DK170467B1 - 2-Alkyl-4-(3',5'-di(pseudo)halogen-phen-4'-on)-indonaphth-1-oler samt fremgangsmåde til deres fremstilling - Google Patents

Description

DK 170467 B1

Opfindelsen angår hidtil ukendte 2-alkyl-4-(3',51 -di- (pseudo)halogen-phen-41-on)-indonaphth-l-oler, der kan ; anvendes ved måling af ioners tilstedeværelse, især ioner i vandig opløsning, samt en fremgangsmåde til fremstilling af 5 disse forbindelser. Opfindelsen muliggør en hurtig og let bestemmelse af ioner således, at resultaterne er tilgængelige for den, der udfører analysen, øjeblikkeligt efter blot at have tilvejebragt kontakt mellem en testprøveopløsning med et testmateriale eller -middel, som indeholder en forbindelse 10 ifølge opfindelsen. Der kræves ikke noget vanskeligt håndterbart og dyrt elektronisk udstyr såsom ionspecifikke elek-. troder, flammefotometre eller atomabsorptionsspektrofotometre. Det er heller ikke nødvendigt at tage tilflugt til tidskrævende vådkemiske metoder såsom titrering eller andre 15 laboratoriemetoder. De her omhandlede forbindelser sætter den, der analyserer, i stand til blot at kontakte testprøven med et strimmelmateriale eller et lignende testmateriale med hensyn til konfiguration og at iagttage enhver forekommende farveændring.

20 Bestemmelsen af vandige ionkoncentrationer finder anvendelse inden for talrige grene af teknikken. Ved vandrensning må calciumkoncentrationen styres omhyggeligt til fastsættelse af graden af mætning af en ionbytterharpiks--afioniserer. Måling af natriumioner og andre ioner i hav-25 vand er vigtig ved fremstillingen af drikkevand ombord på et skib i søen. Måling af kaliumniveauet i blod hjælper lægen ved diagnose af betingelser, der fører til muskelirritabilitet og excitatoriske ændringer i den myocardiale funktion. Sådanne betingelser omfatter oliguri, anuri, u-30 rinobstruktion og renalsvigt på grund af chok.

Det siger sig selv, at en hurtig og let metode til bestemmelse af ionkoncentration i høj grad ville forøge værdien af den omtalte teknologi og andre teknologier, hvor en sådan hurtig og nøjagtig bestemmelse ville være 35 fordelagtig. Hvis således f.eks. en tekniker i et medicinsk laboratorium nøjagtigt kunne måle kalium- eller calciumniveauet i en prøve af serum eller helblod i løbet af 2 DK 170467 B1 sekunder eller minutter, ville sådanne hurtige resultater ikke blot hjælpe lægen ved diagnosen, men laboratorieeffek-tiviteten ville også forøges mange gange. De her omhandlede forbindelser er det essentielle ved en sådan test, idet de 5 er reporter-stoffer, der, når de er til stede i materialet ^ indeholdende en ionophor for den ion, der skal detekteres, producerer et detekterbart respons på tilstedeværelsen af ionen.

Forud for den foreliggende opfindelsen blev pheno- 10 liske iminforbindelser fremstillet ved den såkaldte Gibbs-reaktion, jf. H.D. Gibbs, Chem. Review 13. 291-319 (1927), se også D. Svobodova et al., Mikrochimica A-cta, pp. 251-264 (1978). De nævnte litteratursteder beskriver koblingen af phenoler med iminer i overensstemmelse med følgende reak- 15 tionsskema:

OH

Λ

- X X " V

·<.χλχ A

0 | 25 Cl^l^ Cl 0 Sådanne reaktioner er nyttige ved en test til bestemmelse af nærværelsen af phenoler.

30 De her omhandlede, hidtil ukendte forbindelser er ikke blot nyttige som reporter-stoffer til detektering af ioner i en testprøve, men tilvejebringer stabilitet under opbevaring og er forholdsvis fri for interfererende sidere- * aktioner i en prøve.

35 Visse udtryk, der benyttes i nærværende beskrivel se, bør nævnes på dette sted til sikring af, at læseren 3 DK 170467 B1 forstår de pågældende udtryk på den måde, der er tilsigtet. De følgende definitioner anføres således til klarlæggelse af opfindelsens omfang og muliggørelse af dens formulering og anvendelse.

5 Udtrykket "ionophor" inkluderer molekyler, der er i stand til at danne et kompleks med en bestemt ion, i nogle tilfælde til i det væsentlige udelukkelse af andre. Eksempelvis bindes det cycliske polypeptid valinomycin selektivt til kaliumioner i opløsning til dannelse af et katio-10 nisk kompleks. Udtrykket omfatter også coronander, cryptan-der og podander.

Udtrykket "ikke-porøs" skal betyde i det væsentlige uigennemtrængelig for vandgennemstrømning. En ikke--porøs bærermatrix er således en sådan, der i det væsent-15 lige udelukker passage af vand gennem sig fra den ene side til den anden. Eksempelvis vil en polyvinylchloridfilm til det her omhandlede formål blive betragtet som værende ikke--porøs.

Et "reporter-stof" er en forbindelse, der er i ’ 20 stand til at reagere med et ionophor/ion-kompleks til frem bringelse af en farveændring eller et andet detekterbart respons. Et reporter-stof kan således være et stof, der er forholdsvis farveløst i den ikke-ioniserede tilstand, men som farves i nærværelse af et kompleks af en ionophor 25 og en ion. De her omhandlede forbindelser er sådanne stoffer', dvs. de frembringer farve eller ændring i lysreflektans i nærværelse af et sådant kompleks.

Ved udtrykket "reagere" som anvendt ovenfor menes der enhver reaktion mellem et reporter-stof og et ionophor/-30 ion-kompleks, der fører til et detekterbart respons. Et eksempel på et tilfælde, hvor reporter-stoffet reagerer med komplekset, er det tilfælde, hvor reporter-stoffet ændres af komplekset fra en farveløs til en farvet tilstand, f.eks. i tilfælde af 2-methyl-4-(3',51-dichlorphen-35 -4'-on)-indonaphth-l-ol.

4 DK 170467 B1

Udtrykket "detekterbart respons" betyder her en ændring i eller forekomsten af en parameter i et testmid-delsystem, der er i stand til at blive registreret, enten * ved direkte observation eller ved hjælp af et instrument, 5 og som er en funktion af nærværelsen af en specifik ion £ i en vandig testprøve.

Udtrykket "lavere alkyl", således som det anvendes i nærværende sammenhæng, omfatter en alkyldel, som indeholder fra 1 til 4 carbonatomer. Omfattet af betydningen af lavere 10 alkyl er methyl, ethyl, n-propyl, isopropyl, n-butyl, sek.-butyl og tert.butyl. "Lavere alkyliden" anvendes i samme forbindelse som "lavere alkyl", men betegner en alkylengrup-pe, dvs. en divalent alkylgruppe, med 1-4 carbonatomer.

Lavere alkylidengrupper omfatter således methyliden, ethy-15 liden, n-propyliden, isopropyliden, n-butyliden og tert.bu-tyliden.

Ved "pseudohalogen" skal der forstås atomer eller grupper af atomer, der, når de er bundet til et umættet eller aromatisk ringsystem, påvirker ringsystemets elektro-20 filitet eller nucleofilitet og/eller har en evne til at fordele en elektrisk ladning ved delokalisering eller resonans, på lignende måde som halogenerne. Medens "halogen" således betegner atomer fra gruppe VII såsom F, Cl og I, betegner "pseudohalogener" grupperne -CN, -SCN, -OCN, -N3; 25 -COR, -C00R, -CONHR, -CF3, -CC13, -N02, -S02CF3, -S02CH3 og -S02CgH4CH3, hvor R betyder alkyl eller aryl.

Den foreliggende opfindelse bygger på opdagelsen af hidtil ukendte forbindelser, der har vist sig at være nyttige som reporter-stoffer eller indikatorer ved en test 30 for nærværelsen af en specifik ion eller gruppe af ioner i en vandig testprøve. Forbindelserne ifølge opfindelsen har strukturformlen 35 i

0H

5 DK 170467 B1 ' .

N (I)

A

'\Τ' 0 i hvilken R1 betyder lavere alkyl, og X betyder halogen eller -CN, -SCN, -OCN, -N3, -COR, -COOR, -CONHR, -CF3, -CC13, 15 -NO2, -SO2CF3, -S02CH3 eller -SC^Cg^C!^, hvor R betyder alkyl eller aryl. Ifølge en foretrukken udførelsesfojrm for opfindelsen er R·1· methyl og/eller X er Cl.

Udover de hidtil ukendte forbindelser angår opfindelsen også en fremgangsmåde til deres fremstilling. Denne 20 fremgangsmåde er ejendommelig ved, at man omsætter en forbindelse, 2,6-dihaloquinon-4-haloimid, med strukturformlen 0

X

I li (Π)

25 ' I

V

NX

i hvilken X har den ovenfor angivne betydning, med en forbindelse, en N- (21 -(lavere alkyl)-11-naphthyl)-aminoalkohol, 30 med strukturformlen

A-OH

NH

6 DK 170467 B1 i hvilken R1 betyder lavere alkyl, og A betyder lavere alky-liden, til dannelse af en første reaktionsblanding, indstiller pH-værdien af denne første reaktionsblanding på mindst ca. 8 til dannelse af en anden reaktionsblanding, og udvinder 5 en forbindelse ifølge opfindelsen fra den anden reaktionsblanding. Ifølge en foretrukken udførelsesform for fremgangsmåden omfatter isolationstrinet syrning af den anden reaktionsblanding til en pH-værdi i området fra ca. 2 til ca. 4. Foretrukne reaktanter er 2,6-dichlorquinon-4-chlorimid 10 og N-(11 -(21-methyl)-naphthyl)-aminoethanol. Disse sidstnævnte forbindelser danner den forbindelse med formlen (I), der har betegnelsen 2-methyl-4-(3',51-dichIorphen-4'-on)-in-donaphth-l-ol.

På grund af den relative instabilitet af forbindel-15 sen (II) foretrækkes det at anvende en ikke-vandig opløsning ved omsætningen deraf med forbindelsen (III) . Acetone har vist sig at være særlig egnet til dette trin, men naturligvis kan andre opløsningsmidler såsom andre ketoner og alkoholer i givet fald være lige så kompatible. En sådan bestemmelse 20 kan foretages af den rutinerede fagmand med kendskab til nærværende beskrivelse.

Almindeligvis foretrækkes det at omsætte støkiometrisk lige store mængder af (II) og (III) som opløsninger til dannelse af en første reaktionsblanding. pH-vær-25 dien for den første blanding indstilles derpå på mindst ca. 8 under anvendelse af en egnet base, hvorved der dannes en anden reaktionsblanding. Der anvendes fortrinsvis en vandig puffer (pH-værdi i området fra ca. 8 til ca. 11).

Det har vist sig, at der opnås gode resultater med en 30 100 mM vandig opløsning af 3-(cyclohexylamino)-propan- sulfonsyre, der er blevet indstillet på en pH-værdi på 10 med LiOH.

Efter dannelsen af den anden reaktionsblanding iso- / leres produktet (I) på en vilkårlig egnet måde. Syrning 35 af den anden reaktionsblanding er én sådan metode til isolering, idet den basiske form af (I), dvs. den depro- 7 DK 170467 B1 toniserede form, der er opløselig i vand, gøres uopløselig ved tilsætning af sure hydrogenioner. Tilsætning af 1 N HC1 under hurtig omrøring forårsager således fældning af (I), og udfældningen isoleres let ved centrifugering.

5 Ideelt syrnes den anden reaktionsblanding til en pH-værdi i området fra ca. 2 til ca. 4.

Yderligere rensning kan gennemføres ved opløsning af fældningen i et egnet opløsningsmiddel, f.eks. acetone, og passage af denne opløsning gennem en rensningsprocedure, 10 f.eks. omkrystallisation, søjlechromatografi eller tyndt-lagschromatografi.

De her omhandlede forbindelser finder anvendelse som reporter-stoffer eller indikatorer i et system til måling af specifikke ioner eller grupper af ioner. Et 15 sådant system omfatter ud over forbindelsen (I) en ionophor og en bærermatrix. Bærermatrixen har inkorporeret ionophoren, og forbindelsen (I) inkorporeres i matrixen eller sættes særskilt til den testprøve, der analyseres.

Hvis den ion, der skal bestemmes, er til stede i testprøven, 20 kan den danne kompleks med ionophoren, og dannelsen af et . sådant kompleks bevirker, at forbindelsen (I) ændrer farve.

Der dannes typisk en blå farve.

Ved en foretrukken anvendelse inkorporeres ionophoren og forbindelsen (I) i bærermatrixen på en sådan 25 måde,at de er i det væsentlige isoleret fra den vandige testprøve. Eksempelvis kan ionophoren og forbindelsen (I) optages i en opløsning af vinylchlorid-vinylidenchlorid--copolymer i et egnet opløsningsmiddel og udstøbes i form af en film på en polyestersubstratfilra. Til trods for en 30 sådan films hydrofobicitet, kan den ion, for hvilken der analyseres, gennemtrænge den ved kompleksdannelse med ionophoren. En sådan gennemtrængning udelukker andre testprø-vebestanddele. Dannelsen af ionophor-ion-komplekset fremkalder forekomsten af farve i filmen på grund af, at kom-35 plekset reagerer med forbindelsen (I).

0 8 DK 170467 B1

Skønt farvedannelsesmekanismen ikke kendes, kan farvedannelsen meget vel skyldes dannelsen af en ion med en resonansstruktur, der kan absorbere lys ved bestemte bølgelængder. Det er sandsynligt, at forbindelsen (I) ud-5 viser tautomeri i overensstemmelse med strukturformlerne * OH 0

O^r*’ otV

N ^===^ K

jf\ A

15 X

0 OH

Der er udviklet den teori, at den tautomere, ved en mekanisme, der ikke fuldstændigt forstås, i nærværelse 20 af et ladet ion-ionophor-kompleks kan miste en hydroxyl-proton for derved at blive en resonans-ion i overensstemmelse med strukturformlerne 0' 0 * @ώτ' oy

N N

’ .-O. -4- 0 0“ 5 35 En sådan resonansstrukturteori er en plausibel for klaring på dannelsen af blå farve, der iagttages, når en 9 DK 170467 B1 film indeholdende valinomycin og forbindelsen (I) bringes i kontakt med kaliumioner i vandig opløsning.

Opfindelsen illustreres nærmere i de følgende eksempler.

5

Eksempler

Der udføres en række forsøg, hvorved der anvendes en unik synteseprocedure til fremstilling af en af de hidtil ukendte forbindelser (I). Efter fremstillingen testes for-10 bindeisen (I) for dens anvendelighed som reporter-stof i et testmiddel og -materiale til måling af ioner i opløsning. De anvendte præparative metoder samt bedømmelsen af forbindelsens anvendelighed er beskrevet i de følgende eksempler.

15

Fremstilling af 2-methyl-4-(31,51-dichlorophen-41-on)-" -indonaphth-l-ol

Den ovennævnte forbindelse, i det følgende benævnt MEDPIN, fremstilles på følgende måde: - 20 Ækvimolære mængder af 2,6-dichlorguinon-4-chlor- imid (DQCI) og N-(1'-(2'-methyl)-naphthyl)-aminoethanol (MeNAE) blandes i acetone til en koncentration på 100 mM af hvert opløst stof. Der fås en brun opløsning.

Til en portion på 1 ml '"af denne opløsning sættes 25 der 6 ml 100 mM CAPS-puffer (pH=10). CAPS-puffer er en vandig opløsning af 3-(cyclohexylamino)-propansulfonsyre titreret til en pH-værdi på 10 med LiOH. Den resulterende opløsning har en rød farVe.

Der sættes dråbevis 1 N HC1 til den røde opløsning 30 under effektiv omrøring, indtil pH-værdien falder til ca.

2,6. Opløsningen bliver hurtigt uklar, idet der dannes en murstensrød fældning. Der drages omsorg for, at pH-værdien ikke får lov at synke under ca. 1,9 til undgåelse af produktsønderdeling .

35 Blandingen centrifugeres derpå, og fældningen tør res ved stuetemperatur og genopløses i 3 ml acetone. Efter 10 DK 170467 B1 o henstand i et køleskab ved 4°C i 30 minutter ledes væsken gennem en silicagelsøjle og elueres med en l:4-blanding af ethylacetat og toluen. Der dannes et rødlig-brunt bånd i søjlen.

5 Tyndtlagschromatografi af produktet på en silicagel-

Si plade elueret med en l:4-opløsning af ethylacetat og toluen giver en enkelt plet ved en R^-værdi på 0,76.

De fraktioner, der indeholder produktet, slås sammen, og opløsningsmidlet fjernes under vakuum i en rota-10 tionsfordamper. Det rensede produkt kan opbevares i form af et tørret pulver eller i acetone ved 0°C.

Karakterisering af det fremstillede produkt

Der udføres en række forsøg til karakterisering af 15 den ifølge det ovenstående eksempel isolerede forbindelse og til opklaring af denne forbindelses struktur.

En analyse af massespektret giver et kraftigt 3--liniemønster ved 331, 333 og 335. Et sådant mønster indicerer nærværelsen af to chloratomer.

20 Elementæranalyse viser en empirisk formel ^17^11^2^^2 ·* overensstemmelse med følgende data: C% H% N% 0% Cl%

Fundet 61,79 3,76 3,98 9,50 20,69 25 Beregnet 61,45 3,31 4,22 9,64 21,39

Ved massespektroskop! findes der en molekylvægt på 332.

Proton-kærnemagnetiske resonansspektre (NMR) viser 30 tilstedeværelsen af syv grupper af protoner ud over dem, der hidrører fra opløsningsmidlet. Spektrets signal længst * oppe i feltet skyldes methyl-protoner spaltet af den nabostillede ensomme proton. Det næste signal skyldes to æk- . r, vivalente enkelte protoner på en benzenring. Det tredie 35 signal, en kvartet, tilskrives en proton ved 3-stillingen på en naphthaienring, spaltet af tre methylprotoner. De 11 DK 170467 B1 o resterende signaler længere nede i spektret skyldes fire protoner ved 5-, 6-, 7- og 8-stillingerne i en naphthalen-ring. Interaktioner mellem disse signaler giver anledning til dette komplekse spektrum af ABCD-typen.

5 Resultaterne af disse forsøg er, taget under ét, et stærkt bevis for, at produktet ifølge det ovenstående i eksempel har strukturen for forbindelsen (I), hvor R er methyl, og X er chlor.

10 Anvendelse af forbindelsen (I) til detektering af kalium Der fremstilles en opløsning indeholdende 6,7 mg valinomycin pr. ml og 1,67 mg MEDPIN pr. ml i o-nitrophen-yloctylether. Der fremstilles en pufret gelatineopløsning under anvendelse af 3,13 g Type I-gelatine (Sigma Chemi-15 cal Co.), der er blevet dialyseret ved 10°C til fjernelse af ioniske urenheder, samt 20,8 g afioniseret vand. Her- f· til sættes der 0,25 ml af en puffer fremstillet ved indstilling af 1 M Trizma-base (Sigma Chemical Co.) til en pH-værdi på 8 med HC1 (Baker) og derefter til en pH-værdi 20 på 5 med eddikesyre (Baker).

Olie- og gelatineopløsningerne blandes og anbringes i en 12-37 ml-miniprøvebeholder for en Waring-blander (Fisher Scientific) og blandes i 2 minutter ved høj hastighed. Efter en ventetid på 15-30 minutter ved 45°C til 25 opstigning af bobler spredes emulsionen på en polyester-filmbærer, der i forvejen er behandlet til at acceptere gelatine (40 GAB 2S, 3M Co.). Filmen udspredes til en tykkelse på ca. 0,171 mm (nr. 75 Mayer Rod, RDS Co., Webster N. Y.). Filmen lufttørres, hvorpå stykker med dimensioner-30 ne ca. 5 mm x ca. 10 mm monteres på polystyrenfilmbærer- -håndgreb under anvendelse af dobbeltsidet adhæsivt tape (Double Stick, 3M Co.) til dannelse af testmaterialer. Testprøverne fremstilles indeholdende 0, 0,2, O, 6, 0,8 og 1,1 mM KC1, 100 mM tris-Cl, pH=8,5. Disse kon-35 centrationer svarer til de, der findes i serum, som er fortyndet ni gange. En 30^,ul (mikroliter) prøvedråbe an- 12 0 DK 170467 B1 bringes på reagensdelen af et testmateriale og inkuberes ved 37°C i et Seralyzer ® (Ames Division, Miles Laboratories, Inc.)-reflektansspektrofotometer i 2,5 minutter, ; på hvilket tidspunkt reflektansen ved 640 nm måles. De op-5 nåede reflektansdata fremgår af den følgende tabel: , K+ (mM) (K/S)2 0 0,2048 10 0,2 1,4945 0,6 5,3038 1,1 8,4158

Disse data viser en lineær korrelation mellem K+-2 15 -koncentration og (K/S) .

2 (K/S) er defineret som: (K/S)2 = -li^ 4ir

20 hvor R er fraktionen af reflektans fra testmaterialet, K

er en konstant, og S er lysspredningskoefficienten for det anvendte reflekterende medium. Den ovenstående ligning er en simplificeret form for den velkendte Kubelka-Munk-lig-ning, jfr. Gustav Kortum, "Reflectance Spectroscopy", pp.

25 106-111, Springer Verlag, New York (1969).

De ovenstående data viser, at kaliumkoncentrationen svarer lineært til (K/S)^. Endvidere viser de anførte data, at forskellige koncentrationer kan måles nøjagtigt.

30

Jr y 35

Claims (6)

13 DK 170467 B1 PATENTKRAV. 1. 2-Alkyl-4-(3 ' , 5 '-di-(pseudo) halogen-phen-4 ' -on)-indonaphth-l-oler med strukturformlen

2. Forbindelser ifølge krav 1, kendetegnet ved, at Ri betyder methyl.

3. Forbindelse ifølge krav 1 eller 2, kende -tegnet ved, at X betyder chlor.

4. Fremgangsmåde til fremstilling af en forbindelse 25 ifølge krav 1, kendetegnet ved, at man omsætter en forbindelse med strukturformlen NX 30 || |] (II) Ύχ o hvilken X har den i krav 1 angivne betydning, med en for-35 bindelse med strukturformlen DK 170467 B1 14 A-OH N 1 1 (IH) Op i hvilken R1 betyder lavere alkyl, og A betyder lavere alky-liden, til dannelse af en første reaktionsblanding, indstiller pH-værdien af denne første reaktionsblanding på mindst 10 ca. 8 til dannelse af en anden reaktionsblanding, og udvinder forbindelsen ifølge krav 1 fra den anden reaktionsblanding.

5. Fremgangsmåde ifølge krav 4,'kendetegne t ved, at udvindingstrinene omfatter indstilling af pH-værdien i et område fra ca. 2 til ca. 4.

5 OH ©Øf’

10 N (I) Λ jH λ !l X 15 0 . i hvilken R1 betyder lavere alkyl, og X betyder halogen eller -CN, -SCN, -OCN, -N3, -COR, -COOR, -CONHR, -CF3, -CC13, -N02, -S02CF3, -S02CH3 eller -S02CgH4CH3, hvor R betyder alkyl eller aryl.

6. Fremgangsmåde ifølge krav 4,kendeteg ne t ved, at man omsætter 2,5-dichlorquinon-4-chlorimid og N-(11 -(21-methyl)-naphthyl)-aminoethanol, og at forbindelsen ifølge krav 1 er 2-methyl-4-(3',5’-dichlorophen-4'-on)-indonaphth-l-ol. 20 * *