FI79697B - Vid detektering av ioner anvaendbar ny indonaftolderivat och foerfarande foer dess framstaellning. - Google Patents

Description

1 79697

Ionien toteamisessa käyttökelpoinen uusi indonaftolijohdan-nainen ja menetelmä sen valmistamiseksi

Esillä oleva keksintö kohdistuu uuteen yhdisteeseen, 5 joka on käyttökelpoinen mitattaessa ioneja, erityisesti vesiliuoksessa olevia ioneja, ja menetelmään sen valmistamiseksi. Keksintö tarjoaa nopean, helpon tavan ionien analysoimiseksi, jolloin tulokset ovat analyytikon käytettävissä välittömästi sen jälkeen, kun tutkittava liuosnäy-10 te on vain saatettu kosketukseen yhdistettä sisältävän testivälineen tai laitteen kanssa. Tällöin ei vaadita monimutkaista, kallista elektronista laitetta, kuten ioni-spesifisiä elektrodeja, liekkifotometrejä, atomiabsorptio-spektrofotometrejä tai vastaavia. Ei myöskään vaadita 15 aikaavievien märkäkemiallisten menettelyjen, kuten titrauk-sen käyttöä eikä muita laboratoriokäsittelyjä. Esillä olevan keksinnön mukainen yhdiste mahdollistaa sen, että analyytikko voi pelkästään saattaa testinäytteen kosketukseen liuskan tai vastaavan testivälinerakenteen kanssa ja 20 havaita värimuutoksen.

Vesiliuoksen ionipitoisuuden määrittämistä käytetään lukuisilla tekniikan aloilla. Veden puhdistuksessa täytyy kalsiumpitoisuutta valvoa huolellisesti de-ionisointilait-teen ioninvaihtohartsin kyllästysasteen analysoimiseksi. 25 Natriumionin ja muiden ionien mittaus merivedestä on tärkeä valmistettaessa juomavettä laivassa merellä. Kaliumtason mittaus verestä auttaa lääkäriä toteamaan olosuhteet, jotka aiheuttavat lihaksen ärtymistä ja eksikatoorisia muutoksia myokardiaalisessa toiminnassa. Näihin olosuhteisiin kuulu-30 vat oliguria, anuria, virtsateiden tukkeumat ja munuais-häiriöt shokin vaikutuksesta.

Ilmeisesti nopea, helppo menetelmä ionipitoisuuden määrittämiseksi edistäisi suuresti näiden menetelmien käyttökelpoisuutta samoin kuin muidenkin menetelmien, joissa 2 79697 tällainen nopea, tarkka mittaus olisi edullinen. Täten esimerkiksi jos lääketieteellisen laboratorion tutkija voisi mitata tarkasti seerumi- tai kokoverinäytteen kalium- tai kalsiumtason muutamissa sekunneissa tai minuuteissa, täl-5 laiset nopeat tulokset lisäisivät laboratorin tehokkuuden moninkertaiseksi sen lisäksi, että ne auttaisivat lääkäriä diagnoosin tekemisessä. Tässä testissä ratkaisevassa asemassa on keksinnön mukainen yhdiste, joka on ilmaiseva aine, joka ollessaan läsnä koostumuksessa, joka sisältää 10 todettavan ionin ionoforia, muodostaa todettavissa olevan vasteen ionin läsnäololle.

Ennen esillä olevaa keksintöä fenoli-imiiniyhdisteet valmistettiin ns. Gibbs'in reaktion avulla [H. D. Gibbs, Chem. Review 13 (1927), ss. 291 - 319; Kts. myös D. Svoboda 15 et ai.; Microchimica Acta 81978), ss. 251 - 264]. Nämä viitteet, joiden sisältö on liitetty tähän vertailua varten, kuvaavat fenolin liittymistä imiineihin seuraavan reaktiokaavion mukaisesti:

OH

20 1 r4o1 OH NC1 - ~~ 1

0 AA

Cl J Cl o 30 Nämä reaktiot ovat käyttökelpoisia tutkittaessa fenolien läsnäoloa. Sen lisäksi, että keksinnön mukainen yhdiste on käyttökelpoinen ilmaisevana aineena ionien toteamiseksi testinäytteessä, se on myös stabiili varas toitaessa ja verrattain vapaa häiritsevistä sivureaktioista 35 näytteessä.

3 79697

Tietyt tässä käytetyt termit on syytä selventää väärinkäsitysten välttämiseksi. Täten seuraavat määritelmät esitetään esillä olevan keksinnön alueen selventämiseksi ja sen soveltamisen ja käytön sallimiseksi.

5 Termi "ionofori" käsittää molekyylit, jotka pystyvät muodostamaan kompleksin määrätyn ionin kanssa ja eräissä tapauksissa sulkemaan oleellisesti muut ionit pois. Esimerkiksi syklinen polypeptidi, valinomysiini, sitoo selektiivisesti kaliumioneja liuoksessa muodostaen kationisen 10 kompleksin. Termi käsittää myös koronandit, kryptandit ja polandit.

Termi "huokoseton" tarkoittaa oleellisesti läpäisemätöntä vesivirtauksen suhteen. Täten huokoseton kantaja-matriisi on sellainen, joka suurimmaksi osaksi estää veden 15 kulun lävitseen toiselta pinnalta toiselle. Esimerkiksi polyvinyylikloridikalvoa voidaan pitää tässä mielessä huokosettomana.

"Ilmaiseva aine" on yhdiste, joka pystyy vuorovaikutukseen ionofori/ioni-kompleksin kanssa muodostaen värin-20 muutoksen tai muun havaittavan vasteen. Täten ilmaiseva aine voi olla sellainen, joka on verrattain väritön ioni-soitumattomassa tilassa, mutta joka värittyy ionoforin ja ionin kompleksin läsnäollessa. Esillä olevan keksinnön mukainen yhdiste on tällainen aine, so. se muodostaa värin 25 tai muutoksen valon heijastuksessa tällaisen kompleksin läsnäollessa.

Termillä "vuorovaikutus" tarkoitetaan ilmaisevan aineen ja ionofori/ioni-kompleksin välistä yhteisvaikutusta, joka johtaa havaittavaan vasteeseen. Esimerkki ilmai-30 sevan aineen vuorovaikutuksesta kompleksin kanssa on tapaus, jolloin ilmaiseva aine muuttuu kompleksin vaikutuksesta värittömästä värilliseen tilaan, kuten tapahtuu 2-metyyli-4-(3',5'-dikloorifen-4’-oni)indonaft-l-olin tapauksessa.

4 79697

Termillä "havaittava vaste" tarkoitetaan tässä yhteydessä mittausjärjestelmässä tapahtuvaa parametrin muutosta tai esiintymistä, joka voidaan havaita joko suoran havainnon tai mittauslaitteen avulla, joka joka on funktio 5 määrätyn ionin läsnäolosta vesipitoisessa testinäytteessä.

Termi "alempi alkyyli" tarkoittaa tässä yhteydessä noin 1-4 hiiliatomia sisältävää alkyyliryhmää, kuten metyyliä, etyyliä, n-propyyliä, isopropyyliä, n-butyyliä, sek.-butyyliä ja tert.-butyyliä.

10 Termiä "alempi alkyleeni" käytetään samassa mielessä kuin termiä "alempi alkyyli", paitsi että sillä tarkoitetaan kaksiarvoista ryhmää, jossa on 1 - 4 hiiliatomia. Täten alempiin alkyleeneihin kuuluvat metyleeni, etyleeni, n-propyleeni, isopropyleeni, n-butyleeni, sek.-butyleeni 15 ja tert.-butyleeni.

Esillä oleva keksintö perustuu uuden yhdisteen löytämiseen, joka on havaittu käyttökelpoiseksi ilmaisevana aineena tai indikaattorina tutkittaessa määrätyn ionin tai ioniryhmän läsnäoloa vesipitoisessa testinäytteessä. 20 Tällä yhdisteellä on kaava I

OH

iQjQf* 25 S 1 Ä jossa R on alempi alkyyli ja X on halogeeni, kuten F, Cl, 30 Br tai I. Suositeltavassa toteutuksessa R on metyyli ja X on kloori.

Edellä määriteltyjen kaavan I mukaisten yhdisteiden kanssa ekvivalenttinen käyttökelpoisuus ioninmääritykeissä on oletettavasti myös vastaavilla yhdisteillä, joissa 35 halogeenisubstituentin X tilalla on ns. pseudohalogeeni.

li 5 79697

Termillä "pseudohalogeeni" tarkoitetaan atomeja tai atomiryhmiä, jotka liittyneinä tyydyttämättömään tai aromaattiseen rengasjärjestelmään vaikuttavat rengasjärjes-telmän eletrofiilisyyteen tai nukleofiilisyyteen ja/tai 5 niillä on kyky jakaa sähkövaraus delokalisoinnin tai resonanssin välityksellä tavalla, joka muistuttaa halogeenejä: täten kun halogeenit tarkoittavat ryhmän VII atomeja, kuten F, Cl ja I, käsittävät pseudohalogeenit ryhmiä kuten -CN, -SCN, -OCN, -N3, -COR, -COOR, -CONHR, -CF3, -CC13, -N02, 10 -S02 CF3 , -S02CH3 ja -S02 C6 H4 CH3 , jolloin R on alkyyli tai aryyli.

Uuden yhdisteen lisäksi keksintö käsittää myös menetelmän sen valmistamiseksi. Tämä menetelmä perustuu 2,6-dihalokinoni-4-haloimidin ja N-[2'-(alempi alkyyli)-15 1'-naftyyli]aminoalkanolin väliseen reaktioon. Ensimmäisen yhdisteen kaava on

X X

\J

20 *'

NX

jossa X on edellä määritelty. N-naftyyliaminoalkanolin rakennekaava on A-OH

i

25 X

(0^TR

jossa R on alempi alkyyli ja A on alempi alkyleeni. Nämä 30 lähtöaineet yhdistetään ensimmäisen reaktioseoksen muodostamiseksi, minkä jälkeen pH säädetään vähintään arvoon noin 7 toisen reaktioseoksen muodostamiseksi. Kaavan I mukainen yhdiste eristetään sitten reaktioseoksesta. Suositeltavassa toteutuksessa eristysvaihe käsittää toisen 35 reaktioseoksen tekemisen happameksi pH-arvoon noin 2-4.

6 79697

Edulliset lähtöaineet ovat 2,6-dikloorikinoni-4-kloori-imidi ja N-[1'-(2'-metyyli )naftyyli]aminoetanoli. Viimeksi mainituista yhdisteistä muodostuu kaavan I mukaisten yhdisteiden edullinen toteutusmuoto, yhdiste 2-metyyli-4-(3',5'-5 dikloorifen-4'-oni)indonaft-l-oli.

Yhdisteen II verrattain suuren epästabiilisuuden vuoksi on edullista käyttää vedetöntä liuosta yhdistettäessä se yhdisteen III kanssa. Asetoni on havaittu erikoisen sopivaksi tässä vaiheessa, mutta luonnollisesti muutkin 10 liuottimet, kuten muut ketonit ja alkoholit voivat olla yhtä sopivia. Alan asiantuntija voi helposti suorittaa niiden valinnan tämän selityksen perusteella.

Yleensä on edullista yhdistää stökiometrisesti yhtä suuret määrät yhdisteitä II ja III liuoksina ensimmäisen 15 reaktioseoksen muodostamiseksi. Ensimmäisen seoksen pH

säädetään sitten vähintään arvoon noin 8 sopivaa emästä käyttäen, jolloin muodostuu toinen reaktioseos. Edullisesti käytetään vesipitoista puskuriliuosta (pH-arvo noin 8- 11). On havaittu, että saadaan hyviä tuloksia käytettäessä 20 100 millimolaarista 3-(sykloheksyyliamino)-propaanisul- fonihapon vesiliuosta, jonka pH on säädetty arvoon 10 li-tiumhydroksidin avulla.

Toisen reaktioseoksen muodostamisen jälkeen otetaan tuote (I) talteen jollakin sopivalla tavalla. Toisen reak-25 tioseoksen tekeminen happameksi on eräs tällainen talteen-ottotapa, koska yhdisteen I emäksinen muoto, so. deproto-noitu muoto, joka liukenee veteen, muuttuu liukenemattomaksi, kun lisätään happamia vetyioneja. Täten 1-n HCl-liuok-sen lisäys nopeasti sekoittaen aiheuttaa yhdisteen I saos-30 tumisen, ja sakka voidaan erottaa helposti linkoamalla. Edullisesti toinen reaktioseos tehdään happameksi pH-arvoon alueella noin 2-4.

Jatkopuhdistus voidaan suorittaa liuottamalla sakka sopivaan liuottimeen, kuten asetoniin ja suorittamalla 35 liuokselle puhdistuskäsittely, kuten uudelleenkiteytys, li 7 79697 pylväskromatografinen tai ohutkerroskromatografinen käsittely.

Keksinnön mukaisia yhdisteitä voidaan käyttää ilmaisevina aineina tai indikaattoreina järjestelmissä mitat-5 taessa määrättyjä ioneja tai ioniryhmiä. Tällainen järjestelmä sisältää yhdisteen I lisäksi ionoforia ja kantajamat-riisia. Kantajamatriisi on liitetty ionoforiin ja yhdiste I on joko liitetty matriisiin tai liitetään erikseen tutkittavaan testinäytteeseen. Jos analysoitavaa ionia on 10 läsnä testinäytteessä, se voi muodostaa kompleksin ionofo-rin kanssa, ja tämän kompleksin muodostuminen aiheuttaa yhdisteen I värin muutoksen. Tyypillisesti muodostuu sininen väri.

Suositeltavassa käytössä ionofori ja yhdiste I 15 lisätään kantajamatriisiin siten, että ne on oleellisesti eristetty vesipitoisesta testinäytteestä. Esimerkiksi ionofori ja yhdiste I voidaan panna vinyylikloridi/vinyli-deenikloridi-kopolymeerin liuokseen sopivassa liuottimessa ja valaa kalvoksi polyesteriä olevalle aluskalvolle. Huo-20 limatta tällaisen kalvon hydrofobisuudesta voi analysoitava ioni tunkeutua siihen muodostaessaan kompleksin ionoforin kanssa. Tämä tunkeutuminen estää muiden testinäytteen aineosien tunkeutumisen. Ionofori/ioni-kompleksin muodostuminen aiheuttaa värin esiintymisen kalvolla kompleksin 25 vuorovaikutuksen vuoksi yhdisteen I kanssa.

Vaikka värin muodostumismekanismia ei tunneta, voi se hyvin aiheutua ionin muodostumisesta, jonka resonanssi-rakenne pystyy absorboimaan valoa määrätyillä aallonpituuksilla. On todennäköistä, että yhdisteessä I esiintyy tauto-30 meriaa seuraavasti: 79697 8 0H l .^V rrV*

lyH

5 N--Λ ,K '

Li

X X

it OH

0 10 Varatun ioni/ionofori-kompleksin läsnäollessa, vaikka mekanismia ei täysin ymmärretä, tautomeeri luultavasti voi menettää hydroksyyliprotonin muuttuen resonoivaksi ioniksi kaavojen o- 1

15 ^ l. R

M N

N j 20 Λ jul

S

mukaan, mikä resonoiva rakenneteoria on todennäköisesti 25 selitys sinisen värin muodostumiselle, joka havaitaan, kun kalvo, joka sisältää valinomysiiniä ja yhdistettä I koskettaa kaliumin vesiliuosta.

Suoritettiin sarja kokeita, joissa käytettiin ainutlaatuista synteesimenettelyä uutta yhdistettä I valmistet- 30 taessa. Valmistuksen jälkeen yhdistettä I testattiin sitten sen käyttökelpoisuuden suhteen ilmaisevana aineena tes-tivälineessä ja -laitteessa mitattaessa ioneja liuoksissa. Valmistusmenetelmät ja tulokset on esitetty seuraavissa esimerkeissä.

9 79697 2-metyyli-4-(3',5'-dikloorifen-4’-oni)indonaft-l-oli (tämän jälkeen MEDPIN) valmistettiin seuraavan menetelmän mukaan.

Ekvimolaariset määrät 2,6-dikloorikinoni-4-kloori-5 imidiä (DQCI) ja N-[1'-(2'-metyyli)naftyyli]aminoetanolia (MeNAE) sekoitettiin keskenään asetonissa, jolloin kummankin liuoksen pitoisuus oli 100 mM. Muodostui ruskea liuos. 1 ml:n osuuteen tätä liuosta lisättiin 6 ml 100 mM CAPS-puskuria (pH-arvo 10). CAPS-puskuri on 3-(syklohek-10 syyliamino)propaanisulfonihapon vesiliuos, joka on titrattu pH -arvoon 10 LiOH-liuoksella. Saadun liuoksen väri oli punainen.

Punaiseen liuokseen lisättiin tipoittain 1-n HC1-liuosta tehokkaasti sekoittaen, kunnes pH laski arvoon 15 noin 2,6. Liuos muuttui nopeasti sameaksi ja muodostui tiilenpunainen sakka. Huolehdittiin siitä, että pH ei laskenut arovn noin 1,9 alapuolelle tuotteen hajaantumisen estämiseksi.

Seos lingottiin sitten, sakka kuivattiin huoneen 20 lämpötilassa typen alla ja luotettiin uudelleen 3 ml:aan asetonia. Liuosta pidettiin jääkaapissa 4°C:n lämpötilassa 30 minuuttia, neste johdettiin piigeelipylvääseen ja eluoi-tiin etyyliasetaatin ja tolueenin 1:4-suhteisella seoksella. Pylvääseen muodostui punaisen ruskea nauha.

25 Tuotteen ohutkerroskromatografia piigeelilevyllä, jota eluoitiin etyyliasetaatin ja tolueenin 1:4-suhteisella seoksella, antoi täplän kohdassa Rf 0,6.

Tuotetta sisältävät jakeet yhdistettiin ja liuotin poistettiin tyhjössä kiertohaihduttimessa. Puhdistettu 30 tuote voidaan varastoida kuivattuna tuotteena tai asetonissa 0°C:n lämpötilassa.

Suoritettiin sarja kokeita eristetyn tuotteen tunnistamiseksi ja sen rakenteen selvittämiseksi.

Massaspektrianalyysi antoi voimakkaan 3-viivaisen 35 kuvion seuraavien arvojen mukaan: 10 79697 C H N O Cl

Laskettu: 61,45 3,31 4,22 9,64 21,39

Saatu: 61,79 3,76 3,98 9,50 20,69

Massaspetroskopian avulla saatiin molekyylipainoksi 5 332.

Protoniydinmagneettinen resonanssispektri (NMR) osoitti 7 protoniryhmän läsnäolon liuottimen protonien lisäksi. Spektrin ylimmän kentän signaali aiheutuu kahdesta metyyliprotonista, jotka ovat lohjenneet viereisen yksilö naisen protonin vaikutuksesta. Seuraava signaali aiheutuu kahdesta ekvivalentista yksittäisestä protonista bentsee-nirenkaassa. Kolmas signaali, kvartetti, liittyy protoniin naftaleenirenkaan 3-asemassa kolmen metyyliprotonin lohkaisemana. Muut signaalit alenevassa kentässä aiheutuvat 15 neljästä protonista naftaleenirenkaan 5-, 6-, 7- ja 8- asemissa. Näiden signaalien vuorovaikutukset aiheuttavat tämän monimutkaisen ABCD-tyyppisen spektrin.

Näiden kokeiden tulos kokonaisuudessaan on voimakas todistus sille, että esimerkin mukaisella tuotteella on 20 yhdisteen I rakenne, jossa R on metyyli ja X on kloori.

Valmistettiin liuos, joka sisälsi 6,7 mg/ml valino-mysiiniä ja 1,67 mg/ml MEDPIN’iä o-nitrofenyylioktyylieet-terissä. Valmistettiin puskuroitu gelatiiniliuos käyttäen 3,13 g Type I-gelatiinia (Sigma Chemical Co.), joka oli 25 dialysoitu 10°C:n lämpötilassa ionisten epäpuhtauksien poistamiseksi, ja 20,8 g dieionisoitua vettä. Tähän seokseen lisättiin 0,25 ml puskuria, joka oli valmistettu säätämällä 1 M Trizma-emäs (Sigma Chemical CO.) pH-arvoon 8 HCl-liuoksen (Baker) avulla ja sitten pH-arvoon 5 etik-30 kahapolla (Baker).

Öljy- ja gelatiiniliuokset sekoitettiin keskenään ja pantiin 12 - 37 ml:n mininäytesäiliöissä Waring-sekoit-timeen (Fisher Scientific) ja sekoitettiin 2 minuutin ajan suurella nopeudella.

Il 11 79697

Kuplien annettiin poistua 15 - 30 minuutin ajan 45°C:n lämpötilassa ja emulsio levitettiin sitten polyesteriä olevalle kalvoalustalle, joka oli esikäsitelty gelatiinin vastaanottamista varten (40 GAB 2S, 3M Co.). Kalvo 5 levitettiin 0,171 pm:n paksuiseksi (No. 75 Mayer-tanko, RDS Co., Webster, N.Y., USA), kalvo kuivattiin ilmassa ja 5,1 x 10,2 mm:n palasia sijoitettiin polyesterikalvoalus-talle käyttäen kaksipuolista liimanauhaa (Double Stick, 3M Co.) testilaitteen muodostamiseksi.

10 Valmistettiin testinäytteitä, jotka sisälsivät 0, 0,2, 0,6, 0,8 ja 1,1 mM KCL-liuosta, 100 mM Tris-Cl; pH-arvo 8,5. Nämä pitoisuudet vastasivat niitä, joita on havaittu 9-kertaisesti laimennetussa seerumissa. 30μ1:η näytepisara pantiin testilaitteen reagenssiosalle ja sitä 15 inkuboitiin 37°C:n lämpötilassa Seralyz^ (Ames Division, Miles Laboratories Inc.) heijastusspektrofotometrissä 2,5 minuuttia, jona ajankohtana mitattiin heijastus 640 nm:ssä. Heijastusarvot on esitetty seuraavassa taulukossa.

20 [K* ] (mM)_(K/S)2 0 0,2048 0,2 1,4945 0,6 5,3038 1,1 8,4158 25

Arvot osoittavat lineaarisen riippuvuuden K+-pitoisuuden ja (K/S)2-arvojen välillä.

(K/S)2 saadaan kaavasta 30 (1-R )4 (K/S)2 = - 4R2 jossa R on heijastusjae testilaitteesta, K on vakio ja S 35 on kulloisenkin heijastavan väliaineen valonsirontakerroin.

ia 79697

Edellä esitetty yhtälö on yksinkertaistettu muoto hyvin tunnetusta Kubelka-Munk-yhtälöstä (kts. Gustav Kortum, "Reflectance Spectroscopy", ss. 106 - 111, Springer Verlag, New York (1969)].

5 Edellä esitetyt arvot osoittavat, että kaliumpitoi- suus vastaa lineaarisesti (K/S)2-arvoja. Lisäksi arvot osoittavat, että eri pitoisuuksia voidaan mitata tarkasti.

Il

Claims (5)

1. Uusi yhdiste, tunnettu siitä, että sillä on kaava I

5 PH N A O jossa R on alempi alkyyli ja X on halogeeni.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen yhdiste, tunnettu siitä, että R on metyyli ja X on kloori.

3. Menetelmä patenttivaatimuksen 1 mukaisen yhdisteen valmistamiseksi, tunnettu siitä, että yhdiste, jolla on kaava II 20 il X x i I V NX 25 jossa X on halogeeni ja yhdiste, jolla on kaava III A-OH NH 30 jossa R on alempi alkyyli ja A on alempi alkyleeni, yhdistetään ensimmäisen reaktioseoksen muodostamiseksi; ensimmäisen reaktioseoksen pH-arvo säädetään vähintään arvoon 35 noin 8 toisen reaktioseoksen muodostamiseksi; ja patentti- i4 79697 vaatimuksen 1 mukainen yhdiste tai sen suola otetaan talteen toisesta reaktioseoksesta.

4. Patenttivaatimuksen 3 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että talteenottovaihe käsittää 5 pH-arvon säätämisen alueelle noin 2-4.

5. Patenttivaatimuksen 3 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että yhdistysvaihe käsittää 2,5-dikloorikinoni-4-kloori-imidin ja N-[1'-(2'-metyyli)naf-tyyli]aminoetanolin yhdistämisen, ja että patenttivaatimuk- 10 sen 1 mukainen yhdiste on 2-metyyli-4-(3',5'-dikloorifen-4'-oni)indonaft-l-oli. li is 79697