DK160729B - Testmateriale med en hydrofil matrix til bestemmelse af naervaerelsen af en ion i en vandig testproeve, dets fremstilling og anvendelse. - Google Patents

Description

DK 160729 B ; i o

Den foreliggende opfindelse angår målingen af ioner, især ioner i vandig opløsning, samt et testmateriale eller testmiddel til udførelse af sådanne målinger. Med den foreliggende opfindelse tilvejebringes der en hurtig og let 5 metode til bestemmelse af sådanne ioner, hvorved resultaterne bliver tilgængelig for den, der udfører analysen, øjeblikkeligt efter blot at have tilvejebragt kontakt mellem en testprøveopløsning og materialet eller -midlet. Der er ikke noget behov for besværligt anvendeligt, dyrt elek-10 tronisk udstyr, f.eks. ionspecifikke elektroder, flammefo-tometre eller atomabsorptionsspektrofotometre. Det er heller ikke nødvendigt at tage tilflugt til tidsrøvende vådkemiske metoder, f.eks. titrering eller andre laboratoriemetoder. Den foreliggende opfindelse sætter den, der udfører 15 analysen, i stand til blot at tilvejebringe kontakt mellem testprøven og et strimmelmateriale eller et testmateriale med lignende konfiguration, hvorpå en fremkommen farveændring iagttages.

Bestemmelsen af vandige ionkoncentrationer kan an-20 vendes inden for mange tekniske områder. Inden for vandrensningsteknikken må calciumkoncentrationen overvåges omhyggeligt til fastlæggelse af graden af mætning af en ion-bytter-afioniserer. Måling af natriumioner og andre ioner i havvand er af betydning ved fremstilling af drikkevand 25 ombord på et skib i søen. Måling af kaliumniveauet i blod hjælper lægen ved diagnose af tilstande, der fører til muskelirritabilitet og excitatoriske ændringer i den myo-cardiale funktion. Sådanne tilstande omfatter oliguri, anuri, urinobstruktion og renalsvigt på grund af chok.

30 Det siger sig selv, at en hurtig og let metode til bestemmelse af ionkoncentration i høj grad vil forbedre disse tekniske områders stade, samt andre områder, hvor sådanne hurtige og nøjagtige bestemmelser vil være til nytte. Hvis f.eks. en tekniker i et medicinsk laboratorium nøj-35 agtigt kan måle kalium- eller calciumniveauet i en prøve 2

DK 160729 B

af serum eller helblod i løbet af sekunder eller minutter, vil sådanne hurtige resultater ikke blot hjælpe lægen ved diagnosen, men laboratorieeffektiviteten vil også forøges mange gange.

5 Forud for den foreliggende opfindelse omfattede me toder til bestemmelse af ioner i opløsning flammefotometri, atomabsorptionsfotometri og anvendelsen af ionspecifikke elektroder. Et teststrimmelmateriale er angivet i EP offentliggørelsesskrift nr. 41.175 (beskrevet af Charlton i 10 Clin. Chem. 28 (9), 1857-1861 (1982)). Anvendelsen af bestemte forbindelser og materialer, der selektivt tjener til isolering af visse ioner fra prøveopløsningen, er blevet populære i ionspecifikke elektroder. Disse stoffer, der kendes under betegnelsen ionophorer, har den evne, at de 15 selektivt kan isolere ioner fra deres modioner, hvorved der forårsages en ladningsadskillelse og en tilsvarende ændring i elektrisk ledningsevne i den fase, der indeholder ionophoren. Eksempler på ion-ionophor-fænomenet omfatter ionbestemmelser under anvendelse af membranelektroder, væske-20 -væske-fordeling og fluorescens.

Når to opløsninger med forskellige koncentrationer af ioner adskilles ved hjælp af en elektrisk ledende membran, dannes der et elektrisk potentiale (EMK).

I sådanne membran-adskillelsesceller kan membranen 25 være en simpel frittet glasbarriere, der tillader en lille, men målelig grad af iondiffusion fra én opløsning til en anden. Alternativt kan der anvendes en ikke-porøs, elektrisk ikke-ledende film, f.eks. polyvinylchlorid, der er imprægneret med en ionophor. I fraværelse af ionophoren er filmen 30 en isolator, og der kan ikke måles nogen EMK. Når der blandes med en ionophor, bindes ladede ioner til filmen, og en lille, målelig strøm kan induceres til at strømme. Eftersom ionophoren er selektiv i sin affinitet og således kun vil binde visse specifikke ioner, er sådanne celler ionselektive.

35 Enhver målelig EMK skyldes udelukkende tilstedeværelsen af disse ioner.

i 3

DK 160729 B

Den strøm, der flyder tværs over membranen, er så lille, at ingen signifikant mængde K+ eller modion tiltransporteres gennem den. Elektrisk neutralitet af membranen opretholdes enten ved en omvendt strøm af hydro-5 genioner eller ved en parallel strøm af hydroxy1ioner.

Denne anioneffekt kan formindske specificiteten af elektroden i forhold til den bestemte ion, der skal bestemmes, og er en interferens, der bør gøres så lille som mulig.

En hovedvanskelighed ved anvendelsen af sådanne 10 ionselektive elektroder har været den mærkbare formindskelse af nøjagtighed og hastighed for respons gennem tiden.

Endvidere frembringer små ændringer i ionkoncentrationen sådanne små ændringer i EMK, at der kræves et sofistikeret voltmeterudstyr.

15 Det er kendt, at visse antibiotika, f.eks. valino- mycin, har en virkning på de elektriske egenskaber af phospholipid- tolagsmembraner (biologiske membraner), således at disse antibiotika opløseliggør kationer inden i membranen i form af mobile ladede par, hvorved der tilvejebrin-20 ges en "bærer"-mekanisme, ved hjælp af hvilken kationer kan krydse det isolerende carbonhydrid-indre af membranen.

Sådanne komplekser bærer kompleksets ladning gennem membranen således, at en spændingsforskel kan bestemmes mellem opløsningerne på hver side af membranen.

25 I schweizisk patentskrift nr. 479.870, jfr. også US

patentskrift nr. 3.562.129, beskrives anvendelsen af porøse membraner imprægneret med makrocycliske derivater af amino-og oxy-syrer i ionsensitive elektroder. De materialer, der anvendes til dannelse af membranen, er glasfritter og andre 30 porøse membraner. Sådanne elektroder angives at være effektive ved måling af ionaktiviteter.

I US patentskrift nr. 4.053.381 er der beskrevet en lignende teknik, og der anvendes her en ionspecifik membran med ionmobilitet tværs over denne.

35 I US patentskrift nr. 4.272.485 beskrives anvendelse af en ionselektiv membran til dannelse af en optode. En 4

DK 160729 B

ionophor er inkorporeret i en membran, der omgiver og danner et kammer indeholdende en opløsning af en indikator, der ændrer farve i nærværelse af ionen. Dette arrangement kræver transport af ionen gennem den ionselektive membran og ind i 5 indikatoropløsningen, jfr. patentskriftets tegning og spalte 3, linie 40-50. Til forøgelse af systemets selektivitet kan der anvendes et arrangement af multiple ionselektive membraner og indikatoropløsninger. Begge anvendelser af den ionselektive membran, elektroden og optoden kræver transport 10 af ionen gennem membranen til tilvejebringelse af et måleligt respons.

En anden kendt anvendelse af ionophorer ved ionbestemmelse er ved væske-væske-fordeling. Ved denne metode opløses en hydrofob ionophor i organisk opløsningsmiddel, 15 der ikke er blandbart med vand. Eisenman et al., J. Membrane Biol. 1, 294-345 (1969) beskriver den selektive ekstraktion af kationer fra vandige opløsninger i organiske opløsningsmidler via makrotetralid-actin antibiotika. Denne teknik omfatter omrystning af en organisk opløsnings-20 middelfase indeholdende de pågældende antibiotika med vandige opløsninger indeholdende kationiske salte af lipidop-løselige, farvede anioner, f.eks. picrater og dinitrophe-nolater. Intensiteten af farven af den organiske fase måles dernæst spektrofotometrisk til angivelse af den mæng-de salt, der er blevet ekstraheret. Faseoverføring er også blevet studeret af Dix et al., Angew. Chem. Int. Ed.

Engl., Γ7, 857 (1978) og i oversigtsartikler, herunder Burgermeister et al., Top. Curr. Chem., 69, 91 (1977), Yu et al., "Membrane Active Complexones", Elsevier, Amster- ο Π dam (1974) samt Duncan, "Calcium in Biological Systems", Cambridge University Press (1976) .

Sumiyoshi et al. beskriver i Talanta, 2_4, 76 3-765 (1977) en anden metode, der kan anvendes til bestemmelse af K+ i serum. Ved denne metode fjernes der protein fra 35 serum ved hjælp af trichloreddikesyre, der tilsættes et indikator-farvestof, og der omrystes med et opløsnings- 5

DK 160729 B

middel såsom chloroform indeholdende valinomycin.

Fordeling af en forbindelse er hurtig og effektiv mellem væsker, således som dette er påvist af Eisenman, på grund af mobiliteten af ionophor-bæreren og ionerne, 5 der tillader det transporterede materiale at diffundere hurtigt bort fra grænsefladen. En sådan mekanisme er normalt umulig i den faste fase på grund af stivheden, immobiliteten og den i det væsentlige nul-diffusion af materialer i en fast fase.

10 Et andet forsøg på måling af ionaktivitet i van dige opløsninger bygger på fluorescerende anioner, jfr.

Feinstein et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 6j8, 2037--2041 (1971). Det angives, at tilstedeværelsen af kation-ionophor-komplekser i organiske opløsningsmidler er kendt, 15 men at kompleksdannelse i rent vandige medier ikke tidligere er blevet påvist. Feinstein et al. viser eksistensen af sådanne komplekser i vand ved anvendelse af de fluore- [ scerende salte l-anilino-8-naphthalen-sulfonat og 2-p- 1 -toluidinyl-sulfonat.

20 Det har vist sig, at interaktionen af ionophor-kat- ion-komplekserne med de fluorescerende farvestoffer frembringer forøget fluorescensemission, forøget levetid og polarisation og et signifikant blå-skift ved fluorescensspektrets emissionsmaksima. Ved konstante koncentrationer 25 af ionophor og fluorophor viser intensiteten af fluorescensemissionen sig at være en funktion af kationkoncentratio-nen.

Den ionbestemmelse, der er beskrevet i US patentskrift nr. 4.367.072, er primært rettet mod anvendelsen af en chro-30 mogen ionophor, dvs. en ionophor, der er covalent bundet til et chromogen. Et ladet chromogen-ionophor-kompleks med den samme ladning som den ion, der skal bestemmes, anvendes også. Ved anvendelsen sættes en chromogen ionophor eller et i ladet chromogen-ionophor-kompleks til en flydende prøve, og 35 opløsningens farve overvåges spektrofotometrisk. Der er !

omtalt inkorporering af ionophoren i en bærer såsom papir, I

6

DK 160729 B

syntetisk harpiksfilm, siliciumoxid, naturlige eller syntetiske fibre eller metal.

I GB patentskrift nr. 1.271.209 er der beskrevet et materiale indeholdende et kompleksdannende middel for cu-5 proioner. Midlet ændrer farve ved kompleksdannelse med cupro-ioner. Midlet kan inkorporeres i en papirmatrix ved anvendelse af en totrinsmetode, ved hvilken de organisk opløselige bestanddele og de vandopløselige bestanddele inkorporeres særskilt.

10 Både den chromogene ionophor og chelateringsmidlet involverer anvendelsen af et enkelt materiale, der både danner kompleks med ionen og ændrer farve.

I EP offentliggørelsesskrift nr. 41.175 er der beskrevet et iontest-testmateriale, hvor en ionophor er inkor-15 poreret i et ikke-polært lag af materiale, og vandringen af et detekterbart stof til overfladen af laget måles og relateres til den ionkoncentration, der skal måles. Denne test er blevet diskuteret af den pågældende opfinder i Clin.

Chem. 28 (9), 1857-1861 (1982), og der anføres her data, 20 der viser, at testen kan anvendes til måling af kalium i serum. Det detekterbare stof er fortrinsvis et modion-farve-stof. I alle udførelsesformer er modionen ekstern i forhold til det ikke-polære ionophor-inkorporerede lag.

I US patentskrift nr. 4.234.313 er der beskrevet et 25 testmateriale, i hvilket indikatoren giver respons på det materiale, der testes, på en sådan måde, at den mister sin farve direkte proportionalt med den tilstedeværende mængde materiale. Et foretrukkent indikatorsystem til detektering af urinsyre er kompleksbundet iod, en iodophor, der mister 30 farve med stigende koncentration af urinsyre. Tab af farve for p-nitrophenol ved en ændring af pH er også beskrevet, men der forefindes ingen omtale af iontestning med ionophorer.

Til opsummering af baggrunden af tekniske udviklin-35 ger, der har ført til den foreliggende opfindelse, kan det anføres, at der kendes mange metoder til bestemmelse 7

DK 160729 B

af ioner i opløsning. Metoder, ved hvilke der anvendes instrumenter, omfatter sådanne sofistikerede tekniske metoder som ionspecifik potentiometri, flammefotometri og atomabsorptionsfotometri. Anvendelsen af ionophorer, 5 der selektivt danner komplekser med specifikke ioner, har ført til fire grundlæggende metoder, nemlig anvendelsen af ionselektive elektroder, væske-væske-fordeling, forøgelse af fluorescensen og chromophor-mærkede iono-phor-konj ugater.

10 Ingen af disse metoder giver imidlertid den, der ud fører en analyse, enkle og hurtige analyseresultater ved tilvejebringelse af kontakt mellem en testprøveopløsning og et testmateriale eller -middel. Den foreliggende opfindelse tillader derimod den, der udfører analysen, blot at 15 tilvejebringe kontakt mellem prøven og en "dyp- og -aflæs"--teststrimmel eller -testmateriale med tilsvarende konfiguration, hvorpå man iagttager en ændring i farve eller andet detekterbart respons. Endvidere kan graden af et sådant respons reguleres ved variation af støkiometrien for 20 de reaktanter, der frembringer det nævnte respons.

Data, der viser dosis-respons-målinger i forbindelse med forskellige udførelsesformer for den foreliggende opfindelse, er afbildet grafisk på tegningen i fig. 1-8.

De forsøg, ved hvilke de omhandlede data er fremkommet, 25 er beskrevet i de efterfølgende eksempler.

Den foreliggende opfindelse bygger på udviklingen af et nyt testmateriale til detektering af tilstedeværelsen af en ion i en vandig testprøve samt bestemmelse af j dennes koncentration. Testmaterialet er ifølge opfindelsen 30 ejendommeligt ved, at det omfatter en hydrofil matrix, inkorporeret med findelte småkugler af en hydrofob bærer, i hvor bæreren indeholder en ionophor, der er i stand til at danne et kompleks med ionen, og et reporter-stof, der er i stand til at reagere med komplekset af ionophor og ion til 35 frembringelse af et detekterbart respons, f.eks. en ændring i eller fremkomsten af farve eller fluorescens.

8

DK 160729 B

Testmidlet ifølge opfindelsen er ejendommeligt ved, at det omfatter en aflang understøtning med en øvre, i det væsentlige plan flade og et testmateriale ifølge ethvert af kravene 1-8 fastgjort til den plane overflade af understøt-5 ningen. Understøtningen kan f.eks. være en plastfilm.

Opfindelsen angår endvidere en fremgangsmåde til fremstilling af et testmiddel til bestemmelse af nærværelsen af en ion i en vandig testprøve, og denne fremgangsmåde er ejendommelig ved, at man fremstiller en første blanding af 10 vand og en hydrofil polymer, fremstiller en anden blanding af en hydrofob bærer, en ionophor, der er i stand til at danne et kompleks med ionen, og et reporter-stof, der er i stand til at reagere med komplekset af ionophoren og ionen til frembringelse af et detekterbart respons, idet man kom-15 binerer den første og den anden blanding til dannelse af en stabil emulsion af findelte småkugler af den anden blanding i den første blanding, overtrækker emulsionen på en aflang understøtning med en øvre, i det væsentlige plan overflade, og fordamper vandet fra emulsionen til frembringelse af en 20 hydrofil matrix inkorporeret med findelte småkugler af den anden blanding, idet matrixen herved fastgøres til den plane overflade af understøtningen.

Ved anvendelsen bringes testprøven i kontakt med testmaterialet eller testmidlet. Nærværelsen og/eller 25 koncentrationen af ionen bestemmes derefter ved iagttagelse af ethvert frembragt detekterbart respons.

De her omhandlede testmaterialer og -midler giver hurtige resultater, idet et tilstrækkeligt detekterbart respons i de fleste tilfælde frembringes i løbet af i 30 det mindste nogle få minutter. Der kræves ud over materialet ifølge opfindelsen intet besværligt anvendeligt eller dyrt testudstyr, og det fremkomne respons kan have en tilstrækkelig størrelse til at muliggøre direkte visuel detektering. Det har endvidere vist sig, at den far-35 ve eller andet respons,der frembringes i testmaterialerne, er stabilt, i nogle tilfælde i dage, således at et antal anvendte testmaterialer kan opbevares til aflæsning på et senere tidspunkt.

9

DK 160729 B

O

En række udtryk, der anvendes i den foreliggende beskrivelse, skal her defineres til sikring af, at de opfattes på den tilsigtede måde. Der skal således anføres de følgende definitioner til klarlæggelse af opfindelsens 5 omfang og muliggørelse af dens formulering og anvendelse.

Udtrykket "ionophor" omfatter molekyler, der er i stand til at danne et kompleks med et bestemt ion, i nogle tilfælde til i det væsentlige udelukkelse af andre.

Eksempelvis bindes det cycliske polypeptid valinomycin se-10 lektivt til kaliumioner i opløsning til dannelse af et kationisk kompleks. Udtrykket omfatter tillige koronan-der, kryptander og podander.

"Reporter-stof" er et stof, der er i stand til at reagere med et ionophor-ion-kompleks til frembringelse 15 af en farveændring eller et andet detekterbart respons. Reporter-stoffet kan således være et ionisk farvestof, således, at når det befinder sig i sin ioniserede tilstand, er det en modion, dvs. modsat i ladning til den ion, for hvilken der analyseres. Nogle eksempler herpå 20 er Erythrosin B, 7-amino-4-trifluormethyl-coumarin og 2,6-dichlorindophenol-natriumsalt. Reporter-stoffet omfatter også phenoliske forbindelser, f.eks. p-nitrophe-nol, der er forholdsvis farveløs i den ikke-ioniserede tilstand, men som farves ved ionisering. Reporter-stoffet 25 kan også være et sådant, som kan udløse et detekterbart respons sammen med andre bestanddele. Eksempelvis kan iodidionen frembringe et detekterbart respons ved reaktion med ionophor-ion-komplekset i nærværelse af stivelse og et oxidationsmiddel. ! 30 Ved "reagere"» "reaktion" eller "interaktion" skal der forstås enhver samvirkning mellem et reporter-stof og et ionophor-ion-kompleks, der fører til et detekterbart respons.

Et eksempel på, at reporter-stoffet reagerer med komplekset, er det tilfælde, hvor reporter-stoffet ændres af 35 komplekset fra en farveløs til en farvet tilstand, f.eks. i tilfælde af p-nitrophenol.

10

DK 160729 B

o

Udtrykket "detekterbart respons" skal her betegne en ændring i - eller fremkomsten af en parameter i et testmid-delsystem, der kan opfattes, enten ved direkte iagttagelse eller ved hjælp af et instrument, og som er en funk-5 tion af nærværelsen af en specifik ion i en vandig testprøve. Som eksempler på et detekterbart respons kan nævnes en ændring i eller fremkomsten af farve, fluorescens, reflektans, pH-værdi, kemoluminescens og infrarøde spektre.

10 Ved udtrykket "intermediært alkyl" skal der for stås en alkylgruppe med fra 4 til 12 carbonatomer. Udtrykket omfatter normale og forgrenede isomere. Gruppen kan være usubstitueret, eller den kan være substitueret, forudsat at en sådan substitution ikke interfererer med 15 virkningen af det her omhandlede testmateriale eller -middel med hensyn til dettes evne til detektering af ioner.

Udtrykket "lavere alkyl" skal betegne en alkyl-del indeholdende fra 1 til 4 carbonatomer. Udtrykket 20 omfatter methyl, ethyl, n-propyl, isopropyl, n-butyl, sek.butyl og tert.butyl. Disse grupper kan være usubsti-tuerede, eller de kan være substituerede, forudsat at substituenterne ikke interfererer med funktionen af de her omhandlede testmaterialer eller -midler med hensyn til de-25 res evne til detektering af ioner.

Udtrykket "pseudohalogen" betegner atomer eller grupper af atomer, som, når de er bundet til et umættet eller aromatisk ringsystem, påvirker ringsystemets elektro-filitet eller nukleofilitet og/eller har en evne til at på-30 virke fordelingen af en elektrisk ladning ved delokalise-ring eller resonans på lignende måde som halogenerne. Medens halogenerne således betegner atomer fra gruppe VII,. f.eks. F, Cl, Br og I, omfatter pseudohalogenerne sådanne grupper som -CN, -SCN, -OCN, -N3, -COR°, -C00R°, -C0NHR°, 35 -CF3, “CCI3, -N02, -S02CF3, -S02CH3 og -S02C6H4CH3, hvor R° betyder alkyl eller aryl.

j 11

DK 160729 B

o

Udtrykket "småkugler" refererer til sfæriske eller quasi-sfæriske kugler eller andre formede partikler af et stof, således som de dannes i bifasiske suspensioner eller emulsioner. Når der således dannes en olie-i-vand-sus-5 pension eller -emulsion, eksisterer den hydrofobe oliefase som sfæriske dele omgivet af en mere eller mindre kontinuerlig vandig fase. Jo mere energi, der tilføres ved dannelse af suspensionen, desto mindre er størrelsen af småkuglerne. Småkuglernes størrelse kan ligeledes regule-10 res ved hjælp af additiver, f.eks. detergenter og andre emulgeringsmidler.

Betegnelsen "småkugler" skal også omfatte findelte partikler af et fast materiale. Når det hydrofobe medium således er ikke-porøst, ikke-polært materiale, f.eks.

15 en polymer, kan det formales eller på anden måde findeles til faste partikler.

Udtrykket "hydrofil" betyder, at et stof har en kraftig eller udtalt tendens til binding eller absorption ! af vand. Udtrykket omfatter de materialer, der undergår 20 kvældning eller dannelse af reversible geler med vand, eller som kan fugtes eller gennemtrænges af vand, eller som danner vandige opløsninger.

Det her omhandlede testmateriale omfatter fire grundelementer, nemlig en hydrofil matrix, findelte småkug-25 ler af en hydrofob bærer, en ionophor, hvori småkuglerne er inkorporeret, samt et reporter-stof, der også er indeholdt i småkuglerne. Når en vandig testprøve indeholder en ion, der er i stand til at danne kompleks med ionophoren, kan ionen træde ind i de hydrofobe småkugler og reagere 30 med reporter-stoffet, hvorved der frembringes et detek-terbart respons.

For at testmaterialet kan tilvejebringe et detekter-bart respons på en specifik ion, er det nødvendigt^ at den vandige testprøve har i det væsentlige uhindret adgang til j 35 den ydre overflade af de hydrofobe småkugler. Den matrix, med hvilken småkuglerne er inkorporeret, skal således være let befugtelig med vandige systemer, dvs. hydrofil.

ji

O

12

DK 160729 B

Typiske eksempler på nogle materialer, der udviser passende hydrofilitet, er gelatine, agarose, polyvinylalko-hol, polypropylenimin, carrageenan og alginsyre. Disse forbindelser er vandopløselige polymere, der i deres tørre 5 tilstand udviser en markeret fugtelighed med vandige medier.

Andre uopløselige polymermaterialer, der er egnet til anvendelse, omfatter porøse stoffer, f.eks. papir og andre celluloseholdige systemer, sintrede keramiske frit-10 ter og lignende porøse, hydrofile matrixer, forudsat at småkuglernes integritet kan opretholdes. En egnet matrix er således f.eks. en kombination af papir og gelatine. I dette tilfælde kan en filtrérpapirpude imprægneres med en stabil emulsion af vandig gelatine og de hy-15 drofobe småkugler. Ved tørring bliver filtrérpapir-gela-tine-matrixen i stand til at bibeholde integriteten af småkuglerne, indtil testmaterialet anvendes på den tilsigtede måde.

Den primære funktion af den her omhandlede hydro-20 fobe bærer er at isolere ionophoren og reporter-stoffet fra den vandige testprøve. Bæreren kan således være et flydende eller fast stof, blot det har tilstrækkelig hydrofo-bicitet til at opnå den nævnte isolation af reagenser fra testprøven. Endvidere skal bæreren udelukke væsentlig 25 ionisk penetration af småkuglerne, medmindre ionen er en sådan, der er i stand til at danne kompleks med ionophoren.

Stoffer, der kan anvendes som hydrofobe bærere, omfatter væsker, der samtidig er uopløselige i vand og i 30 stand til at opløse en ionophor og et reporter-stof i tilstrækkelig koncentration til tilvejebringelse af et væsentligt respons ved anvendelsen. Stofferne skal være forholdsvis ikke-flygtige, dvs. med et kogepunkt på mindst ca.

150°C. Typiske væsker, der falder i denne katagori, er tri-35 cresylphosphat, 2-nitrophenyloctylether, 2-nitrophenyl- butylether, dioctylphthalat, tri-2-ethylhexylphosphat, di-

O

13

DK 160729 B

-2-ethylhexylphosphat, di-2-ethylhexylsebacat og n-butyl-acetylricinolat.

Ud over olier og andre flydende medier er det ligeledes muligt at anvende findelte partikler (småkugler) 5 af faste materialer til at indeholde og isolere ionophoren og reporter-stoffet. Bæreren kan således omfatte hydrofobe materialer såsom organiske polymere, der er i det væsentlige ikke-porøse og ikke-polære. Disse omfatter polyvinyl fluorid, polyvinylchlorid, vinylchlorid-vinylacetat-10 -copolymer, vinylchlorid-vinylidenchlorid-copolymer, vi-nylchlorid-vinylacetat-vinylalkohol-terpolymer, vinyliden-chlorid-acrylonitril-copolymer og polyurethan. Mange andre polymere materialer vil naturligvis være egnede til anvendelse som den hydrofobe bærer, og fastlæggelsen 15 af sådanne materialers art ligger inden for fagmandens formåen under hensyn til de i nærværende beskrivelse givne anvisninger.

Den ionophor, der anvendes ifølge opfindelsen, er et begreb, der har et bredt omfang, jfr. definitionen i 20 det foregående. Begrebet omfatter multidentate cycliske forbindelser, der indeholder donoratomer i deres cycliske kæder. Sådanne multidentate cycliske forbindelser kan være monocycliske eller polycycliske. Alternativt kan ionophoren være en åben kæde indeholdende donoratomer. Ionophor-25 -begrebet omfatter således monocycliske systemer, der er ionspecifikke, og som betegnes koronander, endvidere polycycliske, ionspecifikke forbindelser, der betegnes kryptander, samt åbenkædede strukturer, der kendes som podander, og som er i stand til selektivt at danne komplekser med 30 ioner.

Koronanderne er monocycliske forbindelser, der indeholder donoratomer, som er elektronrige eller -deficiente, og som er i stand til at danne komplekser med bestemte kationer og anioner på grund af deres specielle strukturer.

35 ! Omfattet af dette udtryk er de krone-ethere, i hvilke den j monocycliske kæde indeholder oxygen som donoratomer. An- j

O

14

DK 160729 B

dre koronander er forbindelser, der indeholder en samling elektronrige atomer såsom oxygen-, svovl- og nitrogenatomer. På grund af de specielle størrelser og den specielle geometri af bestemte koronander er disse egnede til kom-5 pleksdannelse med forskellige ioner. Ved en sådan kompleksdannelse orienteres de elektronrige atomer, f.eks. oxygenatomerne i en krone-ether, mod den elektron-deficiente kation. Carbonatomsegmenterne i kæden projiceres samtidigt i en retning udad fra ionen. Det fremkomne ion-koronand-kom-10 pleks er således ladet i centret, men er hydrofobt ved dets perimeter.

Kryptanderne er de polycycliske analoge til koro-nanderne. De omfatter således bicycliske og tricycliske multidentate forbindelser. I kryptanderne er det cycliske 15 arrangement af donoratomer tredimensionelt i rummet i modsætning til koronandens i det væsentlige plane konfiguration. En kryptand er i stand til så at sige at indeslutte ionen på tredimensionel måde, og den er dermed i stand til at tilvejebringe stærke bindinger til ionen ved dan-20 nelsen af komplekset. Ligesom i koronanderne kan donoratomerne omfatte sådanne atomer som oxygen, nitrogen og svovl.

Ioner kan også danne komplekser med ikke-cycliske forbindelser. Eksempelvis har en lineær kæde, der indeholder en regulær sekvens af elektronrige atomer, f.eks. oxy-25 genatomer, evnen til at associere sig med positivt ladede ioner til dannelse af komplekser, ikke ganske uligt koronanderne og kryptander. Den væsentlige strukturelle forskel mellem podander og de andre to ionophorer er strukturens åbenhed. Podanderne kan således underinddeles i mono-30 podander, dipodander, tripodander etc. En monopodand er derfor en enkelt organisk kæde indeholdende donoratomer, en dipodand er to sådanne kæder koblet med et broatom eller en gruppe af atomer, der er i stand til at tilvejebringe en variabel rumlig orientering, og en tripodand er 35 tre kæder knyttet til et centralt atom eller en central gruppe af atomer.

DK 160729 B j 15

O

Nogle af de ionophorer, der har vist sig at være særligt anvendelige til opfindelsens formål, er angivet i den følgende tabel sammen med de kationer, med hvilke de er i stand til selektivt at danne komplekser.

5

Ionophor Kation

Valinomycin K+ 4,7,13,16,21-pentaoxa-l,10-diazabicy- clo[8,8,5]tricosan (Kryptofix 221) Na+ 10 4,7,13,16,21,24-hexaoxa-l,10-diazabi- cyclo[8,8,8]hexacosan (Kryptofix 222) K+ 4,7,13,18-tetraoxa-l,10-diazabicycΙοί 8,5,5]eicosan (Kryptofix 211) Li 12-Krone-4 Li+ 15 16-Krone-5 Na+, K+ 18-Krone-6 K+

Dibenzo-18-krone-6 K+

Dicyclohexano-18-krone-6 K+ 20 Kryptofix er et registreret varemærke for E. Merck,

Darmstadt, Tyskland.

Når den ion, der er af interesse, er til stede i testopløsningen, er det reporter-stoffet, der tilveje-25 bringer det detekterbare respons ved reaktion med iono-phor-ion-komplekset. Reporter-stoffet kan variere i sammensætning fra en enkelt forbindelse, f.eks. en chromo-gen modioniserbar forbindelse, til en blanding af reaktive materialer, der frembringer et detekterbart produkt,

30 når deres reaktionskæde udløses ved nærværelsen af kom- J

i plekset. Det vil således ses, at når der ikke er nogen j analyt-ion til stede, forbliver reporter-stoffet passivt, | og der iagttages intet detekterbart respons. Alternativt er det således, at når den bestemte ion, der overvåges, 35 er nærværende, reagerer komplekset med reporter-stoffet og inducerer det til at undergå en detekterbar ændring.

O

16

DK 160729 B

I det tilfælde, hvor reporter-stoffet er en enkelt forbindelse, kan denne være en dissocierbar forbindelse, således at der ved dissociation dannes en farvet ionisk forbindelse. Et ionisk reporter-stof vælges typisk således, at den farvede ion har modsat ladning af analytten.

O

Der kan også anvendes en dissocierbar forbindelse, i hvilken modionen til analytten er fluorescerende. Eksempler på sådanne chromophore og fluorophore reporter-stoffer er di-chlorphenolindophenol, fluorescein og derivater deraf, 10 8-anilino-l-naphthalensulfonsyre, 7-amino-4-trifluorme- thyl-coumarin, Erythrosin B, Orange IV, Ploxin B og Eosin Y. Strukturerne for Erythrosin B, Ploxin B og Eosin Y er givet i "Aldrich Handbook of Fine Chemicals", Aldrich Chemical Company, Milwaukee (1983). Strukturen for Orange IV 15 kan findes i "The Merck Index", 9. udg., Merck & Co., Inc., Rahway (1976).

Når reporter-stoffet omfatter en blanding af reaktive materialer, er der et stort spillerum til rådighed ved udvælgelse af en passende kombination af bestanddele.

2Q Eksempelvis kan et system være iodidion, stivelse og et oxidationsmiddel. Et sådant system kan anvendes i et testmateriale, hvor den hydrofobe bærer ud over ionophoren indeholder stivelse og oxidationsmidlet. lodid kan dernæst sættes til testprøven. I nærværelse af en analyt-25 -ion vil dannelse af ion-ionophor-komplekset inducere iodidet til at associere sig med matrixen, hvorpå det vil omdannes til frit iod, hvorved der indikeres en positiv test.

Et yderligere eksempel på en reaktionssekvens, der 3Q kan anvendes som reporter-stof, er en sådan, der involverer dissociation af en proton fra en phenol, hvorved der initieres en koblingsreaktion til dannelse af et farvet produkt. Den såkaldte Gibbs-reaktion er typisk for en sådan reaktionssekvens, hvor en 2,5-cyclohexadien-l-on-2,6-diha-35 logen-4-halogenimin (I) kobles med en phenol (II) til dan nelse af et farvet reaktionsprodukt (III).

17 DK 160729 B

i

O

X 8

V 'V V

NX OH i (I} (II) N CITI ) *.-φ 0' 15 I denne reaktionssekvens kan være en vilkårlig sub stituent i stilling 2, 3, 5 og/eller 6, der ikke hindrer den samlede reaktionsrækkefølge. betyder således lavere eller intermediært alkyl eller aryl, eller R kan danne et kondense- n ret ringsystem i enten 2,3- eller 5,6-stillingerne. X beteg-20 ner halogen eller pseudohalogen som ovenfor defineret, og n er et tal fra 0 til 4. Denne type reporter-stof kan anvendes ved inkorporering af forbindelser med strukturerne (I) og (II) med den hydrofobe bærer.

En yderligere anvendelse af de kemiske forhold ifølge 25 Gibbs involverer forbindelser med en struktur såsom (III) i dens ikke-ioniserede form. Dannelsen af ion-ionophor-komplek-set resulterer i en reaktion således, at reporter-stoffet (III) giver en iagttagelig farve i sig selv. Dette fænomen svarer til at gå frem i overensstemmelse med det følgende 30 reaktionsskema og de viste resonansstrukturer: i | i 35

O

18

DK 160729 B

O” . o • *.-φ ^ νφ

N ^- N

A Λ

10 i i JOL

o OH

15 -H+ 20 -iéi Λ "T^VJ R„-{- i

25 N V

Λ A

Π o x ir x A*

30 Ο I

0 35

DK 160729 B

19 o i hvor substituenterne R, der er ens eller forskellige, er lavere eller intermediært alkyl, dvs. C^-C^-alkylf aryl eller et kondenseret ringsystem i 2,3- eller 5,6-stillingerne, og n er et tal fra 0-4. Særlig foretrukken er en forbindelse nu 5 med strukturen .

N

10 iL

O

x II * o 15 i hvilken R' betyder hydrogen eller lavere alkyl, dvs. C^-C^--alkyl. I det tilfælde, hvor R' betegner methyl, har forbindelsen vist sig at være særlig egnet til opfindelsens formål. i Et yderligere foretrukkent reporter-stof er en forbindelse med strukturen ‘

20 OH

'τΟφτ'

25 X

A

o 30 i hvilken R betegner intermediært alkyl, dvs. en gruppe ! med fra 4 til 12 carbonatomer, og hvor R' har den ovenfor angivne betydning. Forbindelser såsom disse har vist sig at være særligt resistente mod mulig interferens på grund af nærværelsen af serumalbumin i testprøven. Foretrukne 35 blandt disse typer reporter-stoffer er det stof, i hvil- ! )

O

20

DK 160729 B

ket RK betyder n-decyl, og R' betyder methyl.

De ovenfor beskrevne testmaterialer kan anbringes ved den ene ende af en aflang understøtning, idet den anden ende af understøtningen tjener som et håndgreb. Et så-5 dant testmiddel kan holdes ved håndgrebsenden, medens den anden ende, der bærer testmaterialet, bringes i kontakt med testprøven.

Materialer, der kan anvendes til understøtningen, omfatter film af et overmåde stort antal plastmaterialer 10 eller polymere. Eksempler herpå omfatter sådanne polymere materialer som celluloseacetat, polyethylenterephthalat, polycarbonater og polystyren. Understøtningen kan være uigennemskinnelig, eller den kan transmittere lys eller anden form for energi. Foretrukne understøtninger omfatter 15 transparente materialer, der er i stand til at transmittere elektromagnetisk stråling ved en bølgelængde i området fra ca. 200 nanometer (nm) til 900 nm. Understøtningen behøver naturligvis ikke at transmittere over hele området fra 200 til 900 nm, omend det til fluorometrisk detekte-20 ring af analyseresultater er ønskeligt, at understøtningen er transparent over et bredere bånd, der er bredere eller i det mindste lig med absorptions- og emissionsspektrene for det fluorescerende materiale, der anvendes til detektering. Det kan også være ønskeligt at have en under-25 støtning, der transmitterer ét eller flere snævre bølgelængdebånd og er uigennemskinneligt for tilstødende bølgelængdebånd. Dette kan eksempelvis opnås ved imprægnering eller overtrækning af understøtningen med et eller flere farvende midler, der har passende absorptionskarak-30 teristika.

Til fremstilling af et testmiddel ifølge opfindelsen fastgøres et lille rektangel af testmaterialet, dvs. en hydrofil matrix inkorporeret med småkugler af en hydrofobt bærer indeholdende en ionophor, et reporter-35 -stof og eventuelt andre bestanddele, til en aflang under-

O

21

DK 160729 B

støtning med en øvre, i det væsentlige plan overflade, f.eks. et aflangt stykke polystyrenfilm. Testmaterialestykket fastgøres til den plane flade ved den ene ende, idet den anden ende af polystyrenmaterialet efterlades således, at det kan 5 tjene som et bekvemt håndgreb.

Testmaterialet kan fastgøres ved enhver metode, der er forenelig med den tilsigtede anvendelse. En metode omfatter anvendelsen af et dobbeltsidet adhæsivt tape mellem kvadratet af testmateriale og understøtningen. Et sådant tape-10 materiale kendes som Double Stick ®, der fås fra 3M Company.

En anden metode til fastgørelse af testmaterialet består i udstøbning af en film af en emulsion af en vandig polymerfase, dvs. en hydrofil matrix, og en hydrofob bærer indeholdende ionophoren og reporter-stoffet direkte på un-15 derstøtningen, efterfulgt af et tørringstrin.

Testmaterialet og -midlet ifølge opfindelsen kan anven- | des ved udførelsen af et stort antal kemiske analyser, ikke 1 blot inden for den kliniske kemi, men også i kemisk research | og i kemiske proceskontrollaboratorier. Midlerne og materia-20 lerne er velegnede til klinisk testning af legemsvæsker, f.eks. blod, blodserum og urin, eftersom der inden for dette område hyppigt udføres et stort antal gentagne tests, og testresultaterne kræves ofte meget kort tid efter, at prøven er udta get. Inden for f.eks. blodanalyse kan opfindelsen anvendes 25 ved udførelsen af kvantitativ analyse for mange af de io-niske blodbestanddele, der er af klinisk interesse.

Testmaterialet (og testmidlet) anvendes ved at bringe det i kontakt med testprøven i et tilstrækkeligt tidsrum, f.eks. nogle minutter. Efter dette tidsrum kan over-30 skud af prøve fjernes, f.eks. ved vaskning i en svag vandstrøm og samtidig aftrykning med trækpapir, eller ved simpel af strygning. Alternativt kan det være unødvendigt at fjerne prøven.

Såfremt den ion, for hvilken der analyseres, er til * 35 stede i testprøven, vil komplekset af ionophor og ion rea-

DK 160729B

O

22 gere med reporter-stoffet, og der vil fremkomme et detek-terbart respons. Når reporter-stoffet er et dissocierbart stof, der frembringer en farvet modion til analytten, vil der dannes en iagttagelig farve i matrix-testmateria-5 let. Når reporter-stoffet er en fluorophor, f.eks. fluorescein, kan der anvendes et fluorescens-spektrofotometer til måling af det detekterbare respons, der frembringes i testmaterialet, i dette tilfælde fremkomsten af eller en ændring i fluorescensen. Andre metoder, der kan anvendes til iagt-10 tagelse af et detekterbart respons, omfatter reflektans-spektrofotometri, absorptionsspektrofotometri og målinger af lystransmission. Når testprøven er blodserum, kan der Når testprøven er blodserum, kan der anvendes transmissionsteknik til detektering og kvantificering af nærvæ-15 reisen af ethvert reaktionsprodukt, hvis dannelse tjener som det detekterbare respons. I dette tilfælde er strålingsenergi, f.eks. ultraviolet, synlig eller infrarød stråling, rettet mod én overflade af testmaterialet, og udsendelsen af denne energi fra den modsatte overflade måles.

20 Almindeligvis har elektromagnetisk stråling i området fra ca. 200 til ca. 900 nm vist sig nyttig til sådanne målinger, omend enhver stråling, der gennemtrænger testmaterialet, og som er i stand til at vise fremkomsten eller graden af det omhandlede respons, kan anvendes.

25 Forskellige former for kalibreringsteknik kan an vendes som kontrol ved analysen. Eksempelvis kan en prøve af analyt-standardopløsning påføres på et særskilt testmateriale som en sammenligning eller for at tillade anvendelsen af differentielle målinger ved analysen.

30

Eksempler

De følgende eksempler tjener til nærmere belysning af opfindelsen. I eksemplerne er der beskrevet detaljer af foretrukne udførelsesformer, og resultaterne er analy-35 seret.

23

DK 160729 B

O

Eksempel 1

Fremstilling af 7-(n-decyl)-2-methyl-4-(31,5'-dichloro-phen-4'-on)indonaphthol

Den ovennævnte forbindelse, der i det følgende be-5 tegnes 7-decyl-MEDPIN, fremstilles til anvendelse som et reporter-stof i det omhandlede testmateriale og testmiddel. Reaktionsvejen er vist i den følgende reaktionssekvens, hvor Rx betyder n-decyl: 10 15 20 25 30 35 i 24

DK 160729 B

A

i O

li il” O 6" C- ·_; lo 1 v u 1* 1 V ^“0 © = S p p \ „ h i i i ^0·°

J S V

§8 =ΰ is u° = ft tn] ° u Λ * ^S\ s γ°γ° \o § . §λΟ> 0 v p ’'es r _ ”οί ^

O

25

DK 160729 B

Fremstilling af β-(p-n-decylbenzoyl)-propionsyre

En blanding af 26,2 g (1,2 mol) phenyldecan, 120 g (1,2 mol) ravsyreanhydrid og 360 ml nitroethan i en 5 liters trehalset kolbe udstyret med HC1-udtag og mekanisk omrører 5 afkøles til 0°C i et isbad. Til denne blanding sættes der langsomt i løbet af 1/2 time under omrøring 360 g (2,7 mol) AlCl^. Der iagttages udvikling af HCl, når ca. halvdelen af aluminiumchloridet er tilsat. Efter tilsætningen fjernes isbadet, og reaktionsblandingen får lov at henstå ved stuetem-10 peratur i 5 minutter. Blandingen opvarmes derefter over et dampbad. Opvarmningen og omrøringen fortsættes, indtil den kraftige udvikling af HCl ophører efter ca. 30 minutter. Reaktionsblandingen afkøles i et isbad, medens der tilsættes 2 liter isvand, efterfulgt af 600 ml koncentreret saltsyre.

15 Den fremkomne blanding omrøres ved stuetemperatur i 2 timer, indtil al det mørkebrune, faste stof er hydrolyseret. Det uopløselige produkt isoleres ved filtrering. Det faste stof omkrystalliseres dernæst to gange fra eddikesyre (250 ml pr. gang), hvorved der fås ca. 320 g (85%'s udbytte) af produk-20 tet (tørret i vakuum over KOH). Tyndtlagschromatografi: = 0,43 i en blanding af EtOAc og toluen i rumfangsforholdet 1:1 (silicagelplade).

Analyse, beregnet for C2oH30°3: C = 75,42%, H = 9,50%.

25 Fundet: C = 76,02%, H = 9,89%.

Fremstilling af 4-(p-n-decyl-phenyl)-smørsyre 20 g Pd/C (palladium-mættet carbon fra Aldrich Chemical Co., katalog nr. 20.569-9) og 150 g (0,47 mol) β-(p-n-30 -decyl-benzoyl)-propionsyre blandes med 350 ml eddikesyre i en 1 liters Paar-bombe. Reaktionen sættes i gang ved et H2_tryk på 50 psi og en temperatur på 50°C. Der iagttages en pludselig forøgelse af temperaturen, ledsaget af et fald i ^“-rumfanget. Tyndtlagschromatografi af reaktionsblandin-35 gen viser fuldstændig omsætning. Katalysatoren fjernes ved i 26

DK 160729 B

O

glasfiberfiltrering i varm tilstand. Filtratet får lov at krystallisere ved stuetemperatur, og det krystallinske pro- dukt isoleres ved filtrering. Et yderligere udbytte af produkt, der dannes efter kraftig afkøling af filtratet, isole-5 res også. Det totale udbytte er 100 g (68%) efter tørring under vakuum over KOH. Smp. 67-69°C.

Tyndtlagschromatografi: = 0,68 i en blanding af EtOAC og toluen i rumfangsforholdet 1:1 (silicagelplade).

Analyse, beregnet for C2oH32^2: 10 C = 78,90%, H = 10,50%.

Fundet: C - 78,39%, H = 10.,70%.

Fremstilling af 7-n-decyl-l-tetralon

En blanding af 30 g (98,7 mmol) p-decyl-phenyl-smør-15 syre og 150 g polyphosphorsyre opvarmes i et oliebad, indtil alt fast stof er smeltet. Den indre temperatur hæves ved opvarmning til 150°C, og blandingen omrøres kraftigt i 30 minutter. Reaktionsblandingen afkøles derpå til stuetemperatur og behandles med 300 ml isvand og 150 ml ethylether.

20 Efter at blandingen er omrørt i 30 minutter ved stuetemperatur, fraskilles det vandige lag og vaskes to gange med 150 ml ethylether. De kombinerede organiske faser vaskes med 150 ml mættet vandig natriumchloridopløsning. Ether fjernes ved inddampning, og remanensen destilleres på et Kugelrohr-de-25 stillationsapparat (Aldrich Chemical Co.). Produktet har et kogepunkt på 190-200°C ved 0,1 mm Hg. Udbyttet er 11 g (39%) af en bleggul olie.

Tyndtlagschromatografi: Rf = 0,34 i toluen (silicagelplader). Analyse, beregnet for C2oH300: 30 C = 83,90%, H = 10,70%.

Fundet: C = 85,63%, H = 10,83%.

35 27

DK 160729 B

O

Fremstilling af 2-hydroxymethylen-7-n-decyl-l-tetralon

En blanding af 5,4 g (40,5 mmol) natriummethoxid, 7,4 g (100 mmol) ethylformiat og 100 ml tør toluen afkøles 1 et isbad under en indifferent atmosfære af nitrogen eller 5 argon. En opløsning af 11,5 g (40 mmol) af 7-decyl-l-tetra- lonen i 100 ml tør toluen tilsættes under hurtig omrøring. Isbadet fjernes, og reaktionsblandingen omrøres ved stuetemperatur i 4 timer. Reaktionsblandingen behandles med 100 ml vand og 100 ml 6 N saltsyre. Det organiske lag skil-10 les fra og vaskes to gange med 50 ml mættet natriumchlorid-opløsning, tørres over vandfrit natriumsulfat, filtreres og inddampes til fjernelse af al toluen. Den olieagtige remanens anvendes til den næste reaktion uden yderligere rensning.

15 Tyndtlagschromatografi: = 0,56 i toluen (silicagelplader).

Pletten bliver mørkebrun efter spraybehandling med 5%'s FeCl^-opløsning.

Fremstilling af 2-benzoyloxymethylen-7-n-decyl-l-tetralon 20 Den olieagtige remanens fra det forudgående reak tionstrin blandes med 120 ml tør pyridin. Opløsningen omrøres under nitrogen ved 0°C (isbad). Opløsningen behandles med 30 ml benzoylchlorid, og efter tilsætning af benzoyl-chloridet iagttages der uopløseligt pyridiniumchlorid i blan-25 dingen. Reaktionsblandingen omrøres ved stuetemperatur i 2 timer. Produktet udhældes i 400 ml isvand under kraftig omrøring. Det lyst chremefarvede faste stof isoleres ved filtrering og vaskes grundigt med koldt vand. Det svagt fugtige faste stof omkrystalliseres fra 120 ml varm abso- 30 lut ethanol. Der fås 14 g (87%'s udbytte) af hvidt fast stof, idet udbyttet er beregnet på 7-decyl-l-tetralonen. Smeltepunktet er 64-66°C.

Tyndtlagschromatografi: Rf = 0,40 i toluen (silicagelplader) .

35 o 28

DK 160729 B

Analyse, beregnet for C28H34°3: C = 80,34%, H = 8,19%.

Fundet: C = 80,05%, H = 8,27%.

5 Fremstilling af 7-n-decyl-2-methyl-l-naphthol

Til en blanding af 14 g (33,5 mmol) 2-benzoyloxyme-thylen-7-n-decyl-l-tetralon og 3,5 g Pd/C under en indifferent atmosfære sættes der 175 ml cyclohexen. Blandingen opvarmes til tilbagesvaling, idet den indifferente atmosfære 10 opretholdes. Omdannelsen af udgangsmaterialet til produkt bestemmes efter 3 timer ved tyndtlagschromatografi. Efter at alt udgangsmaterialet har reageret, nedkøles blandingen til stuetemperatur. Katalysatoren fjernes ved filtrering og vaskes to gange med 50 ml varm toluen. Det kombinerede 15 filtrat inddampes til et lille rumfang, og produktet renses med en Prep-500-silicagelkolonne (en højtryks-silicagel-kolonne til præparative formål, der kan fås fra Waters Association, Milford, MA). Der anvendes toluen som den mobile fase. Produktfraktionerne slås sammen og inddampes 20 til tørhed under vakuum natten over. Der fås 9,0 g (udbytte 90%) af et cremefarvet, hvidt fast stof. Smeltepunktet er 65-67°C.

Tyndtlagschromatografi: = 0,65 i toluen (silicagelpla- der). Der udvikles en lyserød farve, når produktpletten 25 bestråles med kortbølge-UV-lys.

Analyse, beregnet for C^jH^qO: C = 84,51%, H = 10,13%.

Fundet: C = 84,49%, H = 10,72%.

30 Fremstilling af 7-(n-decyl)-2-methyl-4-(31,51-dichlorophen--4 *-on)-indonaphthol 4,5 g (15,1 mmol) 7-decyl-2-methyl-l-naphthol og 3,0 g (14,3 mmol) 2,6-dichlorquinon-4-chlorimid opløses i 150 ml acetone. Opløsningen behandles med 700 ml kaliumcarbonatop-35 løsning (0,1 M, pH = 10,0). Opløsningen omrøres kraftigt ved

O

29 DK 160729 B

stuetemperatur i 10 minutter. Reaktionsblandingens pH-vær-di indstilles på 2,8 med 1,0 N saltsyre. Blandingen omrø-res i 15 minutter, og det røde faste stof isoleres ved filtrering og vaskes grundigt med vand. Det faste stof oplø-5 ses i toluen og filtreres ved hjælp af glasfiberpapir til fjernelse af mulige uopløselige materialer. Filtratet koncentreres og renses ved hjælp af en Prep-500-silicagelko-lonne, idet der anvendes toluen som den mobile fase. Produktfraktionerne slås sammen og inddampes til tørhed. Re-10 manensen krystalliseres fra 100 ml n-hexan, hvorved der fås 3,9 g produkt (udbytte 58%).

Tyndtlagschromatografi: R^ = 0,26 i toluen (silicagelpla-der). Den brune farveplet bliver purpur-blå efter behandling med 0,1 N NaOH på pladerne.

15 Analyse, beregnet for C27H3iN02C^2: C = 68,64%, H = 6,57%, N = 2,97%.

Fundet: C = 68,88%, H = 6,85%, N = 2,97%.

Eksempel 2 20 Gelatine som en hydrofil matrix

Der udføres en række forsøg til fremstilling og bedømmelse af de her omhandlede testmidler og testmaterialer, idet gelatine anvendes som den hydrofile matrix.

Der fremstilles en opløsning af en hydrofob bærer 25 indeholdende en ionophor og et reporter-stof ved at sætte 68 mg valinomycin fra Sigma Chemical Co. og 29 mg 7-n-decyl-MEDPIN til 4,27 g o-nitrophenyloctylether under opvarmning, indtil stofferne er opløste. Der fremstilles en pufret gelatineopløsning under anvendelse af 3,13 g 30 type I-gelatine (Sigma Chemical Co.), der er blevet dialyseret ved 10°C til fjernelse af ioniske urenheder, samt 20,8 g afioniseret vand. Hertil sættes der 0,25 ml af en puffer fremstillet ved indstilling af 1 M Trizma-base (Sigma Chemical Co.) på en pH-værdi på 8 med HC1 (Baker) 35 og dernæst på en pH-værdi på 5 med eddikesyre (Baker).

0 30 DK 160729 B , i

Olie- og gelatineopløsningerne blandes og anbringes i en 12-37 ml-miniprøvebeholder til en Waring-blander (Fisher Scientific), hvori der blandes i 2 minutter ved høj | hastighed.

5 Efter at boblerne har fået lov at stige til vejrs i | 15-30 minutter ved 45°C, udspredes emulsionen på en poly- j esterfilm-bærer, der er blevet forbehandlet til at acceptere gelatine (40 GAB 2S, 3M Co.) til en tykkelse på ca.

0/17 mm (nr. 75 Meyer Rod. RDS Co., Webster N.Y.). Filmen 10 lufttørres, og dernæst anbringes der stykker med dimensionerne ca. 5 mm x ca. 10 mm på polystyrenfilm-understøt-ninger i form af håndgreb under anvendelse af dobbeltsidet adhæsivt tape (Double Stick, 3M Co.) til dannelse af testmaterialer.

15 Der fremstilles testprøver indeholdende 0, 0,2, 0,6, 0,6, 0,8 og 1,1 mM KC1, 100 inM tris-Cl med pH = 8,5. Disse koncentrationer svarer til de, der findes i plasma, der er fortyndet ni gange. En 30 pi prøvedråbe anbringes på reagensdelen af et testmateriale og inkuberes ved 30°C i et 20 Seralyzer ®-reflektansspektrofotometer (Ames Division,

Miles Laboratories, Inc.) i 2,5 minutter, på hvilket tidspunkt reflektansen ved 640 nm måles. De opnåede reflektans-data fremgår af den følgende tabel: 25 K+ (mM) (K/S)2 O 0,1140 0,2 1,2839 0,4 2,2822 0,6 3,3909 30 0,8 4,6256 1,1 5,9271 35 o 2 31

DK 160729 B

(K/S) er defineret som følger: (K/S)2 = —- 4ΙΓ 5 i hvilken R er fraktionen af reflektans fra testmaterialet, K er en konstant, og S er lysspredningskoefficienten for det bestemte reflekterende medium. Den ovenfor angivne ligning er en simplificeret form for den velkendte Kubelka-10 -Munk-ligning, jfr. Gustav Kortum "Reflectance Spectroscopy", side 106-111, Springer Verlag, New York (1969) .

De ovenfor angivne data er angivet i fig. 1 og viser, at kaliumkoncentrationen svarer lineært til værdien af 2 (K/S) . De angivne data viser endvidere, at forskellige kon-15 centrationer kan måles med stor nøjagtighed.

Det ovenfor angivne forsøg gentages under anvendelse af 2-methyl-4-(3'5'-dichlorophen-4'-on)-indonaphthol (MEDPIN) i stedet for det n-decyl-substituerede molekyle som reporter-stof. Der fremstilles således en opløsning 20 indeholdende 6,7 mg valinomycin pr. ml og 1,67 mg MEDPIN pr. ml i o-nitrophenyloctylether. Der fremstilles en vandig gelatineopløsning som ovenfor beskrevet således, at emulsionen indeholder 12% etheropløsning og 7% gelatine.

En film af emulsionen med en vådtykkelse på ca. 5 mm udstø-25 bes med en rakel på en polyesterunderstøtning, tørres og anbringes på strimler af polystyrenfilm.

Der fremstilles prøver af KCl, og testmaterialerne bedømmes som ovenfor beskrevet. De reflektansdata, der er angivet i den følgende tabel, er vist grafisk på tegningen 30 i fig. 2.

K+ (mM) (K/S)2 O 0,2048 0,2 1,4945 35 0,6 5,3038 1,1 8,4158

DK 160729 B

o 32

De angivne data og de på tegningen afsatte data viser en lineær korrelation mellem K+-koncentrationen og (K/S)2.

Forsøget fra det første eksempel gentages, men med 5 den undtagelse, at der anvendes 3-(n-pentalkyl)-3',5'-dichlo-rophen-4'-on-indophenol (DIP) som reporter-stof i stedet 7-n-decyl-MEDPIN.

DIP fremstilles ud fra 3-n-pentadecylphenol og 2,6-dichlorquinon-4-chlorimid (DQC1). Ækvimolære mængder af 10 disse forbindelser kombineres i acetone til opnåelse af en teoretisk koncentration på ca. 100 mM af hver. Til hver ml opløsning sættes der 6 ml puffer (pH = 10). Pufferen er 100 mM 3-(cyclohexylamino)-propansulfonsyre i vand. Den fremkomne opløsning indstilles på en pH-værdi på 2,6 med 15 IN saltsyre, og blandingen centrifugeres, hvorpå fældningen tørres under nitrogenatmosfære.

Der fremstilles en vandig gelatineopløsning som ovenfor beskrevet, men indeholdende 9,66 vægt% gelatine og 12,6 vægts ΝΡ0Ε. Opløst i olien findes der 15 mM valinomy-20 cin og 25 mM DIP.

De data, der fås ved bedømmelse af testmaterialet, fremgår af den følgende tabel og er afbildet grafisk i fig. 3.

25 K+ (mM) (K/S)2 0 0,8409 0,2 1,0858 0,6 1,5302 1,1 2,0794 30

Disse data og deres afbildning på tegningen viser + 2 en lineær korrelation mellem K -koncentrationen og (K/S) .

35

DK 160729 B I

0 f 33

Eksempel 3

Agarose som den hydrofile matrix

Der udføres en række forsøg, hvor testmaterialet og testmidlet ifølge opfindelsen fremstilles under anvendelse 5 af agarose som den hydrofile matrix.

Der fremstilles et testmateriale, i hvilket den hydrofile matrix er agarose, og den hydrofobe bærer er 2-nitrophenyloctylether (NPOE).

Der fremstilles en opløsning ved opløsning af 18,6 g 10 valinomycin og 10,4 mg 7-n-decyl-MEDPIN i 1,52 ml NPOE under opvarmning, indtil der foregår en opløsningsproces.

Der fremstilles en anden opløsning indeholdende 1,2 g agarose i 40 ml destilleret vand ved 60°C. Til denne opløsning sættes der 760 jil af en 1 mg/ml vandig opløsning af 15 Zwittergent 3-10 fra Calbiochem-Behring Corp. i LaJolla, CA. Zwittergent er et handelsnavn for N-decyl-N,N-dimethyl--3-ammonium-l-propansulfonsyre.

Disse opløsninger emulgeres i en kop med en kapacitet på 12-37 ml på en Waring-blander ved høj hastighed.

20 Den fremkomne emulsion udhældes i et 50 ml bægerglas og anbringes under vakuum i 15 sekunder til fjernelse af indesluttet luft. Derefter udstøbes emulsionen i en film med en tykkelse på ca. 1,27 mm (vådtykkelse) på Bruning Drafting Film under anvendelse af en rakel. Efter tørring 25 ved stuetemperatur i 16 timer udskæres den tørrede emulsion i rektangler med dimensionerne ca. 5 mm x ca. 10 mm og anbringes på en polystyrenfilmstrimmel som beskrevet i eksempel 2.

Til bedømmelse af testmaterialet fremstilles der 30 vandige opløsninger af KCl i forskellige koncentrationer.

Disse opløsninger pufres ved en pH-værdi på 8,5 med tris- -HCl-puffer. Opløsningerne bestemmes som i de forudgående eksempler ved hjælp af Seralyzer-reflektansfotometret, og 2 (K/S) -værdierne angives i den følgende tabel: 35

O

34

DK 160729 B

K+ (mM) (K/S)2 O 0,0696 0,05 0,5313 0,10 0,7026 5 0,15 1,0242 0,20 1,4149

De angivne data er afsat grafisk i fig. 4, der viser 2 en lineær korrelation mellem kaliumkoncentration og (K/S) .

10 Dette forhold muliggør reflektansmålings-differentiering -J- mellem forskellige koncentrationsniveauer af K .

12,8 mg valinomycin og 5,4 mg 7-n-decyl-MEDPIN opløses i 760 pi 2-nitrophenylbutylether tinder opvarmning. Der fremstilles en anden opløsning ved tilsætning af 600 mg aga-15 rose med lav geldannelsestemperatur (Marine Colloids Division af FMC Corp.) til 20 ml destilleret vand. Til denne vandige blanding sættes der 38 pi af en 10 mg/ml vandig opløsning af Zwittergent 3-16 (N-hexadecyl-N,N-dimethyl-3-am-monium-l-propansulfonsyre fra Calbiochem-Behring). Agarose-20 og 2-nitrophenylbutylether-opløsningerne emulgeres dernæst i en 12-37 ml kop på en Waring-laboratorieblander i 5 minutter ved høj hastighed. Efter sammenblanding får emulsionen lov at henstå i 5 minutter for at tillade udvikling af indesluttede luftbobler.

25 Emulsionen udstøbes på Gel Bond-polyesterfilm (Marine Colloids Division of FMC Corp.) under anvendelse af en ca. 0,64 mm rakel. Efter lufttørring i 1 time ved stuetemperatur anbringes filmen i en luftovn i 15 minutter ved en temperatur på 40°C. Filmen udskæres derpå i rektangler 30 med dimensionerne ca. 5 mm x ca. 10 mm, der anbringes på ! t en polystyrenfilm som beskrevet i eksempel 2 og bedømmes. j

Reflektansdata opsamles ved 640 nm under anvendelse i af Seralyzer-reflektansfotometer, og de opnåede data omdan-2 nes til (K/S) -værdier. Resultaterne er angivet i den føl- j 35 gende tabel og er afsat grafisk i fig. 5. De viser en line- 35

DK 160729 B

O

2 ær korrelation mellem kaliumionkoncentration og (K/S) , hvilket muliggør en nøjagtig bestemmelse af koncentrationen.

K+ (mM) (K/S)2 5 O 0,0915 0,10 1,133 0,15 1,750 0,20 2,189 10 12,8 mg valinomycin og 5,4 mg 7-n-decyl-MEDPIN opløses i 760 yil diethylphthalat under opvarmning. En anden opløsning fremstilles ved at sætte 600 mg agarose og 38 jul af en 10 mg/-ml af Zwittergent 3-16 i vand til 20 ml destilleret vand ved 60°C. De to opløsninger kombineres og emulgeres. Den fremkom-15 ne emulsion anbringes under vakuum i 15 sekunder til fjernelse af indesluttede luftbobler.

En film af emulsion med en vådtykkelse på ca. 1,27 mm udstøbes på en Gel Bond-film under anvendelse af en rakel. Filmen får lov at henstå ved stuetemperatur i 2 timer, hvor-20 efter den tørres yderligere i en luftovn ved 40°C i yderligere 30 minutter. Der fremstilles derefter testmaterialer som beskrevet i de foregående eksempler.

Testmaterialerne bedømmes under anvendelse af vandige KCl-opløsninger indeholdende en puffer af 3-(cyclohexyl-25 amino)-propansulfonsyre og LiOH (pH = 10). Resultaterne fremgår af den følgende tabel: K+ (mM) (K/S)2 0 0,0865 30 0,5 0,3565 1.0 0,7937 1,5 1,2034 2.0 2,0207 35 o 36

DK 160729 B

De opnåede data er afsat grafisk i fig. 6. Dosis-re-spons-kurven muliggør en let differentiering mellem forskellige K+-niveauer.

5 Eksempel 4

Papir og hydrofil polymer som en sammensat matrix

Der udføres forsøg til yderligere bedømmelse af varianter af den hydrofile matrix. I de følgende eksempler indesluttes findelte småkugler af en hydrofob bærer 10 indeholdende ionophor og reporter-stof i en hydrofil matrix omfattende papir og agarose.

Der fremstilles tre lageropløsninger. Til den første ______ opløsning sættes der 28,4 mg 7-n-decyl-MEDPIN og 71,6 mg (2,3-naphtho)-15-krone-5 til 2 ml nitrophenyloctylether, 15 hvorpå der blandes kraftigt med en hvirvelblander i 5 sekunder og anbringes i 10-20 minutter i en Sybron Thermolyne Dri-Bath-opvarmer, der er indstillet på 90°C, indtil alle reagenserne er opløst. Der fremstilles en agaroseopløsning ved opløsning af 1 g agarose i 20 ml vand ved 80°C. En 20 zwitterionisk detergentopløsning fremstilles ved at opløse 50 mg Zwittergent 3-10 i 20 ml vand.

Der fremstilles en reagensemuision ved at kombinere 0,8 ml af den første opløsning, 12,0 ml af agaroseopløsnin-gen, 0,8 ml af detergentopløsningen og 1,4 ml destilleret 25 vand, hvorefter blandingen emulgeres i en 12-37 ml kop af rustfrit stål ved høj hastighed i 5 minutter på en Waring--laboratorieblander. Den orangefarvede emulsion får lov at afgive luft i 5 minutter ved 60°C, inden den påføres et Whatman 31 ET-papir under anvendelse af en nr. 75 Meyer-30 -stav. Papiret tørres dernæst i en ovn ved 60°C i 20 minutter. Et stykke dobbeltsidet acrylisk adhæsiv (Double Stick) påføres den uovertrukne side af papiret. Materialet udskæres i strimler med en bredde på ca. 10 mm, som dernæst fastgøres til en polystyrenunderstøtning via den anden side af 35 den adhæsive film. Yderligere udskæring til strimler på ca.

O

37

DK 160729 B

5 inm giver dernæst reagens strimler, der hver består af en ca. 5 mm x ca. 10 mm-reagenspude fastgjort til et polystyrenhåndgreb og egnet til anvendelse sammen med Ames SERALYZER-reflektansfotometeret.

5 Afprøvning af strimlerne udføres ved måling af den diffuse reflektans ved 640 nm af den reagerede reagenspude under anvendelse af et SERALYZER-instrument. Fem vandige opløsninger af kaliumchlorid, der er pufret ved en pH-vær-di på 9,0 med 100 mM boratpuffer, anvendes som prøver.

10 Ved hvert kaliumniveau måles der tre strimmelreaktiviteter, og middelværdien beregnes. Resultaterne fremgår af den følgende tabel: K+ (mM) (K/S)2 15 0,08 0,1836 0,12 0,2328 0,16 0,3018 0,20 0,3532 0,24 0,4440 20

Resultaterne viser fortrinlige bestemmelser for varierende K+-koncentrationer, hvilket også fremgår af de ovennævnte datas afsætning i fig. 7.

25 Eksempel 5

Anvendelse af TiO^ som en bestanddel af matrixen

Der udføres et forsøg, hvor testmaterialerne og testmidlerne ifølge opfindelsen fremstilles under anvendelse af Ti02 som en yderligere bestanddel i den sammensatte ma-30 trix. Resultaterne viser forbedret evne til bestemmelse af ioner i en testprøve.

Der fremstilles en emulsion af o-nitrophenyloctyl-ether (ΝΡ0Ε) (12,6 vægt%) og gelatine (9,6 vægt%) i vand.

Forud for emulgeringen gøres ΝΡ0Ε 15 mM med hensyn til 35 7-decyl-MEDPIN og valinomycin. Efter emulgering af NPOE/ge- 38

DK 160729 B

O

1atine-blandingen med en Waring-laboratorieblander ved høj hastighed, udspredes den fremkomne emulsion på en polyesterfilm, der er behandlet til at acceptere gelatine (40 GAB 2S fra 3M Co.) Filmene udspredes til en vådtykkelse på ca.

5 0,171 mm (nr. 75 Mayer-stav), ca. 0,38 mm (rakel) og ca.

0,76 mm (rakel). Filmene tørres ved stuetemperatur i ca.

30 minutter.

Et andet sæt film fremstilles som ovenfor angivet, men med den undtagelse, at der indføres 0,75 vægt% Ti02-pul-10 ver (0,5 p partikelstørrelse, NL 2030, der kan fås fra NL Industries). Filmene udspredes på en 40 GAB 2S-polyester-film til en vådtykkelse på ca. 0,09 mm (nr. 40 Mayer-stav) , ca. 0,171 mm (nr. 75 Mayer-stav), ca. 0,38 mm (rakel) og ca. 0,76 mm (rakel).

15 Små rektangulære stykker (ca. 5 mm x ca. 10 mm) ud skæres fra begge sæt film og anbringes ved den ene ende af særskilte strimler af polystyren under anvendelse af et dobbeltsidet adhæsivt tape (Double Stick, 3M Co.).

Der fremstilles testprøver indeholdende 0,2, 0,6, 1,1 20 og 3,3 mM KC1 i 100 mM tri-hydroxymethylaminomethan-puffer (pH = 8,0). En aliquot af hver testprøve (30 pi) påføres en særskilt film, og ændringen i reflektans overvåges i 130-150 sekunder i en SERALYZER. Reflektansværdierne omdannes til (K/S) som i eksempel 2. De fremkomne (K/S)-vær-25 dier (slutpunkt) er angivet i den følgende tabel.

30 35 39

DK 160729 B

rf (O 1\| ri O O σι r~ vd m σ n h O (N ^ Η O Γ" *· σ m O in ιο vo in fr) < r. «-

N η i1 O O O O

in in ίο <ί nj Ί1 ri cn oj m σι ^ no θ' k ffl ID Nf in ή O i^·

Hr^Hin cn ^ ·μ* m g fc. *******

p ri N N OOOO

•H

rH S

aS E

λ; i—1 •m + & w U.M» g in O m ησιΐ^-σ

η loioooin η in H

-rH * rP t"· in oo ΓΊ ri ON

4-t O H in oo cNmnnj s, s s ^ < *» ·*

H-t rH rH H OOOO

nJ

ω ra O O m η-φ-^ρΟ

β fNOl'-'X» OO 00 (N H

O n n Nf n Γ-τσισσ

Oj o vo oo O r—I Η Η H

o] »*>*»* ^ Ναι O O Ή OOOO

Pi O)

03 rH rH rH

h r-, h oo «ο σ r" oo vo <1) E H CO Γ" O H m Γ- k> fjj ^ * * * *

M'-OOO OOOO

>1

EH

<N

O

Ή

Eh

^ ύΡ dP tiP OP tiP

<x> in in m m m CM 4-) Γ~ Ι^-Γ^Γ'-Γ'' O &n O O O - ·> ** - *

•H w O OOOO

* £ 0 40

DK 160729 B

De angivne data viser, at varierende tykkelser af film indeholdende Ti09 har ringe virkning på værdien af + (K/S) for en bestemt K -koncentration, medens der iagttages forholdsvis store forskelle, når T1O2 ikke er til ste-5 de i formuleringen.

10 15 20 25 30 35

Claims (11)

1. Testmateriale til bestemmelse af nærværelsen af en ion i en vandig testprøve, kendetegnet ved, at 5 materialet omfatter en hydrofil matrix inkorporeret med findelte småkugler af en hydrofob bærer, hvor bæreren indeholder en ionophor, der er i stand til at danne et kompleks med ionen, og et reporter-stof, der er i stand til at reagere med komplekset af ionophor og ion til frembringelse 10 af et detekterbart respons.

2. Testmateriale ifølge krav 1, kendetegnet ved, at den hydrofile matrix er en hydrofil polymer, fortrinsvis gelatine, agarose, polyvinylalkohol, po- 15 lypropylenimin, carrageenan eller alginsyre.

3. Testmateriale ifølge krav 1 eller 2, kendetegnet ved, at den hydrofile matrix yderligere indeholder papir. 20

4. Testmateriale ifølge ethvert af kravene 1-3, kendetegnet ved, at ionophoren er koronand, en kryptand eller en podand, fortrinsvis valinomycin, 4,7,13,-16,21-pentaoxa-l,10-diazabicyclo[8,8,5]tricosan, 4,7,13,- 25 16,21,24-hexaoxa-l,10-diazabicyclo[8,8,8]hexacosan, 4,7,13,- 18-tetraoxa—1,10-diazabicyclo[8,5,5]eicosan, 12-krone-4, 15-krone-5, 18-krone-6, dibenzo-18-krone-6 eller dicyclo-hexan-18-krone-6.

5. Testmateriale ifølge ethvert af kravene 1-4, kendetegnet ved, at den hydrofile matrix yderligere er inkorporeret med Ti02·

6. Testmateriale ifølge ethvert af kravene 1-5, 35 kendetegnet ved, at reporter-stoffet er en for- O DK 160729 B bindelse med den almene formel OH 5 N 10 x i hvilken X er halogen, CN, SCN, OCNf N3, COR°f COOR°, CONHR°, CP3, CC13, N02, S02CF3, S02CH3 eller S02CgH4CH3, 15 hvor R° er alkyl eller aryl, er en substituent i 2-, 3-, 5- og/eller 6-stillingen valgt blandt lavere og inter-mediært alkyl, dvs. alkyl med 1-12 carbonatomer, aryl og en kondenseret ring ved 2,3- eller 5,6-stillingerne, og n er et tal fra O til 4. 20

7. Testmateriale ifølge ethvert af kravene 1-5, kendetegnet ved, at reporter-stoffet er en forbindelse med formlen OH ΤοΙοΓ Å- o i hvilken R' betyder hydrogen eller lavere alkyl, dvs. alkyl * med 1-4 carbonatomer, fortrinsvis methyl, R betegner hydro-35 gen eller intermediært alkyl, dvs. alkyl med 4-12 carbonatomer, fortrinsvis n-decyl, CC13 og X betyder halogen, CN, scn, ocn, n3, cor°, coor°, conhr°, cf3, cci3, no2, so2cf3, S02CH3 eller S02CgH4CH3, hvor R° er alkyl eller aryl. O DK 160729 B

8. Testmateriale ifølge ethvert af kravene 1-7, kendetegnet ved, at reporter-stoffet er et sådant, der er i stand til at frembringe tilsynekomsten af eller en ændring af fluorescens i nærværelse af komplekset af ionophor 5 og ion, og at stoffet fortrinsvis er fluorescein eller et derivat deraf.

9. Testmiddel til bestemmelse af nærværelsen af ion i en vandig testprøve, kendetegnet ved, at det 10 omfatter en aflang understøtning med en øvre, i det væsentlige plan flade og et testmateriale ifølge ethvert af kravene 1-8 fastgjort til den plane overflade af understøtningen.

10. Fremgangsmåde til fremstilling af et testmiddel ifølge krav 9, til bestemmelse af nærværelsen af en ion i en vandig testprøve, kendetegnet ved, at man fremstiller en første blanding af vand og en hydrofil polymer, fremstiller en anden blanding af en hydrofob bærer, en ionophor, der 20 er i stand til at danne et kompleks med ionen, og et reporter-stof, der er i stand til at reagere med komplekset af ionophoren og ionen til frembringelse af et detekterbart respons, idet man kombinerer den første og den anden blanding til dannelse af en stabil emulsion af findelte småkugler af 25 den anden blanding i den første blanding, overtrækker emulsionen på en aflang understøtning med en Øvre, i det væsentlige plan overflade, og fordamper vandet fra emulsionen til frembringelse af en hydrofil matrix inkorporeret med findelte småkugler af den anden blanding, idet matrixen 30 herved fastgøres til den plane overflade af understøtningen.

11. Fremgangsmåde til bestemmelse af nærværelsen af en ion i en vandig testprøve, kendetegnet ved, at man bringer testprøven i kontakt med et testmateriale iføl-35 ge ethvert af kravene 1-8 eller med et testmiddel ifølge krav 9 og iagttager et detekterbart respons.