mmoolia Tris-Cl:ää ja 8,89 mmoolia Erythosin B:tä (pH-arvo 7,2)»kaliumpitoi-20 suuksien 0,133, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,75, 0,9 ja 1,1 mM saamiseksi vastaavasti. Valmistettiin myös liuos, joka ei sisältänyt kaliumia.

Näytteiden analysointi suoritettiin sijoittamalla riittävä määrä testiliuosta nestepuolipallon muodostamisek-25 si laitteelle. Neljän minuutin kuluttua poistettiin neste huuhtelemalla varovasti vedellä ja laite kuivattiin painelemalla varovasti paperivanulla. Pysynyt väriaine määritettiin prosentuaalisena heijastuksena (% R) mitattuna aallonpituudella 530 nm heijastusspektrometrin avulla. Lukemia, 30 jotka saatiin testiliuoksista, jotka sisälsivät 0,2 ja 0,5 mmoolia kaliumioneja, käytettiin spektrometrin kalibroimi-seen.

Tämän analyyttisen menettelyn avulla saadut lukemat olivat prosentuaalisina heijastuksina (% R), jotka muutet-35 tiin Kubelka-Monk-yhtälön ja kalibrointiarvojen avulla ka-liumpitoisuus (K+)-yksiköiksi; lukemat sekä vastaavat havaitut pitoisuudet on esitetty taulukossa 1.

1A 7481 7 14

Taulukko 1

Todellinen Havaittu K+ (rnM)_(% R)_K+ (mM) 0 62,9 0,03 5 0,133 40,5 0,19 0,2 36,2 0,24 0,3 30,7 0,35 0,4 27,1 0,44 0,5 24,9 0,51 10 0,6 23,0 0,58 0,75 19,4 0,76 0,9 18,4 0,83 1,1 15,9 1,02 15 Saadut arvot osoittavat, että yhtenäinen analyytti nen laite antoi kvantitatiivisesti ilmaistavan vasteen ka-liumpitoisuudelle jokaisessa tutkitussa näytteessä. Esimerkki 2 Tässä esimerkissä osoitetaan, että valimysiini-iono-20 foria sisältävä laite on selektiivinen kaliumin suhteen, mutta ei natriumin suhteen, jolloin saadaan differentiaali-testi, tässä kokeessa absorbanssina luettuna, näiden biologisissa nesteissä yleisesti esiintyvien ionien suhteen.

Kaliumspesifinen elementti sisälsi samat aineosat ja 25 oli valmistettu samalla tavalla kuin esimerkissä 1 on esitetty paitsi, että elementtiä ei kiinnitetty heijastavalle tukialustalle.

Testiliuosten valmistamiseksi kaliumkloridia ja nat-riukloridia lisättiin näytteisiin liuoksesta, joka sisälsi 30 5 mmoolia Erythosin B:tä ja 50 mmoolia tris-asetaattia (pH- arvo 7,2) taulukossa 2 esitettyjen kalium- ja natriumpitoisuuksien saamiseksi.

7481 7 15

Taulukko 2

Liuos_K* (mmol)_Na+ (mmol) 1 0 4 2 0 10 5 3 0 20 4 0 50 5 0 100 6 2,2 0 10 Edellä valmistettujen testiliuosten analyysit suori tettiin esimerkissä 1 esitettyä menetelmää käyttäen, paitsi että säilynyt värimäärä mitattiin absorbanssin avulla heijastumisen asemesta ja lukemat otettiin 553 nm aallonpituudella. Jokaisesta pitoisuudesta tehtiin kolme mittaus-15 ta ja niistä laskettiin keskiarvo, joka on esitetty seuraa-vassa.

Analyyttisessä menetelmässä saadut lukemat olivat absorbanssiyksikköinä, jotka muutettiin matemaattisesti kaliumpitoisuuksiksi, (K+)-yksiköiksi, käyttäen ensimmäistä 20 ja viimeistä arvoa kalibrointiarvoina. Nämä lukemat ja vastaavat havaitut pitoisuudet on esitetty taulukossa 3.

Taulukko 3

Todellinen Todellinen Havaittu absorbanssi K+ (mM)_Na+ (mM)_(553 nm) K+ (mM) 25 0 4 0,063 0 0 10 0,062 0 0 20 0,063 0 0 50 0,060 -0,01 0 100 0,057 -0,03 30 2,2 0 0,547 2,2

Saadut arvot osoittavat, että yhtenäinen analyyttinen laite antaa kvantitatiivisesti ilmaistavan vasteen jokaisen tutkitun näytteen spesifiselle kaliumpitoisuudelle natrium-35 ionipitoisuudesta riippumatta.

7481 7 16

Esimerkki 3 Tässä esimerkissä esitetyssä kokeessa vaihdeltiin ioniforikerrosta valmistettaessa käytettyjä pehmentimiä.

Kaliumille spesifistä laitetta valmistettaessa käy-5 tetty liuos sisälsi seuraavat aineosat:

Aineosa Määrä Lopullinen pitoisuus _(q/100 ml liuosta) PVC 40 mg 4 pehmennin 100 mg 10 10 valinomysiini 1,5 mg 0,15 THF 0,9 ml 90 kokonaismäärä 1 ml 100 ml

Pehmentiminä käytettiin tris-2-etyyliheksyylifosfaat-tia (TEP) ja di-2-etyyliheksyylisebasaattia (DHS). Laite 15 valmistettiin esimerkissä 1 esitetyllä tavalla.

Testiliuoksen valmistamiseksi kaliumkloridia lisättiin näytteisiin liuosta, joka sisälsi 40 mM tris-Cl:ää ja 10 mM Erythrosin B:tä (pH-arvo 7,2) 0,2, 0,4, 0,6,0,8 ja 1.1 mM olevien kaliumpitoisuuksien saamiseksi. Yksi näyte 20 valmistettiin ilman kaliumia.

Analyysimenetelmä oli sama kuin esimerkissä 1 paitsi, että aallonpitoisuus mitttauksissa oli 540 nm ja kalibroitaessa käytettiin 0,4 ja 0,8 mM kaliumpitoisuuksia. Kokeet suoritettiin kolmesti ja määrättiin keskiarvo, joka on esi-25 tetty seuraavassa.

Keskimääräiset heijastuslukemat ja niiden perusteella saadut pitoisuudet on esitetty taulukossa 4.

Taulukko 4 _TEP DHS_ 30 Todellinen % R Havaittu % R Havaittu K+ (mM)_K+ (mM)_K* (mM) 0 39,8 -0,23 62,8 0 0,2 33,0 0,18 41,7 0,21 0,4 29,4 0,47 34,1 0,37 35 0,6 27,5 0,67 28,3 0,55 0,8 25,9 0,86 24,4 0,74 1.1 24,3 1,07 20,3 1,02 7481 7 17

Taulukon 4 graafiset esitykset TEP:n ja DHP:n suhteen on esitetty vastaavasti kuvioissa 1 ja 2.

Saadut arvot osoittavat, ett laite, joka sisälsi jompaa kumpaa edellä esitetyistä pehmentimistä, pystyi ilmai-5 semaan kvantitatiivisesti kaliumpitoisuuden näytteessä verrattain tarkasti.

Esimerkki 4 Tässä esimerkissä käytettiin eri väriaineita osoittamaan ilmaistavien ainelajien laajuus, joita voidaan käyttää 10 keksinnössä.

Kaliumspesifinen laite, joka sisälsi samat aineosat kuin esimerkissä 3 valmistettiin samalla tavalla, paitsi että pehmentimenä käytettiin dipentyyliftalaattia.

Testitulos valmistettiin esimerkissä 3 esitetyllä 15 tavalla, paitsi että Erythrosin B:n sijasta liuos sisälsi yhtä seuraavista väriaineista: 2,6-dikloorifenoli-indofeno-li (DCPIP), Orange IV, Phloxine B ja Eosin Y.

Analyysimenetelmä oli sama kuin esimerkissä 3, paitsi että eri väriaineita sisältävät koostumukset luettiin seu-20 raavilla aallonpituuksilla:

Phloxine B: 550 nm Oran IV: 430 nm DCPIP: 680 nm Eosin Y: 550 nm

Heijastuslukemat yhdessä niistä laskettujen kalium-pitoisuuksien kanssa on esitetty taulukossa 5. Todellisten 25 ja havaittujen pitoisuuksien välisten vastaavaisuuksien graafiset esitykset testiliuoksille, jotka sisälsivät seu-raavia väriaineita: Phloxine B, Orange IV, Eosin Y ja DCPIP, on esitetty vastaavasti kuvioissa 3, 4, 5 ja 6.

18 7481 7

*E VD f—I H ro O H

^ to cm tn to <τι σ> ^ ^ ^ ^ v κ 4- o o o o o o c m

•H

tn o W PS r- σ> oo vo m ^ ^ ^ ^ ^ ^ dP O (Ti 00 Γ~ Γ' vo to m in in m S r» h r~ -a· oo >SrHrH'a,LnOOO H ** ** ^ ·* ^ ·»

+ O O O O O rH

in O) « i tp

O G

M (0 X Μ&ι-ισιιηοοοσι 3 O «·»»···»».

rH (#>ΐησν(Ν00^Ο 3 vo "s»1 «a* on ro n (0 E-· S vo o m vo σν cm

B rH rH T}· VO Γ- rH

'w' H k S *k ^ ^

O O O O O rH

a< + i H «

CH

U

Q

Cd n n m o m o cap <ni m in cm o r*

in Π CN (N ΓΗ rH

CQEvovovom^m

—' o cn m vo rH

O) -

3+ O O O O O rH

•H «

X

O

rH

.CCdr-or^n-vorH

n) s k v ^ ^ ^ df> σι m cn h oo m in m m in ίτ

G

<l) C — *rl 2

H E IN d VO CO H

f—1 ' ^ ^ V

Q) O O O O O -H

Tl + O «

En 7481 7 19

Saadut arvot osoittavat, että valmistetut laitteet, jotka sisältävät jotain edellä esitetyistä ilmaistavista ainelajeista, ilmaisevat tehokkaasti kaliumpitoisuuden näytteessä verrattain tarkasti.

5 Esimerkki 5 Tässä esimerkissä osoitetaan, että analyyttisellä laitteella on kvantitatiivinen ja spesifinen vaste kalium-ionille erilaista ionforia (Kryptofix® K 222) käytettäessä.

Kaliumspesifistä laitetta valmistettaessa käytetty 10 liuos sisälsi seuraavat aineosat:

Aineosa Määrä Lopullinen koostumus _(q/100 ml liuosta) PVC 38,40 mg 3,84 DPP 64,80 mg 6,48 15 Kryptofix® K 222 2,40 mg 0,24 THF 0,935 ml 93,50 ml

Kokonaistilavuus 1 ml 100 ml

Laite valmistettiin esimerkissä 1 esitetyn menettelyn mukaan.

20 Testiliuoksen valmistamiseksi kaliumkloridia lisättiin näytteisiin liuosta, joka sisälsi 5 nM Erythrosin B:tä ja 20 nM tris-Cl:ää (pH-arvo 7,3) liuosten saamiseksi, jotka sisälsivät vastaavasti 0, 0,1, 0,3, 1,0, 3,0 ja 30 nM ka-liumioneja. Joukko liuoksia valmistettiin samalla tavalla 25 käyttäen natriumkloridia kaliumkloridin asemesta.

Analyysimenetelmä oli sama kuin esimerkissä 1 mukaan luettuna käytetty aallonpituus, paitsi että kalibrointi-liuokset sisälsivät 0,1 ja 1,0 nM kaliumia. Kokeet suoritettiin kolmesti ja saadut keskiarvot on esitetty seuraavassa. 30 Näiden laitteiden keskimääräiset lukemat ja niistä lasketut pitoisuudet kaliumin ja natriumin suhteen on esitetty taulukossa 6.

7481 7 20 3 4-1 4-1 + m m lo KO oo h fö o o o o o (0 J2 < * v * » > o o o o o (0

X

K m ti· m m m

OP -rf Π Γ0 Tl· H

m m in m m

C

143 o>

G S

O -h s

4* rH ^ H n O O

44 ·—I *.**,«.

G <u + o o o ·—i m h Ό m G O 53 (0 E-t

EH

3 4-1 4-1 2 ••H E t# m

(0 w O <H (N O CM

^ «k V %.

id' + o o o ή m te * r> OS H m r-l i-H «Ti V ^ k K ^ <#> IB O ID m (J\ m in ί n

G

(D

C ~ ·γ4 2 •—1 Ei •H — i-\ m o o Q) ·· - - * 'Ö + o o o <Η m O «

Eh__ 7481 7 21

Sopivaa ionoforia, kuten Kryptofix® K 222, sisältävät laitteet antavat siis spesifisen ja kvantitatiivisen vasteen kaliumionille.

Esimerkki 6 5 Tässä esimerkissä osoitetaan, että analyyttisellä laitteella on spesifinen ja kvantitatiivinen vaste natrium-ionin suhteen käytettäessä Kryptofix^ K 221-ionoforia.

Laite valmistettiin kuten esimerkissä 5, paitsi että käytettiin Kryptofix K 221:tä Kryptofix K 222:n asemesta.

10 Analyysimenettely oli sama kuin esimerkissä 1 käytet ty aallonpituus mukaan luettuna, paitsi että kalibrointi-liuokset sisälsivät 0,1 ja 10,0 mM natriumia. Kokeet suoritettiin kolmesti ja saadut keskiarvot on esitetty seuraa-vassa.

15 Näiden laitteiden keskimääräiset heijastuslukemat ja niistä lasketut pitoisuudet natriumille ja kaliumille testiliuoksissa on esitetty taulukossa 7.

22 7 4 8 1 7 3 ~ 4J 2 -ι-l 6 o οο o >—i •rl ' " i—I i—I r—) r-) Γ0 r8 - * r - - >+' ooooooo

<Ö W

ffi K r-» ro γμ r·» σ\ ** ττ

&> 'f li ^ >T h Ί O

m m m m m m m

C

Φ C —-

I—1 K rH 00 O O

r-H —" ****.%.

d> o o o »h m o o Ό + rH 00 n- O «

Eh

O

* * 3__

rH

3 (0

Eh 3 P 2

-U £ h» O

-iH-^i-HrHTrTfTr m (0 "‘•'VV ^

>+ O O O rH 00 O rH

10 ro rH OH

ffi 2 K '»r-moocNovo

<#> VOlOfNr^OOOCO

m m un rr oo (n -h

G

Φ -v G 2 ή ε

γΗ"- rH 00 o O O O

rH - ^ s v ^

d)+ O O O Ή ro O O

Ό fl rH 00 0 2

Eh 23 7481 7

Sopivaa ionoforia, kuten Kryptofix K 221, sisältävät analyyttiset laitteet omaavat siten kvantitatiivisen ja spesifisen vasteen natriumionille.

Claims (9)

24 7 4 8 1 7

1. Menetelmä määrätyn ionisen anlayytin pitoisuuden määrittämiseksi nestenäytteessä, tunnettu siitä, 5 että menetelmä käsittää yhtenäisen analyyttisen laitteen saattamisen kosketukseen näytteen kanssa ioniseen analyyttiin liittyvän ilmaistavan ionilajin läsnäollessa, jolloin analyyttinen laite käsittää oleellisesti ei-polaarista materiaalia olevan 10 kerroksen, johon on lisätty analyytille spesifistä iono-foria, mahdollisen ylimääräisen näytteen poistamisen analyyttisestä laitteesta, ja ilmaistavan ionilajin sen määrän mittaamisen foto-15 metrisesti, joka on siirtynyt vähintään analyyttisen laitteen pinnan osalle, jolloin siirtynyt määrä ilmaistavaa io-nilajia osoittaa määrätyn ionisen analyytin pitoisuuden näytteessä.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, t u n -20 n e t t u siitä, että kosketus käsittää ioniseen analyyttiin liittyvän ilmaistavan ionilajin lisäämisen nestenäyt-teeseen ja analyyttisen laitteen saattamisen sitten kosketukseen ilmaistavaa ionilajia sisältävän näytteen kanssa.

3. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, t u n -25 n e t t u siitä, että kosketus käsittää analyyttisen laitteen saattamisen kosketukseen näytteen kanssa, jolloin analyyttinen laite käsittää oleellisesti ei-polaarista materiaalia olevan kerroksen, johon on lisätty analyytille spesifistä ionoforia, ja siihen nähden laminaarisesti olevan 30 toisen kerroksen, johon on lisätty ioniseen analyyttiin liittyvää ilmaistavaa ionilajia.

4. Patenttivaatimuksen 3 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että ionoforikerroksessa on kaksi vastakkaista pintaa, jolloin ilmaistavaa ionilajia sisältävä ker- 35 ros on sijoitettu laminaarisesti toiselle näistä pinnoista ja kosketus käsittää kosketuksen suorittamisen toiselle pinnalle . 25 7481 7

5. Patenttivaatimuksen 3 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että ilmaistavaa ionilajia sisältävässä kerroksessa on kaksi vastakkaista pintaa, ionoforikerrok-sen ollessa laminaarisesti kosketuksessa toisen pinnan 5 kanssa ja kosketus suoritetaan toiseen pintaan.

6. Yhtenäinen analyyttinen laite määrätyn ionisen analyytin pitoisuuden määrittämiseksi nestenäytteessä, tunnettu siitä, että laite käsittää oleellisesti ei-polaarista materiaalia olevan kerrok-10 sen, johon on lisätty analyytille spesifistä ionoforia ja sen suhteen laminaarisesti sijoitettuna toisen kerroksen, johon on lisätty ioniseen analyyt-tiin liittyvää ilmaistavaa ionilajia.

7. Patenttivaatimuksen 6 mukainen analyyttinen laite, 15 tunnettu siitä, että ionoforikerroksessa on kaksi vastakkaista pintaa, ilmaistavaa ionilajia sisältävän kerroksen ollessa laminaarisessa kosketuksessa toisen pinnan kanssa ja kosketus suoritetaan toiseen pintaan.

8. Patenttivaatimuksen 6 mukainen analyyttinen laite, 20 tunnettu siitä, että ilmaistavaa ionilajia sisältävässä kerroksessa on kaksi vastakkaista pintaa, jolloin ionoforikerros on laminaarisessa kosketuksessa toisen pinnan kanssa ja kosketus suoritetaan toiseen pintaan.

9. Jonkin patenttivaatimuksista 6-8 mukainen analyyt-25 tinen laite, tunnettu siitä, että ionoforikerroksen oleellisesti ei-polaarinen materiaali on koostumusta, joka sisältää pehmennintä ja ei-polaarista polymeeriä, joka soveltuu antamaan laitteelle dimensionaalisen stabiilisuuden. 26 74 81 7