NO158535B - Forbindelse for paavisning av ioner og fremgangsmaate til deres fremstilling. - Google Patents

Description

Foreliggende oppfinnelse vedrører nye forbindelser som kan anvendes ved målingen av ioner, særlig ioner i vandig opp-løsning, og en fremgangsmåte for deres fremstilling. Opp-finnelsen muliggjør en hurtig, lettvint måte å analysere ioner på, hvorved resultatene er tilgjengelige for den som utfører analysen øyeblikkelig etter kun å ha bragt prøve-oppløsningen i kontakt med en prøveenhet eller -innretning som inneholder forbindelsen. Det er ikke noe behov for tungvint, kostbart elektronisk utstyr, slik som ionespesi-fike elektroder, flammefotometere, atomabsorbsjonsspektro-fotometere e.l. Det er heller ikke nødvendig å ty til tid-krevende våtkjemiteknikker, slik som titrering og andre laboratoriefremgangsmåter. Forbindelsene ifølge foreliggende oppfinnelse muliggjør for den som utfører analysen kun å bringe prøven i kontakt med en strimmelinnretning eller lignende prøveenhetutforming, og iaktta eventuell fargeendring.

Bestemmelsen av vandig ionekonsentrasjon har anvendelse innen mange teknologier. I vannrensingsteknikken må kal-siumkonsentrasjonen overvåkes nøye for å fastsette metnings-graden av en ionebytterharpiks som avioniseringsmiddel. Måling av natrium og andre ioner i sjøvann er viktig ved fremstillingen av drikkevann ombord på et skip til sjøs. Måling av kaliumnivået i blod hjelper legen ved diagnose

av tilstander som fører til muskelirritabilitet og stimu-leringsendringer i hjertemuskelfunksjon. Slike tilstander omfatter oliguria, anuria, urinveishindring og nyresvikt på grunn av sjokk .

En hurtig, lettvint fremgangsmåte for å bestemme ionekonsentrasjon ville selvsagt øke nivået innen disse teknologi-ene i stor grad, såvel som innen alle andre hvor slike hurtige, nøyaktige bestemmelser ville være fordelaktig. Dersom således f.eks. en medisinsk laboratorietekniker kunne måle kalium- eller kalsiumnivået i en serum- eller helblodprøve nøyaktig i løpet av sekunder eller minutter, ville slike hurtige resultater ikke bare hjelpe legen ved diagnosen, men laboratorieeffektiviteten ville også øke mange ganger. Foreliggende forbindelser er den sentrale delen i en slik prøve, idet den er et rapportørstoff som når det er tilstede i blandingen som inneholder en ionofor for ionet som skal påvises, gir en påvisbar respons på nærværet av ionet.

Før foreliggende oppfinnelse ble fenolholdige iminforbindel-ser fremstilt ved hjelp av den såkalte Gibbs reaksjon. H.D.Gibbs, Chem, Review 13, 291-319 (1927). Se også D.Svobodova, et al., Mikrochimica Acta, sidene 251-264

(1978). Disse litteraturhenvisningene beskriver sammenkob-lingen av fenoler med iminer i henhold til

Slike reaksjoner er nyttige i en prøve for å bestemme til-stedeværende fenoler.

De nye forbindelsene ifølge foreliggende oppfinnelse er ikke bare anvendelige som et rapportørstoff for å påvise ioner i en prøve, men er stabile under lagring og er forholdsvis fri for forstyrrende bireaksjoner'i en prøve.

Visse uttrykk som er brukt i den foreliggende beskrivelse bør på dette punkt nevnes for å sikre at leseren har den samme oppfatning som forfatteren med hensyn til deres respektive betydninger. De følgende definisjoner gis følge-lig for å klargjøre omfanget av foreliggende oppfinnelse og for å muliggjøre dens utforming og bruk.

Uttrykket "ionofor" omfatter molekyler som er istand til å danne et kompleks med et bestemt ion, i noen tilfeller under hovedsakelig utelukkelse av andre. F.eks. bindes det ringformede polypeptid, valinomycin, slektivt til kalium-ioner i oppløsning, hvorved det dannet et kationisk kompleks. Også inkludert i uttrykket er koronander, kryptander og podander.

Uttrykket "ikke-porøs" er ment å skulle bety hovedsakelig vanntett. En ikke-porøs bærergrunnmasse er således en som i det vesentlige utelukker vannpassering fra den ene siden til den andre. F.eks. ville en polyvinylkloridfilm anses som ikke-porøs for de her nevnte formål.

Et "rapportørstoff" er en forbindelse som er istand til ved gjensidig påvirkning med et ionofor/ionkompleks å gi i en fargeendring eller annen påvisbar respons. Et rapportør-stoff kan således være et som er forholdsvis fargeløst i den ikke-ioniserte tilstand, men som farges når det fore-ligger sammen med et kompleks av en ionofor og et ion. Forbindelsen ifølge foreliggende oppfinnelse er et slikt stoff, dvs. det gir farge eller endring i lysreflektans i nærvær av et slikt kompleks.

Med "gjensidig påvirkning" er ment ethvert samvirke mellom et rapportørstoff og et ionofor/ionkompleks som fører til ) en påvisbar respons. Et eksempel på at rapportørstoffet gir gjensidig påvirkning med komplekset, er i tilfellet hvor rapportørstoffet endres av komplekset fra en farge-løs til en farget tilstand, slik som i tilfellet med 2-mety1-4 -(3',5'-diklorofen-4'-on)-indonaft-l-ol.

>

Uttrykket "påvisbar respons" er her ment som en endring i eller fremkomst av en parameter i prøveenhetssystemet som er istand til å bli registrert, enten ved direkte iakt-tagelse eller instrumentelt, og som er en funksjon av til-stedeværelsen av et bestemt ion i en vandig prøve.

Uttrykket "laverealkyl", slik det er brukt i foreliggende beskrivelse, omfatter en alkylrest, substituert eller usub-stituert, som inneholder ca. 1-4 karbonatomer. Inkludert i betydningen laverealkyl er metyl, etyl, n-propyl, isopro-pyl, n-butyl, sec-butyl og tert.-butyl. Disse kan være usubstituerte eller de kan være substituerte, forutsatt at enhver slik substitusjon ikke forstyrrer anvendelsen eller virkningen av den her krevde prøveenhet eller -innretning når det gjelder dens evne til å påvise ioner. "Laverealkyliden" er brukt i den samme samenheng som "laverealkyl", men betegner en alkylengruppe (dvs. et divalent alkyl) med 1-4 karbonatomer. Laverealkyliden omfatter således metylen, etyliden, n-propyliden, isoproyliden, n-butyliden, sec-butyliden og tert.-butyliden.

Med "pseudohalogen" er det ment atomer eller grupper av atomer som, når de er bundet til et umettet eller aromatisk ringsystem, påvirker ringsystemets elektrofile eller nukleo-file egenskaper, og/eller har en evne til å fordele en elek-trisk ladning gjennom delokalisering eller resonans på en måte som svarer til halogenes. Mens halogen betegner gruppe VII atomer, slik som F, Cl og I, omfatter således pseudo-halogenene slike rester som -CN, -SCN, -OCN, -N3, -COR, -COOR, -CONHR, -CF3, -CCI3, -N02, -S02CF3, -S02CH3, og -S02CgH4CH3, hvor R er alkyl eller aryl.

Foreliggende oppfinnelse ligger i oppdagelsen av en ny forbindelse som er funnet anvendelig som et rapportørstoff, eller indikator, i en prøve på nærværet av et bestemt ion eller gruppe av ioner i en vandig prøve. Forbindelsen er en som har strukturen

hvor R er laverealkyl og X er et halogen, slik som F, Cl, Br eller I, eller x er et pseudohalogen. I foretrukkede utførelsesformer er R metyl og/eller X er Cl.

I tillegg til den nye forbindelsen, omfatter foreliggende oppfinnelse også en fremgangsmåte for å fremstille den. Dypest sett omfatter fremgangsmåten reaksjonen mellom et 2,6-dihalokinon-4-haloimid og N-/2'-(laverealkyl)-1<1->naftyl/- aminoalkanol. Den førstnevnte forbindelsen har strukturen

hvor X er som definert ovenfor. N-naftylaminoalkanolen har strukturen

hvor R er laverealkyl og A er laverealkyliden. Etter blanding av disse forløperforbindelsene slik at det dannes en

første reaksjonsblanding, justeres pH til minst 8, hvorved det fåes en andre reaksjonsblanding. Forbindelse I isoleres så fra den andre reaksjonsblandingen. Ved en foretrukket utførelsesform, omfatter isoleringstrinnet å sur-gjøre den andre reaksjonsblandingen til en pH i området fra 2 til 4. Foretrukkede reaktanter er 2,6-diklor-kinon-4-klorimid og N-/1'-(2<1->metyl)naftyl/aminoetanol. Disse sistnevnte forbindelsene gir den bestemte utgaven av forbindelse I med navnet 2-metyl-4-(31,5'-diklorfenyl-4 ' - on)indonaft-l-ol.

På grunn av den forholdsvis store ustabiliteten til forbindelse (II) er det foretrukket å bruke en ikke-vandig opp-løsning ved blandingen av den med (III). Aceton er funnet særlig egnet til dette trinnet, men selvfølgelig kan andre oppløsningsmidler, slik som andre ketoner og alkoholer være like forenlige. En slik bestemmelse ligger godt innenfor mulighetene for rutinearbeideren under forutsetning av kjennskap til foreliggende beskrivelse.

Det er vanligvis foretrukket å blande støkiometriske like store mengder av (II) og (III) som oppløsninger for å lage en første reaksjonsblanding. pH i den første blandingen justeres så til minst 8 ved å bruke en egnet base og derved danne en andre reaksjonsoppløsning. Det anvendes fortrinnsvis en vandig buffer (pH i området fra 8 til 11). Det er funnet at gode resultater oppnås med en 100

mM vandig oppløsning av 3-(cykloheksylamino)propansulfon-syre som er blitt justert til pH 10 med LiOH.

Etter dannelsen av den andre reaksjonsblandingen, utvinnes produktet (I) ved hjelp av hvilke som helst egnet måte. Surgjøring av den andre reaksjonsblandingen er en slik utvinningsmåte, hvor den grunnleggende formen av (I), dvs. den avprotoniserte formen som er oppløselig i vann, gjøres uoppløselig ved tilsetning av hydrogenioner fra syre. Således forårsaker tilsetning av lN HC1 med hurtig omrøring utfelling av (I) og bunnfallet utvinnes lett via sentrifu-gering. Den andre reaksjonsblandingen surgjøres helst til en pH i området fra 2 til 4.

Ytterligere rensing kan utføres ved å oppløse bunnfallet i et egnet oppløsningsmiddel, slik som aceton, og sende denne oppløsningen gjennom en rensingsfremgangsmåte, slik som rekrystallisering, kolonnekromatografi eller tynnsjiktkromatografi.

Forbindelsene ifølge foreliggende oppfinnelse finner anvendelse som rapportørstoffer, eller indikatorer, i et system for å måle bestemte ioner eller grupper av ioner. Et slikt system omfatter i tillegg til (I), en ionofor og en bærergrunnmasse. Bærergrunnmassen er iblandet ionoforen, idet forbindelse (I) enten er iblandet grunnmassen eller tilset-tes separat til prøven som analyseres. Dersom ionet som skal analyseres er tilstede i prøven, kan det danne kompleks med ionoforen og dannelsen av et slikt kompleks forårsaker at (I) endrer farge. Vanligvis dannes det en blå farge.

Ved en foretrukket bruk innlemmes ionoforen og (I) i bærergrunnmassen på en slik måte at de blir i det vesentlige isolert fra den vandige prøven. F.eks. kan ionoforen og (I) tas opp i en oppløsning av vinylklorid/vinylidenklorid-kopolymer i et egnet oppløsningsmiddel og formes som en film på en polyestersubstratfilm. På tross av den hydro-fobe egenskapen til en slik film, kan ionet som analyseres trenge gjennom den ved å danne kompleks med ionoforen. Slik gjennomtrengning skjer under utelukkelse av andre prøvebe-standdeler. Dannelsen av ionofor/ionkomplekset fremkaller tilsynekomsten av farge i filmen på grunn av gjensidig påvirkning mellom komplekset og forbindelse (I).

Selv om mekanismen for fargedannelsen ikke er kjent, kan den godt skyldes dannelsen av et ion med en resonans-struktur som er istand til å absorbere lys ved visse bølge-lenger. Det er mulig at forbindelse (I) utviser tautomer-isme i henhold til I nærvær av et ladet ion/ionofor-kompleks, antas det at tautomeren, gjennom en mekanisme som ikke er helt forstått, kan miste et hydroksylproton og bli et resonansion i henhold til

En slik resonansstrukturteori er en plausibel forklaring på dannelsen av blå farge som kan ses når en film som inneholder valinomycin og (I), bringes i kontakt med vandig kalium.

Det ble utført en serie eksperimenter, hvorved en unik syn-tesefremgangsmåte ble anvendt for fremstillingen av den nye forbindelsen (I).

Etter fremstillingen ble så (I) utprøvd med hensyn til sin anvendbarhet som et rapportørstoff i en prøveenhet og -innretning for å måle ioner i oppløsning. De preparative fremgangsmåtene som ble utnyttet, såvel som vurderingen av forbindelsene, er beskrevet i de følgende eksempler.

Eksempel 1.

Fremstilling av 2- metyl- 4-( 3', 5'- diklorfenyl- 4'- on)-indonaft- l- ol.

Tittelforbindelsen (heretter kalt MEDPIN) ble fremstilt i henhold til den følgende fremgangsmåte.

Ekvimolare mengder av 2,6-diklorkinon-4-klorimid (DQCI) og N-/1'-(2'-metyl)naftyl/-aminoetanol (MeNAE) ble blandet i aceton til en konsentrasjon på 100 mM av hver oppløst forbindelse. Man fikk en brun oppløsning.

Til en 1 ml porsjon av denne oppløsningen ble det tilsatt 6 ml 100 mM CAPS-buffer (pH = 10). CAPS buffer er en vandig oppløsning av 3-(cykloheksylamino)propansulfonsyre titrert til pH 10 med LiOH. Den resulterende oppløsning var rød-farget .

1 N HC1 ble tilsatt dråpevis til den røde oppløsning med tilstrekkelig blanding inntil pH falt til ca. 2,6. Oppløs-ningen ble hurtig turbid, idet en tegelrød utfelling ble dannet. Det ble passet på at pH ikke fikk komme under ca. 1,9 for å unngå produktdekomponering.

Blandingen ble så sentrifugert, bunnfallet tørket ved værel-sestemperatur under nitrogen og på nytt oppløst i 3 ml aceton. Etter henstand i et kjøleskap ved 4°C i 30 minutter, ble væsken sendt gjennom en silisiumdioksydgel-kolonne og eluert med en 1:4 blanding av etylacetat og toluen. Det ble dannet et rødbrunt bånd i kolonnen.

Tynnsjiktkromatografi av produktet på en silisiumdioksydgel-plate eluert med en 1:4 oppløsning av etylacetat og toluen ga en enkel flekk ved Rf 0,76.

Fraksjonene som inneholdt produktet ble slått sammen og oppløsningsmidlet fjernet under vakuum i en rotasjonsfor-damper. Det rensede produkt kan lagres som et tørket pulver eller i aceton ved 0°C.

Eksempel 2.

Karakterisering av produktet ifølge eksempel 1. En serie eksperimenter ble gjennomført for å karakterisere forbindelsene isolert i eksempel 1 og for å fastslå dens struktur.

Massespektrumanalyse ga et sterkt 3-linjemønster ved 331, 333 og 335. Et slikt mønster er tegn på tilstedeværelse av to kloratomer.

Elementæranalyse ga bevis for den empiriske formel (~17H11N<~)2<~:"'"2 overensstenunelse med de følgende data:

Det ble utledet en molekylvekt på 322 fra massespektro-skopi.

Proton-kjernemagnetisk resonans (nmr) spektra viste tilstedeværelse av 7 protongrupper i tillegg til oppløsnings-midlets. Det øverste signalet i spektret skyldes metylprotoner avspaltet ved hjelp av det nærliggende enslige pro-tonet. Det neste signalet skyldes to ekvivalente enkeltpro-toner på en benzenring. Det tredje signalet, en kvartett, tilskrives et proton i 3-stillingen hos en naftalenring, adskilt av tre metylprotoner. De gjenværende signaler lengre nede skyldes fire protoner i 5-, 6-, 7- og 8-stil-lingene i en naftalenring. Gjensidige påvirkninger mellom disse signalene er opphav til dette komplekse ABCD-type-spektret.

Resultatene av disse eksperimentene utgjør tilsammen et sterkt bevis på at produktet ifølge eksempel I har strukturen til forbindelsen (I) hvor R er metyl og X er Cl.

Eksempel 3.

Bruk av forbindelse ( I) ved påvisning av kalium.

Det ble fremstilt en oppløsning som inneholdt 6,7 mg/ml valinomycin og 1,67 mg/ml MEDPIN i o-nitrofenyloktyleter. Det ble fremstilt en bufret gelatinoppløsning ved å bruke 3,13 g "Type I"-gelatin som var blitt dialysert ved 10°C for å fjerne ioniske urenheter, og 20,8 g avionisert vann. Til dette ble det tilsatt 0,25 ml av en buffer fremstilt ved å justere IM "Trizma"-base til pH 8 med HC1 og deretter til pH 5 med eddiksyre.

Olje- og gelatinoppløsningene ble blandet og plassert i en 12-37 ml miniprøve-beholder til en "Waring"-blander og det ble blandet i 2 minutter ved høy hastighet.

Etter at bobler hadde fått stige opp i 15-30 minutter ved 45°C, ble emulsjonen fordelt ut over en polyesterfilmbærer som var blitt forbehandlet til å tolerere gelatin ("40 GAB 2S"). Filmen ble fordelt til en tykkelse på 0,17 mm (nr. 75 Mayer-stav). Filmen ble lufttørket, deretter ble 5 x 10 mm store stykker montert opp på polystyrenfilmenbærer-håndtak ved å bruke dobbeltsidig tape for å lage prøveinn-retninger.

Det ble fremstilt prøver som inneholdt 0, 0,2, 0,6, 0,6, 0,8 og 1,1 mM KC1, 100 mM tris-Cl pH 8,5. Disse konsentra-sjonene svarer til de som ble funnet i serum fortynnet 9 ganger. En 20 |al prøvedråpe ble plassert på reagensdelen av en prøveinnretning og inkubert ved 37°C i er Seralyzer reflektans spektrofotometer i 2,5 minutter, hvoretter refleksjonsfaktoren ved 640 nm ble målt. Reflektansdata er stilt opp i tabellen nedenunder.

Dataene viser en lineær korrelasjon mellom K+ konsentra-2 sjon og (K/S) .

2

(K/S) er definert som

hvor R er reflektanslelen fra prøveinnretningen, K er en konstant og S er lysspredningskoeffesienten til det bestemte reflekterende medium. Ligningen ovenfor er en forenk-let utgave av den velkjente Kubelka-Munk-ligningen (se Gustav Kortiim, "Reflectance Spectroscopy", sidene 106-111, Springer Verlag, New York (1969).

Dataene ovenfor viser at kaliumkonsentrasjon svarer lineært til (K/S) 2. Videre viser dataene at forskjellige konsentra-sjoner kan måles nøyaktig.

Claims (3)

1. Ny forbindelse karakterisert ved at den har strukturen hvor R er laverealkyl og X er halogen eller pseudohalogen.

2 . Forbindelse ifølge krav 1, karakterisert ved at R betyr metyl, og X betyr klor.

3 . Fremgangsmåte for fremstilling av forbindelsen ifølge krav 1, karakterisert ved følgende trinn: a) omsetning av en forbindelse med strukturen hvori X betyr halogen eller pseudohalogen med en forbindelse med strukturen hvori R betyr lavere alkyl og A er lavere alikyliden, for å danne en første reaksjonsblanding, b) justering av pH av den første reaksjonsblanding til minst 8 for å danne en andre reaksjonsblanding og c) utvinning av forbindelsen ifølge krav 1 fra den andre reaksjonsblanding ved å justere pH til området 2-4.