FI80150B - Iontesthjaelpmedel med poroes baermatris. - Google Patents

Description

1 80150

Huokoisen kantajamatriisin sisältävä testiväline ionien määrittämiseksi ja sen valmistusmenetelmä

Keksinnön kohteena on ionien, erityisesti vesipi-5 toisessa liuoksessa olevien ionien mittaaminen ja testiväline tai -laite tällaisten mittausten suorittamiseksi. Keksintö antaa nopean ja helpon tavan tällaisten ionien määrittämiseksi, jolloin tulokset ovat hetkessä analyytikon käytettävissä hänen saatettuaan vain testinäyteliuok-10 sen kosketukseen testivälineen tai -laitteen kanssa. Ei tarvita vaikeasti käsiteltäviä, kalliita elektronisia laitteita kuten ioni-spesifisiä elektrodeja, liekkifoto-metrejä, atomi-absorptiospektrofotometrejä tai vastaavia. Liioin ei ole tarpeen turvautua aikaavieviin kemian märkä-15 menetelmiin, kuten titraukseen ja muihin laboratoriomenetelmiin. Tämä keksintö tekee mahdolliseksi, että analyytikko ainoastaan saattaa testinäytteen kosketukseen liuskan tai vastaavan muodossa olevan testivälineen kanssa ja havaitsee havaittavan vasteen.

20 Ioniväkevyyden määrityksellä vesipitoisesta nes teestä on käyttöä lukuisilla aloilla. Vedenpuhdistusalalla kalsium-väkevyyttä täytyy huolellisesti tarkkailla ionin-vaihtohartsi-ioninpoistajan kyllästysasteen arvioimiseksi. Natriumin ja muiden ionien mittaaminen merivedestä on tär-25 keätä valmistettaessa juomavettä merellä olevalla laivalla. Kaliumtason mittaaminen veressä auttaa lääkäriä sellaisissa tautimäärityksissä, jotka johtavat lihasärsytyk-seen ja ärsyttäviin muutoksiin sydänlihastoiminnassa. Tällaisia tiloja ovat vähävirtsaisuus, virtsanerityksen puu-30 te, virtsanerityksen tukkeutuminen ja iskusta aiheutunut munuaisvika. Litiumtasojen mittaus verestä on erityisen tärkeä, sillä myrkylliset annostasot ovat vain lievästi korkeampia kuin terapeuttiset tasot, joita käytetään psykiatrisessa hoidossa.

35 On selvää, että nopea, helppo menetelmä ioniväke vyyden määrittämiseksi parantaisi suuresti näiden teknolo- 2 80150 gioiden tilaa, samoin kuin monien muiden, joissa tällaiset nopeat, tarkat määritykset olisivat hyödyksi. Siten, esimerkiksi, jos lääkintälaboratorion teknikko voisi tarkasti mitata seerumi- tai kokoverinäytteen natrium-, litium-, 5 kalium- tai kalsium-ionitason sekuntien tai minuuttien sisällä, tällaiset nopeat tulokset auttaisivat lääkäriä taudinmäärityksessä ja lisäisivät laboratorion tehokkuutta moninkertaisesti.

Aikaisemmat menetelmät ionien määrittämiseksi 10 liuoksista käsittävät liekkifotometrian, atomiabsorptiofo-tometrian, ioni-spesifisiä elektrodeja ja testiliuskafor-maatteja. Tiettyjen yhdisteiden ja tietyn yhdistelmän, joka selektiivisesti eristää tiettyjä ioneja näyteliuok-sesta, käyttö on yleistynyt ioni-spesifisissä elektrodeis-15 sa. Näillä aineilla, jotka tunnetaan ionoforeina, on kyky eristää selektiivisesti ioneja niiden vasta-ioneista aiheuttaen siten varauksen erottumisen ja vastaavan muutoksen sähkönjohtavuudessa ionoforin sisältävässä faasissa. Ioni/ionofori-ilmiötä valaisevat ionianalyysit, joissa 20 käytetään membraanielektrodeja, neste/neste-erotusta ja fluoresenssia.

Kun kaksi liuosta, joilla on erilaiset ioniväkevyy-det, erotetaan sähköäjohtavalla membraanilla, kehittyy sähköpotentiaali (EMF). Tällaisen systeemin kehittämä EMF 25 on väkevyyden eli ioniaktiivisuuden funktio. Tämä ilmiö ilmaistaan matemaattisesti hyvin tunnetulla Nernst-yhtä-löllä RT 1 c 1 30 ε = - on - (1) nF 2 c 2 jossa ε on nimenomaisen systeemin EMF, F on Faradayn vakio [23.062,4 - 0,003 kaloria (voltti ekviv.) _1], R on kaasu-35 vakio, T on lämpötila (°C), In on luonnollinen logaritmi ja γ ja c ovat vastaavasti tutkittavan ionin aktiivisuus- 3 80150 kertoimia ja mooliväkevyyksiä, alaindeksi 1 tarkoittaa liuosta membraanin toisella puolella, alaindeksi 2 tarkoittaa liuosta toisella puolella, ja n on reaktiossa siirtyneiden elektronien lukumäärä.

5 Tällaisissa membraanierotuskennoissa membraani voi olla yksinkertainen sintrattu lasieste, joka sallii pienen mutta mitattavan ionidiffuusioasteen toisesta liuoksesta toiseen. Vaihtoehtoisesti voidaan käyttää huokosetonta, sähköä johtamatonta kalvoa, kuten polyvinyylikloridia, 10 joka on kyllästetty ionoforilla. Ionoforin poissaollessa kalvo on eristin eikä mitään EMFrää voida mitata; sekoitettaessa ionoforin kanssa varautuneet ionit sitoutuvat kalvoon ja pieni, mitattava virta voi indusoitua virtaamaan. Koska ionofori on selektiivinen affiniteetiltään ja 15 siten sitoo ainoastaan tiettyjä spesifisiä ioneja, tällaiset kennot ovat ioni-selektiivisiä. Mikä tahansa mitattava EMF aiheutuu pelkästään näiden ionien läsnäolosta.

Siten kenno kaliumionien (K* ) määrittämiseksi voidaan aikaansaada käyttämällä ionoforia, joka on spesifinen 20 K*:lle, esim. valinomysiiniä. Kaliumin läsnäollessa vali-nomysiini muodostaa johtavan kulkutien membraanin poikki sitomalla ja kuljettamalla K*-ioneja, sallien pienen virran kulkemiseen. K*:n vertailuväkevyys sijoitetaan membraanin toiselle puolelle ja testinäyte toiselle. Kehitty-25 nyt EMF mitataan ja käytetään tuntemattoman väkevyyden laskemiseen yhtälöstä (1). Koska K* sitoutuu valinomysii-nimembraaniin, johtava kulkutie esiintyy vain K*:lle. Sen-tähden kehittynyt EMF aikheutuu pelkästään K*-väkevyysgra-dientista membraanin poikki.

30 Membraanin poikki kulkeva virta on niin pieni, että mitään merkittävää K*- tai vasta-ioni-määrää ei kulkeudu sen läpi. Membraanin sähköinen neutraalisuus ylläpidetään joko vetyionien päinvastastaisella virtauksella tai OH--ionien samansuuntaisella virtauksella. Tämä anioni-vaiku-35 tus voi vähentää elektrodin spesifisyyttä aiottua ionia kohti ja on häiriötekijä, joka on minimoitava.

4 80150 Päähaitta tällaisten ioni-selektiivisten elektrodien käytössä on ollut vasteen tarkkuuden ja nopeuden merkittävä väheneminen ajanmittaan. Lisäksi pienet muutokset ioniväkevyydessä aikaansaavat niin pieniä muutoksia 5 EMF:ssä, että tarvitaan tarkkuusvolttimittarilaitteita.

On myös osoitettu, että tietyillä antibiooteilla kuten valinomysiinillä on vaikutus fosfolipidi-kaksiker-ros-membräänien (biologisten membraanien) sähköisiin ominaisuuksiin, niin että nämä antibiootit liuentavat katio-10 neja membraanin sisällä, liikkuvien varattujen parien muodossa, aikaansaaden siten "kantaja"-mekanismin, jolla kationit voivat kulkea membraanin eristävän hiilivetysisuk-sen poikki. Tällaisten kompleksien ainoana tarkoituksena on kuljettaa kompleksin varaus membraanin läpi, niin että 15 jännite-ero voidaan määrittää membraanin kummallakin puolella olevien liuosten välillä.

US-patenttijulkaisussa 3 562 129 selostetaan huokoisten membraanien, jotka on kyllästetty amino- ja oksi-happojen makrosyklisillä johdannaisilla, käyttöä ioni-se-20 lektiivisissä elektrodeissa. Membraanin muodostamiseen käytetyt ainekset ovat lasisulatteita ja muita huokoisia membraaneja. Tällaisten elektrodien sanotaan olevan tehokkaita ioni-aktiivisuuksien mittaamisessa.

Hamlen'ille et ai. myönnetyssä US-patentissa nro 25 4 053 381 esitetään samanlainen teknologia ja käytetään ioni-spesifistä membraania, jonka läpi tapahtuu ionien liikkumista.

Simon'ille, et ai. myönnetyssä US-patentissa nro 3 957 607 esitetään menetelmä kationien sähkökemiallista 30 määrittämistä varten käyttäen elektrodia, jossa on memb-raani, joka sisältää neutraaleja ionoforeja, jotka pystyvät muodostamaan lipidiliuokoisia komplekseja kationien kanssa.

Ionoforien eräs toinen tunnettu käyttö ioni-määri-35 tyksessä on neste/neste-erotus. Tässä menetelmässä hydro- tl 5 80150 fobinen ionofori liuotetaan orgaaniseen liuottimeen, joka on veden kanssa sekoittumaton. Eisenman et ai., J. Membrane Biol.1:294-345 (1969) esittävät kationien selektiivisen uuttumisen vesipitoisista liuoksista orgaanisiin 5 liuottimiin makrotetralidi-aktiini-antibioottien kautta. Tämä menetelmä käsittää ainoastaan orgaanisen liuotinfaa-sin, joka sisältää antibiootit, ravistelemisen vesipitoisten liuosten kanssa, jotka sisältävät lipidiliukoisten värillisten anionien kationisuoloja, kuten pikraatteja ja 10 nitrofenolaatteja. Orgaanisen faasin värin voimakkuus mitataan sitten spektrofotometrisesti osoittamaan, kuinka paljon suolaa on uuttunut. Faasi-siirtoa ovat tutkineet myös Dix et ai., Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 17:857 (1978) sekä katsauksissa kuten Burgermesister et.ai., Top. Cur.

15 Chem. 69:91 (1977); Yu et ai., "Membrane Active Comple- xones", Elsevier, Amsterdam (1974); ja Duncan, "Calcium in Biological Systems", Cambridge University Press (1976).

Sumiyoshi, et ai., Talanta, 24, 763-765 (1977) selostavat erään toisen menetelmän, joka on käyttökelpoinen 20 K*:n määrittämiseksi seerumista. Tässä menetelmässä seerumista poistetaan proteiinit trikloorietikkahapolla, lisätään indikaattoriväriaine ja ravistellaan liuottimen kuten kloroformin kanssa, joka sisältää valinomysiiniä.

Yhdisteen jakautuminen on nopea ja tehokas nestei-25 den välillä, kuten Eisenman on esittänyt, mikä johtuu io-nofori-kantajan ja ionien liikkuvuudesta, mikä sallii kuljetetun lajin diffundoitua nopeasti pois rajapinnalta. Tällainen mekanismi on normaalisti mahdoton kiintofaasis-sa, mikä johtuu kiintofaasissa olevien aineiden jäykkyy-30 destä, liikkumattomuudesta ja pääasiallisesti nolla-diffuusiosta.

Vielä eräässä yrityksessä ioni-aktiivisuuden mittaamiseksi vesipitoisista liuoksista käytetään fluoroivia anioneja. [Feinstein, et ai., Proc. Nat. Acad. Sei.

35 U.S.A., 68, 2037-2041 (1971)]. Todetaan, että kationi/io- nofori-kompleksien läsnäolo orgaanisissa liuottimissa tun- 6 80150 netaan, mutta että kompleksien muodostumista puhtaasti vesipitoisissa väliaineissa ei sitä aikaisemmin ollut havaittu. Feinstein, et ai. osoittivat tällaisten kompleksien läsnäolon vedessä käyttämällä fluoroivia suoloja 1-5 aniliini-8-naftaleenisulfonaatti ja 2-p-toluidinyylisulfo-naatti.

Havaittiin, että ionofori/kationi-kompleksien vuorovaikutus fluoroivien väriaineiden kanssa antoi parantuneen fluoresenssi-emission, lisääntyneen käyttöajan ja 10 polarisoinnin ja merkitsevän siniseksi muuttumisen fluore-senssikirjon emissiomaksimeissa. Ionoforin ja fluoroforin muuttumattomilla väkevyyksillä fluoresenssiemission voimakkuuden havaittiin olevan kationiväkevyyden funktio.

US-patentissa nro 4 367 072 esitetään ionin määri-15 tys, jossa käytetään konjugaattia, jonka muodostaa kromo-foriainekseen kovalenttisesti sidottu ionofori. Käytössä tätä konjugaattia lisätään nestenäytteeseen ja värin ilmestymistä liuokseen tarkkaillaan spektrofotometrisesti.

Esitys rajoittuu liuosmääritykseen ja näyttää sil-20 tä, että väriä kehittyy riittämättömästi suoran näköhavainnon mahdollistamiseksi. Lisäksi kromoforin stökiomet-rinen suhde ionoforiin on kiinteä tällaisessa systeemissä, mikä johtuu suorasta sitoutumisesta näiden molekyylien välillä. Tästä suorasta sitoutumisesta johtuen on mahdo-25 tonta säädellä värivoimakkuutta; ionoforin suhde kromofo-riin on kiinteä.

EP-julkaisun 41 175 kohteena on huokoseton kantaja-matriisi, joka on yhdistetty ionoforin kanssa. Kantaja voi edelleen olla yhdistetty ilmaisuaineen kanssa tai ilmaisu-30 aine voidaan lisätä testinäytteeseen. Ionofori (ja ilmaisuaine) yhdistetään huokosettomalle kantajamatriisille kalvona. Tässä keksinnössä ei ole huokosetonta kantajamat-riisia; kantajamatriisin tulee välttämättä päinvastoin olla luonteeltaan huokoinen.

35 EP-julkaisun 125 555 kohteena on samoin huokoseton kantajamatriisi yhdistettynä ionoforin ja ilmaisuaineen 7 80150 kanssa. Niinmuodoin mainittu esitys poikkeaa tästä keksinnöstä samalla tavalla kuin edellisessä kappaleessa selostettiin.

EP-julkaisun 125 554 kohteena on hydrofiili kanta-5 jamatriisi yhdistettynä hydrofobisen kantajan hienojakois ten pallosten kanssa. Nämä palloset sisältävät ionoforia ja ilmaisuainetta. Ne muodostetaan valmistamalla hydrofobisen seoksen emulsio ja veden ja hydrofiilin polymeerin kuten gelatiinin seos. Kantajaosa päällystetään sitten 10 tällä emulsiolla ja vesi haihdutetaan jättämään hydrofiili polymeeri ja hienojakoiset palloset. Emulsio voidaan päällystää paperille, haihduttaa ja tämä kantaja kiinnittää alustalle. Kaikissa tapauksissa testiväline sisältää hydrofobisen kantajan (joka sisältää ionoforin ja ilmaisuai-15 neen hydrofiilissä kantajamatriisissa) hienojakoisia pallosia. Tämä keksintö poikkeaa '982-hakemuksen esityksestä siinä, että ionofori ja ilmaisuaine yhdistetään huokoiseen kantajamatriisiin suoraan homogeenisena hydrofobisena yhdistelmänä. Mitään emulsiota ei ole osallisena.

20 Yhteenvetona taustasta teknologiselle kehitykselle, joka on johtanut tähän keksintöön, tunnetaan monia menetelmiä liuoksessa olevien ionien määrittämiseksi. Laiteme-netelmät käsittävät sellaisia pitkälle kehitettyjä menetelmiä kuin ioni-spesifinen potentiometria, liekkifotomet-25 ria ja atomiabsorptiofotometria. Ionoforien, jotka komp-leksoituvat selektiivisesti spesifisten ionien kanssa, käyttö on johtanut viiteen peruslähestymistapaan: ioniselektiivisiin elektrodeihin, neste/neste-erotukseen, fluoresenssin lisäämiseen, kromoforimerkattuihin ionofori-kon-30 jugaatteihin sekä testiliuskoihin.

Toisin kuin alan aikaisemmat testimuodot, tämä keksintö antaa pysyvän yhtenäisen testivälineen (tai laitteen) yhdistämällä homogeeninen hydrofobinen koostumus huokoiselle kantajamatriisille.

35 Suoritusarvoja, jotka kuvaavat testivälineen annos- 8 80150 vastetta, joka on herkkä kaliumionin läsnäololle, on kuvattu graafisesti kuvassa 1. Arvoja otettiin käyttäen tes-tivälineitä, jotka oli muodostettu esimerkissä 5 selostetun menetelmän mukaisesti. Graafinen esitys osoittaa las-5 ketut K/S-arvot merkittyinä kalium-ionin [K*] väkevyyttä vastaan, millimooleissa/1 tai millimoolisena (mM). Kalium-herkän testivälineen muodostaminen on tässä esitetyn keksinnön eräs edullinen suoritusmuoto.

Kuva 2 esittää heijastumisspektrejä, jotka on saatu 10 30 sekunnin kuluttua siitä, kun testivälineitä, jotka on valmistettu esimerkissä 11.2 kuvatulla tavalla on kastettu virtsaan, joka on 30- tai 120-millimoolinen (mM) natrium-ionin suhteen. Pieni muutos spektreissä testivälineille, jotka on saatettu 1 kuukauden varastoimisrasitukseen 15 40°C:ssa (katkoviiva) verrattuna huoneen lämpötilan spektriin (yhtenäinen viiva) osoittaa natrium-herkän välineen kestävyyden lämpörasitusta vastaan paperimatriisilla, joka on muodostettu sisällyttämällä siihen puskuria. Heijastu-misprosentti (%R) merkitään aallonpituutta ( λ) nanomet-20 reissä (nM) vastaan natrium-herkille testivälineille.

Tämä keksintö koskee uutta testivälinettä ionin läsnäolon havaitsemiseksi vesipitoisesta testinäytteestä ja sen väkevyyden määrittämisestä. Testiväline käsittää huokoisen kantajamatriisin, johon on tasaisesti yhdistetty 25 a) homogeeninen hydrofobinen seos, joka sisältää kolme pääaineosaa: ionoforin, joka pystyy muodostamaan kompleksin määritettävän ionin kanssa, hydrofobisen apuaineen ja ilmaisuaineen, joka pystyy reagoimaan ionoforin ja ionin kompleksin kanssa kehittäen havaittavan vasteen; ja b) 30 purskuroiva aine, joka pystyy ylläpitämään pH:n alueelta n. 5-10.

Testilaite käsittää testivälineen kiinnitettynä pitkänomaisen kantajaosan tasaiselle yläpinnalle.

Käytössä vesipitoinen testinäyte saatetaan köske-35 tukseen testivälineen tai -laitteen kanssa. Ionin läsnäolo ja/tai väkevyys testinäytteessä määritetään sitten havait- 9 80150 semalla kehittynyt havaittava vaste.

Keksinnön mukainen testiväline ja -laite antavat nopeita tuloksia, jolloin riittävä havaittava vaste muodostuu useimmissa tapauksissa vähintään muutamissa minuu-5 teissä.

Seuraavat määritelmät annetaan tämän keksinnön piirin selventämiseksi ja sen toteuttamisenn ja käytön mahdollistamiseksi .

Ilmaisu "ionofori" tarkoittaa molekyylejä, jotka 10 pystyvät muodostamaan kompleksin jonkin spesifisen ionin kanssa, joissakin tapauksissa muiden pääasiallisesti poissulkemiseksi. Esimerkiksi syklinen polyeetteri 2,3-nafto-1,4,7,10,13-pentaoksasyklopentadeka-2-eeni (tunnetaan joskus 2,3-nafto-15-kruunu-5:nä ja nimitetään tässä natrium-15 ionofori I:ksi) sitoutuu selektiivisesti kalium-ioneihin liuoksessa muodostaen kationikompleksin. Käsitteeseen sisältyvät koronandit, kryptandit ja podandit.

"Ilmaisuaine" on aine, joka pystyy olemaan vuorovaikutuksessa ionofori/ioni-kompleksin kanssa kehittäen 20 havaittavan vasteen, kuten värinmuutoksen. Siten ilmaisin voi olla väriaine, joka pystyy reagoimaan ionofori/ioni-kompleksin kanssa siten, että ilmaisin menettää protonin ja tulee varatuksi, aikaansaaden muutoksen elektronijakautumassa. Muutos elektronijakautumassa aikaansaa havaitta-25 van vasteen. "Ilmaisuaine" käsittää fenoli-yhdisteitä, kuten p-nitrofenolin, jotka ovat suhteellisen värittömiä ei-ionoidussa tilassa, mutta jotka värjäytyvät ionisoi-tuessaan, ja fluoroivia yhdisteitä, jotka aiheuttavat enemmän tai vähemmän fluoresenssia elektronijakautuman 30 muuttuessa. Ilmaisuaine voi olla myös aine, joka voi laukaista havaittavan vasteen yhdessä muiden komponenttien kanssa. Esimerkiksi muutos ilmaisuaineen elektronijakautumassa, joka on aiheutettu reaktiolla kompleksin kanssa, voi vuorostaan helpottaa ilmaisimen reaktiota toisen kom-35 ponentin kanssa, joka sitten antaa havaittavan vasteen.

"Reaktiolla" tarkoitetaan mitä tahansa yhteistoi- 10 801 50 mintaa ilmaisuaineen ja ionofori/ioni-kompleksin välillä, joka johtaa havaittavaan vasteeseen.

Ilmaisulla "havaittava vaste" tarkoitetaan tässä muutosta jossakin parametrissä tai sen esiintymistä tes-5 tivälinesysteemissä, joka muutos pystytään havaitsemaan, joko suoraan havaitsemalla tai jollakin kojeella ja joka on funktio ionin spesifisestä läsnäolosta vesipitoisessa testinäytteessä. Eräitä havaittavia vasteita ovat muutos värissä tai värin ilmeneminen, fluoresenssi, heijastus, 10 pH, kerniluminesenssi ja infrapunaspektri.

Ilmaisulla "väli-alkyyli", kuten sitä tässä käytetään, tarkoitetaan alkyyli-ryhmää, jossa on n. 5 - n. 15 hiiliatomia. Se käsittää normaaleja ja haarautuneita isomeerejä. Se voi olla substituoimaton tai se voi olla subs-15 tituoitu, edellyttäen, että mikään tällainen substituointi ei häiritse tässä kuvatun testivälineen tai -laitteen toimintaa sen kyvyssä havaita ioneja.

Ilmaisu "alempi alkyyli", kuten sitä tässä esityksessä käytetään, tarkoittaa alkyyliosaa, joka sisältää n. 20 1-4 hiiliatomia. Alemman alkyylin tarkoittamia ryhmiä ovat metyyli, etyyli, n-propyyli, isopropyyli, n-butyyli, sek-butyyli ja tert-butyyli. Nämä voivat olla substituoimat-tomia tai ne voivat olla substituoituja, edellyttäen, että mikään tällaisista substituenteista ei häiritse tässä vaa-25 ditun testivälineen tai -laitteen toimintaa sen kyvyssä havaita ioneja.

"Pseudohalogeenilla" tarkoitetaan atomeja tai atomien ryhmiä, jotka, kun ne liittyvät tyydyttämättömään tai aromaattiseen rengassysteemiin, vaikuttavat rengassystee-30 min elektrofiiliyteen tai nukleofiiliyteen, ja/tai joilla on kyky vaikuttaa sähkövarauksen jakautumiseen paikoiltaan siirtymisen tai resonanssin kautta samalla tavalla kuin halogeenit. Siten, kun halogeeni ilmaisee ryhmän VII atomeja, kuten F, Cl, Br ja I, pseudohalogeenit käsittävät 35 sellaisia osia kuin -CN, -SCN, -OCN, -C3, -COR, -C00R, -CONHR, -CF3 , -CC13 , -N02 , -S02 CF3 , -S02 CH3 , -S02C6H5, 11 80150 -S02C6H4CH3, -SOC6H5 ja -SOCFj , joissa R on alkyyli tai aryyli.

Käsite "huokoinen", kuten sitä tässä käytetään, tarkoittaa, että kantajamatriisissa on käytettävissä väli-5 tiloja, jotka sallivat vesipitoisen testinäytteen helpon pääsyn hydrofobiseen koostumukseen, joka sisältää ionofo-rin ja ilmaisuaineen. Esimerkiksi paperi on huokoinen kanta jämät riisi, joka säilyttää avoimen hilarakenteen senkin jälkeen, kun siihen on yhdistetty homogeeninen hydrofobi-10 nen koostumus ja puskuroiva aine ja se on kuivattu. Kosketuksen jälkeen kaksi kertaa kuivatun ja yhdistetyn paperin kanssa vesipitoinen näyte virtaa helposti tähän avoimeen verkostoon. Kosketuspinta-ala hydrofobisen koostumuksen ja vesipitoisen näytteen välillä on niinmuodoin hyvin 15 suuri.

"Homogeenisella" tarkoitetaan koostumuksen tasaista hajaantumista kauttaaltaan, niin että mikä tahansa umpi-mähkäisesti valittu osa sisältää saman määrän kutakin koostumuksen aineosista.

20 Homogeeninen hydrofobinen koostumus yhdistetään huokoisen kantajamatriisin kanssa ilman mitään tarkoituksellisia epäjatkuvuuksia. Matriisin huokoinen luonne säilyy kuitenkin vielä yhdistämisen jälkeenkin. Sentähden ilmaisua "pääasiallisesti tasaisesti" käytetään tunnustuk-25 sena siitä tosiasiasta, että matriisi säilyttää aukkoja kuivaamisen jälkeen, joihin vesipitoinen testinäyte voi virrata, kun se saatetaan kosketukseen testivälineen (tai laitteen) kanssa.

Tämä testiväline käsittää kolme perusaineosaa: (a) 30 huokoisen kantajamatriisin; (b) homogeenisen hydrofobisen koostumuksen, joka sisältää ionoforia, hydrofobia apuainetta ja ilmaisuainetta; ja (c) puskuroivan aineen. Kun vesipitoinen testinäyte sisältää ionin, joka pystyy komp-leksoitumaan ionoforin kanssa, tämä ioni voi reagoida io-35 noforin kanssa, joka sisältyy homogeeniseen hydrofobiseen koostumukseen, muodostaen ionofori/ioni-kompleksin, joka 12 801 50 vuorostaan reagoi ilmaisuaineen kanssa kehittäen havaittavan vasteen. Puskuroiva aine, joka yhdistetään suoraan huokoiseen kantajamatriisiin, antaa oikean pH:n ionofori/ ioni-kompleksin reaktiota varten ilmaisuaineen kanssa.

5 Koska testivälineeseen on yhdistetty puskuri, testinäyt-teen käsittely pH:n säätämiseksi on tarpeetonta.

Häiriönpoistosysteemi ja kostutusaine voidaan lisätä testivälineeseen (tai -laitteeseen). Muita komponentteja, kuten stabiloimisaineita, säilytysaineita, paksuntimia 10 [kuten polyvinyylimetyylieetteriä (saatavissa kaupallisesti nimellä Gantre^-154 firmasta GAF Corp., New York, New York), polystyreenisulfonihappo tai agaroosi], valokemial-lisia stabiloimisaineita jne. voidaan myös lisätä, edellyttäen että ne eivät häiritse havaittavan vasteen tuot-15 tamista. Kun tämä esitys tunnetaan, on tällaisten komponenttien valinta alaan perehtyneen tietämyksellä helppoa. Minkään hydrofobiseen koostumukseen lisätyn komponentin ei tulisi muuttaa sen olennaista homogeenistä hydrofobista luonnetta. Lisäksi kantajamatriisin tulisi säilyttää huo-20 koinen luonteensa kaikkien komponenttien yhdistämisen ja kuivaamisen jälkeen.

Keksinnön mukainen koostumus voidaan yhdistää kanta jamatriisin monilla eri tavoilla. Aineosat voidaan liuottaa sopivaan liuottimeen tai liuottimien seokseen, 25 kuten tässä on selostettu. Tällaista liuosta voidaan käyttää kyllästämään kantajamatriisi upottamalla tai musteena, jolloin reagoivat aineet painetaan sopivalle matriisille, tai kantajamatriisi voidaan päällystää koostumuksella, kuten kaavinterällä. Edullinen menetelmä on selostettu 30 yleisessä menetelmässä.

Kantajamatriisin, jonka kanssa homogeeninen hydrofobinen koostumus yhdistetään, täytyy pystyä olemaan hydrofobisen faasin kantajana sillä tavalla, että kuivaamisen jälkeen on olemassa melkoisia aukkoja, joihin vesipitoinen 35 testinäyte voi helposti liikkua, ts. sen täytyy olla huokoinen.

i3 801 50

Sopivia aineksia ovat paperi, puu ja muut selluloo-sasysteemit, sintratut keraamiset sulatteet ja huokoiset polymeeri-ainekset, edellyttäen, että matriisin dimensio-kokonaisuus säilyy hydrofobisen koostumuksen yhdistämisen 5 jälkeen ja senjälkeisen kosketuksen jälkeen vesipitoisen näytteen kanssa. Lisäksi matriisi-aines ei voi reagoida hydrofobisen koostumuksen kanssa tavalla, joka häiritsisi havaittavan vasteen aikaansaamista.

Edullinen kantajamatriisi on paperi. Esimerkiksi 10 suodatinpaperiin voidaan yhdistää homogeenista hydrofobista koostumusta ja kuivata. Paperiin voidaan myös yhdistää puskuroivaa ainetta. Sen jälkeen kun testiväline on saatettu kosketukseen vesipitoisen testinäytteen kanssa, ioni voi helposti päästä hydrofobiseen faasiin virtaamalla pa-15 perin avoimeen hilaan. Koska puskuri yhdistetään suoraan testivälineen kanssa, näytteen laimentaminen ei ole tarpeen oikean pH:n aikaansamiseksi.

Hydrofobisen apuaineen ensisijaisena tehtävänä on lisätä testivälinesysteemin havaittavaa vastetta. Siten 20 apuaine voi olla neste tai kiinteä aine, edellyttäen, että se lisää ionofori/ioni-kompleksin ja ilmaisuaineen kykyä esiintyä yhdessä homogeenisessa hydrofobisessa koostumuksessa. Huolellisuutta on noudatettava apuaineen valitsemiseksi, joka ei häiritse ionofori/ionikompleksin ja ilmai-25 suaineen reaktiota.

Aineita, jotka ovat käyttökelpoisia hydrofobisina apuaineina, ovat nesteet, jotka ovat liukenemattomia emäksisiin liuoksiin ja pystyvät liuottamaan ionoforin ja ilmaisuaineen. Edullisesti ne ovat suhteellisen haihtumat-30 tornia, ts. niiden kiehumapiste on vähintäin n. 150°C, ihanteellisesti vähintään n. 200eC. Apuaine on normaalisti hapen luovuttaja, joka sisältää funktionaalisia ryhmiä, kuten eetteriä, esteriä, amidia jne. tai niiden yhdistelmiä.

35 Tyypillisiä tähän ryhmään kuuluvia nesteitä ovat trikresyylifosfaatti, dioktyylifatalaatti, tris-2-etyyli- 14 801 50 heksyylisebasaatti, n-butyyliasetyyli-risinolaatti ja nit-rofenyylieetterit, kuten 2-nitrofenyylioktyylieetteri, 2-nitrofenyylibutyylieetteri, dibentsyylieetteri ja o-nitro-fenyyli-2-(1,3,3)-trimetyyli-butyyli-5,7,7-trietyylioktyy-5 lieetteri. Niiden nesteiden seoksia voidaan käyttää. Käyttökelpoisia kiinteitä aineita ovat cis-Ν,Ν,Ν',N'-tetraiso-butyyli-1,2-sykloheksaani-dikarboksiamidi ja N,N'-dietyy-lieetteri-N,N-diheptyyli-5,5'-dimetyyli-3,7-dioksanonaani.

On mahdollista, että yksi yhdiste homogeenisessa 10 hydrobisessa koostumuksessa toimii sekä ionoforina että hydrofobisena apuaineena. Esimerkiksi cis-N,N,Ν',N'-tetra-isobutyyli-1,2-sykloheksaani-dikarboksiamidia (jota tässä nimitetään CDA:ksi) X-< 20 \/-p=0 25 käytettiin alunperin valmistemuodoissa litium-ionitestiä varten hydrofobisena apuaineena. Myöhemmin havaittiin, että CDA toimii yksinään sekä ionoforina että hydrofobisena apuaineena.

30 Tämän keksinnön ionofori-elementti on piiriltään laaja käsite, luonnehdittuna kuten edellä määriteltiin.

Se käsittää monihammastettuja syklisiä yhdisteitä, jotka sisältävät luovuttaja-atomeja syklisissä ketjuissaan. Tällaiset monihammastetut sykliset yhdisteet voivat olla 35 yksirenkaisia tai monirenkaisia. Vaihtoehtoisesti ionofori voi olla avoin ketju, joka sisältää luovuttaja-atomeja.

11 15 80 1 50

Siten ionoforielementtiin sisältyy yksirenkaisia systeemejä, jotka ovat ioni-spesifisiä, joita nimitetään koronan-deiksi; monirenkaisia ioni-spesifisiä yhdisteitä, jotka tunnetaan kryptandeina; ja avoketjuisia rakenteita, jotka 5 tunnetaan podandeina, jotka pystyvät selektiivisesti muodostamaan komplekseja ionien kanssa.

Koronandit ovat monosyklisiä yhdisteitä, jotka sisältävät luovuttaja-atomeja, joissa on liikaa elektroneja tai joista puuttuu elektroneja ja jotka pystyvät muodos-10 tamaan komplekseja erikoiskationien ja anionien kanssa, ainutlaatuisten rakenteidensa ansiosta. Tähän käsitteeseen kuuluvat kruunueetterit, joissa monosyklinen ketju sisältää happea luovuttaja-atomina. Muita koronandeja ovat yhdisteet, jotka sisältävät kokoelman runsas-elektronisia 15 atomeja, kuten happea, rikkiä ja typpeä. Erikois-koronan-dien ainutlaatuisten kokojen ja geometrioiden ansiosta ne ovat käyttökelpoisia muodostamaan komplekseja eri ionien kanssa. Tällä tavalla kompleksoituessaan runsas-elektroniset atomit, kuten happiatomit kruunueetterissä, suuntautu-20 vat kohti elektronivajaata kationia. Ketjun hiiliatomiloh-kot ovat samaikaisesti suuntautuneet suuntaan ulospäin ionista. Siten syntynyt koronandi/ioni-kompleksi on varattu keskustassa, mutta hydrofobinen ympäryksellään.

Kryptandit ovat koronandien kanssa analogisia poly-25 syklisiä yhdisteitä. Niinmuodoin ne käsittävät kaksiren-kaisia ja kolmirenkaisia monihammastettuja yhdisteitä. Luovuttaja-atomien syklinen järjestely on tilassa kolmiulotteinen vastakohtana koronandien pääasiallisesti taso-konfiguraatiolle. Kryptandi pystyy itse asiassa ympäröi-30 mään ionin kolmiulotteisella tavalla ja pystyy siten sitoutumaan lujasti ioniin kompleksin muodostuksessa. Samoin kuin koronandeissa voivat luovuttaja-atomeja olla sellaiset atomit kuin happi, typpi ja rikki.

Ionit voivat myös muodostaa komplekseja ei-syklis-35 ten yhdisteiden kanssa. Esimerkiksi lineaarisella ketjulla, joka sisältää säännöllisen sekvenssin runsaselektro- 16 801 50 nisiä atomeja kuten happea, on kyky yhdistyä positiivisesti varattujen ionien kanssa muodostamaan komplekseja, ei kokonaan eri tavalla kuin koronandi ja kryptandit. Päära-kenne-ero podandien ja kahden muun ionoforin välillä on 5 rakenteen avoimuus. Siten podandit voidaan alaluokitella monopodandeihin, dipodandeihin, tripodandeihin jne. Mono-podandi on siten yksinkertainen orgaaninen ketju, joka sisältää luovuttaja-atomeja, dipodandi on kaksi tällaista ketjua kytkettynä silta-atomilla tai atomien ryhmällä, 10 jotka atomit pystyvät muuttuvaan kolmiulotteiseen suuntautumiseen, ja tripodandi on kolme ketjua liittyneinä kes-kusatomiin tai atomien ryhmään. Simon et ai. esittävät US-patentissa nro 3 957 606 dipodandeja, jotka sopivat erityisesti kalsium- tai bariumionien määrittämiseen. Tässä 15 keksinnössä eräs edullinen ionofori on tripodandi 1,1,1- tris[l-(2'-oksa-4'-okso-5'atsa-5’-metyyli)dodekanyyli]propaani, jota tässä nimitetään natrium-ionofori I:ksi, jonka havaittiin olevan erityisen käyttökelpoinen testivälineis-sä natrium-ionin määrittämiseksi. Itse asiassa natrium-20 ionofori I on 90 kertaa selektiivisempi natrium-ionien suhteen kuin dipodandi, N,N'-dibentsyyli-N,N'-difenyyli- 1,2-fenyylidioksidiasetamidi. [Gyqqi, M., Oehme, M., Pretsch, E ja Simon, W. Helv. Chim. Acta. 59:2417 (1976)].

Eräitä ionoforeja, jotka on havaittu erityisen 25 käyttökelpoisiksi, kun niitä käytetään tässä keksinnössä, on lueteltu seuraavassa, yhdessä kationien kanssa, joiden kanssa ne pystyvät selektiivisesti kompleksoitumaan.

Seuraavassa kemiallisia nimiä edullisille ionofo-reille rakenteineen. Yleiset nimet, jotka on tarkoitettu 30 käytettäviksi tässä, on esitetty hakasuluissa.

17 801 50

Ionofori l,l,l-tris/i'“(2l-oksa-4'-okso-5'- -atsa-5'-metyyli)dodekanyyli_7propaani Na+ Λ3 \ ° 0 ^natrium-ionofori I_7 N ,N 1 -dibentsyyli-N,N difenyyli-1,2-20 fenyleenidioksidiasetamidi Na+ ’ ” λΘ 0 0

Cr^° * * o c .1 3 /natrium-ionofori Il7 ie 80150 6,7,9,10,18,19-heksahydro-17-n-butyyli-dibentso/b,k7 /1,4,7,10 , l3_7pentaoksa-sykloheksadekin-18-yyli-oksietikkahappo Na+ /^><0^oh

Ct; /natrium-ionofori IIlT 2,3-nafto-l,4,7,10,13-pentaoksasyklo- 1 c +

pentadek-2-eeni K

20 . I 0 /Tcalium-ionofori l7 25 N,N'-diheptyyli-N,N1,5,5-tetrametyyli-3,7- • ' , + dioksanonaani-diamidi Li 30 Λ»

Xl“ i; » ' r /"litium-ionofori 17

II

i9 801 50

Ionofori Kationi N,Ν'-diheptyyli-5,5-dimetyyli-N,Ν'-di(3-oksapentyyli)-3,7-dioksanonaani-diamidi Li+ 5 jA°

ίο I

S.

/Titium-ionofori Il7 20 dietyyli-N,N'- [ (4R,5R)-4,5-dimetyyli-l,8- diokso-3,ö-dioksaoktametyleeni/bis(12- ++ metyyliaminododekanoaatti) Ca

X

- ·· V.

.. /kalsium-ionofori l7 20 801 50

Muita tässä keksinnössä käyttökelpoisia ionoforeja ovat seuraavassa luetellut:

Ionofori Kationi 15-kruunu-5 Na*, K* 5 valinomysiini K* 4,7,13,16,21,24-heksaoksa-l,10-diatsabisyklo-[8,8,8]heksakosaani (KryptofixR 222) K* dibentso-18-kruunu-6 K* disykloheksano-18-kruunu-6 K* 10 4,7,13,18-tetraoksa-l,10-diatsa-bisyklo- [8,5,5]eikosaani (Kryptofi^- 211) Li* 12-kruunu-4 Li*

Kryptofi»? on firman E. Merck, Darmstadt, BRD, kauppamerkki.

15 Vaikka näitä spesifisiä ionoforeja käytettiin edul lisesti tämän keksinnön testivälineissä, voidaan käyttää myös muita ionoforeja tai niiden seoksia. Erityisesti io-noforit, jotka sisältävät ionoituvia ryhmiä, kuten natrium- ionofori III, voidaan korvata koostumuksessa, niin 20 kauan kuin niillä on riittävä analyytti-ioni-spesifisyys.

Kun kiinnostavan ionin läsnäolo testiliuoksessa tiedetään, on ilmaisuaine se, joka antaa havaittavan vasteen olemalla reagoimalla ionofori/ioni-kompleksin kanssa. Ilmaisuaine voi vaihdella koostumukseltaan yksinkertaises-25 ta yhdisteestä, joka voi ionoitua vasteena ionofori/ioni-kompleksin muodostumiselle, reaktiivisten lajien seokseen, jotka lajit tuottavat havaittavan tuotteen, kun niiden reaktioketju laukeaa kompleksin läsnäolon vaikutuksesta. Siten voidaan nähdä, että kun mitään analyytti-ionia ei 30 ole läsnä, ilmaisuaine pysyy hyödyttömänä; mitään havaittavaa vastetta ei voida todeta. Vaihtoehtoisesti, kun tarkkailun alainen nimenomainen ioni on läsnä, muodostuu kompleksi, joka on reagoi ilmaisuaineen kanssa ja saattaa siinä tapahtumaan havaittavan muutoksen.

35 Tapauksessa, jolloin ilmaisija on yksinkertainen

II

2i 80150 yhdiste, se voi sisältää dissosioituvan ryhmän, niin että dissosioitumisen jälkeen muodostuu värillinen ionilaji. Esimerkiksi, fenoli-yhdisteet, kuten p-nitrofenoli, ovat suhteellisen värittömiä ei-ionoidussa tilassa, mutta ovat 5 värillisiä ionoitumisen jälkeen. Muita yhdisteitä, kuten niitä, jotka aiheuttavat enemmän tai vähemmän fluoresens-siä elektronijakautuman muuttuessa, voidaan myös käyttää. Fluoroivien indikaattoreiden ja niiden johdannaisten luokkia, jotka ovat käyttökelpoisia tässä keksinnössä, ovat 10 fluoresiinin johdannaiset, erityisesti fluoresiiniesterit, 7-hydroksi-kumariinit, resorufiinit, pyren-3-olit ja fla-vonit.

Ilmaisuaine voi myös olla aine, joka voi laukaista havaittavan vasteen yhdessä muiden komponenttien kanssa.

15 Esimerkiksi eräs reaktiosysteemi, joka on käyttökelpoinen ilmaisuaineena, on systeemi, joka käsittää fenolista peräisin olevan protonin dissosioitumisen, aloittaen siten kytkentäreaktion värillisen tuotteen muodostamiseksi. Ns. Gibbs-reaktio on eräs tyypillinen tällainen reaktiosek-20 venssi, jossa 2,5-sykloheksadien-l-oni-2,6-dihalo-4-halo-imiini (I) kytkeytyy fenolin (II) kanssa muodostaen värillisen reaktiotuotteen (III).

-vy *

NX 0H N

30 (I) (II) (III>

NdtJj 35 0" 22 8 0 1 50 Tässä reaktiosekvenssissä R, samanlainen tai erilainen, voi olla joku 2, 3, 5- ja 6-aseman substituentti (substituenteista), joka (jotka) ei (eivät) haittaa koko-nai sreaktiosekvenssiä. Siten kukin R on alempi tai väli-5 alkyyli tai aryyli, tai yksi R voi muodostaa fuusioituneen rengassysteemin jommassakummassa 2,3- tai 5,6-asemista. X on halogeeni tai pseudohalogeeni ja n on 0-4. Tämänkaltaista ilmaisuainetta käytetään yhdistämällä yhdisteitä, joilla on rakennekaavat (I) ja (II), hydrofobisen apuai-10 neen kanssa.

Vielä eräs Gibb'in kemian hyödyntämiskeino käsittää yhdisteitä, joilla on yhdisteen (III) kaltainen rakenne ei-ionoidussa muodossaan. Ioni/ionofori-kompleksin muodostumisesta on tuloksena reaktio, niin että ilmaisuaine 15 (III) antaa havaittavan värin itseensä ja itsestään. Tämän ilmiön voidaan ajatella tapahtuvan seuraavan reaktiosek-venssin ja resonanssi-rakenteiden mukaisesti: il 23 801 50

X A

A _/X

Λ ' ^φχ, ΟΗ 0 \ l· -Η+

'J

\Ι Ο

Λ A

R—ο ^--- *n~\c

I N

M ,

A A

0 24 801 50 jossa kukin R, samanlainen tai erilainen, on alempi tai väli-alkyyli, aryyli tai fuusioitunut rengassysteemi 2,3-tai 5,6-asemissa, ja n on 0-4. Erityisen edullinen on yhdiste, jolla on rakenne 5

OH

(ϋιόΓ

ίο I

N

Λ -ΛΛ u jossa R' on H tai alempi alkyyli ja X on halogeeni tai pseudohalogeeni, kuten edellä vastaavasti määriteltiin. Tapaus, jossa R' on metyyli ja X on kloori, on havaittu 20 erityisen sopivaksi tälle keksinnölle.

Vielä eräs edullinen ilmaisuaine on yhdiste, jolla on kaava

OH

R* ./k. . R'

TOIÖT

N

Λ 30 0 jossa R* on väli-alkyyli, ts. ryhmä, jossa on 5-15 hiili-35 atomia, ja jossa R' on H tai alempi alkyyli ja X on halo- il 25 80 1 50 geeni tai pseudohalogeeni. Tämänkaltaisten yhdisteiden on havaittu olevan erityisen kestäviä mahdollista häiriötä vastaan, joka johtuu seerumialbumiinin läsnäolosta tes-tinäytteessä. Edullinen tämäntyyppisten ilmaisuaineiden 5 joukosta on 7-(n-dekyyli)-2-metyyli-4-(3',5'-diklorofen-4'-oni)indonaftoli (Jota tässä nimitetään 7-dekyyli-MEDPIN'iksi), jossa R* on n-dekyyli, X on kloori ja R1 on metyyli. Yksityiskohtaisempaa tietoa tällaisten yhdisteiden käytöstä ja valmistuksesta voidaan löytää US-patentti-10 julkaisuista 4 552 697 ja 4 540 520, joista kumpikin on siirretty tämän hakemuksen oikeuden omistajalle ja joihin tässä viitataan.

Puskuroiva aine voi olla mikä tahansa puskuri tai puskurien yhdistelmä, joka pystyy ylläpitämään pH:n 15 alueella n. 5-10. Puskuri valitaan helpottamaan ionofori/ ioni-kompleksin reaktiota ilmaisuaineen kanssa, joka reaktio johtaa havaittavaan vasteeseen.

Sopivia puskureita ovat bis[2-hydroksietyyli]imino-tris[hydroksimetyyli]metaani; 1,3-bis[tris(hydroksimetyy-20 li)metyyliamino]propaani, N,N-bis(2-hydroksietyyli)glysii-ni, tris(hydroksimetyyli)aminometaani, N-[2-asetamido]-2-iminodietikkahappo; N-2-hydroksietyylipiperatsiini-N',3-propaanisulfonihappo; 3-[N-tris(hydroksimetyyli)metyyli-amino-2-hydroksipropaanisulfonihappo; tetrametyyliammo-25 niumboraatti; ja tetrametyyliammoniumfosfaatti.

Edullinen pH-alue riippuu ilmaisuaineesta; sentäh-den puskurin valinta määräytyy käytetyn ilmaisuaineen mukaan ja jossakin määrässä halutun havaittavan vasteen mukaan. Esimerkiksi, kun ilmaisijana käytetään 7-dekyyli-30 MEDPIN'iä, edullinen pH-alue on 6-8,5. Kuitenkin, kun käytetään ilmaisuainetta, jolla on suurempi pKa dissosioituvalle protonille, on korkeampi pH-alue edullinen; samalla tavalla, kun käytetään ilmaisijaa, jolla on pienempi pKa dissosloituvalle protonille, on alempi pH-alue edullinen. 35 Kun havaittava vaste on värin muutos, voi puskuri vaikut- 26 801 50 taa tällaisen havaittavan vasteen asteeseen ja voidaan valita joku nimenomainen puskuri värivoimakkuuden optimointia varten. Käyttökelpoinen värialue esimerkiksi ilmaisijalle 7-dekyyli-MEDPIN on n. pH 6-8,5, jossa värin 5 muutos tapahtuu oranssista siniseen. Suurempi pH, pH 8,5-10, antaa tummansinisen sävyjä, joita on silmämääräisesti vaikea erottaa, ja alempi pH, pH 5-6 antaa vaaleankeltaisia sävyjä, joiden erottaminen silmällä myös on vaikeata. Kumpaakin ääri-pH:ta voitaisiin käyttää laiteanalyysissä, 10 vaikkakin paras instrumentti-tarkkuus on pH-alueella n. 6- 8,5. Sopivan pH:n määrittäminen on rutiinilaboratoriokoe, joka ilmenee tästä esityksestä.

Käyttökelpoisia hydrofobisia polymeerejä ovat pää-asillisesti ei-polaariset (ts. ionoituvat funktionaaliset 15 ryhmät puuttuvat), ja ovat sekoittuvia hydrofobisen apuaineen kanssa. Näitä ovat polyvinyylikloridi, polyvinylidee-nifluoridi, polystyreeni, polykarbonaatti. poly(4-kloori-styreeni), polyvinyyliasetaatti, vinylideenikloridi/vinyy-likloridi-kopolymeeri, vinylideenikloridi/akryylinitriili-20 kopolymeeri, vinyylikloridi/vinyyliasetaattikopolymeeri, polymetyylimetakrylaatti, vinyylikloridi/vinyyliasetaat-ti/vinyylialkoholiterpolymeeri, polyetyleeni, polypropyleeni ja polyuretaani. Tietenkin monet muut polymeeri-ainekset ovat sopivia käytettäviksi hydrofobisena polymeeri-25 nä ja tällaisten ainesten tunnistaminen on alaan perehtyneiden hyvin suoritettavissa, tämän esityksen perusteella. Hydrofobisen polymeerin sisällyttäminen hydrofobiseen koostumukseen lisää analyysitulosten tarkkuutta, niin että variaatiokerroin ei ole suurempi kuin 2-4 %. Lisäksi, kun 30 hydrofobinen polymeeri sisällytetään hydrofobiseen koostumukseen, visuaalinen vaste voidaan korreloida ioniväke-vyyden kanssa semikvantitiivisesti.

Kehon nesteet sisältävät normaalisti monia kationeja, kuten natriumionin (Na* ), kaliumionin (K* ), kalsium-35 ionin (Ca** ) ja magnesium-ionin (Mg** ). Vaikka ionofori 27 801 50 tavallisesti valitaan selektiivisyytensä perusteella halutun ioni-analyysin suhteen, voisi joissakin tapauksissa muiden kationien läsnäolo häiritä ionoforin yhteistoimintaa halutun ioni-analyytin kanssa. Esimerkiksi natrium-5 ionofori I sitoo etusijaisesti natrium-ionin kalsium-ioniin verrattuna suhteessa n. 4:1. Näytteissä, joissa natrium-ionin suhde kalsium-ioniin on pienempi kuin 4:1, saattaa olla tarpeen estää kalsium-ionin reaktio ionoforin kanssa oikean suhteen varmistamiseksi natriumioni-väkevyy-10 den ja havaittavan vasteen välillä. Häiriönpoistosysteemi voidaan järjestää tämän ongelman torjumiseksi.

Häiriönpoistosysteemi voidaan yhdistää kantajamat-riisiin suoraan tai puskuroivan aineen kanssa. Eräässä edullisessa suoritusmuodossa poistosysteemi on suunniteltu 15 olemaan vuorovaikutuksessa häiritsevän kationin kanssa sen pitämiseksi siten vesipitoisessa faasissa tai muulla tavalla kationin reaktion estämiseksi ionoforin kanssa hydrofobisessa faasissa. Esimerkiksi etyleenidiamiinitetra-etikkahappo (EDTA) ja etyeeniglykoli-bis(aminoetyyli) tet-20 raetikkahappo ovat vesiliukoisia yhdisteitä, jotka muodostavat komplekseja kaksiarvoisten kationien, kuten kalsium-ionin kanssa. Jos EDTA yhdistetään testivälineeseen natrium-ionin määrittämiseksi saatettaessa kosketukseen natrium- ja kalsium-ioneja sisältävän vesipitoisen näytteen 25 kanssa, sitoo EDTA etusijaisesti Ca* * . Sidottu kalsium- ioni ei olennaisesti häiritse ionofori/natrium-ioni-komp-leksin muodostumista. Lisäksi ionoforeja voidaan käyttää poistamaan häiritseviä kationeja, jos ne ovat spesifisiä häiritsevälle ionille ja ovat vesiliukoisia tai niitä on 30 modifioitu kemiallisesti niiden vesiliukoisuuden lisäämiseksi vähentämättä niiden kykyä reagoida häiritsevän tekijän kanssa. Esimerkiksi natrium-ionoforia III voidaan modifioida lisäämällä liuentavia ryhmiä, kuten (-S03H)-ryh-miä, bentseeni-renkaisiin lisäämään sen vesiliukoisuutta 35 vähentämättä sen kykyä reagoida natrium-ionin kanssa. Mui- 28 801 50 ta yhdisteitä, kuten urasiilidietikkahappoa ja trans-1,2-diaminosykloheksaani-N,N, N' N ’-tetraetikkahappoa, voidaan myös edullisesti käyttää.

Joitakin käyttötarkoituksia varten testivälineen 5 (tai -laitteen) toimintaa parannetaan lisäämällä kostutus-ainetta. Esimerkiksi, kun näyte pipetoidaan testivälineelle, se voi muodostaa nestehelmen välineen pinnalle. Mikä tahansa aine, joka vähentää vesipitoisen näytteen pintajännitystä mahdollistaen näytteen virtaamisen testimatrii-10 sin huokosiin, voi toimia kostutusaineena. Tietenkin tämä aine täytyy valita niin, että se ei häiritse ionofori/io-ni-kompleksin muodostamista tai ionofori/ioni-kompleksin ja ilmaisuaineen yhteistoimintaa havaittavan vasteen aikaansaamiseksi .

15 Joissakin tapauksissa kostutusainetta ei tarvitse lisätä. Esimerkiksi, kun käytetään natrium-ionoforia III, ei ylimääräinen kostutusaine ole tarpeen. Kun kostutusainetta on lisättävä, aine lisätään edullisesti joko pusku-riaineeseen tai erikseen. Sopivia kostutusaineita ovat 20 agaroosi ja detergentit kuten polyetyleeniglykoli-iso-ok-tyylifenyylieetteri; 2-0-asetoksi-3-(perfluorialkyyli)-N-karboksimetyyli-N,N-dimetyylipropyyliamiini; polyetyleeni-glykoli-l-(2-perfluorialkyyli)etyylieetteri; n-dekyyli-N,N-dimetyyli-3-ammonium-l-propaanisulfonaatti; N-perfluo-25 rialkyyli-N-karboksietyyli-N,N-dimetyyliamiini ja rasva-alkoholien polyoksietyleeniesterit, erityisesti BrijR35SP (saatu firmasta ICI United States, Inc. Wilmington,

Del.). Muita detergenttejä voidaan käyttää, edellyttäen, että ne eivät häiritse havaittavan vasteen aikaansaamista 30 tarkoitetun ioni-analyytin kanssa.

Testivälinekomponenttien pitoisuudet eivät ole ratkaisevia keksinnölle, edellyttäen, että ionoforin, hydrofobisen apuaineen, ilmaisuaineen ja puskuroivan aineen pitoisuudet ovat riittävät aikaansaamaan haluttu havait-35 tava vaste. Joissakin tapauksissa halutun havaittavan vas- 29 80150 teen tai halutun tarkkuuden aikaansaaminen vaativat hydrofobisen polymeerin lisäämistä. Kvalitatiivisia tuloksia varten ei ionoforin väkevyys eikä ilmaisuaineen väkevyys kuitenkaan ole sidottu määritettävän ioni-analyytin väke-5 vyysalueeseen.

Optimi-väkevyyksien määrittämisen voi alaan perehtynyt tehdä tämän esityksen perusteella. Kuitenkin annetaan seuraavat ohjenuorat. On edullista, että ionoforia on läsnä moolisessa ylimäärässä ilmaisuaineeseen nähden 10 (ts. ionofori/ilmaisuaine-moolisuhde on suurempi kuin 1:1). Ionoforin työskentelyväkevyydet voivat olla väkevyydestä 2 g/1 kyllästykseen. Hydrofobista polymeeriä, jos sitä ylipäänsä lisätään, on tavallisesti pitoisuuksissa 0-50 g/1. Häiriönpoistosysteemin ja kostutusaineen, jos 15 niitä ylipäänsä lisätään, pitoisuudet ovat tavallisesti vain 0-30 g/1.

Työskentely- ja edulliset alueet instrumentaalisia ja visuaalisia ionivastetestivälineitä varten annetaan seuraavassa: 20 30 80 1 50

Instrumentaalinen Työskentely Edullinen

gm/1 gmA

Hydrofobinen seos (väkevyys annettu grammoissa/1 orgaanista liuotinta) 5 Ionofori 2-200 50-100 ilmaisuaine 1-50 5-30 hydrofobinen apuaine 0,01-3 0,02-05 " polymeeri 0-50 10-30 kostutusaine 0-30 0-20

Puskuriseos (annetut väke--^Q vyydet ovat grammoja lit raa kohti vettä tai veden kanssa sekoittuvaa liuotinta)

puskuri 0,1—1 M 0,1-0,5 M

häiriönpoistosysteemi 0-30 10-20 15 kostutusaine 0_30 10_20

Visuaalinen

Hydrofobinen seos (väkevyys annettu painossa/hydrofobi-2Q sen liuoksen loppu- tilavuus) ionofori 2-50 5-15 ilmaisuaine 0,5-5 1,5-4 hydrofobinen apuaine 20-200 80-150 25 hydrofobinen polymeeri 10-50 10-20

Puskuriseos (väkevyys puskuriliuoksen lopullisessa tilavuudessa)

puskuri 0,1-1,0 M 0,3-0,7 M

30 ........

hainonpoistosysteemi q_3q q-20 kostutusaine 0-30 0-20 3i 80150

Edellä selostetulla tavalla valmistettu testiväline voidaan kiinnittää pitkänomaisen tukiosan toiseen päähän, jolloin tukiosan toinen pää toimii vartena, muodostaen siten testilaitteen. Tällaista testilaitetta voidaan pidellä 5 varsipäästä, samalla kun toinen pää, jossa testiväline on, saatetaan kosketukseen testinäytteen kanssa.

Käyttökelpoisia aineksia tukiosaa varten ovat lukemattomien muovien tai polymeerien kalvot. Esimerkkejä ovat sellaiset polymeeri-ainekset kuin selluloosa-asetaatti, 10 polyetyleenitereftalaatti, polykarbonaatit ja polystyree-ni. Tukiosa voi olla läpinäkymätön tai se voi läpäistä valoa tai muuta energiaa. Kun havaittava vaste on fluoresenssi tai kun päällyste sijoitetaan testivälineen yläpinnalle mahdollistaen näytteen pyyhkäiseminen, testiväline 15 voidaan lukea tukiaineksen läpi. Tässä tapauksessa hyödyllisiä tukiaineita ovat läpinäkyvät ainekset, jotka pystyvät läpäisemään sähkömagneettista säteilyä aallonpituudeltaan alueelta n. 200 nanometriä (nm) - 900 nm. Tukiosan ei tietenkään tarvitse läpäistä koko 200-900 nm:n alueel-20 la, vaikka analyysitulosten fluorometristä havaitsemista varten on toivottavaa, että tukiosa on läpinäkyvä alueella, joka on leveämpi tai ainakin yhtä leveä kuin havaitsemiseen käytettyjen fluoroivien ainesten absorptio- ja emissio-kirjot. On myös toivottavaa, että tukiosa läpäisee 25 yhden tai useampia kapeita aallonpituusalueita ja on läpinäkymätön viereisille aallonpituusalueille. Tämä voidaan toteuttaa esimerkiksi kyllästämällä tai päällystämällä tukiosa yhdellä tai useammalla väriaineella, jolla on sopivat absorptio-ominaisuudet.

30 Tämän keksinnön testilaitteen valmistamiseksi pieni suorakaiteen muotoinen kappale testivälinettä, ts. kaksinkertaisesti kuivattua huokoista kantajamatriisia, johon on kaksinkertaisesti yhdistetty homogeenistä hydrofobista koostumusta, joka sisältää ionoforia, hydrofobista apuai-35 netta ja ilmaisuainetta sekä puskuroivaa ainetta ja mahdollisesti muita aineosia, kiinnitetään pitkänomaiseen tukiosaan, joka päällyspinta on pääasiallisesti tasainen, 32 8 0 1 50 kuten pitkulaiselle polystyreenikalvoliuskalle. Testiväli-nekappale kiinnitetään tasaiselle pinnalle toisesta päästä, jättäen polystyreenin toisen pään toimimaan mukavana pitimenä.

5 Testiväline voidaan kiinnittää millä tahansa taval la, joka on yhteensopiva aiotun käytön kanssa. Eräs tapa on käyttää kaksipuolista liimanauhaa testivälinesuorakai-teen ja tukiosan välissä. Erästä tällaista teippiä, joka tunnetaan nimellä Double Stick, on saatavissa firmasta 3M 10 Company, St. Paul, Minnesota.

Tämän keksinnön mukaista testivälinetä ja -laitetta voidaan käyttää hyvin erilaisissa kemiallisissa analyyseissä, ei ainoastaan kliinisen kemian alueella, vaan myös kemiallisessa tutkimuksessa ja kemiallisten prosessien 15 valvontalaboratorioissa. Ne sopivat hyvin käytettäviksi kehon nesteiden, kuten veren, veriseerumin, selkäydinnesteen ja virtsan, kliinisen testaamiseen, koska tässä työssä suoritetaan usein suuri määrä toistuvia testejä ja testitulokset tarvitaan usein hyvin nopeasti näytteenoton 20 jälkeen. Verianalyysien alueella keksintöä voidaan soveltaa käytettäväksi kvantitatiiviseen analyysien suorittamiseen monille ionisille veren komponenteille, jotka ovat kliinisesti kiinnostavia.

Testivälinettä (ja testilaitetta) käytetään saatta-25 maila se kosketukseen testinäytteen kanssa riittäväksi ajaksi. Virtsan testaamistapauksessa riittää pelkkä tes-tivälineen (tai -laitteen) kastaminen näytteeseen. Vaikka tavallisesti on tarpeetonta poistaa ylimääräinen näyte, joissakin tapauksissa, kuten kokoverinäytteissä, on toi-30 vottavaa poistaa ylimäärä pyyhkäisemällä tai imeyttämällä.

Jos analysoitava ioni on läsnä testinäytteessä, ionoforin ja ionin kompleksi reagoi ilmaisuaineen kanssa ja ilmenee havaittava vaste. Kun ilmaisuaine on dissosioi-tuva aine, joka antaa analyytin värillisen vastaionin, 35 muodostuu havaittava väri testivälineeseen, jota voidaan instrumentaalisesti tarkkailla välineen kummaltakin puolelta, kun käytetään läpinäkyvää tukiosaa. Kun ilmaisuai- 33 8 0 1 50 ne on fluorofori, kuten fluoreseiini tai sen johdannainen, voidaan käyttää fluoresenssispektrofotometriä testiväli-neessä muodostuneen havaittavan vasteen mittaamiseksi (tässä fluoresenssin ilmeneminen tai muutos). Muita käyt-5 tökelpoisia menetelmiä havaittavan vasteen havaitsemiseksi ovat heijastusspektrofotometria, absorptiospektrofotomet-ria ja valonläpäisymittaukset.

Erilaiset kalibroimismenetelmät ovat käyttökelpoisia kontrollina analyysille. Esimerkiksi analyytin stan-10 dardiliuoksen näytettä voidaan levittää erilliselle tes-tivälineelle vertailuksi tai mahdollistamaan diffenrenti-aalimittauksien käyttö analyysissä. Testivälineitä (tai -laitteita), jotka on valmistettu hydrofobisesta koostumuksesta, joka sisältää hydrofobisia polymeeriä, voidaan 15 käyttää semikvantitatiivisiin visuaalisiin määrityksiin, kun on käytettävissä sopiva värikartta.

Testivälineitä, jotka ovat herkkiä jollekin spesifiselle ionille, jota nimitetään analyytiksi, valmistettiin seuraavalla menetelmällä: 20 a) muodostettiin ensimmäinen homogeeninen seos hyd rofobisesta koostumuksesta, joka sisälsi ainakin yhtä io-noforia, joka on spesifinen jollekin tarkoitetulle ionille, hydrofobista apuainetta, ilmaisuainetta ja orgaanista liuotinta; 25 b) muodostettiin toinen homogeeninen seos puskuroi vasta aineesta, joka pystyy ylläpitämään pH:n alueella n.

5-10, ja vedestä tai veden kanssa sekoittuvasta liuotti-mesta tai niiden seoksista; c) yhdistettiin toinen mainitusta ensimmäisestä tai 30 toisesta seoksesta huokoisen kantajamatriisin kanssa; d) kuivattiin yhdistetty matriisi; e) yhdistettiin toinen mainitusta ensimmäisestä tai toisesta seoksesta huokoisen kantajamatriisin kanssa; ja f) kuivattiin näin käsitelty kantajamatriisi.

35 Ellei toisin esitetä, on ensimmäinen seos homogee ninen hydrofobinen liuos, joka on valmistettu liuottamalla tarvittavat komponentit orgaaniseen liuottimeen. Sopivia 34 80150 orgaanisia liuottimia ovat ketonit ja eetterit, kuten tet-rahydrofuraani, asetoni ja sykloheksanoni yms. Sopivan liuottimen valinta on alaan perehtyneelle rutiiniasia tämän esityksen perusteella. Vaikka toimiva valmistemuoto 5 voidaan saada pelkästään ionoforilla, hydrofobisella apuaineella ja ilmaisuaineella; sisältää seos yleensä lisäksi hydrofobista polymeeriä.

Toinen seos on tavallisesti sopivaa puskuria sisältävä vesipitoinen liuos, joka on valmistettu liuottamalla 10 puskuri tislattuun veteen ja titraamalla haluttuun pH:hon. Seuraavissa esimerkeissä puskuriliuos määritellään loppu-väkevyytensä avulla. Whatman" tyyppi 31 ET-suodatinpape-ria käytettiin huokoisena kantajamatriisina. Kukin liuos yhdistetään huokoiseen kantajamatriisiin erikseen. Homo-15 geeninen hydrofobinen liuos yhdistettiin paperiin upottamalla ensin paperiliuokseen. Paperi kuivattiin sitten kuivausuunissa. Toinen yhdistäminen suoritettiin upottamalla kuivattu paperi vesipitoiseen puskuriliuokseen; kaksinkertaisesti yhdistetty paperi kuivattiin jälleen kui-20 vausuunissa.

Testivälineitä, ellei toisin esitetä, valmistettiin kiinnittämällä palanen kaksinkertaisesti imeytettyä ja kuivattua paperia, joka oli leikattu muodostuneesta tes-tivälineestä, 0,5 x 10 cm:n polystyreenikalvoliuskan toi-25 seen päähän kaksipuolisella liimanauhalla (Double Stick firmasta 3M Co., St. Paul, Minn.). Tällä tavalla muodos- r tettu testiväline on sopiva käytettäväksi Ames SERALYZER" -fotometrin kanssa tai silmämääräistä lukemista varten sopivan värikartan kanssa.

30 Mistä tahansa muunnoksesta edellä esitetystä ylei sestä menettelystä huomautetaan spesifisesti esimerkeissä.

Joissakin tapauksissa puskuriliuos valmistettiin veden kanssa sekoittuvasta liuottimesta, kuten alemmista 35 alkoholeista tai asetonista, tai veden ja veden kanssa sekoittuvan liuottimen seoksista. Esimerkiksi, puskuroiva aine voidaan liuottaa tislattuun veteen, titrata haluttuun 35 80150 pHthon ja lisätä veden ja alemman alkoholin, kuten metano-lin tai etanolin, seos antamaan lopullinen tilavuus. Näissä tapauksissa puskuriliuos määritellään sen lopullisena väkevyytenä vesi/alkoholi-liuoksessa. Kun käytetään veden 5 kanssa sekoittuvaa liuotinta yksinään, puskuriaine liuotetaan liuottimeen, titrataan sopivaan pH:hon fosforiha-polla ja saatetaan lopputilavuuteen liuottimena.

Normaalisti jotakin kostutusainetta ja/tai käytettyä häiriönpoistosysteemiä sisällytettiin testivälineeseen 10 toisessa imeytyksessä.

Testiväline (tai -laite) testattiin vasteensa suhteen määrätylle ioni-analyytille saattamalla väline kosketukseen vesipitoisen näytteen kanssa ja havaitsemalla mahdollinen vaste. Kosketus aikaansaatiin joko kastamalla 15 väline näytteeseen tai pipetoimalla näytettä välineelle.

Näytteet olivat joko keinotekoisia vesipitoisia näytteitä, virtsa- tai seeruminäytteitä. Kun käytettiin kehoneste-näytteitä, käytettiin liekkifotometriaa näytteessä olevan määrätyn ioni-analyytin pitoisuuden määrittämiseksi. Hei-20 jastusmittaukset, joita tehtiin ennalta määrätyn ajan ku luttua kosketukseen saattamisesta, olivat suhteessa ioni-analyytin pitoisuuteen.

Kun välineet muodostettiin kvantitatiivista instrumentaalista lukemista varten, heijastus mitattiin Ames 25 SERALYZEri* -heijastusfotometrillä (Miles Laboratories,

Inc., Elkhart, IN) aallonpituudella väliltä 640-700 nano-metriä (nm). Näitä heijastusmittauksia arvioitiin hyvin tunnetun Kubelka-Munk-yhtälön yksinkertaistetulla muodolla [ks. Gustav Kortiim, "Reflectance Spectroscopy", sivut 106-30 111, Springer Verlag, New York (1969)]: (1-R)2 K/s = -

2R

jossa R on heijastusfraktio testivälineestä, K on vakio ja S on nimenomaisen heijastavan väliaineen valon hajaan- 35 36 80 1 50 tumiskerroin. K/S saatetaan suhteisiin absorboivan lajin, tavallisesti deprotonoidun ilmaisuaineen, väkevyyden kanssa. K/S (tai K/S:n joku potenssi, joka riippuu absorboivan lajin ja ioni-analyytin väkevyyden tasapainosuhteesta) 5 merkittiin koordinaatistoon ioni-analyytin [ionin] kasvavaa väkevyyttä vastaan millimooleissa/1 (mM) testinäyt-teessä. Pienimmän neliösumman lineaarista regressioanalyysiä käytetään parhaan arvoihin sopivan suoran viivan saamiseksi. Kun käytetään suhdetta K/S, esittää tätä suo-10 raa viivaa yhtälö K/S = kaltevuus [ioni] + korkeusero jossa [ioni] on vesipitoisessa näytteessä olevan ioniana-15 lyytin pitoisuus; K/S tarkoittaa samaa kuin edellä määriteltiin; "kaltevuus" tarkoittaa koordinaatistoon merkityn pienimmän neliösumman suoran kulmakerrointa; ja "korkeusero" tarkoittaa pienimmän neliösumman suoran korkeuseroa. Lasketaan regressio-kerroin, r, ja se osoittaa suoralta 20 viivalta poikkeavien arvojen hajonnan. Arvojen, jotka sopivat täysin suoralle viivalle, regressiokerroin on yksi. Kun K/S:n joku potenssi saatetaan suhteisiin ioni-analyytin väkevyyden kanssa, joka johtuu ionin tasapaino-suhteesta absorboivan lajin kanssa, K/S:n tätä potenssia 25 käytetään määrittelemään yhtälö, ts. (K/S)2 = kaltevuus [ioni] + korkeusero. Kaikissa tapauksissa yhtälö edustaa testivälineen vastetta lisääntyvälle ioniväkevyydelle ja sitä nimitetään usein "annosvaste"-käyräksi.

Suuri kaltevuus osoittaa, että väline on hyvin 30 herkkä, koska pieni muutos ioni-analyytin pitoisuudessa näytteessä antaa suuren muutoksen vasteessa (ts. värissä). Toisaalta korkeuseron (arvon, jossa ioni-analyytin väke-syys on nolla) tulisi olla niin pieni kuin mahdollista, koska tämä piste osoittaa taustah (värin), joka ei korre-35 loi ioni-analyytin väkevyyden kanssa.

Välineet, jotka on muodostettu hydrofobisesta polymeeristä, antavat semikvantitatiivisen vasteen ioni- 37 801 50 väkevyydelle. Ioniväkevyys voidaan määrittää visuaalisesti, kun sopiva värikartta on käytettävissä. Nämä välineet arvioitiin käyttäen heijastusmittauksia, jotka tehtiin Macbeth" kalorimetrillä, sarja 1500 (Kollmorgen Corp., 5 Newburgh, N.Y.) aallonpituuksilla 400-700 nm.

Näitä heijastusarvoja käytettiin kahden näytteen välisen Δ E:n laskemiseksi. Δ E on kokonaisvärieron mitta kahden näytteen välillä kolmiulotteisessa väritilassa.

ΔΕ lasketaan seuraavalla yhtälöllä: [ks. D.B. Judd ja G. 10 Wyszecki, "Color in Business, Science and Industry", John Wiley and Sons, New York (1975)].

ΔΕ = [(AL*)2 + (Δ3*)2 + (Ab*)2]1» 15 jossa L* on mitta kahden näytteen valomäärän (kirkkauden) välillä ja vaihtelee nollasta (absoluuttisen mustalle) 100:aan (täysin valkoiselle); a* on punaisuuden -vihreyden eron mitta kahden näytteen välillä; ja b* on keltaisuuden - sinisyyden eron mitta. L*, a* ja b* laske-20 taan heijastuskyvystä aallonpituuksilla 400-700 cm.

Δε negatiivisen näytteen (näytteen, joka ei sisällä io-ni-analyyttiä) ja positiivisen näytteen (näytteen, joka sisältää ioni-analyyttiä) välillä kasvaa ioniväkevyyden kasvaessa. Visuaalista testausta varten eron väkevyysta-25 sojen välillä, jotka määritellään värikartalla, tulisi olla niin suuri kuin mahdollista, jotta ihmissilmä pystyisi havaitsemaan eron syntyneiden värien välillä. Ihmissilmä havaitsee tavallisesti kaksi väriä erilaisiksi jos E niiden välillä on vähintään 3 värieroyksikköä (ts. ΔΕ:η 30 väkevyystasojen välillä tulisi olla 3 tai suurempi). Ihmissilmän kyky erottaa värieroja vaihtelee jossakin määrässä riippuen siitä, mikä väritilan alue on kysymyksessä (ts. muutoksilla kullanvärisestä vaalean nahan ruskeaan ja vaihteluilla harmaissa sävyissä voi olla sama Δ E ja 35 silti edellinen voitaisiin erottaa helpommin kuin jälkimmäinen). Tällainen ero ei kuitenkaan ole tärkeä, jos 38 80 1 50 on käytettävä instrumentaalista lukemista.

Esimerkeissä käytetyt lyhennykset ovat seuraavat: Hakasulkuja, CO· käytetään tarkoittamaan ioni-väkevyyttä millimooleissa/1 (mM) suoraviivaisissa regressio-5 yhtälöissä. Kaikki väkevyys-prosentit annetaan painoyksik-köinä/dl, ellei toisin esitetä.

Lämpötila: o Celsius-asteita

C

*·0 Pituus: cm senttimetriä

Paino: g gramma mg milligramma 15 Tilavuus: . desilitra

dL

mL millilitra ^uL mikrolitra L litra 20 Väkevyys: mM millimoolinen (millimoolia/litra) M moolinen (moolia/litra) 25 % w/v paino-prosenttia/ desilitra % v/v tilav.prosenttia/desi- litra 30 Ionit:

Na+ natrium-ioni K+ kalium-ioni

Li+ litium-ioni , ++ ......

Ca kalsium-iorn 35 Lyhenteet käytetyille kemiallisille komponenteille

II

39 801 50 annetaan seuraavassa. Ionofori-nimitykset annettiin tätä keksintöä koskemaan pelkästään mukavuussyistä. Nimi perustuu tavallisesti pää-ioniin, jonka määrittämiseen ionoforia käytettiin. Ionoforit antavat kuitenkin tavallisesti vas-5 teen, eriasteisena, muille ioneille. (Edullisten ionoforien rakenteet on annettu edellä).

Ionoforit natrium-ionofori I 1,1,1-tris/1'-(2'-oksa-4'- okso-5'-atsa-5'-metyyli) dodekanyylijpropaani ^ natrium-ionofori II N,N'-dibentsyyli-N,N-difenyyli- 1,2-fenyleenidioksidiasetamidi natrium-ionofori III 6,7,9,10,18,10-heksahydro-17-n- butyyli-dibentso/b,k ,.7 /1,4,7, 10,13/pentaoksasykloheksadekin- 18-yyliloksietikkahappo 15 kalium-ionofori I 2,3-nafto-l,4,7,10,13-penta- oksasyklopentadeka-2-eeni litium-ionofori I N,N-diheptyyli-N,N’-5,5-tetra- metyyli-3,7-dioksanonaani-diami-di -n litium-ionofori II N,N'-diheptyyli-5,5-dimetyyli- N,N1-di(3-oksapentyyli)-3,7-dioksanonaani-diamidi kalsium-ionofori dietyyli-N ,N ' -/~(4R,5R) -4,5-di- metyyli-l,8-diokso-3,6-dioksa-oktametyleeni7bis(12-metyyli-aminododekanoaatti) ^ Hydrofobiset apuaineet NPOE 2-nitrofenyyli-oktyylieetteri NPBE 2-nitrofenyyli-butyylieetteri CDA cis-Ν,Ν,Ν',N'-tetraisobutyyli- sykloheksaani-dikarboksi- amidi

Ilmaisuaine 7-dekyyli-MEDPIN 7-(n-dekyyli)-2-metyyli-4- (3', 5 ' -dikloorifen-4 ' -oni) -indonaftoli 40 80 1 50

Puskuroiva aine

Bis-Tris bis/2-hydroksietyyli7imino-tris-

Thydroksi-metyyli/metaani

Bis-Tris-propaani 1,3-bis/tris(hydroksimetyyli) me tyyliaminci7-propaani 5

Tris tris(hydroksimetyyliaminome- taani ADA N-/2-asetamido7-2-iminodietikka- happo HEPPS N-2-hydroksietyylipiperatsiini- 10 N',3'propaanisulfonihappo

Bicine N,N-bis/2-hydroksietyyli7gly- siini TMA-boraatti tetrametyyliammoniumboraatti TMA-fosfaatti tetrametyyliammoniumfosfaatti 15 TAPSO 3/N-tris(hydroksimetyyli)me- tyyliaminol/2-hydroksipropaani-sulfonihappo (saatu firmasta P.L. Biochemicals, Ins. , Milwaukee, WI) 20 Hydrofobinen polymeeri (kaikki saatu firmasta Aldrich Chemical Co., Milwaukee WI, ellei toisin ole esitetty) PVC polyvinyylikloridi, pieni mole- (pieni mp) kyylipaino 25 (hyvin suuri mp.) hyvin suuri molekyylipaino

VdC/VC vinyylideenikloridi/vinyyli- kloridi-kopolymeeri (Scientific Polymer Products, Ontario, N.Y.) 30 VsC/An vinylideenikloridi-akryylinit- riili-kopolymeeri (Scientific Polymer Products, Inc., Ontario, N.Y.) 35 PC - 1 polykarbonaatti(molekyylipaino 20,000-25,000) 11 4i 80150 PC - II polykarbonaatti (molekyylipaino 33,800) PC - III polykarbonaatti (molekyylipaino 38,100) 5

Sekalaista THF tetrahydrofuraani EDTA etyleenidiamiini-tetraetikka- happo 10 EGTA etyleeniglykoli-bis(aminoetyyli) - tetraetikkahappo (G.Fredrick Smith Chemical Co., Columbus Ohio)

Triton^X-100 polyetyleeniglykoli-p-iso-oktyyli- fenyyli-eetteri (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) ®

Zonyl FSK 2-0-asetoksi-3-(perfluorialkyyli) - „ N-karboksimetyyli-N,N-dimetyyli- propyyliamiini (Dupont Chemical Co., Wilmington, Del) (f)

Zonyl FSN polyetyleeniglykoli-1-(2-perfluori- alkyyli)-etyylieetteri (Dupont Chemical Co., Wilmington Del) (b) 25 Zonyl FRB N-perfluorialkyyli-N-karboksi- etyyli-N,N-dimetyyliamiini (Dupont Chemical Co., Wilmington Del)

Zwittergent 3-10 n-dekyyli-N,N-dimetyyli-3-ammonium- 1-propaanisulfonaatti (Calbiochem- 30 Behring, San Diego, CA)

Bri] 358P rasva-alkoholien polyoksietyleeni- eettereitä) ICI United States, Inc. Wilmington, Del) 35 Keksintöä valaistaan, mutta ei rajoiteta seuraavin esimerkein.

42 801 50

Esimerkki 1

Natrium-ioni: natrium-ligandi I

Testivälineitä (ja -laitteita), jotka ovat herkkiä natrium-ionin väkevyydelle vesipitoisessa näytteessä, valmistettiin kuten yleisessä menetelmässä selostettiin.

5 Hydrofobisen liuoksen koostumus oli seuraava: natrium-ligandi I 6 mg NPOE 0,3 ml PVC (pieni mp., 10-%:nen sykloheksanonissa) 0,6 ml 10 7-dekyyli-MEDPIN 5,4 mg sykloheksanoni 1,35 ml 15 Ensimmäisen imeyttämisen jälkeen paperia kuivattiin 50°C:ssa 40 minuuttia. Puskuriliuos sisälsi 0,3 M Bis-Tris pH 7,5. Toinen kuivaaminen suoritettiin 50°C:ssa 30 minuutin aikana. 0,6 x 0,6 cm:n neliö kaksinkertaisesti imeytettyä ja kuivattua paperia käytettiin testiväliaineen muodostami-20 seen. Tämä yhdistelmä testattiin sen määrittämiseksi, kehit-tyisikö visuaalisesti havaittavia väritasoja, kun väline kastettiin vesipitoiseen näytteeseen, joka sisälsi 0-200 mM natrium-ionia. Tulokset olivat positiivisia, jolloin kehittynyt väritaso vastasi semikvantitatiivisesti läsnäolevaa 25 natriumioniväkevyyttä.

Esimerkki 2

Natrium-ioni: edullinen suoritusmuoto Testivälineiden (ja -laitteiden) edullinen suoritusmuoto, joka on herkkä natrium-ionin väkevyydelle vesipitoi-30 sessa näytteessä, valmistettiin kuten edellisessä menetelmässä selostettiin.

Hydrofobinen liuos sisälsi: natrium-ligandia I 300 mg NPOE 4,5 ml 35 PVC (suuri mp., 5-%:nen THF:ssa) 15 ml 43 801 50 7-dekyyli-MEDPIN 81 mg THF 12,75 ml

Puskuriliuos sisälsi 0,45 M Bis-Tris, pH 7,5, 5 ja 0,05 % polyvinyylimetyylieetteriä (Gantrez^ll-154 firmasta GAF Corp. New York, N.Y.). Molemmat kuivausvaiheet suoritettiin 65°C:ssa 7 minuutissa. 1/5 x 2/5 tuuman (0,5 x 1,0 cm) palanen kaksinkertaisesti kuivattua ja imeytettyä paperia käytettiin testivälineen muodostamiseen.

10 Testaaminen suoritettiin virtsanäytteillä, jotka sisältävät 0, 30, 70, 120 tai 200 mM natrium-ionia. Välineet, jotka kastettiin eri näytteisiin, voitiin erottaa toisistaan visuaalisesti. Heijastuskirjot mitattiin 30 sekuntia välineiden kastamisen jälkeen. ΔΕ:η laskeminen antoi seuraavat 15 tulokset: /Na, mM ΔΕ tasojen välillä 30 5,97 70 6,65 120 4,16 20 200

Koska ero E:ssä väkevyystasolta toiselle oli hyvin yli kolme yksikköä» voitiin nämä väkevyystasot helposti erottaa toisistaan visuaalisesti.

25 Esimerkki 3

Natrium-ioni: vaihtoehtoinen ionofori Vaihtoehtoista ionoforia natrium-ioniväkevyyden määrittämiseksi vesipitoisista näytteistä testattiin käyttäen tämän keksinnön valmistemuotoa.

30 Testivälineet (ja -laitteet) valmistettiin kuten yleisessä menetelmässä selostettiin, käyttäen vaihtoehtoista ionoforia, natrium-ionoforia II. Hydrofobinen liuos sisälsi: Natrium-ionoforia II 50 mg NPOE 0,75 ml 35 PVC (pieni mp, 10-%:nen syklo- heksanonissa) 1 ml 7-dekyyli-MEDPIN 14 mg sykloheksanonia 3,3 ml « 80150

Ensimmäisen imeyttämisen jälkeen paperia kuivattiin 90°C:ssa 20 minuuttia. Puskuriliuos oli 0,3 M Bis-Tris, pH 7,5.

Toinen kuivaaminen suoritettiin 75°C:ssa 20 minuutin aikana. 0,5 x 1,0 cm:n kappale kaksinkertaisesti imeytet-5 tyä ja kuivattua paperia käytettiin testivälmeen muodostamiseen .

Kun testivälineitä kastettiin virtsanäytteisiin, jotka sisälsivät 14, 34, 68, 119 mM natrium-ionia, kehittyi visuaalisesti havaittava väri. Heijastumiskirjot otet-10 tiin 2 minuuttia välineiden kastamisen jälkeen virtsanäytteisiin. Δ.E-laskennat antoivat seuraavat tulokset: M· mM Δε tasojen välillä 15 14-----------------------8,68 34 -----------------------11,03 68-----------------------1,37 119 20

Tulokset osoittavat, että ihmissilmä pystyi tekemään eron värin välillä, joka kehittyi kosketuksen jälkeen kolmen pienimmän väkevyyden kanssa, mutta ei pystynyt erottamaan värieroa 68 mM:n ja 119 mM:n väkevyyksien välillä.

Esimerkki 4 25

Natrium-ioni: yhdistämisjärjestystä muutettu

Valmistettiin testivälineitä (ja -laitteita), jotka ovat herkkiä natrium-ionin väkevyydelle vesipitoisissa näytteissä. Yleistä menetelmää muutettiin imeyttämällä 30 Whatman-paperi ensin puskuriliuoksella, joka oli valmistettu metanoliin, ja toiseksi hydrofobisella liuoksella. Puskuriliuos sisälsi 0,3 M Bis-Tris(metanolissa), pH 7,5. Puskurilla imeyttämisen jälkeen paperia kuivattiin 90°C:ssa 20 minuuttia.

Il is 80150

Hydrofobinen liuos sisälsi: natrium-ligandia I 40 mg PVC (pieni mp., 10-%:nen 4 n ml (sykloheksanonissa) ' 5 NPOE 3,08 ml 7-dekyyli-MEDPIN 56 mg sykloheksanonia 12,92 ml

Toinen kuivaaminen tapahtui 75°C:ssa 20 minuutin aikana.

10 Testiväliaineen muodostamiseen käytettiin 0,5 x 1,0 cm:n kappaletta kaksinkertaisesti imeytettyä ja kuivattua paperia.

Kun välineet, jotka oli muodostettu kääntämällä imeytysjärjestys, kastettiin virtsanäytteisiin, väri oli 15 visuaalisesti havaittavissa ja vastasi semikvantitatiivisesti natriumionirväkevyyttä ^Na+/ mitattuna liekkifotometrillä Heijastuskirjot otettiin 30 sekuntia välineiden kastamisen jälkeen virtsanäytteisiin.

2Q ΔΕ-laskennat antoivat seuraavat tulokset: /Na*/ , mM Δε tasojen välillä 2i--------------------------- 2,59 5!---------------------------12,52 25 101

Pienemmille väkevyystasoille saadut väritasot olivat hieman lähempänä kuin 3 väriyksikköä. Natrium-ionin pienissä väkevyyksissä tämä välineyhdistelmä muuttui kuitenkin kullanvärisestä vaalean nahanruskeaksi, mikä voidaan helpommin 30 erottaa visuaalisesti kuin samanasteinen värinmuutos (Δε tasojen välillä) suuremmilla natrium-ioniväkevyyksillä. Esimerkiksi 100 mM:ssa natrium-ionia ja suuremmissa väkevyyksissä tämä yhdistelmä antaa vaihtelevia harmaan sävyjä, joiden erottaminen visuaalisesti on vaikeampaa.

46 801 50

Esimerkki 5

Kalium-ioni: edullinen suoritusmuoto

Testivälineitä (ja -laitteita), jotka ovat herkkiä kalium-ionin väkevyydelle vesipitoisessa näytteessä, valmis-5 tettiin yleisen menetelmän mukaisesti.

Hydrofobinen liuos sisälsi:

Kalium-ionoforia I 50 mg NPOE 0,6 ml

VdC/AN 300 mg 10 PC-II 110 mg 7-dekyyli-MEDPIN 19 mg THF 25 ml

Puskuriliuos, pH 6,26, sisälsi 500 mM ADA, 667 mM Tris ja 15 0,3 % pinta-aktiivista ainetta, Triton® X-100, tislatussa vedessä. Kumpikin kuivausvaihe suoritettiin 60°C:ssa 10 minuutin aikana. 0,2 x 0,4 cm:n palanen kaksinkertaisesti imeytettyä ja kuivattua paperia käytettiin testiväliaineen valmistukseen.

20 Näytteinä käytettiin vesipitoisia kaliumkloridi- liuoksia. Kalium-ionin jokaiselle väkevyydelle mitattiin välineen reaktiivisuudet 3-kertaisesti heijastuskyvyllä ja keskimääräinen K/S-arvo laskettiin.

Keskim. K/S

25 /k+J f mM

2 0,4750 3 0,6114 4 0,7119 5 0,8555 30 6 0,9592

Arvojen pienimmän neliösumman analyysimenetelmä (keskimääräinen K/S vastaan mM kalium-ioniväkevyyttä) antoi seuraavan suoran suhteen K/S = 0,121 /"K + 0,238; r = 0,9 986 35 Testiväline antoi positiivisen vasteen kalium-ionin läsnäololle 47 80 1 50 hyvällä vastaavuussuhteella K/S:n ja kalium-ioniväkevyyden välillä.

Esimerkki 6

Kalium-ioni; ionofori-vaihtelu 5 Valmistettiin sarja testivälineitä (ja -laitteita) yleisen menetelmän mukaisesti käyttäen erilaisia kalium-selektiivisiä ionoforeja.

Hydrofobinen liuos sisälsi: ionoforia (ks. seuraavassa) 10 NPOE 2,4 ml

VdC/AC 254 mg PC-II 254 mg 7-dekyyli-MEDPIN 76 mg

THF 100 mL

15 Puskuriliuos, pH 6,6, sisälsi 300 mM ADA, 471 mM Tris ja 0,2 % pinta-aktiivista ainetta. Triton ® χ-100, tislatussa vedessä. Kummatkin kuivausvaiheet suoritettiin 60°C;ssa 10 minuutin aikana. 0,2 x 0,4 cm:n palanen kaksinkertaisesti imeytettyä ja kuivattua paperia käytettiin testiväliaineiden muodosta-20 miseksi, jotka ovat sopivia käytettäviksi Ames SERALYZER -foto- metrin kanssa.

Hydrofobisessa liuoksessa käytetyt ionoforit on luetteloitu seuraavassa. Kaikki saatiin firmasta Parish Chemical Co., Orem, Utah.

25 Ionofori A sykloheksyyli-15-kruunu-5 47,6^ul B bentso-15-kruunu-5 50,6 mg C 4-asetyylibentso-15-kruunu-5 58,6 mg D 4-(1-hydroksietyyli)bentso-15-kruunu-5 58,9 mg 30 E 4-(1-hydroksimyristyyli)bentso-15-kruunu-5 90,7 mg F 4-t-butyylibentso-15-kruunu-5 61,2 mg G kalium-ionofori I 60,0 mg

Valmistettiin vesipitoisia kaliumkloridi-näytteitä, jotka sisälsivät 0, 2, 4, 6, 8 ja 10 mM kalium-ionia. Lisäksi 35 valmistettiin vesipitoisia natriumkloridi-näytteitä, jotka 48 801 50 sisälsivät O, 40, 80, 120, 160 ja 200 mM natrium-ionia. Jokaista yhdistelmää testattiin vasteen suhteen kalium-ioni-näytteille ja natrium-ioninäytteille. Jokaista näytettä pipetoitiin testivälineelle ja tehtiin heijastusmittaukset.

5 Tulokset arvojen pienimmän neliösumman regressioanalyysistä (lasketut K/S-arvot vastaan ioniväkevyys mM:eissa) jokaisen yhdistelmän vasteelle natrium-ionille ja kalium-ionille, on luetteloitu seuraavassa.

10

Ionofori Annosvaste Selektiivisyvs K + /Na A K/S = 0.1540 + 0,02371 [K+] . 62 15 A K/S = 0,1440 -f- 0,00383 [Na ] B K/S - 0,1293 + 0,006576 [K+] 41 B K/S = 0,1255 + 0,000162 [Na ] C K/S = 0,1376 + 0,00633 [K+], 73 C K/S = 0.1437 + 0,00091 [Na ] D K/S = 0.1562 + 0,00904 [K+], 60 20 D K/S = 0,1477 + 0,00015 [Na ] E K/S = 0,2901 + 0,1527 [K+], 160 E K/S = 0,1793 + 0,00096 [Na ] F K/S = 0r4253 + 0,1606 [K+] 179 F K/S = 0,1805 + 0,000896 [Na ] G K/S = 0,2734 + 0,1171 [K+] 276 25 G K/S = 0,1409 + 0,00042 [Na ]

Tulokset osoittavat jokaisen yhdistelmän annosvasteen natrium-ionille ja kalium-ionille. Kaikissa tapauksissa vaste kalium-ionille oli ainakin suuruusluokkaa suurempi 30 kuin vaste natrium-ionille. Jokaisen yhdistelmän selek-tiivisyys kalium-ionille natrium-ioniin verrattuna laskettiin kalium-ionille johdetun yhtälön kaltevuuden suhteesta natrium-ionille johdetun yhtälön kaltevuuteen.

35 49 801 50

Esimerkki 7

Kalium-ioni: seerumi-näytteitä

Testivälineet (ja -laitteet), jotka ovat herkkiä kalium-ionin väkevyydelle, valmistettiin yleisellä menetelmällä.

5 Hydrofobinen liuos sisälsi:

Kalium-ionoforia I 1,875 g NPOE 15 ml PC-II 3,0 g

VdC/AN 6,0 g 10 7-dekyy1i-MEDPIN 0,75 g THF 600 ml

Puskuriliuos, pH 6,6, valmistettiin liuottamalla 42,8 g ADA, 42,8 g Tris ja 1,5 g kostutusainetta Zony FSB 750 ml:aan tislattua vettä. Molemmat kuivausvaiheet toteutettiin 60°C:ssa 15 10 minuutin aikana. 0,2 x 0,4 cm:n palanen kaksinkertaisesti imeytettyä paperia käytettiin testivälineen valmistukseen.

Näin valmistetut välineet testattiin vasteen suhteen kalium-ionille seeruminäytteessä. Testivälineiden heijas-tuskyky mitattiin Ames SERALYZER®-heijastusfotometrillä 20 60-75 sekuntia kosketuksen jälkeen seerumi-näytteiden kanssa.

Lukemat otettiin 640 nanometrissä.

K/S, laskettuna heijastusmittausten funktiona, merkittiin koordinaatistoon kalium-ionin väkevyyttä (mM) vastaan jokaisessa näytteessä (määritettynä liekkifotometrialla).

25 Arvojen pienimmän neliösumman analyysi antoi suhteen: K/S = 0,1198 /K +J + 0,608 mikä osoitti, että yhdistelmä antoi hyvän vasteen seerumin kalium-väkevyydelle.

Esimerkki 8

Kalium-ioni: polymeerin vaihtelu 30 Valmistettiin kaksi sarjaa testivälineitä (ja -lait teita) yleisellä menetelmällä eri hydrofobisilla polymeereillä.

Hydrobobinen liuos sisälsi:

Kalium-ionoforia I 188 mg 35 NPOE 0,60 ml so 801 50 hydrofobinen polymeeri 0,90 g 7-dekyyli-MEDPIN 75 mg THF 60 ml 5 Puskuriliuos, pH 6,6, valmistettiin sisältämään 300 m>! ADA, 470 mM Tris ja 0,2 % kostutusainetta, Triton®X-100, tislatussa vedessä. Molemmat kuivausvaiheet suoritettiin 60°C:ssa 10 minuutin aikana. 0,2 x 0,4 cm:n palanen kaksinkertaisesti imeytettyä ja kuivattua paperia käytettiin 10 välineen valmistukseen.

Testivälineet, sarja A, muodostettiin käyttäen polykarbonaattia (PC-II) hydrofobisena polymeerinä. Toinen sarja B, muodostettiin käyttäen vinylideenikloridi/akryyli-nitriili-kopolvmeeriä, (VdC/AN), hydrofobisena polymeerinä.

15 Välineen vaste kalium-ioniväkevyydelle määritettiin saattamalla väline kosketukseen vesipitoisten liuosten kanssa, jotka sisälsivät 2, 3, 4, 5 tai 6 mM kaliumkloridia, ja mittaamalla sen heijastuskyky. Molemmat yhdistelmät olivat herkkiä kalium-ionin väkevyydelle, mutta reaktiivisuus, osoi- 20 tettuna kaltevuudella, ja taustan interferenssi, osoitettuna annosvastekäyrän korkeuserolla, muuttuivat. Pienimmän neliösumman regressioanalyysi jokaiselle yhdistelmälle antoi seuraavat annosvasteyhtälöt: 25 A K/S = 0,2214 + 0,0510[K+];r = 0,9642 B K/S = 0.4826 + 0,1662 fK+];r = 0,9886

Molemmat yhdistelmät antoivat positiivisen vasteen kalium-ioniväkevyydelle K/S:n ja kalium-ioniväkevyyden hyvällä 30 vastaavuussuhteella. Yhdistelmä B osoitti suurempaa muutosta K/S:ssä kasvavan kalium-ioniväkevyyden mukana kuin yhdistelmä A.

Esimerkki 9

Kalium-ioni; hydrofobisen apuaineen vaihtelu

Valmistettiin kaksi sarjaa testivälineitä (ja -lait- il 3 5 si 80150 teitä) yleisen menetelmän mukaisesti erilaisin hydrofobisin apuainein.

Hydrofobinen liuos sisälsi:

Kalium-ionoforia I 150 mg 5 hydrofobista apuainetta 0,60 ml PC-III 126 mg 7-dekyyli-MEDPIN 19 mg THF 25 ml 10 Puskuriliuos sisälsi 300 mM ADA, 470 mM Tris ja 0,2 % kostutus-ainetta. Triton®X-100 tislatussa vedessä. Testivälineet (ja - laitteet), sarja A, valmistettiin käyttäen 2-nitro-fenyylioktyylieetteriä (NPOE) hydrofobisena apuaineena. Testivälineet (ja -laitteet), sarja B, valmistettiin 15 käyttäen 2-nitrofenyvlibutyylieetteriä (NPBE) hydrofobisena apuaineena.

Jokaisen testivälinesarjän annosvaste kalium-ioni-väkevyydelle mitattiin käyttäen vesipitoisia näytteitä, jotka sisälsivät 2, 3, 4, 5 tai 6 mM kaliumkloridia. Lasket-20 tujen K/S-arvojen vastaan mM kalium-väkevyyttä pienimmän neliösumman analyysi antoi seuraavat annosvastesuhteet: A K/S = 0,2302 + 0,0747 [K+]; r = 0,9995 25 B K/S = 0,3263 + 0,1150 IK+); r = 0,9962

Molemmat yhdistelmät antoivat hyvän lineaarisen vasteen kalium-ioniväkevyydelle.

Esimerkki 10 30 Kalium-ioni: polymeerin poisjättäminen

Testivälineitä (ja -laitteita) valmistettiin yleisen menetelmän mukaisesti, mutta lisäämättä hydrofobista polymeeriä hydrofobiseen liuokseen.

Hydrofobinen liuos sisälsi: 35 Kalium-ionoforia I 150 mg 52 801 50 NPOE 0,6 ml 7-dekyyli-MEDPIN 19 mg THF 25 ml

Vesipitoinen puskuriliuos,pH 6,6, sisälsi 0,30 M ADA ja 0,47 M Tris, 0,2 %:n kanssa pinta-aktiivista ainetta, 5 Triton'0· X-100. Kaksinkertaisesti imeytetty ja kuivattu paperi leikattiin ja käytettiin testivälineiden muodostamiseen, jotka sopivat käytettäviksi Ames SERALYZER -heijastus-fotometrin kanssa. Välineet valmistettiin ja vaste vesipitoisille liuoksille, jotka sisälsivät 2, 3, 4, 5 ja 6 mM 10 kaliumkloridia, mitattiin 640 nanometrissä kuten yleisessä menetelmässä selostettiin K/S-arvojen (lasketut heijastus-arvoista) vastaan mM kalium-ioniväkevyyttä pienimmän neliösumman analyysi antoi seuraavan annosvastesuhteen: K/S = 0,1888 + 0,0435 ; r = 0,998 15 Yhdistelmä antoi positiivisen vasteen kalium-ioniväke- vyydelle jopa ilman hydrofobisen apuaineen lisäämistä. Esimerkki 11

Litium-ioni; Litium-ionofori II

Testivälineitä (ja -laitteita), jotka ovat herkkiä 20 litium-ionin väkevyydelle, valmistettiin kuten yleisessä menetelmässä selostettiin.

Hydrofobinen liuos sisälsi:

Litium-ionoforia II 10 mg CDA 0,75 ml 25 PVC (pieni mp., 10-%—nen syklo- heksanonissa) 1,0 ml 7-dekyyli-MEDPIN 14 mg sykloheksanonia 3,3 ml

Puskuriliuos oli 0,3 M Bis-Tris, pH 7,5. Molemmat 30 kuivausvaiheet suoritettiin 65°C;ssa 7 minuutin aikana.

Kaksinkertaisesti imeytettyä ja kuivattua paperia käytettiin testivälineen muodostamiseen.

Kun välineet kastettiin vesipitoisiin näytteisiin, jotka sisälsivät 0-50 mM litium-ionia, kehittyi silmämää-35 räisesti erottuvia väritasoja, jotka vastasivat, semikvantita- 53 801 50 tiivisesti, litium-ionin väkevyyttä.

^E't, jotka laskettiin heijastusmittauksista, jotka tehtiin 5 minuuttia välineen kastamisen jälkeen näytteisiin, jokaiselle testatulle litium-ioniväkevyydelle,olivat: 5 [Li ], mM Δε tasojen välillä 1---- 5,91 10 5--------------------4,61 10---------------------2,31 15------- 6,24 25---------------------3,82 50 Väkevyystasot 1, 5, 15, 25 ja 50 mM voitiin helposti erottaa visuaalisesti yhdistelmää käyttäen. Samalla kun 10 mM litium-ioni voitiin erottaa 15 mM:stä, on 5 mM:n visuaalinen erottaminen 10 mMrstä vaikeampaa. Tietenkin kaikki väkevyys-tasot voitaisiin helposti erottaa instrumentaalisesti.

20 Esimerkki 12

Litium-ioni: edullinen suoritusmuoto

Testivälineitä (ja -laitteita) valmistettiin käyttäen 1itium-ionoforia II. Hydrofobinen liuos valmistettiin sekoittamalla 0,04 ml liuosta, joka sisälsi 1,008 g CDA, 18 mg 25 7-dekyyli-MEDPIN ja 90^ul 1itium-ionoforia II; ja 14,6 ml liuosta, joka sisältää 0,19 g VdC/VC ja 25 mL THF. Paperi kuivattiin ja upotettiin sitten puskuriliuokseen, joka sisälsi 0,20 M bisiiniä, joka oli säädetty pH 8,5:een, ja 0,5 % Triton ®X-100. Kaksinkertaisesti imeytettyä paperia 30 kuivattiin uunissa 60°C:ssa. Testivälineiden vaste litium-ioniväkevyydelle arvioitiin heijastuslukemien avulla vesipitoisilla näytteillä, 3otka sisälsivät 0-10 mM litiumkloridia. Heijastusmittauksista kasvavalla mM litium-ioniväkevyvdellä laskettujen arvojen /(K/S) _7 pienimmän neliösumman analyysi 35 antoi seuraavan suhteen: si 80150 <K/S)2 = 0,3146 + 0,03691 ; r = 0,988

Johdettu yhtälö osoittaa, että väline on herkkä kasvavalle litium-ioniväkevyydelle hyvällä vastaavuussuhteella lasketun 2 (K/S) ja litium-ioniväkevyyden välillä.

5 Esimerkki 13

Litium-ioni: vaihtoehtoisia puskureita

Testivälineitä (ja -laitteita) valmistettiin, kuten yleisessä menetelmässä selostettiin. Hydrofobinen liuos valmistettiin kuten esimerkissä 11 selostettiin. Puskuri-10 liuos sisälsi 0,3 M HEPPS, pH 7,5.

Arviointi Macbetn^kolorimetrillä 5 minuuttia välineiden kastamisen jälkeen vesipitoisiin näytteisiin, jotka sisälsivät litium-ionia, antoi seuraavat tulokset: 15 — +-γ /Li / , mM ΔΕ tasojen välillä 10--------------------------5,07 25--------------------------6,33 50 20

Toinen sarja testivälineitä valmistettiin käyttäen puskuriliuosta, joka sisälsi 0,2 M Tris, pH 7,5. Samanlaiset arviointimenetelmät vesipitoisilla näytteillä, jotka sisälsivät litium-ionia, antoivat seuraavat tulokset: 25 /Li*/ , mM ΔΕ tasojen välillä 10------------------------- 6 25------------------------- 5,61 30 50

Molemmat yhdistelmät antoivat likimain saman värinmuutoksen yhdestä näytepitoisuudesta seuraavaan, mutta kuten edellä esitettiin, vaikutti puskurin valinta värin kehittymiseen.

55 801 50

Esimerkki 14

Litium-ioni: kalsiumioni-häirinnän poistaminen

Testivälineitä (ja -laitteita), jotka ovat herkkiä litium-ionin läsnäololle, valmistettiin lisäämällä aineosia, 5 jotka oli tarkoitettu kalsiumioni-häirinnän poistamiseksi. Whatman-suodatinpaperin sarjaimeytystä ja kuivausta käytettiin testivälineiden valmistamiseksi.

Hydrofobinen liuos valmistettiin sekoittamalla 0,4 ml liuosta, joka sisälsi 90^ul 1itium-ionoforia I, 1,004 g 10 CDA ja 9 mg 7-dekyyli-MEDPIN, 14,6 ml:n kanssa liuosta, joka sisälsi 19 mg VDC/AN ja 25 ml THF. Paperi upotettiin hydrofobiseen liuokseen ja kuivattiin. Kuivattu paperi upotettiin sitten liuokseen, joka sisälsi 1 % agaroosia ja 0,2 %

Triton ^ X-100 ja kuivattiin. Kaksinkertaisesti kuivattu 15 paperi upotettiin kolmanteen liuokseen, pH 8,50, joka sisälsi puskuriaineen ja häiriönpoistosysteemin, joka sisälsi 0,46 M Tris, 0f05 M MgSO^‘7H20 (magnesiumsulfaattiheptahydraatti), 0,1 % Triton % -100 ja 0,05 M EGTA. Kolmannen imeyttämisen jälkeen paperi kuivattiin jälleen. Palasta kolminkertaisesti 20 imeytettyä ja kuivattua paperia käytettiin testivälineiden muodostamiseksi, jotka ovat sopivia käytettäviksi Ames SERALYZEI^-heijastusfotometrin kanssa. Näytteitä, jotka sisälsivät 0, 2, 4, 6, 8 tai 10 mM kalsiumkloridia, pipe- toitiin välineille. Reagoineille välineille tehtiin heijastus- 2 25 mittauksia (K/S) :n laskemiseksi. Laskettuja arvoja käytettiin sitten pienimmän neliösumman regressioanalyysissä sen määrittämiseksi olivatko kalsium-häiriönpoistosysteemiä sisältävät välineet herkkiä kalsium-ionin läsnäololle.

Saatu annosvasteyhtälö oli: 30 (K/S) 2 = 0,1488 - 9,77 x 10-5 [ca**] ; r = -0,068, mikä osoittaa, että kalsiumionin läsnäololla ei ole mitään vaikutusta välineisiin, jotka on muodostettu kalsiumionin häiriönpoistosysteemin kanssa.

56 80 1 50

Esimerkki 15

Litium-ioni: Ionofori häiriönpoistosysteeminä

Testivälineitä (ja -laitteita), jotka ovat herkkiä litium-ionin läsnäololle, valmistetaan kuten esimerkissä 5 12 selostettiin. Natrium-ionin häiriön pienentämiseksi li- tium-ionoforin vuorovaikutukseen litium-ionin kanssa, yhdistetään paperiin vesiliukoista, natrium-spesifistä ionoforia, kuten —o o—

H03S-T- I I--SO,H

“ X, X

puskuriliuoksen kanssa. Vesiliukoinen ionofori valmiste-20 uaan lisäämällä kemiallisesti liuentavia ryhmiä, kuten -SO^H, ioni-spesifiseen ionoforiin sillä tavalla, että kemiallinen muutos ei häiritse toivotun ionofori/ioni-komplek-sin muodostumista. Natrium-ionin yhteistoiminta häiriötä poistavan ionoforin kanssa vesipitoisessa faasissa pitää 25 natrium-ionin vesipitoisessa faasissa ja estää häiritsevän ionin tulon hydrofobiseen faasiin, jossa se voisi reagoida litium-ioniforin kanssa.

Muut kationi-häiriöt poistetaan käyttäen sopivasti selektiivisiä ionoforeja, jotka voidaan tehdä vesiliukoi-30 siksi kemiallisella muunnoksella.

Esimerkki 16 Kalsium-ioni

Valmistettiin testivälineiden (ja -laitteiden) formu-laatio esimerkissä 3 kuvatulla tavalla.

Il 57 80 1 50

Hydrofobinen liuos sisälsi:

Kalsium-ionoforia 20 mg NPOE 0,75 ml PVC (pieni mp., lO-%:nen 5 sykloheksanonissa) 1,0 ml 7-dekyyli-MEDPIN 14 mg sykloheksanonia 3,3 ml

Puskuriliuos sisälsi 0,3 M BIS-Tris-propaania, pH 7.5 tis-10 latussa vedessä. Liuska kaksinkertaisesti imeytettyä ja kuivattua paperia käytettiin välineen muodostamiseksi kuten yleisessä menetelmässä selitettiin.

Tulokset instrumentaalisesta arvioinnista Macbeth"-kolorimetrillä, 30 sekuntia välineiden kastamisen jälkeen 15 valmistettuihin vesipitoisiin liuoksiin, jotka sisälsivät kalsium-ionia, olivat: [Ca++], mM Δε tasojen välillä 5------------------ 5,23 20 15------------------- 3,50 20

Tulokset osoittavat, että yhdistelmää voidaan käyttää välineiden valmistukseen visuaalisen korrelaation saarni-25 seksi kalsium-ionin semikvantitatiivisen väkevyyden kanssa vesipitoisilla liuosalueilla.

Esimerkki 17

Kalsium-ioni: edullinen suoritusmuoto

Testivälineitä (ja -laitteita) valmistettiin sarja-30 imeytyksellä ja -kuivauksella, kuten yleisessä menetelmässä selostettiin, paitsi että puskuriliuokseen lisättiin EGTA, voimakasta kalsium sitojaa. EGTA:n väkevyys säädettiin niin, että testiväline ei reagoi kalsiumionin läsnäololle ennenkuin ioniväkevyys saavuttaisi 1 mM. Tämän 35 odotettiin mahdollistavan testivälineen toiminnan suuremmalla tarkkuudella halutulla väkevyysalueella.

58 801 50

Hydrofobinen liuos sisälsi:

Kalsium-ionoforia 100 mg

VdC/VC 282 mg PC-III 100 mg 5 NPOE 0,625 ml 7-dekyyli-MEDPIN 12,5 ml THF 25 ml

Puskuriliuos sisälsi 500 mM TAPSO, 75 mg TritonΦχ-100 ja 10 1 ml liuosta, joka sisälsi 190 mg EGTA, 123 mg MgS04 ·7Η20 ja 1297 mg TAPSO lopullisessa tilavuudessa 10 ml tislatussa vedessä.

Palasta kaksinkertaisesti imeytettyä kuivattua paperia käytettiin testivälineen muodostamiseen. Välineet 15 testattiin vesipitoisilla kalsiumkloridi-liuoksilla, jotka sisälsivät 0-4 mM kalsium-ionia 0,25 mM lisäyksin ja hei-jastusmittauksia suoritettiin AMES SERALYZER*-heijastus-fotometrillä. Tasapainosuhteen perusteella, joka osoittaa kalsium-ioniväkevyyden olevan verrannollinen (K/S)3 reen, 20 (K/S)3 laskettiin jokaiselle väkevyystasolle. Näitä arvoja käytettiin pienimmän neliösumman regressioanalyysissä. Täten määritetty annosvaste oli: (K/S)3 = 1,711 + 1,938 [Ca+ + ]; r = 0,997 25

Negatiivinen korkeusero johtuu annos-vaste-käyrän, joka ei osoita vastetta ennenkuin kalsium-ionin väkevyys saavuttaa arvon 1 mM, lasketusta ekstrapoloinnista. Tulokset osoittavat, että näin muodostetut välineet antavat merkit-30 sevän vasteen kalsium-ioniväkevyydelle, antaen suuren tarkkuuden, joka vaaditaan seerumin kalsium-määrityksiä varten.

On selvää, että keksinnöstä, kuten se edellä on esitetty, voidaan tehdä monia muunnoksia ja vaihteluita 35 poikkeamatta sen hengestä ja piiristä.

il

Claims (11)

59 80150

1. Testiväline ionin läsnäolon määrittämiseksi vesipitoisesta testinäytteestä, tunnettu siitä, että 5 se käsittää huokoisen kantajamatriisin, johon on tasaisesti yhdistetty a) homogeenista hydrofobista koostumusta, joka sisältää ionoforin, joka pystyy muodostamaan kompleksin määritettävän ionin kanssa, hydrofobisen väliaineen ja ilmai- 10 suaineen, joka pystyy reagoimaan ionoforin ja ionin kompleksin kanssa kehittäen havaittavan vasteen; ja b) puskurointlainetta, joka pystyy ylläpitämään pH:n alueella n. 5-10.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen testiväline, 15 tunnettu siitä, että huokoinen kantajamatriisi on paperia.

3. Patenttivaatimuksen 1 tai 2 mukainen testiväline, tunnettu siitä, että ionofori on varaamaton podandi.

4. Jonkin patenttivaatimuksen 1-3 mukainen testivä line, tunnettu siitä, että homogeeninen hydrofobinen koostumus sisältää lisäksi hydrofobista polymeeriä.

5. Jokin patenttivaatimuksen 1-4 mukainen testiväline, tunnettu siitä, että huokoiseen kantajamat- 25 riisiin on lisäksi yhdistetty kostutusainetta ja/tai häi-riönpoistosysteemi.

6. Jonkin patenttivaatimuksen 1-5 mukainen testiväline, tunnettu siitä, että ilmaisuaine on aine, joka pystyy aikaansaamaan värin tai fluoresenssin ilmene- 30 misen, tai muutoksen niissä, ionoforin ja ionin kompleksin läsnäollessa.

7. Jonkin patenttivaatimuksen 1-6 mukainen testiväline, tunnettu siitä, että ilmaisuaine on yhdiste, jolla on rakennekaava 35 60 801 50 on , - X ίο 0 jossa X on halogeeni tai pseudohalogeeni; kukin R, samanlainen tai erilainen, on 2-, 3-, 5- ja/tai 6-asemassa ole-15 va substituentti, joka on valittu alemmasta alkyylistä, välialkyylistä, aryylistä ja fuusioituneesta renkaasta 2,3- tai 5,6-asemissa; ja n on 0-4; tai rakennekaava R* iQior ” Δ V· O jossa R' on H tai alempi alkyyli, edullisesti metyyli, R* 30 on H tai välialkyyli, edullisesti n-dekyyli, ja X on halogeeni tai pseudohalogeeni.

8. Menetelmä testivälineen valmistamiseksi ionin läsnäolon määrittämiseksi vesipitoisesta testinäytteestä, tunnettu siitä, että 35 a) muodostetaan ensimmäinen homogeeninen seos hyd- 61 80150 rofobisesta koostumuksesta, joka sisältää ionoforia, joka pystyy muodostamaan kompleksin ionin kanssa, hydrofobista apuainetta, ilmaisuainetta, joka pystyy reagoimaan ionofo-rin ja ionin kompleksin kanssa kehittäen havaittavan vas-5 teen, ja orgaanista liuotinta; b) muodostetaan toinen homogeeninen seos puskuroin-tiaineesta, joka pystyy ylläpitämään pH;n alueella n. 5-10, ja vedestä tai veden kanssa sekoittuvasta liuottimesta tai niiden seoksista; 10 c) yhdistetään toinen mainitusta ensimmäisestä ja toisesta seoksesta huokoiseen kantajamatriisiin; d) kuivataan yhdistetty matriisi; e) yhdistetään toinen mainitusta ensimmäisestä ja toisesta seoksesta huokoiseen kantajamatriisiin, jolloin 15 saadaan homogeeninen hydrofobista koostumusta ja pusku-rointiainetta sisältävä matriisi; ja f) kuivataan näin käsitelty kantajamatriisi.

9. Patenttivaatimuksen 8 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, etä ensimmäinen seos sisältää li- 20 säksi hydrofobista polymeeriä.

10. Patenttivaatimuksen 8 tai 9 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että toinen seos sisältää lisäksi kostutusainetta ja/tai häiriönpoistosysteemin.

11. Menetelmä ionin läsnäolon määrittämiseksi vesi- 25 pitoisesta testinäytteestä, tunnettu siitä, että testinäyte saatetaan kosketukseen jonkin vaatimuksen 1-7 mukaisen testivälineen kanssa ja havaitaan havaittava vaste. 62 80 1 50