FI77940C - Testanordning foer bestaemning av joner, foerfarande foer framstaellning av denna och dess anvaendning. - Google Patents

Description

1 77940

Testiväline ionien määrittämiseksi, menetelmä sen valmistamiseksi ja sen käyttö

Keksintö koskee testivälinettä ionin läsnäolon mää-5 rittämiseksi vesipitoisesta testinäytteestä. Keksintö koskee myös menetelmää testivälineen valmistamiseksi ja testi-välineen käyttöä ionien määrittämiseksi. Keksintö mahdollistaa nopean, helpon tavan määrittää tällaisia ioneja, jolloin tulokset ovat määrittäjän käytettävissä välittö-10 mästi sen jälkeen, kun koenäyteliuos on pelkästään saatettu kosketukseen testivälineen tai -laitteen kanssa. Ei tarvita mitään vaikeasti käsiteltävää, kallista elektronista laitteistoa, kute ionispesifisiä elektrodeja, liekkifoto-metreja, atomiabsorptiospektrofotometreja tms. Ei myöskään 15 tarvitse turvautua aikaa vievään märkäkemialliseen tekniikkaan, kuten titraukseen ja muihin laboratioriomenettelyi-hin. Tämä keksintö tekee analyytikolle mahdolliseksi pelkästään saattaa testinäyte kosketukseen suikalevälineen tai vastaavan testivälinemuodon kanssa ja todeta mahdollinen 20 värinmuutos.

Vesiliuoksen ioniväkevyyden määrityksellä on käyttöä lukuisissa tekniikoissa. Vedenpuhdistusalalla kalsiumväke-vyyttä on seurattava tarkoin ionivaihtohartsia olevan ioni-poistajan kyllästysasteen arvioimiseksi. Natrium- ja muiden 25 ionien mittaaminen on tärkeää juomaveden valmistuksessa merellä olevassa laivassa. Kaliumtason mittaus verestä auttaa lääkäriä tautitilojen määrityksessä, jotka johtavat lihasten ärtyvyyteen ja sydänlihaksen toiminnan kiihotusmuutok-siin. Tällaisia tautitiloja ovat vähävirtsaisuus, virtsan-30 erityksen puute, virtsatiehyen tukkeutuminen ja shokista johtuva munuaisvika.

On tarpeetonta sanoa, että nopea, helppo menetelmä ioniväkeyyden määrittämiseksi parantaisi suuresti näiden tekniikoiden tilaa samoin kuin kaikkien muidenkin, joissa 35 tällaiset nopeat, tarkat määritykset olisivat edullisia.

Niinpä esimerkiksi jos lääketieteellisen laboratorion labo- 2 77940 rantti voisi mitata tarkasti seerumin tai koko verinäytteen kalium- tai kalsiumtason muutamassa sekunnissa tai minuutissa, eivät nämä nopeat tulokset vain auttaisi lääkäriä taudinmäärityksessä, vaan myös laboratorion tehokkuus kas-5 vaisi moninkertaiseksi.

Aikaisemmissa menetelmissä liuoksessa olevien ionien määrittämiseksi on käytetty liekkifotometriaa ja ionispe-sifisiä elektrodeja. Tiettyjen yhdisteiden ja seosten käyttö, jotka eristävät selektiivisesti tiettyjä ioneja näyte-10 liuoksesta, on tullut suosituksi ionispesifisissä elektrodeissa. Näillä aineilla, jotka tunnetaan ionoforeina, on kyky selektiivisesti eristää ioneja niiden vastaioneista, mikä aiheuttaa varauksen erottumisen ja vastaavan muutoksen sähkönjohtavuudessa ionoforia sisältävässä faasissa.

15 Ioni/ionofori-ilmiötä kuvaavia ovat ionimääritykset, joissa käytetään hyväksi membraanielektrodeja, neste/neste-ero-tusta ja fluoresenssia.

2.1 Ionispesifiset elektrodit

Kun kaksi liuosta, joilla on erilaiset ioniväkevyy-20 det, erotetaan sähköä johtavalla membraanilla, syntyy säh-köpotentiaali (EMF). Tällaisen systeemin kehittämä EMF on väkevyyden tai ioniaktiivisuuden funktio. Tämä ilmiö ilmaistaan matemaattisesti hyvin tunnetulla Nernst'in yhtälöllä.

25 - _ rt . yici £ nF ln Y2c2 1 2 3 4 5 6 jossa on kyseisen systeemin EMF, F on Faraday'n vakio 2 £23062,4 + 0,003 kaloria (volttiekvivalenttia)“^7, R on 3 kaasuvakio, T on lämpötila °C:ssa ja yja c ovat samassa 4 järjestyksessä tutkittavan ionin aktiivisuuskertoimia ja 5 mooliväkevyyksiä, alaindeksi 1 tarkoittaa liuosta membraa- 6 nin toisella puolella, alaindeksi 2 tarkoittaa liuosta toisella puolella ja n on reaktiossa siirtyneiden elektronien luku- 3 77940 määrä.

Tällaisissa membraanierotuskennoissa membraani voi olla yksinkertainen sintrattu lasisulku, joka sallii pienen mutta mitattavan ionidiffuusioasteen toisesta liuoksesta 5 toiseen. Vaihtoehtoisesti voidaan käyttää huokosvapaata, sähköä johtamatonta kalvoa, kuten polyvinvylikloridia, joka on kyllästetty ionoforilla. Ilman ionoforia kalvo on eristin eikä mitään EMF:ä voida mitata; kun siihen sekoitetaan ionoforia, varautuneita ioneja sitoutuu kallo voon ja pieni, mittava virta voidaan saada kulkemaan.

Koska ionofori on affiniteetiltaan selektiivinen ja sitoo näin ollen vain määrättyjä ioneja, tällaiset kennot ovat ioniselektiivisiä. Mahdollinen mitattava EMF johtuu pelkästään näiden ionien läsnäolosta.

15 Näin ollen kenno kaliumionien (K+) määrittämiseksi voidaan valmistaa käyttäen ionoforia, joka on spesifinen K+ - ionille, esim. valinomysiiniä. Kaliumin läsnäollessa valinomysiini aikaansaa johtavan kulkureitin membraanin poikki sitoen ja kuljettaen K+-ionia, mikä sallii pienen 20 virran kulun. Tarkistusväkevyys K+- ionia asetetaan membraanin toiselle puolelle ja testinäyte toiselle Kehittynyt EMF mitataan ja sitä käytetään tuntemattoman väkevyyden laskemiseen yhtälöstä (1). Koska K+ sitoutuu valinomysiini-membraaniin, johtava kulkureitti avautuu vain K+ -ionille.

25 Tämän vuoksi ainoa kehittynyt EMF on luettavissa pelkästään K :n väkevyysgradientin aiheuttamaksi membraanin poikki.

Membraanin poikki kulkeva virta on niin pieni, että mitään merkittävää K+ -ionia tai vastaionia ei kuljeteta sen läpi. Membraanin sähköinen neutraalisuus ylläpidetään 30 joko vetyionien vastakkaisella virtauksella tai OH -ionien samansuuntaisella virtauksella. Tämä anionivaikutus voi pienentää elektrodin spesifisyyttä aiotun ionin suhteen ja on häiriö, joka on minimoitava.

Päävaikeus tällaisten ioniselektiivisten elektrodien 35 käytössä on ollut tarkkuuden ja reagointinopeuden merkittävä 4 77940 huononeminen ajan mukana» Edelleen pienet ioniväkevvyden muutokset aiheuttavat niin pieniä EMF;n muutoksia, että vaaditun pitkälle kehittynyt volttimittarilaitteisto.

On ollut tunnettua, että tietyllä antibiooteilla, 5 kuten valinomysiinillä on sellainen vaikutus fosfolipi- dikaksikerrosmembraanien (biologiset membraanit) sähköisiin ominaisuuksin, että nämä antibiootit tekevät membraanin sisällä olevat kationit liukoisiksi liikkuvien varautuneiden parien muotoon, aikaansaaden täten "kantoaine"-10 mekanismin, jolla kationit voivat kulkea membraanin eristävän hiilivetysisäosan läpi. Tällaisten kompleksien ainoana tarkoituksena on kuljettaa kompleksin varaus membraanin läpi, siten, että jännite-ero voidaan määrittää membraanin kummallakin puolella olevien liuosten välillä.

15 Sveitsiläisessä patenttihakemuksessa sarjanumero 11428/66, jätetty 9, elokuuta 1966, kuvataan huokoisten membraanien käyttöä, jotka on kyllästetty amino- ja oksi-happojen makrosyklisillä johdannaisilla, ioniherkissä elektrodeissa Materiaaleja, joita käytetään membraanin 20 muodostamiseen, ovat lasisintterit ja muut huokoiset membraanit. Tällaisten elektrodien sanotaan olevan tehokkaita ioniaktiivisuuksien mittauksessa.

Amerikkalaisessa patentissa n:o 405 3381, julkaistu nimillä Hamblen et ai., selostetaan samantapaista tekniikkaa 25 ja käytetään ionispesifistä membraania, jonka läpi ionit kulkevat.

2.2 Neste/neste-erotus

Toinen tunnettu ionoforien sovellutus ionimäärityksessä on neste/neste-erotus. Tässä menettelyssä hydrofobinen 30 ionofori liuotetaan veteen sekoittumattomaan orgaaniseen liuottimeen. Eisenman et ai., Membrane Biol. 1:294-345 (19ι69-1 selostavat kationien selektiivistä uuttoa vesiliuoksista orgaanisiin liuottimiin makrotetralidiaktiini-antibiottien kautta. Tässä tekniikassa vain ravistellaan 35 antibiootteja sisältävää orgaanista liuotinta vesiliuosten 5 77940 kanssa, jotka sisältävät lipidiliukoisten värillisten anionien kationisia suoloja» kuten pikraatteja ja dini-trofenolaatteja. Orgaanisen faasin värin voimakkuus mitataan sitten spektrofotometrisesti osoittamaan, kuin paljon 5 suolaa on uuttunut. Paasisiirtoa ovat myös tutkineet Dix et ai., Angew, Chem. Int. Ed. Engl. 17:857 (1978) ja katsauksia siitä ovat esittäneet Burgermeister et ai., Top. Curr. Chem. 69.:91 (19.771 ; Yu et ai., "Membrane Actice Complexones",

Elsevier, Amsterdam (1974); ja Duncan, "Clacium in Biological 10 Systems", Cambridge University Press (1976).

Sumiyoshi, et ai, Talanta, 24, 763-765 (1977) kuvaavat toista menetelmää, joka on hyödyllinen K -ionin määrittämiseen seerumista. Tässä tekniikassa seerumista poistetaan proteiini trikloorietikkahapolla, inidikaattoriväriä lisä-15 tään ja sitä ravistellaan liuottimen, kuten kloroformin kanssa, joka sisältää valinomysiiniä.

Yhdisteen erottuminen on nopeaa ja tehokasta nesteiden välillä , kuten Eisenman on osoittanut, johtuen ionofori-kantoaiheen ja ionien liikkuvuudesta, mikä sallii siirret-20 tyjen lajien diffundoitua nopeasti pois jakopinnalta.

Tällainen mekanismi on normaalisti mahdoton kiinteässä faasissa johtuen kiinteässä faasissa olevien materiaalien jäykkyydestä, liikkumattomuudesta ja olennaisesti olemattomasta diffuusiosta, 25 2,3 Fluoresoivat anionit

Vielä muussa lähestymistavassa ioniaktiivisuuden mittaamiseksi vesiliukoista käytetään fluoresoivia anioneja.

Feinstein, et ai., Proc, Nat. Acad. Sei, U.S.A., 68, 2037-2041 (19711, Siinä esitetään, että kationi/ionofori-30 kompleksien läsnäolo orgaanisissa liuottimissa on tunnettu, mutta että kompleksin muodostumista puhtaasti vesipitoisissa väliaineissa ei ollut tämän vuoksi todettu. Feinstein, et ai., osoittivat tällaisten kompleksien olemassaolon vedessä käyttämällä fluoresoivia suoloja, l-aniliini-8-naftaleeni-35 sulfonaattia ja 2-p-toluidinyylisulfonaattia.

6 77940

Havaittiin, että ionofori/kationikompleksien vuorovaikutus fluoresoivien väriaineiden kanssa tuotti parantuneen fluoresenssiemission, pidentyneen eliniän ja parantuneen polarisaation ja merkittävän siniseen siirtymisen 5 fluoresessispektrin emissiomaksimeissa. Ionoforin ja fluo-forin vakioväkevyyksillä fluoresenssiemission voimakkuuden havaittiin, olevan kationiväkevyyden funktio.

2.4 Kromoforilla merkitty ionofori

Amerikkalaisessa patentissa n:o 4 367 072 selostetaan 10 ionimääritystä, jossa käytetään hyväksi kromoforimateriaa-liin kovalenttisesti sitoutuneen ionoforin yhteenliittymää. Käytössä yhteenliittymä lisätään nestemäiseen näytteeseen ja värin ilmestymistä liuokseen seurataan spektrofotomet-risesti.

15 Mainittu patentti on rajoitettu liuosmääritykseen ja on osoittautunut, että väriä ei kehity riittävästi, jotta suora visuaalinen toteaminen olisi mahdollinen. Sitäpaitsi kromoforin ja ionoforin välinen stökiömetrinen suhde on kiinteä tällaisessa systeemissä johtuen näiden molekyylien 20 välisestä suorasta sitoutumisesta. Johtuen tästä suorasta sitoutumisesta, on mahdotonta säädellä värin voimakkuutta; inoforin suhde kromoforiin on kiinteä.

2.5 Yhteenveto

Yhteenvetona voidaan todeta, että monia menetelmiä 25 tunnetaan ionien määrittämiseksi liuoksesta. Mittalaite-menetelmiä ovat sellaiset pitkälle kehittyneet tekniikat kuin ionispesifisen potentiometria, liekkifotometria ja atomiabsorptiofotometria. Ionoforien käyttö, jotka selektiivisesti kompleksoituvat spesifisten ionien kanssa, on 30 johtanut neljään päälähestymistapaan: ioniselektiiviset elektrodit, neste/neste-erotus, fluoresenssin voimistaminen ja kromiformerkatut ionoforiyhteenliittymät.

Mikään näistä lähestymistavoista ei kuitenkaan anna määrittäjälle yksinkertaisia, nopeita analyysituloksia 35 saattamalla testinäyteliuos kosketukseen testivälineen tai -laitteen kanssa. Esillä oleva keksintö sitävastoin ei 7 77940 edellytä muuta kuin, että näyte saatetaan kosketukseen kasta- ja luetestisuikaleen tai vastaavan muotoisen välineen kanssa ja todetaan värinmuutos tai muu havaittava reaktio. Lisäksi tämän reaktion astetta voidaan säädellä 5 vaihtelemalla niiden reagenssien stökiömetriaa, jotka sen tuottavat.

Koetulokset, jotka kuvaavat tämän keksinnön eri toteutusmuotojen annos/reaktiomittauksia, esitetään graafisesti kuvissa I-VII. Suoritettuja kokeita kuvataan jäljem-10 pänä esimerkkien yhteydessä.

Esillä oleva keksintö koskee testivälinettä ionin läsnäolon määrittämiseksi vesipitoisesta testinäytteestä. Testivälineelle on tunnusomaista, että se käsittää hydro-fiilisen kantajamatriisin, johon on sisällytetty hydrofo-15 bisen aineen hienojakoisia pallosia, joka aine sisältää io-noforia, joka kykenee muodostamaan kompleksin ionin kanssa, ja ilmaisuainetta, joka yhdessä ionoforin ja ionin kompleksin kanssa saa aikaan havaittavan reaktion. Keksintö koskee myös testivälinettä, jolle on tunnusomaista, että se kä-20 sittää pitkänomaisen alustan, jonka yläpinta on oleellisesti tasomainen, ja edellä kuvatun testivälineen kiinnitettynä alustan tasomaiseen pintaan. Keksintö koskee lisäksi menetelmää edellä kuvatun testivälineen valmistamiseksi. Menetelmälle on tunnusomaista, että muodostetaan ensimmäi-25 nen seos, joka sisältää vettä ja hydrofiilista polymeeriä; muodostetaan toinen seos, joka sisältää hydrofobista ainetta, ionoforia, joka kykenee muodostamaan kompleksin ionin kanssa, ja ilmaisuainetta, joka yhdessä ionoforin ja ionin kompleksin kanssa saa aikaan havaittavan reaktion; yhdis-30 tetään ensimmäinen ja toinen seos toisen seoksen hienojakoisten pallosten stabiilin emulsion muodostamsieksi en-simmäiseen seokseen; päällystetään emulsiolla pitkänomainen alusta, jonka yläpinta on oleellisesti tasomainen; ja haihdutetaan vesi emulsiosta hydrofiilisen kantajamatrii-35 sin muodostamiseksi, johon on sisällytetty toisen seoksen hienojakoisia pallosia, jolloin matriisi kiinnittyy alustan tasomaiseen pintaan.

β 77940

Keksintö koskee myös edellä kuvatun testivälineen käyttöä ionin läsnäolon määrittämiseksi vesipitoisesta testinäytteestä saattamalla testinäyte kosketukseen testi-välineen kanssa ja toteamalla havaittava reaktio.

5 Pitkänomainen alusta voi olla esim. muovikalvo, jonka toiselle tasopinnalle testiväline on kiinnitetty.

Käytössä testinäyte saatetaan kosketukseen testivälineen kanssa. Ionin läsnäolo ja/tai väkevyys määritetään sitten toteamalla syntynyt havaittava reaktio.

10 Keksinnön mukaisella testivälineellä tulokset saa daan nopeasti, riittävän havaittavan reaktion muodostuessa useimmissa tapauksissa ainakin muutamassa minuutissa. Mitään vaikeasti käsiteltävää, kallista testauslaitteistoa ei vaadita. Reaktio voi olla voimakkuudeltaan riittävä suo-15 ran visuaalisen toteamisen mahdollistamiseksi. Lisäksi on havaittu, että väri tai muu testivälineessä syntynyt reaktio on stabiili, joissakin tapauksissa päivien ajan, joten käytettyjä testivälineitä voidaan panna sivuun luettavaksi myöhemmin.

20 5. Määritelmät

Seuraavat määritelmät esitetään tämän keksinnön suo-japiirin selvittämiseksi ja sen formuloinnin ja käytön mahdollistamiseksi.

5.1 Sanonta "ionofori" sisältää molekyylit, jotka kykenevät 25 muodostamaan kompleksin määrätyn ionin kanssa, joissakin tapauksissa sulkien oleellisesti pois muut. Esimerkiksi syklinen polypeptidi, valinomysiini sitoutuu selektiivisesti liuoksessa oleviin kaliumioneihin muodostaen kationisen kompleksin. Sanontaan sisältyvät myös koronandit, kryptan-30 dit ja podandit.

5.2 "Ilmaisuaine" on sellainen, joka kykenee toimimaan yhdessä ionofori/ionikompleksin kanssa aikaansaaden värinmuu-toksen tai muun havaittavan reaktion. Niinpä ilmaisin voi olla ioniväriaine, siten että kun väriaine on ionisoitu- 35 neessa tilassaan, se on vastaioni, ts. varaukseltaan vastakkainen analysoitavalle ionille. Eräitä esimerkkejä näis- 9 77940 tä ovat erytrosiini B, 7-amino-4-trifluorimetyylikumariini ja 2,6-dikloori-indofenolin natriumsuola. Ilmaisin sisältää myös fenolisia yhdisteitä, kuten p-nitrofenolia jotka ovat suhteellisen värittömiä ionisoitumattomassa tilassa, mutta 5 jotka värjäytyvät ionisoituessaan. Ilmaisuaine voi olla myös sellainen, joka voi laukaista havaittavan reaktion yhdessä muiden komponenttien kanssa. Esimerkiksi jodidi-ioni voi aikaansaada havaittavan reaktion toimimalla yhdessä ionofori/ionikompleksin kanssa tärkkelyksen ja hape-10 tusaineen kanssa.

5.3. "Yhteenvaikutuksella" tarkoitetaan mitä tahansa yhteistä toimintaa ilmaisuaineen ja ionofori/ioni kompleksin välillä, joka johtaa havaittavaan reaktioon. Esimerkki ilmaisuaineesta, joka toimii yhdessä kompleksin kanssa on 15 tapaus, jossa kompleksi muuttaa ilmaisimen värittömästä värilliseen tilaan, kuten p-nitrofenolin tapauksessa.

5.4. Sanonnalla "havaittava reaktio" tarkoitetaan tässä parametrin muutosta tai esiintymistä testivälinesysteemis-sä, joka kyetään havaitsemaan joko suoralla toteamisella 20 tai mittalaittein ja joka on funktio spesifisen ionin läsnäolosta vesipitoisessa testinäytteessä. Eräitä havaittavia reaktioita ovat värin, fluoresenssin, reflektanssin, pH:n kemiluminesenssin ja infrapunaspektrien muutos tai esiintyminen.

25 5.5. Sanonnalla "keskikokoinen alkyyli" tarkoitetaan tässä käytettynä alkyyliryhmää, jossa on n. 4-12 hiiliatomia. Se sisältää normaalit ja haarautuneet isomeerit. Se voi olla substituoimaton tai substituoitu edellyttäen ettei tällainen substituointi häiriste tässä vaaditun testiväliaineen 30 tai -laitteen toimintaa sen kyvyssä todeta ioneja.

5.7. "Pseudohalogeenilla" tarkoitetaan atomeja tai atomi-ryhmiä, jotka kiinnittyessään tyydyttämättömään tai ero-maattiseen rengassysteemiin, vaikuttavat rengassysteemin elektrofiilisyyteen tai nukleofiilisyyteen ja/tai joilla 35 on kyky vaikuttaa sähkövarauksen jakautumiseen delokali- saation tai resonanssin kautta samalla tavoin kuin halogee- 10 77940 nit. Niinpä kun halogeeni merkitsee ryhmän VII atomeja, kuten F, Cl, BR ja I, pseudohalogeenit käsittävät sellaisia ryhmiä kuin -CN, -SCN, OCN, -N3, -COR, -COOR, CONHR, -CF3, -CCI3, -NC>2, -SO2CF3, -SO2CH3 ja -SC^CgH^CI^, joissa 5 R on alkyyli- tai aryyliryhmä.

5.8. Sanonta "pallonen" viittaa tässä käytettynä sellaisiin pallon- tai puolipallonmuotoisiin kuuliin ja palloihin tai muun muotoisiin ainehiukkasiin, jollaisia muodostuu kaksi-faasisissa suspensioissa tai emulsioissa. Niinpä kun öljyn 10 suspensio tai emulsio veteen muodostetaan, öljyfaasi (hydrofobinen) esiintyy pallomaisina kokonaisuuksina, joita ympäröi enemmän tai vähemmän jatkuva vesifaasi. Mitä enemmän energiaa syötetään suspensiota muodostettaessa, sitä pienempi on pallosten koko. Niinikään pallojen kokoa voi-15 daan säätää lisäaineilla, kuten pinta-aktiivisilla tai muilla emulgoivilla aineilla.

Sanonnan "pallomainen" merkitykseen sisältyvät myös kiinteän materiaalin hienojakoiset hiukkaset. Niinpä kun hydrofobinen apuaine on huokosvapaa, polaariton materiaali, 20 kuten polymeeri, se voidaan jauhaa tai muulla tavoin jakaa hienoiksi kiinteiksi hiukkasiksi.

5.9. "Hydrofiilisellä" tarkoitetaan sitä aineen ominaisuutta, että sillä on vahva tai huomattava taipumus sitoa tai absorboida vettä. Sanontaan sisältyvät ne materiaalit, 25 joille tapahtuu paisumista tai palautuvien geelien muodostumista veden kanssa tai jotka ovat vedellä kostutettavia tai vettä läpäiseviä tai jotka muodostavat vesiliuoksia.

6. Testiväline

Kyseessä oleva testiväline käsittää neljä perusosaa: 30 hydrofiilisen kantajamatriisin; hydrofobisen aineen hienojakoisia pallosia; ionforia, joka on liitetty pallosiin; ja ilmaisuainetta, joka myös sisältyy pallosiin. Kun vesipitoinen testinäyte sisältää ionia, joka kykenee komplek-soitumaan ionoforin kanssa, ioni pääsee hydrofobisiin pal-35 losiin ja toimii yhdessä ilmaisuaineen kanssa aikaansaaden näin havaittavan reaktion.

n 77940 6.1. Kantajamatriisi

Jotta testiväline aikaansaisi havaittavan reaktion määrätylle ionille, on välttämätöntä, että vesipitoisella testinäytteellä on esteetön pääsy hydrofobisten pallosten 5 ulkopinnalle. Näin ollen kantajamatriisin johon palloset on liitetty, on oltava helposti kostutettavissa vesipitoisilla systeemeillä ts. hydrofiilinen.

Tyypillisiä materiaaleja, joilla on sopiva hydrofii-lisyys, ovat gelatiini, agaroosi, poly(vinyylialkoholi), 10 poly(propyleeni-imiini), karrageeni ja algiinihappo. Nämä ovat vesiliukoisia polymeerejä, joilla kuivassa tilassaan on merkittävä koostuvuus vesipitoisilla väliaineilla.

Muita käytettäväksi sopivia liukenemattomia polymeerimateriaaleja ovat huokoiset aineet, kuten paperi ja muut 15 selluloosasysteemit, sintratut keraamiset sintterit ja vastaavat huokoiset, hydrofiiliset matriisit edellyttäen, että pallosten yhtenäisyys voidaan säilyttää. Niinpä sopiva kantoainematriisi on esimerkiksi papeirn ja gelatiinin yhdistelmä. Tässä tapauksessa suodatinpaperityynyt voidaan 20 kyllästää vesipitoisen gelatiinin ja hydrofobisten pallosten stabiililla emulsiolla. Kuivauksen jälkeen suodatinpa-peri/gelatiinikantoainematriisi kykenee säilyttämään pallosten yhtenäisyyden, kunnes testiväline pannaan aiottuun-käyttöönsä.

25 6.2. Hydrofobinen aine

Keksinnön hydrofobisen aineen päätehtävä on eristää ionofori ja ilmaisuaine vesipitoisesta testinäytteestä.

Näin ollen aine voi olla nestemäinen tai kiinteä aine sikäli kuin sillä on riittävä hydrofobisuus yllä mainitun 30 reagenssien eristämisen saavuttamiseksi testinäytteestä. Lisäksi apuaineen on estettävä pallosen oleellinen ioni-tunkeutuminen ellei ioni kykene muodostamaan kompleksia ionoforin kanssa.

Aineita, jotka ovat hyöydyllisiä hydrofobisina ainei-35 na, ovat nesteet, jotka ovat samanaikaisesti liukenemattomia veteen ja kykenevät liuottamaan ionoforia ja ilmaisu- 12 77940 ainetta riittävästi väkevyydeksi oleellisen reaktion aikaansaamiseksi käytössä. Niiden on oltava suhteellisen haihtumattomia, ts. niiden kiehumispisteen on oltava vähintään n. 150°C. Tyypillisiä nesteitä, jotka sattuvat tä-5 hän luokkaan, ovat triksesyylifosfaatti, 2-nitrofenyyli-okstyylieetteri, 2-nitrofenyylibutyylieetteri, dioktyyli-ftalaatti, tris-2-etyyliheksyylifosfaatti, di-2-etyyli-heksyylisebasaatti ja n-butyyliasetyylirisinolaatti.

öljyjen ja muiden nestemäisten apuaineiden lisäksi 10 on niinikään mahdollista käyttää kiinteiden aineiden hienojakoisia hiukkasia (pallosia) pitämään sisällään ja eristämään inofori ja ilmaisuaine. Niinpä apuaine voi koostua hydrofobisista aineista, kuten orgaanisista polymeereistä, jotka ovat oleellisesti huokosvapaita ja polaarittomia.

15 Näitä ovat polyvinyylifluoridi, polyvinyylikloridi, vinyy-likloridi/vinyyliasetaattikopolymeeri, vinyylikloridi/vi-nyylideenikloridikopolymeeri, vinyylikloridi/vinyyliase-taatti/vinyylialkoholiterpolymeeri, vinyylideenikloridi/ akryylinitriilikopolymeeri ja polyuretaani. Luonnollisesti 20 monet muut polymeerimateriaalit olisivat sopivia käytettäväksi hydrofobisena apuaineena ja tällaisten aineiden tunnistaminen sisältyy hyvin alan taitoihin, kun tämä selostus on esitetty.

6.3. Ionoforit 25 Tämän keksinnön ionforiosa on todella käsite, joka on suojapiiriltään laaja, kuten ko. sanonnan määritelmä kappaleessa 5:1 yllä kuvaa. Se käsittää monihampaisia syklisiä yhdisteitä, jotka sisältävät luovuttaja-atomeja syklisiä ketjuissaan. Tällaiset monihampaiset sykliset yhdis-30 teet voivat olal monosyklisiä tai polysyklisiä. Vaihtoehtoisesti ionofori voi olla avonainen ketju, joka sisältää luovuttaja-atomeja. Niinpä ionoforiosaan sisältyvä mono-sykliset systeemit, jotka ovat ionispesifisiä ja joita kutsutaan koronandeiksi, polysykliset ionispesifiset yhdis-35 teet, jotka tunnetaan kryptandeina; ja avoketjuiset rakenteet, jotka tunnetaan podandeina, jotka kykenevät muodostamaan selektiiviset! komplekseja ionien kanssa.

i3 7 79 4 0 6.3.1. Kronandit

Kronandit ovat monosyklisiä yhdisteitä, jotka sisältävät runsaasti tai niukasti elektroneja ja jotka kykenevät muodostamaan komplekseja määrättyjen kationien ja 5 anionien kanssa johtuen niiden ainutlaatuisista rakenteista. Tähän sanontaan sisältyvät kruunueetterit, joissa monosyk-linen rengas sisältää happea luovuttaja-atomina. Muita ko-ronandeja ovat yhdisteet, jotka sisältävät lajitelman run-saselektronisia atomeja, kuten happea, rikkiä ja typpeä.

10 Johtuen määrättyjen koronandien ainutlaatuisesta koosta ja geometriasta, ne soveltuvat kompleksinmuodostukseen erilaisten ionien kanssa. Kompleksoituessaan näin runsaselek-troniset atomit, kuten hapet kruunueetterissä orientoituvat kohti niukkaelektronista kationia. Ketjun hiiliatomi-15 lohkot osoittavat samanaikaisesti ulospäin ionista. Näin ollen tuloksena oleva ioni/koronandikompleksi on varautunut keskeltä, mutta on hydrofobinen ulkokehältään.

6.3.2. Kryptandit

Kryptandit ovat koronandien polysyklisiä analoogeja.

20 Tästä johtuen niihin kuuluu bisyklisiä ja trisyklisiä moni-hampaisia yhdisteitä. Kryptandeissa luovuttaja-atomien syklinen kokoonpano on avaruudessa kolmiulotteinen vastakohtana koronandin oleellisesti tasomaiselle rakenteelle. Kryptandi kykenee itse asiassa sulkemaan ionin sisälleen 25 kolmiulotteisesti ja tästä johtuen kykenee sitomaan ionin vahvasti muodostaessaan kompleksin. Kuten koronandeissakin luovuttaja-atomit voivat sisältää sellaisia atomeja kuin happea, typpeä ja rikkiä.

6.3.3. Podandit 30 Ionit voivat muodostaa komplekseja myös ei-syklisten yhdisteiden kanssa. Esimerkiksi suoraketju, joka sisältää säännöllisessä järjestyksessä runsaselektronisia atomeja, kuten happea, kykenee liittymään positiivisesti varautuneisiin ioneihin muodostaen komplekseja eikä täysin eri taval-35 la kuin koronandit ja kryptandit. Päärakenne-ero podandien ja kahden muun ionoforin välillä on rakenteen avonaisuus.

14 77940

Niinpä podandit voidaan jakaa edelleen monopodandeihin, dipodandeihin, tripodandeihin jne. Monopodandi on täten yksi ainoa orgaaninen ketju, joka sisältää luovuttaja-atomeja, dipodandissa on kaksi tällaista ketjua yhtynyt silta-5 atomin tai atomiryhmän avulla, joka kykenee erilaisiin ava-ruusorientointeihin, ja tripodandissa on kolme ketjua kiinnittynyt keskusatomiin tai atomien ryhmään.

6.3.4. Erikoisionoforit

Eräitä ionoforeja, jotka on havaittu erityisen hyö-10 dyllisiksi tämän keksinnön yhteydessä, on lueteltu tässä yhdessä kationien kanssa, joiden kanssa ne kykenevät muodostamaan selektiivisesti komplekseja.

Ionofori Kationi

Valinomysiini K+ 15 4,7,13,16,21-pentaoksa-l,10-diatsabisyklo- (8,8,5)trioksaani (kryptofix 221) Na+ 4,7,13,16,21,24-heksaoksal-l,10-diatsabisyklo- (8,8,8)heksakosaani (Kryptofix 222) K+ 4,7,13,18-tetraoksa-l,10-diatsabisyklo(8,5,5)-20 eikosaani (Kryptofix 211) Li+ 12-kruunu-4- Li+ 16-kruunu-5- Na+, K+

18-kruunu-6- K

Dibentso-18-kruunu-6 K+ 25 Disykloheksaani-18-kruunu-6 K+

Kryptofix on yhtiön E. Merck, Darmstadt, Länsi-Saksa rekisteröity tavaramerkki.

6.4. Ilmaisuaine

Kun mielenkiintoisen ionin läsnäolo testiliuoksessa 30 on tiedossa, ilmaisuaine aikaansaa havaittavan reaktion toimimalla yhdessä ionofori/ionikompleksin kanssa. Ilmaisuaineen kokoonpano voi vaihdella yksittäisestä yhdisteestä, kuten väriä kehittävästä vastaionisoituvasta yhdisteestä reaktiivisten lajien seokseen, joka aikaansaa havaitta-35 van tuotteen, kun kompleksin läsnäolo laukaisee niiden reak-tioketjun. Näin ollen voidaan nähdä, että kun mitään ana- is 7794 0 lyytti-ionia ei ole läsnä, ilmaisuaine jää muuttumattomaksi; mitään havaittavaa reaktiota ei todeta. Vaihtoehtoisesti kun määrätty tutkittava ioni on läsnä, kompleksi toimii yhdessä ilmaisuaineen kanssa ja aiheuttaa siinä havaittavan 5 muutoksen tapahtumisen.

Siinä tapauksessa, että ilmaisin on yksittäinen yhdiste, se voi käsittää dissosioituvan yhdisteen siten, että dissosioitumisen tapahduttua muodostuu värillinen io-niyhdiste. Ioni-ilmaisin valitaan tyypillisesti siten, että 10 värillinen ioni on varaukseltaan vastakkainen analyyttiin nähden. Hyödyllinen on myös dissosioituva yhdiste, jossa analyytin vastaioni on fluoresoiva. Esimerkkejä tällaisista kromoforisista ja fluoroforisista ilmaisuaineista ovat dikloorifenoli-indofenoli, fluoreseiini ja sen johdannai-15 set, 8-aniliini-l-naftaleenisulfonihappo, 7-amino-4-tri-fluorimetyylikumariini, Erythorsin B, Orange IV, Phloxine B ja Eosin Y. Aineiden Erythrosin B, Phloxine B ja Eosin Y rakenteet on esitetty teoksessa "Aldrich Handbook of Fine Chemicals". Aldrich Chemical Company, Milwaukee (1983).

20 Yhdisteen Orange IV rakenne on löydettävissä teoksesta "The Merck Index", 9. painos, Merck & Co., Inc. Rahway (1976).

Kun ilmaisuaine koostuu reaktiivisten lajien seoksesta, suuri vapaus on mahdollinen valittaessa aineosien 25 sopiva yhdistelmä. Eräs systeemi voisi olla esimerkiksi jodidi-ioni, tärkkelys ja hapettava aine. Tällaista systeemiä voitaisiin käyttää testivälineessä, jossa hydrofobinen apuaine sisältää (ionoforin lisäksi) tärkkelystä ja ko. hapetinta. Jodidia voitaisiin sitten lisätä testinäyt-30 teeseen. Analyytti-ionin läsnäollessa ioni/ionoforikomplek-sin muodostuminen saisi jodidin liittymään matriisiin, jolloin se muuttuisi vapaaksi jodiksi osoittaen siten positiivista koetta.

Vielä eräs esimerkki reaktiosarjasta, joka on hyödyl-35 linen ilmaisuaineena, on sellainen, johon liitty fenolista peräisin olevan protonin dissosioituminen, joka saisi pari- is 77940 tusreaktion rauodostamaaan värillisen tuotteen. Niinkutsuttu Gibbs'in reaktio on tyypillinen tällainen reaktiosarja, jossa 2,5-sykloheksadieeni-l-oni-2,6-dihalo-4-haloimiini (I) parittuu fenolin (II) kanssa muodostaen värillisen 5 reaktiotuotteen (III).

” XT* -Ho) ^ "XjT

NX OH N

«> (II) /k dll» 15 «n-Hfoj 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 2 Tässä reaktiosarjassa R voi olla mikä tahansa 2-, 3 3-, 5- ja/tai 6-aseman substituentti, joka ei estä koko- 4 naisreaktiosarjaa. Niinpä R on alempi tai keskikokoinen 5 alkyyli- tai aryyliryhmä tai R voi muodostaa kondensoitu- 6 neen rengassysteemin joko 2,3- tai 5,6-asemaan. X on halo- 7 geeni tai pseudohalogeeni ja n on 0-4. Tällaista ilmaisu- 8 ainetta käytettään liittämällä rakenteiden (I) ja (II) yh 9 disteitä hydrofobiseen apuaineeseen.

10

Vielä erääseen Gibbsin kemian hyväksikäyttöön liit- 11 tyy yhdisteet, joilla on ionisoitumattomassa muodossaan 12 kaavan (III) rakenne. Ioni/ionoforikompleksin muodostus 13 johtaa sellaiseen yhteisvaikutukseen, että ilmaisuaine 14 (III) tuottaa havaittavan värin itsessään. Tämän ilmiön 15 voidaan ajatella tapahtuvan seuraavan reaktiosarjän ja re- 16 sonanssirakenteiden mukaisesti.

1’ 7 79 4 0 0,1 o HÖ) vÄ

x x X X

0 OH

- H +

V

•-φ "--A

1 T

.A Λ,

0 A I X

0' is 7 7.9 4 0 joissa H ollen sama tai eri ryhmä, on alempi tai keskikokoinen alkvyli-, arvyli- tai kondensoitunut rengas-systeemi 2,3- tai 5,6-asemassa ja n on 0-4. Erityisen edullinen on yhdiste, jolla on rakenne jossa RJ on H 5 tai alempi alkyyliryhmä, Tapauksen, jossa R' on metyyli-ryhmä, on havaittu olevan erityisen sopivan tälle keksinnölle.

Vielä muu edullinen ilmaisuaine on yhdiste, jolla on rakenne

10 OH

ά 20 ° - ' jossa R on keskikokoinen alkyyliryhmä, ts. ryhmä, jossa on 4-12 hiiliatomia ja jossa R' on sama kuin yllä määriteltiin. Tämän tapaisten yhdisteiden on havaittu kestävän 25 erityisesti mahdollista häiriötä, joka johtuu seerumialbu-miinin läsnäolosta testinäytteessä. Näistä ilmaisuaineiden tyypeistä edullinen on se, jossa R on n-desyyliryhmä ja R' on metyyliryhmä, 7. Alusta 30 Yllä kuvattu testiväline voi olla kiinnitetty alusta- osan toiseen päähän alustan toisen pään toimiessa käden-sijana. Tällaista testilaitetta voidaan pitää kiinni kä-densijapäästä, kun taas testivälineen sisältävä toinen pää saatetaan kosketukseen testinäytteen kanssa.

*: 35 Sopivia alustamateriaaleja ovat muovien tai polymee- is 779 40 rien erilaiset kalvot. Esimerkkejä ovat sellaiset polymeerimateriaalit kuin selluloosa-asetaatti, polyetyleenite-reftalaatti, polykarbonaatit ja polystyreeni. Alusta voi olla läpikuultamaton tai se voi läpäistä valoa tai muuta 5 energiaa. Edullisia alustamateriaaleja ovat läpikuultavat materiaalit, jotka kykenevät läpäisemään sähkömagneettista säteilyä, jonka aallonpituus on välillä n. 200-900 nanomet-riä (nm). Alustan ei luonnollisestikaan tarvitse läpäistä koko 200-900 nm:n alueella, vaikka analyyttisten tulosten 10 fluorometrista toteamista varten on toivottavaa, että alusta on läpinäkyvä laajemmassa tai ainakin yhtä leveällä kaistalla kuin toteamiseen käytettyjen fluoresoivien materiaalien absorptio- ja emissiospektrit ovat. Saattaa myös olla toivottavaa käyttää alustamateriaalia, joka läpäisee 15 yhtä tai useampaa kapeaa aallonpituuskaistaa ja on läpikuultamaton vierekkäisille aallonpituuskaistoille. Tämä voitaisiin toteuttaa esimerkiksi kyllästämällä tai päällystämällä alustamateriaali yhdellä tai useammalla värjäys-aineella, jolla on sopivat absorptio-ominaisuudet.

20 Testiväline voidaan kiinnittää millä tahansa keinolla, joka sopii yhteen aiotun käytön kanssa. Eräs menetelmä on käyttää kaksipuolista liimateippiä testivälineneliön ja alustan välissä. Eräs tällainen teippi tunnetaan nimellä Double Stick© jota myy 3M Company. Toinen tapa kiinnittää 25 testiväline on valaa kalvo vesipitoisen polymeerifaasin (ts. hydrofiilinen kantoainematriisi) ja hydrofobisen apuaineen emulsiosta, joka apuaine sisältää ionoforia ja ilmaisuainetta, suoraan tukiaineelle, mitä seuraa kuivaus-vaihe .

30 8. Tämän keksinnön hyväksikäyttö Tämän keksinnön testiväline ja -laite voidaan sovittaa käytettäväksi useiden eri kemiallisten analyysien suorittamiseen, ei vain kliinisen kemian alalla, vaan kemiallisissa tutkimus- ja kemiallisissa prosessinvalvontalabo-35 ratorioissa. Ne sopivat hyvin käytettäväksi ruumiin nesteiden, kuten veren, veriseerumin ja virtsan kliinisessä 20 77940 testauksessa, sillä tässä työssä suoritetaan usein suuri joukko toistuvia kokeita ja koetuloksia tarvitaan usein hyvin lyhyessä ajassa näytteenoton jälkeen. Esimerkiksi verianalyysin alueella keksintöä voidaan soveltaa käytet-5 täväksi kvantitatiivisen analyysin suorittamiseen monille kliinisesti mielenkiintoisille veren ionikomponenteille.

Testivälinettä (ja testilaitetta) käytetään saattamalla se kosketukseen testinäytteen kanssa riittävän pitkäksi ajaksi (kuten muutamiksi minuuteiksi). Sen jälkeen 10 ylimääräinen näyte voidaan poistaa esimerkiksi pesemällä hitaassa vesivirrassa ja sen jälkeen painelemalla imupape-rilla tai pelkästään pyyhkimällä se pois. Vaihtoehtoisesti saattaa olla tarpeetonta poistaa näyte.

Jos analysoitavaa ionia on läsnä testinäytteessä io-15 noforin ja ionin kompleksi toimivat yhdessä ilmaisuaineen kanssa ja havaittava reaktio tulee näkyviin. Kun ilmaisu-aine on dissosioituva aine, joka tuottaa analyytin värillisen vastaionin, todettava väri muodostuu kantoainematrii-sitestivälineeseen. Kun ilmaisuaine on fluorofori, kuten 20 fluoreseiini, voidaan käyttää fluoresenssispektrofotometria mittaamaan testivälineessä muodostunut havaittava reaktio (tätä fluoresenssin esiintyminen tai muutos). Muita havaittavan reaktion toteamisessa hyödyllisiä tekniikoita ovat reflektanssifotometria, absorptiospektrofotometria ja va-25 lonläpäisymittaukset.

Kun testinäyte on veriseerumi, läpäisytekniikkaa : voidaan käyttää minkä tahansa reaktiotuotteen läsnäolon toteamiseen ja paljouden määrittämiseen, jonka tuotteen muodostuminen toimii halvattavana reaktiona. Tässä tapauk-30 sessa säteilyenergiaa, kuten ultravioletti-, näkyvää tai infrapunasäteilyä suunnataan testivälineen toiselle pinnalle ja tämän energian tuotanto vastakkaiselta pinnalta mitataan. Yleensä sähkömagneettinen säteily välillä n. 200-900 nm on havaittu hyödyllisesti tällaisiin mittauk-35 siin, vaikka mitä tahansa säteilyä, joka tunkeutuu testi-välineeseen ja joka kykenee ilmaisemaan reaktion esiintymisen ja määrän, voidaan käyttää.

21 7 7940

Erilaiset kalibrointitekniikat soveltuvat analyysin tarkistukseksi. Esimerkiksi analyytin standardiliuoksen näytettä voidaan levittää erilliselle testivälineelle vertailuna tai tekemään mahdolliseksi erotusmittausten käytön 5 analyysissä.

9. Esimerkit

Seuraavat esimerkit valaisevat keksintöä.

9.1. 7-(n-dekyyli)-2-metyyli-4-(3',5'-dikloorifen-4'-oni)-indonaftolin valmistus 10 Otsikon yhdiste (jäljempänä 7-dekyyli-MEDPIN) valmis tettiin käytettäväksi ilmaisuaineena kyseessä olevassa tes-tiväliaineessa ja testilaitteessa. Reaktion kulku esitetään seuraavassa, jossa R* on n-dekyyliryhmä.

22 77940

A

i O

sf Λ- ¢1 * ox n=u

x z w I

0 X — Ό i° S 8

3s. 4C

/IX oc O ;i t 4

g« 'W

* <8 Q υ»Λ Äfta £3 ä λ

Γ" CWON^O \ X

s YU >° ° < ( χ-ο : Ö 8 Ρ * *« a: 06 23 77940 •|-4

K

CC

λ. »“H

A u Φ· r—( u

fO

X

<_>

O

K ' a: 24 77940 /3 - (p-?-n-dekvylihentsoyyli)_propionihaoon valmistus

Seos, jossa oli 26,2 g fenyylidekaania (1,2 mol), 120. g meripihahappoanhydridiä (1,2 mol) ja 360 mol nitroetaania 5 litraa kolmikaulakolvissa, joka oli 5 varustettu HCl;n ooistoputkella ja mekaanisella sekoittajalla, jäähdytettiin 0°C:en jäähauteella. Tähän seokseen lisättiin 360 g AgCl^ (2,7 mol) hitaasti 1/2 aikana samalla sekoittaen, HCL :n kehittymistä havaittiin, kun noin puolet Aidasta oli lisätty. Lisäyksen jälkeen jäähaude 10 poistettiin ja reaktioseoksen annettiin seistä huoneenlämpötilassa (RT) 5 minuuttia. Seosta lämmitettiin sitten höyryhauteella. Lämmitystä ja sekoittamista jatkettiin, kunnes voimakas HCl:n kehittyminen lakkasi (n. 30 minuuttia). Reaktio jäähdytettiin jäähauteella samalla, kun 2 1 jää-15 vettä ja senjälkeen 600 ml väkevää HCl:a lisättiin. Tätä sekoitettiin huoneenlämpötilassa 2 tuntia, kunnes kaikki tummanruskea kiinteä aine oli hydrolysoitunut. Liukenematon tuote poistettiin suodattamalla. Kiinteä aine kiteytettiin sitten kahdesti uudelleen etikkahaposta (250 ml kummallakin 20 kerralla), jolloin saatiin n. 320 g (85%:n saanto) tuotetta (kuivattu tyhjössä KOH:n yläpuolella). Ohutlevykromato-frafiat Rf 0,43 EtOAc/tolueeni l;l-seos (v/v) (piihappo-geelilevy),

Analyysi: laskemalla kaavasta C20H30°3: C' 75'42; 25 H, 9,50

Kokeellisesti: C, 76,02; H, 9,89 4-(p-n-dekyylifenyyli)voihapon valmistus 20 g Pd/C-katalyyttiä (palladiumilla kyllästetty 30 hiili, jota myy Aldrich Chemical Co., luettelo n:o 20569-9) ja & -(p-n-dekyylibetsoyyli)propionihappoa (150 g, 0,47 mol) sekoitettiin etikkahappoon (350 ml) 1 l:n Paar-pommissa. Reaktio aloitettiin 352 kpajn H2^Paineessa 3a 50°C:ssa. Todettiin nopea lämpötilan nousu, johon liittyi f^-tilavuuden 35 lasku, Reaktioseoksen ohutlevykromatografinen analyysi osoitti täydellistä reaktiota.

25 7 7 9 4 0

Katalyytti poistettiin lasikuitusuodatuksella kuumana, Suodoksen annettiin kiteytyä huoneenlämpötilassa. Kiteinen tuote otettiin talteen suodattamalla. Toinen erä tuotetta, joka muodostui senjälkeen kun suodos oli jäähdytetty, otet-5 tiin myös talteen. Kokonaissaanto oli 100 g (68 %) kuivauksen jälkeen tyhjössä K0H;n yläpuolella. Sulamispiste: 67^69°C.

Ohutlevykromatografia: Rf 0,68 EtDAc/tolueenin 1:1-seoksessa (v/v) 10 (piihappogeelilevv)

Analyysi, laskemalla kaavasta C20H32°2: C' ^8,90; H, 10,50; Kokeellisesti C, 78,39; H, 10,70.

15 7^n<-dekyyli-l-tetralonin valmistus

Seosta, jossa oli p-dekvylifenyylivoihappoa (30 g, 98,7 mmoll ja polyfosforihappoa (150 g) lämmitettiin öljyhau-teella, kunnes kaikki kiinteä aine oli sulanut. Lämmitys nostettiin 150°C:en (sisäinen lämpötila) ja seosta sekoi- 20 tettiin voimakkaasti 30 minuuttia. Reaktio jäähdytettiin Sitten lämpötilaan ja käsiteltiin 300 ml:11a jäävettä ja 150 ml:11a etyylieetteriä. Kun seosta oli sekoitettu 30 minuuttia huoneenlämpötilassa, vesikerros erotettiin ja pestiin kahdesti 150 ml:11a etyylieetteriä. Yhdistetyt or- 25 gaaniset faasit pestiin 150 ml:11a kyllästettyä NaCl:n vesiliuosta. Eetteri poistettiin haihduttamalla ja jäännös tislattiin Kiigelrohr-tislauslaitteella (Aldrich Chemical Co.) .

Tuotteen kiehumispiste oli 190-200°C/0,1 mmHg. Saanto oli 11 g (39 %) vaaleankeltaista öljyä.

30

Ohutlevykromatografia: Rf 0,34 tolueenissa (piihappogeelilevyt):

Analyysi, laskemalla kaavasta C20H30O: C, 83,90: H, 10,70

Kokeellisesti C, 85,63; 35 H, 10,83 26 77940 2-hydroksimetvyli~7-n-dekyyli^l^tetraionin valmistus

Seosta, jossa oli natriummetoksidia (5,4 g, 40,5 mrool) , etyyliformaattia (7,4 g, 100 mmol) ja 100 ml kuivaa tolu-eenia, jäähdytettiin jäähauteella inertissä atmosfäärissä (N2 tai argon)« Liuos, jossa oli 7-dekyyli-l-tetralonia 5 (11,5 g, 40 mmol) 100 ml;ssa kuivaa tolueenia, lisättiin nopeasti sekoittaen, Jäähaude poistettiin ja reaktiota sekoitettiin huoneenlämpötilassa 4 tuntia. Reaktioseosta käsiteltiin 100 ml:11a vettä ja 100 ml:11a 6-N HCl. Orgaaninen kerros erotettiin ja pestiin kahdesti 50 ml:11a kyllästettyä 10 NaCl:a, kuivattiin vedettömällä ^280^:113, suodatettiin ja haihdutettiin kaiken tolueenin poistamiseksi, öljymäistä jäännöstä käytettiin seuraavaan reaktioon enempää puhdistamatta.

Ohutlevykromatografia: Rf = 0,56 tolueenissa (pii-15 happogeelilevyt), täplä muuttui tummanruskeaksi, kun sitä ruiskutettiin 5%;sella FeCl^-liuoksella.

2Hbentsoyyliokslmetyleeni-7-n-dekyyli-l-tetralonin valmistus

Edellisestä reaktiovaiheesta saatu öljymäinen jäännös 20 sekoitettiin kuivaan pyridiiniin (120 ml). Liuosta sekoitettiin typen alaisena 0°C:ssa (jäähaude). Liuosta käsiteltiin 30 ml :11a bentsoyylikloridia. Bentsoyylikloridin lisäyksen jälkeen liukenematonta pyridiniumkloridia havaittiin seoksessa. Reaktiota hämmennettiin huoneenlämpötilassa 25 kaksi tuntia. Tuote kaadettiin jääveteen (40 ml) voimakkaasti hämmentäen. Vaalean kerman värinen kiinteä aine otettiin talteen suodattamalla ja pestiin hyvin kylmällä vedellä. Hieman kostea kiinteä aine kiteytettiin uudelleen kuumasta absoluuttisesta etanolista (120 mil. Valkeaa kiinteää ainetta (14 g, 30 87 %;n saalis laskettuna 7-dekyyli-l-tetraloniksi) saatiin talteen. Sulamispiste oli 64-66°C.

Ohutlevykromatografia: Rf = 0,40 tolueenissa (pii-dioksidigeelilevyt)

Analyysi, laskemalla kaavasta C28H34°3 : C' 80 *34 35 H, 8,19 27 7 7 9 4 0

Kokeellisesti; Cf 80,05 H, 8,27 7-n-dekyyli^2-rmetvyli^l^naftolin valmistus

Seokseen, jossa oli 2*'bentsoyylioksimetvleeni-7-n-dekyyli-l-tetralonia (14 g, 33,5 mmol) ja Pd/C-katalyyt-5 txä (3,5 gl inertissä atmosfäärissä, lisättiin syklohek-seeniä (175 mli , Seosta kuumennettiin refluksoiden samalla, kun sitä pidettiin inertissä atmosfäärissä. Lähtöaineen muuttuminen tuotteeksi määritettiin ohutlevykromatografi-sesti 3 tunnin kuluttua. Kun kaikki lähtöaine oli reagoinit, 10 seos jäähdytettiin huoneenlämpötilaan. Katalyytti poistettiin suodattamalla ja pestiin kahdesti 50 ml;11a kuumaa tolueenla. Yhdistetty suodos haihdutettiin pieneen tilavuuteen, Tuote puhdistettiin Prep-500-piidioksidigeeli-kolonnilla (korkeapaineinen piidioksidivalmistuskolonni,

15 valmistaja Waters Association, Milford MA). Tolueenla käytettiin liikkuvana faasina. Tuotejakeet koottiin yhteen ja haihdutettiin tyhjössä kuiviin yli yön. Kermanvalkoinen kiinteä aine (9,0 g, 90%:n saalis) saatiin talteen. Sulamispiste oli 65-67°C

2Q Ohutlevykromatografia: Rf = 0,65 tolueenissa (pii- dioksidigeelilevytl. Kehittyi vaaleanpunainen väri, kun tuotteen täplää säteilytettiln lyhyellä UV-valolla.

Analyysi, laskemalla kaavasta C21H30O: C’ ®4'^1; H, 10,13 25 Kokeellisesti: C, 84,49 H, 10,72 7^(n-dekyyli),^2-metyyli-4-(31,51-dikloorifen-4 ’-oni) jndonaftolin valmistus 7T-dekyyli-2-r5netyyli-l-naftolia (4,5 g, 15,1 mmol) ja 30 2r6-dikloorikinoni-4-kloori^imidiä (3,0 g, 14,3 mmol) liuo tettiin asetoniin (150 ml). Liuosta käsiteltiin 700 ml :11a kaliumkarbonaattiliuosta (0,1-M, pH=10,O). Liuosta hämmennettiin voimakkaasti huoneenlämpötilassa 10 minuutin ajan.

28 77940

Reaktioseoksen pH säädettiin arvoon 2,8 HCl;lla (1,0-N).

Seosta hämmennettiin 15 minuuttia. Punainen kiinteä aine otettiin talteen suodattamalla ja pestiin hyvin vedellä.

Kiinteä aine liuotettiin tolueeniin ja suodatettiin lasi-kuitupaperilla mahdollisten liukenemattomien materiaalien 5 poistamiseksi. Suodos väkevöitiin ja puhdistettiin Prep-500-piidioksidigeelikolonnilla käyttäen tolueenia liikkuvana faasina. Tuotejakeet koottiin yhteen ja haihdutettiin kuiviin, Jäännös kiteytettiin n-heksaanista (100 ml), jolloin saatiin tuotetta (3,9 g, 58%:n saalis).

10 Ohutlevykromatografia: Rf 0,26 tolueenissa (pii- dioksidigeelilevvt),Ruskeanvärinen täplä muuttui purppuran-siniseksi, kun sitä oli käsitelty 0,1-N NaOH:lla levyjen pinnalla.

Analyysi, laskemalla kaavasta 15 C27H31N02C12: C, 68,64; H, 6,57; N, 2,97

Kokeellisesti: C, 68,88; H, 6,85; N, 2,97.

9,2, Gelatiini hvdrofiilisena kantajamatriisina

Suoritetiin sarja kokeita tämän keksinnön testivälineen ja ^laitteen valmistamiseksi ja arvostelemiseksi, jossa 20 gelatiinia käytettiin hydrofiilisena kantajamatriisina.

9,2,1. Hydrofobisen apuaineen liuos, joka sisälsi iono- foria ja ilmaisuainetta, valmistettiin lisäämällä 68 mg valinomysiiniä, joka oli saatu Sigma Chemical Co. -yhtiöltä, ja 29 mg 7-m-dekyyli-MEDPIN:ä 4,27 grammaan o-nitrofenvyli-25 oktvylieetteriä lämmittäen, kunnes saatiin liuos. Puskuroitu gelatiiniliuos valmistettiin käyttäen 3,13 g tyyppiä I olevaa gelatiinia (Sigma Chemical Co.), jota oli dialvsoitu 10°C;ssa ioniepäpuhtauksien poistamiseksi, ja 20,8 g ioni-vaihdettua vettä. Tähän lisättiin 0,25 ml puskuria, joka 30 oli valmistettu säätämällä l^M Trizma-emäs (Sigma Chemical Co.) pH^arvoon 8 HCl;lla (Baker! ja sitten pH-arvoon 5 etikkahapolla (Baker).

öljy- ja gelatiiniliuokset sekoitettiin ja asetettiin Waring-'sekoittimen (Fisher Scentific) 12-37 ml:n mininäyte-35 astiaan ja sekoitettiin 2 minuuttia suurella nopeudella.

29 7794 0

Senjälkeen, kun kuplien oli annettu nousta 15-30 minuuttia 45°C;ssa, emulsio levitettiin polyesterikalvo-tuelle, jota oli esikäsitelty gelatiinin vastaanottamiseksi (40 GAB 2S, 3M Co.l, Of171 mm;n paksuuteen 5 (^75 Meyer Rod. RDS Co,, Webster N.Y.) , Kalvo ilmakuivat- tiin, minkä jälkeen 5,1 x 10,2 mm:n palaset kiinnitettiin polystyreenikalvotukikädensijaan käyttäen kaksipuolista liimateippiä (Double Stick, 3M Co), testilaitteiden muodostamiseksi .

10 Valmistettiin testinäytteet, jotka sisälsivät O, 0,2, 0,4 0,6, 0,8 ja 1,1 mM KC1, 100 mM tris -Cl, pH 8,5.

Nämä väkevyydet vastaavat niitä, joita tavataan 9-kertaisesti laimennetussa plasmassa. 30^ul:n (mikrolitraa) näytetippa asetettiin testilaitteen reagenssiosalle ja haudottiin 15 37°C?ssa Seralyzer® (Ames Division, Miles Laboratories,

Inc,, I-reflektanssispektrofotometrissa 2,5 minuttia, jolloin reflektanssi aallonpituudella 640 nm (manometri) mitattiin, Reflektanssitulokset on lueteltu alla: 20 K+ (mMl (K/S) 2 0 0,1140 0,2 1,2839 0,4 2,2822 0,6 3,3909 25 0,8 4,6256 1,1 5,9271 2 (K/SJ määritellään seuraavasti (K/SI2 = (l-R]4 30 jossa R on testitlaitteesta johtuva reflektanssin osa. K on vakio ja S on kyseessä olevan heijastavan väliaineen valon-sirontakerroin. Yllä oleva yhtälö on yksinkertaistettu 25 muoto hyvin tunnetusta Kubelka-Munk-yhtälöstä (Kts. Gustav 30 7 7 9 4 0

Kortum, "Reflectance Spectroscopy" , siyut 106-111,

Springer Verlagf New York (1969).,

Yllä olevat tulokset on piirretty kuvaan I ja se osoittaa, että kaliumväkevyys vastaa lineaarisesti lause- 2 5 kettä (K/SI , Lisäksi tulokset osoittavat, että eri väkevyydet voidaan mitata tarkasti.

9,^2,2., Esimerkin 9.2,1 koe toistettiin käyttäen 2-me-tyylir^-O1,5J-dikloorifen-4,-oni)indonaftolia (MEDPIN) n-dekyylisubstituoidun molekyylin sijasta ilmaisuaineena.

10 Näin ollen valmistettiin liuos, joka sisälsi 6,7 mg/ml valinomysiiniä ja 1,67 mg/ml MEDPIN:ä o-nitrofenyylioktyyli-eetterissä. Vesipitoinen gelatiiniemulsio valmistettiin kuten esimerkissä 9.2.1, siten, että emulsio sisälsi 12 % eetteriliuosta ja 7% gelatiinia. Emulsiokalvo, jonka märkä-15 paksuus oli 5,1 mm, valettiin kaavinterällä polyesteri- tuelle, kuivattiin ja kiinnitettiin polystyreenikalvosuika-leisiin.

Valmistettiin KCl-näytteitä ja testilaitteet arvosteltiin kuten esimerkissä 9.2.1. Alla luetellut reflektanssi-20 tulokset on esitetty graafisesti kuvassa II.

K+(mMl (K/S)2 O 0,2048 0,2 1,4945 25 0,6 5,3038 1,1 8,4158

Tulokset ja niistä piirretty käyrä soittavat zine- +" ~ 2 aarista korrelaatiota K -väkevyyden ja (K/S) :n välillä.

9-,2,3, Esimerkin 9,2,1, koe toistettiin paitsi, että 3Q 3·^ (n-pentalkyyliJ -3', 51 -dikloorifen-4 1 -oni-indofenolia (DIPl käytettiin ilmaisuaineena 7-n-dekyyli-MEDPIN:in sijasta, DIP oli valmistettu 3-n-pentadekyylifenolista ja 2,6-cdikloorikinoni-4-kloori-imidistä (DQCl) . Ekvimolaariset 35 määrät näitä yhdisteitä yhdistettiin asetonissa kummankin 3i 77940 n 100 mN teoreettisen väkevyyden saavuttamiseksi. Jokaiseen millilitraan liuosta lisättiin 6 ml puskuria (pH =101. Puskuri oli 100 mM 3—(sykloheksyyliamino)propaanisulfoni-happo vedessä. Saatu liuos säädettiin pH-arvoon 2,6 1-N 5 HCljlla, Seos sentrifugoitiin ja sakka kuivattiin tvppi-atroosfäärissä.

Vesipitoinen gelatiiniemulsio valmistettiin kuten kohdassa 9.2.1. yllä, mutta niin, että se sisälsi 9,66 p-% gelatiinia ja 12,6 p-% NPOE. öljyyn oli liuotettu valino-10 mysiiniä (15 mM) ja DIP:ä (25 mM) :

Testilaitteen arvostelusta saadut tulokset on lueteltu alla ja esitetty graafisesti kuvassa III.

K+ (mM) (K/S)2 15 0 0,8409 0,2 1,0858 0,6 1,5302 1,1 2,0794 20

Tulokset ja niistä piirretty käyrä osoittavat line- + 2 aarista riippuvuutta K -väkevyyden ja lausekkeen (K/S) välillä.

9,3. Agaroosi hydrofiilisenä kantajamatriisina 25

Suoritettiin sarja kokeita, joissa tämän keksinnön testiväline ja -laite valmistettiin käyttäen agaroosia hydrofiilisenä kantajamatriisina.

9,3.1. Valmistettiin testilaite, jossa hydrofiilinen 30 apuaine oli 2-nitrofenyylioktyylieetteriä (NPOE).

Valmistettiin liuos liuottamalla 18,6 g valinomysiiniä ja 10,4 mg 7-n-dekyyli-MEDPIN:ä 1,52 ml:an NPOE lämmittäen, ' kunnes liukeneminen tapahtui. Valmistettiin toinen liuos, joka sisälsi 1,2 g agaroosia 40 ml:ssa tislattua vettä 35 6Q°C*ssa, Tähän liuokseen lisättiin 760^,ul (mikrolitra) 32 7 7 9 4 0

Zwittergent 3-lQ-valmisteen, jota myy Calbiochero^Behring Corp., LaJolla, Ch, 1 mg/ml vesiliuosta. Zwittergent on kaupallinen nimi N-dekyyli—N,N-dimetyyli-3-ammonio-l-pro-paanisulfonihapolle.

Nämä liuokset eroulgoitiin vetoisuudeltaan 12-37 ml:n 5 War±ng-sekoittimen kupissa pika-asetuksella.- Saatu emulsio kaadettiin 50 ml;n dekantterilasiin ja asetettiin tyhjöön 15 sekunniksi loukkuun jääneen ilman poistamiseksi. Seuraavaksi emulsio valettiin 1,27 mm:n (märkä paksuus) kalvoksi Bruning Drafting-kalvolle käyttäen kaavinterää.

10 kun kalvoa oli kuivattu huoneenlämpötilassa 16 tuntia, kuivattu emulsio leikattiin 5,1 x 10,2 mm:n suorakulmioiksi ja kiinnitettiin polystyreenikalvoliuskalle kuten esimerkissä 9,2.1.

Testilaitteen arvostelemiseksi valmistettiin eri 15 väkevyyksinä KCl:n vesiliuoksia. Nämä liuokset puskuroitiin pK-arvoon 8,5 Tris. HCl-puskurilla. Nämä liuokset analysoitiin kuten edellisissä esimerkeissä SERALYZER-ref- 2 lektanssi.fotometrilla ja (K/S) -arvot on rekisteröity seuraavaan taulukkoon.

20 K+ (mM) (K/S)2 O 0,0696 0,05 0,5313 0,10 0,7026 25 0,15 1,0242 0,20 1,4149

Tulokset on piirretty graafisesti kuvaan IV, joka osoit- 2 taa lineaarista riippuvuutta kaliumväkevyyden ja (K/S) :n 30 välillä. Tämä riippuvuus tekee mahdolliseksi erottamisen reflektanssimittauksin eri K+-väkevyystasojen välillä.

9.3.2. Valinomysiiniä (12,8 mgl ja 7-n-dekyyli-MEDPIN:ä (5,4 mg! liuotettiin 760yul:an 2-nitrofenyylibutvylieetteriä lämmittäen. Toinen liuos valmistettiin lisäämällä 600 mg 35 matalan geelittymislämpötilan agaroosia (Marine Colloids 33 77940

Division of FMC Corp.l 20 ml;an tislattua vettä. Tähän vesiliuokseen lisättiin 38^-ul Zwittergent 3-16;n (N-heksa-dekyyli-NjN^imetyyli-Z-ammonio-l-propaanisulfonihappo, valmistaja Calbiochem-Behring) 10 mg/ml vesiliuosta.

5 Agaroosi- ja 2-nitrofenyylibutyylieetteriliuokset emul-goitiin sitten 12-37 ml;n Waring Laboratory-sekoit-timen kupissa 5 minuutin ajan pika-asetuksella. Sekoituksen jälkeen emulsion annettiin seistä 5 minuuttia loukkuun jääneiden ilmakuplien vapauttamiseksi.

10 Emulsio valettiin Gel Bond-polyesterikalvolle (Marine Colloids Division of FMS Corp.) käyttäen 0,635 mm:n kaavinterää. Kun kalvoa oli kuivattu tunnin ajan huoneenlämpötilassa, se asetettiin 40°C:iseen ilmauuniin 15 minuutiksi, Kalvo leikattiin sitten 5,1 x 10,2 mm:n suora-15 kulmioiksi, jotka kiinnitettiin polystvreenikalvoon kuten esimerkissä 9.2.1 ja arvosteltiin.

Reflektanssitulokset koottiin 640 nm:n aallonpituudella käyttäen SERALYZER-reflektanssifotometria ja tulokset 2 muutettiin (K/Sl -arvoiksi. Tulokset on koottu alle ja 20 piirretty graafisesti kuvaan V. Ne osoittavat lineaarista riippuvuutta kaliumioniväkevyvden ja (K/S) :n välillä, mikä tekee mahdolliseksi väkevyyden tarkan määrityksen.

K+ (mM) (K/S) 2 25 0 0,0915 0,10 1,133 0,15 1,750 0,20 2,189 9.3,3, Valinomysiiniä (12,8 mg) ja 7-n-dekvyli-MEDPIN:ä 30 (5,4 mg) liuotettiin 760^ul;an dietyyliftälaattia lämmit täen. Toinen liuos valmistettiin lisäämällä 600 mg agaroosia ja 38^ul Zwittergent 3-16 ;n 10 mg/ml vesiliuosta 20 ml .-aan tislattua vettä 60°C;ssa. Nämä kaksi liuosta yhdistettiin ja emulgoitiin. Saatu emulsio asetettiin tyhjöön 15 sekun-35 niksi loukkuun jääneiden ilmakuplien poistamiseksi.

34 77940

Emulsiosta valettiin kalvo, jonka märkäpaksuus oli 1,27 mm, Gel Bond^kalvolle käyttäen kaavinterää. Kalvon annettiin seistä 2 tuntia huoneenlämpötilassa ja kuivattiin sitten edelleen ilmauunissa 40° C:ssa vielä 30 mi-5 nuuttia. Testilaitteet valmistettiin sitten kuten yllä olevissa esimerkeissä.

Testilaitteet arvosteltiin käyttäen KCl:n vesiliuoksia, jotka sisälsivät puskurina 3-(sykloheksyyliamino)-propaani-sulfonihappoa ja LiOH:a (pH = 10}. Tulokset esitetään seulo raavassa taulukossa: K+(mMl (K/S)2 O 0,0865 0,5 0,3565 1.0 0,7937 15 1,5 1,2034 2.0 2,0207

Tulokset on piirretty graafisesti kuvaan VI. Annos/reaktio-käyrä tekee mahdolliseksi helpon erottamisen eri K+-tasojen 2Q välillä.

9,4. paperi ja hydrofiilinen polymeeri yhdistelmäkantaja-matriisina

Suoritettiin kokeita hydrofiilisen kantajamatriisin haarutumisten arvioimiseksi tarkemmin. Seuraavissa esimer-25 keissä hydrofobisen apuaineen hienojakoisia pallosia, jotka sisältävät ionoforia ja ilmaisuainetta, vangitaan hydro-fiiliseen matriisiin, joka koostuu paperista ja agaroosista.

9,4,1. Valmistettiin varastoliuokset. Ensimmäistä liuosta varten 28,4 mg 7-n-dekyyli-MEDPIN:iä ja 71,6 mg (2,3-nafto)-30 15^-kruunu^5;a lisättiin 2 ml;an 2-nitrofenyvlioktyylieetteriä,

Sekoitettiin voimakkaasti pyörresekoittimella 5 sekuntia ja asetettiin 10-20 minuutiksi Sybron Thermolyne Dri-Bath-läm-mittimeen, joka oli asetettu 90 C:en, kunnes kaikki reagenssit olivat liuenneet, Agaroosiliuos valmistettiin liuottamalla 35 1 g agaroosia 20 ml:an vettä 80°C:ssa. Kahtaisionipesuaine- 35 77940 liuos valmistettiin liuottamalla lg agaroosia 20 ml;an vettä 80°C:ssa. Kahtaisionipesuaineliuos valmistettiin liuottamalla 50 mg Zwittergent 3-10-valmistetta 20 ml:an vettä.

Valmistettiin reagenssiemulsio yhdistämällä 0,8 ml 5 ensimmäistä liuosta, 12,0 ml agaroosiliuosta, 0,8 ml pesu-aineliuosta ja 1,4 ml tislattua vettä ja emulgoimalla seos vetoisuudellaan 12-37 ml:n ruostumattomassa teräs-kupissa suurella nopeudella 5 minuuttia Waring-labora-toriosekoittajalla. Ilman annettiin poistua oranssinväri-10 sestä emulsiosta 5 minuutin ajan 60°C:ssa ennenkuin se levitettiin Whatman 31 ET-paperille käyttäen Meyer-sauvaa n:o 75. Paperia kuivattiin sitten 60°C:isessa uunissa 20 minuuttia. Palanen kaksipuolista akrvyliliimateipoiä (Double Stick) levitettiin paperin päällystämättömälle 15 nuolelle. Kokoonpano leikattiin 10-2 mm leveiksi nauhoiksi, jotka kiinnitettiin sitten polystvreenitukseen liimakalvon toisen puolen avulla. Uusi leikkaus 5,1 mm:n suikaleiksi antoi reagenssisuikaleita, jotka koostuivat kukin 5,1 x 10,2 mm:n reagenssityynvstä kiinnitettynä polystyreeni-20 kädensijaan ja olivat sopivia käytettäväksi Ames'in SERALYZER-reflektanssifotometrin kanssa.

Suikaleiden testaus suoritettiin mittaamalla reagoineen reagenssityynyn hajareflektanssi aallonpituudella 640 nm käyttäen SERALYZER-instrumenttia. Viittä kalium-25 kloridin vesiliuosta, jotka oli puskuroitu pH-arvoon 9,0 100 mM:n boraattipuskurilla, käytettiin näytteinä. Jokaisella kaliumtasolla mitattiin kolme suikalereaktiivi-suutta ja keskiarvo laskettiin. Tulokset on taulukoitu alle.

K+(mM)_(K/S)1 30 0,08 0,1846 0,12 0,2328 0,16 0,3018 0,20 0,3532 0,24 0,4440

Tulokset osoittavat erinomaisia määritystuloksia. Vaihtelevilla K+-väkevyyksillä, kuten yllä olevista tulok-35 sista piirretty käyrä kuvassa VII osoittaa.

s6 7 7940 9.5. Ti02;n käyttö kantoainematriisin aineosana

Suoritettiin koe, jossa valmistettiin tämän keksinnön testiväline ja -laite käyttäen Ti02;a lisäaineosana yhdistelmäkantajamatriisissa.

5 Tulokset osoittavat parantunutta ionien määrityskykyä testinäytteestä.

Valmistettiin o-nitrofenyylioktyylieetterin (NPOE) (12,6 p-%1 ja gelatiinin (9,6 p-%) emulsio veteen.

Ennen emulgointia NPOE tehtiin 15 mM:seksi 7-dekyyli-10 MEDPIN:in ja valinomysiinin suhteen. Kun NPOE/gela- tiiniseos oli emulgoitu Warring-laboratoriosekoittimella suurella nopeudella, saatu emulsio levitettiin polyesteri-kalvolle, jota oli käsitelty vastaanottamaan gelatiini (40 GÄB 2S, 3M Co.). Kalvot levitettiin 0,171 mm:n 15 (Mayerr'sauva n:o 75) 0,381 mm:n (kaavinterä) ja 0,762 nutiin (kaavinterä) märkäpaksuuteen, Kalvoja kuivattiin huoneenlämpötilassa n. 3Q minuuttia.

Toinen sarja kalvoja valmistettiin kuten yllä paitsi, että niihin sisällytettiin 0,75 p-% Ti02-jauhetta (hiukkas-20 koko 0,5yu , NL 2030, valmistaja NL Industries).

Kalvot levitettiin 40 GAB 25-polyesterikalvolle 0,091 mm:n (Mayer-sauva n;o 40), 0,171 uinun (Mayer-sauva n:o 75), 0,381 mnj;n (kaavinterä) ja 0,762 mm"n (kaavinterä) märkäpaksuuteen.

25 Pienet suorakulmaiset palaset (5,1 x 10,2 mm) leikat tiin kummastakin kalvosarjasta ja kiinnitettiin erillisten polystyreenisuikaleiden toiseen päähän käyttäen kaksipuolista liimateippiä (Double Stick, 3 M Co.).

Valmistettiin testinävtteet, jotka sisälsivät 0,2, 3Q 0,6, 1,1 ja 3,3 mM KCL 100mM;n tris-hvdroksimetyyliamino-metaanipuskurissa (pH 8,0). Pieni jae jokaisesta testi-näytteestä (3Q^,ul) levitettiin erilliselle kalvolle ja reflektanssin muutosta seurattiin 130-150 sekunnin ajan SERALYZER-laitteella. Reflektanssiarvot muutettiin (K/S)-ar-35 voiksi kuten esimerkissä 9.2. Saadut (K/S) -arvot (loppu-piste) on rekisteröity seuraavaan taulukkoon.

37 77940

n N H

O O 07 f'- tO LO 07 to r^otM rr i—i o — 07700 LO 70 70 1-0 to ·»·>·» ^ to 'T o o o o <0

rH

i—i lo lo vo rr «j· rr •H N CO in 07 ΗΤ tO 07 E .-H OO Ό Tf LO r-t O r-

3 »- f-. rH LO O n <7 O

•H pH ·*· *s. ·* ·**·«·*

'"j H N N o O O O

ro 2!

-¾ H

ω +"" \ U5 « 7—

w 70 LO O 1-0 M m N OI

*- 70 oo το K) 1Λ tf H

O _ TJ-f'-LO « N H 07

•H ^ Γ-t LO 00 N O tO N

•P «. *. p ·»·»·»·»

44 ·—1 »—· *—* o O O O

ro 0)

M

C (N1 o O LO rH TS- rj- O

<1) «.OI^vO 00 M N H

•07 _ tO rj- (VJ 07 07 07

O 70000 iH i—li—I «-H

JL, O O

^ ’“i O O O O

u

M UV o LO

2 t" o o o t- o o S —

2- 70. 1/70 to 70 LO O

* S jH to rH tO

«? 3 1-J

Λ \ Q

H

^ H

0»P 0,0

I LO »o o\o övO

O t"- LO LO LO LO

_ " - t^~ r— O 'j o o o .

£ O, + o o o o

Claims (8)

38 77940

1. Testiväline ionin läsnäolon määrittämiseksi vesipitoisesta testinnäytteestä, tunnettu siitä, että 5 se käsittää hydrofiilisen kantajamatriisin, johon on sisällytetty hydrofobisen aineen hienojakoisia pallosia, joka aine sisältää ionoforia, joka kykenee muodostamaan kompleksin ionin kanssa, ja ilmaisuainetta, joka yhdessä ionofo-rin ja ionin kompleksin kanssa saa aikaan havaittavan reak-10 tion.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen testiväline, tunnettu siitä, että hydrofiiliseen kantajamatriisiin on lisäksi sisällytetty Tieosa.

3. Patenttivaatimuksen 1 tai 2 mukainen testiväline, 15 tunnettu siitä, että ilmaisuaine on yhdiste, jonka rakenne on OH 20 (O) ~ N 1 jossa X on halogeeni tai pseudohalogeeni, R on 2-, 3-, 5-ja/tai 6-asemassa oleva substituentti, joka on alempi tai keskikokoinen alkyyli, aryyli tai 2,3- tai 5,6-asemiin fuu-30 sioitunut rengas, ja n on 0-4.

4. Patenttivaatimuksen 1 tai 2 mukainen testiväline, tunnettu siitä, että ilmaisuaine on yhdiste, jonka rakenne on 39 77940 OH Τοχοτ

5. Jonkin patenttivaatimuksen 1-4 mukainen testiväli-15 ne, tunnettu siitä, että ilmaisuaine saa aikaan fluoresenssin tai fluoresenssimuutoksen ionoforin ja ionin kompleksin läsnäollessa ja on edullisesti fluoreseiini tai sen johdannainen.

5 N A O 10 jossa R" on H tai alempi alkyyli, edullisesti metyyli, R* on H tai keskikokoinen alkyyli, edullisesti n-dekyyli, ja X on halogeeni tai pseudohalogeeni.

6. Testiväline ionin läsnäolon määrittämiseksi vesi-20 pitoisesta testinäytteestä, tunnettu siitä, että se käsittää pitkänomaisen alustan, jonka yläpinta on oleellisesti tasomainen yläpinta, ja jonkin patenttivaatimuksen 1-5 mukaisen testivälineen kiinnitettynä alustan tasomaiselle pinnalle.

7. Menetelmä testivälineen valmistamiseksi, jolla määritetään ionin läsnäolo vesipitoisesta testinäytteestä, tunnettu siitä, että muodostetaan ensimmäinen seos, joka sisältää vettä ja hydrofiilista polymeeriä; muodostetaan toinen seos, joka sisältää hydrofobista ainetta, iono-30 foria, joka kykenee muodostamaan kompleksin ionin kanssa, ja ilmaisuainetta, joka yhdessä ionoforin ja ionin kompleksin kanssa saa aikaan havaittavan reaktion; yhdistetään ensimmäinen ja toinen seos toisen seoksen hienojakoisten pallosten stabiilin emulsion muodostamiseksi ensimmäiseen 35 seokseen; päällystetään emulsiolla pitkänomainen alusta, jonka yläpinta on oleellisesti tasomainen; ja haihdutetaan 4o 7794 0 vesi emulsiosta hydrofiilisen kantajamatriistin muodostamiseksi, johon on sisällytetty toisen seoksen hienojakoisia pallosia, jolloin matriisi kiinnittyy alustan tasomaiseen pintaan.

8. Jonkin patenttivaatimuksen 1-6 mukaisen testiväli- neen käyttö ionin läsnäolon määrittämiseksi vesipitoisesta testinäytteestä, saattamalla testinäyte kosketukseen testi-välineen kanssa ja toteamalla havaittava reaktio. 41 77940