JPH0659235B2 - アイソザイム混合物から１つの酵素を測定する方法及びテスト担体 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明は妨害アイソザイムを阻害し、阻害されていない
酵素を測定することにより液体試料中のアイソザイム混
合物から１つの酵素を測定するための方法に関する。

本発明のもう１つの課題は妨害アイソザイムを阻害し、
阻害されていない酵素を測定することにより液体試料中
のアイソザイム混合物から１つの酵素を迅速に測定する
ための、試料供給域、評価域並びに多数のテスト層を有
するテスト担体である。

更に、本発明は液体試料中のアイソザイム混合物から１
つの酵素を測定するためのテスト担体の使用を記載す
る。

従来の技術 酵素活性の測定は医学的診断学の重要な分野である。こ
うして、例えば、血液、血清、血漿、尿、髄液、唾液又
は十二指腸液のような体液中の一定の酵素の活性の調査
は疾患があるかどうかの判定のために用いられる。この
ための例はラクテート−デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）、
クレアチン−キナーゼ（ＣＫ）又はアミラーゼである。
自体酵素ではない液体内容物の測定もしばしば、内容物
の濃度に関する尺度を形成する酵素活性を同様に最終的
に測定する反応により実施される。そのような物質は化
学反応及び酵素反応の組合わせにより、又は酵素反応単
独により測定される。免疫学的測定もしばしば酵素活性
測定で終結する。この例は、例えばいわゆる“酵素イム
ノアツセイ”（ＥＩＡ）であり、ここでは酵素は物質の
標識のために使用され、この測定した活性は最終的には
測定すべき物質濃度に関する尺度である。標識酵素とし
てはしばしばアルカリホスフアターゼ、ガラクトシダー
ゼ又はペルオキシダーゼが使用される。

酵素測定における問題は誤差を生ぜしめるアイソザイム
のために生じる誤差のある又は診断学的に証言能力のな
い測定である。アイソザイムとは同一基質を同一生成物
に変換するが、異なる一次構造（アミノ酸配列）及び／
又は異なるコンホーメーシヨンを示す酵素である。その
ような酵素は同じ又は同一源に由来する。しかし、これ
らは異なる起源に由来することもある。

器官の疾患を知るためには、しばしば異なる器官からは
その器官に特異的な酵素が体液中に達するという知識を
利用する。器官の疾患においては、通常体液、例えば血
液、血清、血漿、尿、髄、唾液又は十二指腸液中に通常
分布する器官特異的酵素が正常な量に対して変化した濃
度で存在することがある。アイソザイムは明らかな診断
学的証言をしばしば誤まらせる。こうして、例えば乳酸
デヒトロゲナーゼ（ＬＤＨ）の筋肉（Ｍ）−及び心臓
（Ｈ）−型のアイソザイムが存在し、このうちのＨ_４−
型だけが心筋硬塞の経過に関する証言を行なうことがで
きる。クレアチンキナーゼ（ＣＫ）には筋肉（ＭＭ）
−、脳（ＢＢ）−及び心臓（ＭＢ）−型のアイソザイム
が公知である。ＣＫ−ＭＢ−種のみが心臓診断学に重要
である。α−アミラーゼは膵臓（ｐ）−型として、及び
唾液（Ｓ）−型として存在する。膵臓の診断に重要なの
はｐ−α−アミラーゼである。

免疫テストにおいては非希釈試料の検査のために自体好
適な標識酵素を使用することがしばしば許されない。な
ぜならば内在酵素、すなち試験すべき試料液体中に存在
する酵素がアイソザイム活性を示すためである。こうし
て、血液試料中に内在アルカリホスフアターゼ活性及び
ペルオキシダーゼ活性がある場合、これを相応するアイ
ソザイム標識酵素に使用することはできない。しばしば
標識酵素として使用される、大腸菌からのβ−ガラクト
シダーゼにも、低いｐ^ｋ−値で基質を使用する際に特に
妨害する、体液中のアイソザイムがある。

アイソザイム混合物から１つの酵素を検出するために、
一定の範囲で効果のある一定の配合物がある。ヨーロツ
パ特許公開第０１５０３０９号明細書中には唾液−アイ
ソザイムを抗体により沈降させ、分離するか、又は固定
した抗体により唾液アイソザイムを試料から除去する、
唾液アミラーゼを伴なう膵臓アミラーゼの測定が提案さ
れている。どちらの場合にも分析を複雑にする分離工程
が必要である。この方法による唾液アミラーゼを伴なう
膵臓アミラーゼの測定のためにかかる時間は、特に試料
と阻害する抗体との時間のかかる恒温保持のために約３
０分間かかる。

クリニカル・ケミストリー（Clinical Chemistry）第２
８巻、第１５２５〜１５２７頁（１９８２年）は、唾液
アミラーゼを伴なう膵臓アミラーゼの測定のために、妨
害する唾液酵素を小麦の胚から単離したインヒビターに
より不活性化する方法を記載している。この方法は均質
な溶液中での測定を可能とするが、高いアミラーゼ活性
の溶液に関しては測定の前に希釈することを推めてい
る。更に、選択性は不十分である。最適なインヒビター
濃度においても唾液−酵素の活性の約１３％が保持さ
れ、一方膵臓の酵素の活性は約８１％に減少する。挙げ
た文献中に記載された方法を実施するための時間は約１
０〜１５分間であり、このうち５分間は唾液酵素の阻害
に使用される。

西独特許公開第３５００５２６号公報中にはモノクロー
ナル抗体が記載されており、このモノクローナル抗体は
均質溶液中で唾液アミラーゼを抑制し、膵臓アミラーゼ
には影響を与えない。唾液アミラーゼを伴なう膵臓アミ
ラーゼを測定するためのこの方法の実施のためには、試
料液体を唾液酵素を阻害する抗体と恒温保持し、その後
残つたアミラーゼ活性を測定する。妨害アイソザイムを
阻害するための恒温保持時間は１５分〜３０分間の間で
ある。

ドイツ特許公開第３５２５９２６号公報中には、唾液ア
ミラーゼの阻害のために２つの抗体を使用し、そのうち
の第１の抗体単独では９３％より少ない抑制が達せら
れ、かつ第２の抗体は酵素に結合するが、５％より僅か
な抑制のみを達成する場合、モノクローナル抗体による
唾液−アイソザイムの阻害による唾液アミラーゼを伴な
う膵臓−アミラーゼの測定の際に、阻害のために必要な
恒温保持時間は著しく減少される、ということが記載さ
れている。このようにして、唾液アミラーゼの阻害のた
めの恒温保持時間は約５分間に短縮される。

前記文献は、試料を必要な試薬の溶液又は懸濁液とキユ
ベツト、小管又は相応する液体容器中で接触させる湿式
法だけを記載している。検査すべき試料に試薬を正確に
配量添加する必要性及びその他の場合により必要な工程
は十分に訓練された実験者を必要とし、かつそれ由に、
及び測定工程の間に作業が必要とされるので、人も時間
も集中的に必要である。これに対して担体結合テストは
方法の実施に必要なすべての試薬を固体担体上に、検査
人が検査すべき試料を担体上に供給した後もはや試料液
に手を出す必要が全くないように配置する。クリニカル
・ケミストリー（Clinical Chemistry）、第３１巻、第
１０００頁、１９８５年は担体結合アイソザイムテスト
に関する例を挙げている。そこではクレアチン・キナー
ゼＭを伴なうクレアチン・キナーゼＢを測定することの
できる薄膜要素が提案されている。この方法は妨害する
アイソザイムクレアチン・キナーゼＭの相応する抗体に
よる阻害及び残つたクレアチン・キナーゼ活性（これは
クレアチン・キナーゼＢによる）測定にもとづく。この
測定法に必要な試薬はテスト担体上に存在し、テスト担
体上への供給の後液体試料と接触する。

このクレアチン・キナーゼ・アイソザイムテストは妨害
アイソザイムの阻害のために７分間の恒温保持時間を必
要とし、かつこれは全血で実施不可能である。

この担体結合アイソザイムテストの最適な変法はクリニ
カル・ケミストリー（Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓ
ｔｒｙ）、第３２巻、第１１３０頁、１９８６年に記載
されている。測定法に必要な試薬の濃度の最適化により
妨害アイソザイムの阻害のための恒温保持時間を3.5分
間に短縮することができた。全体で、興味深い酵素を測
定するために５分より長い時間を必要とする。

従来の技術が示すように、妨害アイソザイムの阻害及び
阻害されていない酵素の測定による液体試料中のアイソ
ザイム混合物から１つの酵素を測定するための方法は公
知である。しかしながら、これらの方法は、試料構成
分、例えば妨害するアイソザイムの分離を部分的に必要
とし、高いアミラーゼ活性を有する非希釈試料又は全血
には使用することができないという欠点を有している。
従来技術の一般的欠点は、もともとの測定反応を実施す
る前に、妨害アイソザイムの抑制のために著しく長い恒
温保持時間を必要とするということである。従来、５分
間より短かい時間で終了するアイソザイムテストは全く
知られていない。近代的医学診断法にとつては、緊急の
場合の治療のために緊急に必要な判定をすぐさま行なう
ことができるためにも、又は診療時間内に患者を診断
し、かつ相応する治療を実施することができるために
も、測定をできるだけ迅速に実施するための努力がなさ
れている。

発明が解決しようとする課題 従つて、本発明の課題はアイソザイム混合物から１つの
酵素をできるだけ迅速に、いずれにしても５分間より短
かい時間で測定できる可能性を見い出すことである。こ
の測定はアイソザイムのための独立した分離工程を必要
とすべきではなく、かつできるだけ普遍的に非希釈の液
体試料、特に体液、例えば尿、唾液、髄液、十二指腸液
及び有利に血漿、血清及び全血で実施することができる
べきである。全血及び血漿試料又は血清試料は比較可能
な結果を提供すべきである。更に、このアイソザイム測
定はできるだけわずかな試料の量で実施することができ
るべきである。

課題を解決するための手段 この課題は特許請求項に詳細に特徴を示した要件により
解決する。

特に、この課題は妨害するアイソザイムの阻害及び阻害
されていない酵素の測定により液体試料中のアイソザイ
ム混合物から１つの酵素を測定するための方法により解
決し、この方法は アイソザイム混合物を、妨害アイソザイムを阻害するこ
とのできる１種又は複数種の物質と接触させ、 この阻害物質を含有する試料を細孔性反応媒体中に導入
し、妨害酵素をそこで阻害し、かつ生じた液体中の阻害
されていない酵素の測定を実施する、 ことを特徴とする。

更に、この課題は試料供給域、評価域並びに多くのテス
ト層を有するテスト担体により解決し、このテスト担体
は 試料供給域中で粗孔性材料が妨害アイソザイムを阻害す
ることのできる物質を１種又は複数種含有しており、 ここに細孔性媒体が、粗孔性材料からの液体搬送を可能
とするように直接接触しており、かつ 評価域中には阻害されていない酵素を特徴的なシグナル
により測定するために必要な物質を含有する１つ又は複
数の層が配置されており、かつこれらの層は細孔性反応
媒体と液体移行を可能にする接触状態になるか又は細孔
性反応媒体とそのような接触状態にもたらされることの
できることを特徴とする。

この課題は液体試料中のアイソザイム混合物から１つの
酵素を測定するために前記のテスト担体を使用すること
により特に解決する。

本発明は、妨害アイソザイムを阻害し、阻害されていな
い酵素を測定することにより液体中のアイソザイム混合
物から１つの酵素を著しく迅速に測定することが、液体
試料（試料から誘導された液体も含有する）を妨害アイ
ソザイムに作用する物質と混合し、次いでこの物質を含
有する液体を、妨害アイソザイムの阻害が主に行なわれ
る細孔性反応媒体中に導入する場合に可能となるという
意外な発見に主に基づく。この阻害は著しく短時間に、
概略１分より短時間で、終了する。引き続き、阻害され
ていない酵素の測定を公知法で行なうことができる。

液体試料としては原則的にアイソザイム混合物中に測定
すべき酵素を含有するすべての液体を使用することがで
きる。体液、例えば血液、血漿、血清、尿、髄液、唾液
又は十二指腸液が有利である。血液、血漿及び血清が特
に有利である。全血の使用の際には、試料と妨害アイソ
ザイムに作用する物質との接触の前に細胞性血液成分、
特に赤血球を除去することが多くの場合勧められる。体
液を試験すべき時、本発明方法を実施するためにこれを
希釈する必要はない。

ここで、阻害とは酵素活性の完全な抑制を意味する。本
発明においては完全な抑制とは９０％を越える、有利に
は９５％を越える阻害を意味する。すなわち、阻害すべ
きアイソザイムは阻害の後、残留活性１０％、有利には
５％を越えて示してはならない。

本発明方法のためには、アイソザイムの阻害のために前
記条件を満たし、更に測定すべき酵素の活性に本質的に
影響を与えないすべての物質を使用可能である。妨害ア
イソザイムを阻害する物質と測定すべき酵素との交差反
応は有利に５％より小さい。更に、本発明による方法に
使用可能な阻害物質は、阻害されていない酵素の測定に
マイナスの影響を与えるべきではない。

原則的には前記条件をみたすすべての阻害物質が本発明
方法に好適である。妨害アイソザイムに対する抗体が特
に好適である。モノクローナル抗体は特に特異的に阻害
に作用する。この種の抗体はすでに記載されているか、
又はその製造は専門家によく知られている。本発明の測
定法のためには抗体をそれ自体として、又はこれに相応
する阻害特性を有するフラグメントとして使用する。従
つて、“抗体”という概念にはここではフラグメントも
包含される。

唾液−α−アミラーゼを特異的に抑制するモノクローナ
ル抗体は西ドイツ国特許公開第３５００５２６号公報か
ら公知である。この抗体はNCACC(National Collection
of Animal Cell Culture;Porton Down,GB在)に寄託番号
（９９Ｄ１２）８４１２２００３及び（８９Ｅ２）８４
１２２００４として寄託されている。このような抗体は
本発明方法により唾液−α−アミラーゼの存在において
膵臓−α−アミラーゼを測定するために好適である。西
独特許公開第３５２５９２６号公報に記載された、唾液
−α−アミラーゼに対する２つの抗体の組合わせにも同
じことがいえる。これらの抗体はNCACC(National Colle
ction of Animal Cell Culture;Porton Down,GB在)に寄
託番号（９９Ｄ１２）８４１２２００３及び（８９Ｅ
２）８４１２２００４並びに８４１１１３０１及び８４
１１１３０２として寄託されている。特に唾液−α−ア
ミラーゼに作用する、寄託番号８４１２２００３及び８
４１１１３０１又は８４１２２００３及び８４１１１３
０１のモノクローナル抗体の組合わせは膵臓−α−アミ
ラーゼを唾液−α−アミラーゼの存在において測定する
ための本発明方法にとつて著しく好適である。

本発明方法にとつては、アイソザイム混合物を妨害アイ
ソザイムに作用する阻害物質と接触させることが必要で
ある。このことは該物質をアイソザイム混合物に加える
か、又はその逆を意味する。アイソザイム混合物を阻害
物質に加え、かつこれが均質媒体を形成するように取り
込むのが有利である。“均質媒体”とは物質がアイソザ
イム混合物と密な混合にあるということを意味する。こ
の物質が接触の後アイソザイム混合物により試料の液体
中に溶けているのが有利である。

妨害アイソザイムの阻害はすでに部分的にアイソザイム
混合物と阻害物質との接触の際に行なわれる。迅速で完
全な阻害を達成するために、阻害物質を含有する試料を
できるだけ早く細孔性反応媒体中に導入しなければなら
ず、ここで阻害は迅速に、かつ完全に行なわれる。阻害
物質との接触の後、試料を１分より短時間内に、有利に
は数秒内に細孔性反応媒体中に導びくことが有利であ
る。そこで、妨害アイソザイムは短時間で、一般に１分
間、又はそれより短時間で阻害される。

測定すべき酵素の活性に相応する、残留酵素活性の測定
は必要な試薬の添加により細孔性反応媒体中で行なう
か、又は該試料を細孔性反応媒体から除去し、この材料
の外で測定すべき酵素に関して試験することができる。
阻害されていない酵素の測定は公知基質を用いて公知法
により行なわれる。膵臓−α−アミラーゼの測定のため
には、例えば西独特許公開第３５００５２６号、同第３
５２５９２６号公報、ヨーロツパ特許公開第０１５０３
０９号公報及びフレゼニウス（Fresenius），Ｚ．Anal.
Chem.,第３２４巻、１９８６年、第３０４〜３０５頁に
記載された方法に相応して実施する。

本発明による方法を担体結合して実施するのが特に迅速
で有利である。“担体結合”とは、方法の実施に必要な
すべての試薬及び材料を不活性担体、有利に不活性プラ
スチツク材料に配置することを意味します。該方法の担
体結合した実施は非常に少量の試料量でも、所望の酵素
の著しく迅速な測定を可能にする。

本発明による方法のためには、特に担体結合形において
は、妨害アイソザイム阻害物質を粗孔性材料上に、この
阻害物質が液体試料との接触の際に解放されるように担
持する。このように負荷された粗孔性材料上にアイソザ
イム混合物を供給する。この阻害物質は解放される。物
理的力、例えば重力又は毛管現象による力、しかし有利
には毛管現象による力により、この阻害物質を含有する
液体は細孔性反応媒体中に導びかれる。このことは他の
材料を会して間接的に、有利には直接液体搬送を可能と
する粗孔性材料と細孔性材料との間の接触により直接行
なわれる。

本発明において粗孔性材料とは基本的に、本発明方法に
十分量の阻害物質を担持し、液体との接触の際にこれを
迅速に解放することができ、かつ迅速な液体透過を可能
とする程大きな表面を有するすべての材料である。粗孔
性材料からのインヒビターの解放及び細孔性反応媒体中
への液体搬送は該測定法の律速段階であつてはならな
い。膨潤性又は非膨潤性材料からなるモノフイル又はマ
ルチフイルウエブ様フリース又は織物を使用するのが有
利である。特に試料量の少ない実験において非常に重要
である。僅かな液体保持能のために、非膨潤性材料は特
に好適である。液体保持能とは細孔性反応媒体の吸引力
により粗孔性材料から取り出されることなく、そこに残
る液体量である。液体保持能は使用した試料容量の２０
％より少量であるのが有利であり、特に１０％より少量
であるのが有利である。好適な粗孔性材料は有利にポリ
エステルからなる。同様に、ナイロン織物又はナイロン
とポリエステルとからなる混合織物が好適である。孔径
と関係のある空気通過量が２０００／m²・秒を上回る
粗孔性材料が特に好適である。この空気通過量限界を下
まわると、この粗孔性材料を介する試料通過はもはや本
発明に必要であるように迅速に行なわれず、この材料を
通り、かつこの材料から出る液体搬送が律速段階となる
ということが見い出された。粗孔性材料として厚さ７０
〜１４０μｍで、空気通過量２０００〜１００００／
m²・秒の織物が有利であり、特に厚さ８０〜１０５μｍ
で、空気通過量４０００〜７０００／m²秒の織物が特
に有利である。比較可能な厚さ及び孔径を有する単一フ
アイバー・エンドレスフリースも好適である。

本発明において細孔径反応媒体は、その表面が試験すべ
き液体試料で湿潤性であり、かつこの孔は２５μｍより
小さく、有利には0.5〜２５μｍ、特に有利には１〜１
０μｍの間の孔径を有する材料である。孔径の最少限界
は希釈せずに使用可能な試料、特に血液、血漿又は血清
の粘度により決められる。この下限を下まわる場合、細
孔性反応媒体中への試料の完全な取り込みは測定法の律
速段階となる。すでに見い出されたように、妨害酵素の
阻害は細孔性反応媒体の中で、反応媒体の外側表面上で
より、又はそのような細孔性媒体がない場合より著しく
迅速に経過するので、試料液体はできるだけ迅速に細孔
中を通過することができなければならない。孔の最大限
は、この孔径をうわまわると、毛管現象の力が低下する
ために試料の吸収速度が低くなり、この限界をうわまわ
る孔を有する材料は本発明による課題をもはや解決しな
くなることから生じた。

本発明方法にとつては細孔性反応媒体の吸引能は５〜１
００μｌ／cm²を有するべきである。

材料の厚さは８０〜１０００μｍの間であつてよい。

阻害されていない酵素の測定を細孔性でなくて、他の反
応媒体中で実施する有利な場合には、細孔性反応媒体と
して圧縮可能な材料が特に有利である。こうして、他の
材料を細孔性反応媒体上に押しつけると、この押圧によ
り液体搬送を可能にする接触がもたらされ、試験すべき
液体の残留活性は容易に細孔性反応媒体から他の材料中
に導入される。液体搬送は主に物理的力、例えば重量及
び／又は毛管現象により生じる。

本発明方法に使用される、粗孔性材料も細孔性材料も、
試料内容物と、吸着的にであれ、化学的にであれ、結合
しないということは重要である。これとの関連におい
て、試料内容物とはもともと試験すべき試料中に含有さ
れる物質だけでなく、測定法の間に試料中に達する物質
や試薬をも包含する。不所望な結合は誤つた測定結果に
導びく。このような意味において試料内容物と結合する
材料を場合により、試料内容物との非特異的結合特性を
失なうように処理することができる。そのように処理し
た物質は細孔性又は粗孔性材料として本発明方法のため
にも使用可能である。試料内容物の固体材料への不所望
な非特異的な結合の阻止法は公知技術から専門家には公
知である。例えば、担体材料への試料蛋白質の不所望な
非特異的結合はアルブミンでこの材料を処理することに
より予防することができる。

細孔性反応媒体としては、前記特性を有する織物、フリ
ース、膜又はフイルムが有利に好適である。

細孔性反応媒体として使用可能な材料は、場合によりそ
の表面が前記の意味において試料内容物との不所望な結
合を生じないように改変されている膜である。市販され
ているそのような材料は、例えばロプロジン（Loprodyn
e） （Pall社、Glengrove、New York、USA在）又は親水
性デュラポーレ（hydrophile Durapore） （Millipore
社、Bedford、USA在）である。不活性蛋白質、例えばア
ルブミンにより飽和されたセルロース膜又はセルロース
誘導体膜も使用可能である。セルロース誘導体として
は、例えばセルロースエステル、セルロースエーテル又
はニトロセルロースを挙げることができる。非特異的結
合に関して処理されたナイロン膜も細孔性反応媒体とし
て本発明方法に使用可能である。

場合により相応する内容物、例えば珪藻土のために多孔
性であるフイルムも有利に好適である。そのようないわ
ゆる開放フイルムも例えばヨーロツパ特許公開第００１
６３８７号公報に記載されている。

ステープルフアイバー、グラスフアイバー又はプラスチ
ツク、例えばナイロン、ポリエステル、ポリエチレンを
ベースとしたフリースは同様に有利に使用可能である。

細孔性反応媒体として特に好適であるのは３〜７μｍ、
特に約５μｍの孔を有する膜及び１〜１０μｍ、特に１
〜５μｍの孔を有するグラスフアイバーフリースであ
る。

担体結合型で本発明方法を実施するためには、細孔性反
応媒体に対する粗孔性材料に関する孔径比が２〜２００
０、有利に５〜５００、特に有利には１０〜１００であ
る場合特に有利であることが判明した。

担体結合型で本発明方法を実施するためには、試料供給
域及び評価域並びに多くのテスト層を有するテスト担体
が好適である。テスト担体はしばしば縦長のテストテー
プとして構成されている。しかしながら、正方形又は矩
形の小片として構成されるテスト担体も公知である。主
にテスト担体はテスト層、すなわち実施すべきテストに
必要な試薬を含有する材料からなる。前記の場合におけ
るように全く試薬を有さず、例えばその材料構造のため
に試験すべき液体をあるテスト層から他のテスト層に搬
送するか、反応媒体として、いわば反応容器のようなも
のとして相互に反応する物質を取り込むか、又は一定の
試料内容物のためのフイルターとして作用するテスト層
がテスト担体の構成に関与していてもよい。

テスト担体は一般に、かつ特に本発明において、試料供
給域と評価域に区分されていてよい。試料供給域はテス
ト担体の試料を供給する領域である。評価域は測定すべ
きパラメーターに関する尺度であるシグナルを試験の結
果として測定する領域である。試料供給域と評価域とは
多くの場合同一でなく、本発明においては液体搬送を可
能とする媒体により相互に結合している。

本発明によるテスト担体は試料供給域中に、アイソザイ
ム混合物から１つの酵素を測定するために妨害アイソザ
イムを阻害する。前記のような１種又は複数種の物質を
含有する、前記のような粗孔性材料を有する。これに続
いて反応媒体として働らく前記種類の細孔性材料が、粗
孔性材料からの液体搬送を可能とするように細孔性材料
と粗孔性材料とが接触しているように設けられている。
細孔性材料は本発明によるテスト担体の試料供給域と評
価域とを結合し、このことにより妨害アイソザイムを阻
害するための反応媒体としての機能の他に、試験すべき
液体試料を試料供給域から評価域に搬送するためにも働
らく。

本発明によるテスト担体の評価域は１つ又は複数のシグ
ナル形成層を含有する。このシグナル形成層は阻害され
ていない酵素の測定のために必要な試薬を含有し、かつ
このシグナル形成層は細孔性反応媒体と液体移行を可能
とする接触状態にあるか、又はこれとこのような接触状
態にすることができるように配置されている。

シグナル形成層と細孔性反応媒体との接触も、細孔性反
応媒体と粗孔性インヒビター担体との接触もどちらも平
面の接触を意味し、こうしてできるだけ大きな接触面を
形成するのが有利である。

試験すべき液体とシグナル形成層の検出試薬との接触に
おいて、検出可能なシグナルが生じ、これは阻害されな
かつた酵素の量に関する尺度である。本発明は特に検出
可能なシグナルとして特徴的な変色を生じる場合に関す
るが、この際呈色も同様に変色（無色から有色への）と
みなされる。阻害されていない酵素の測定のための試薬
としては測定法に関してすでに前記のものを使用するこ
とができる。

シグナル形成反応に必要な試薬が相互に認容性であり、
例えばその安定性に関してマイナスに影響を与えない場
合、これらの試薬は１つの層中に一緒に存在してよい。
場合により、測定試薬が空間的に分離され、複数の層に
分配されているということも必要である。この場合、全
体で、測定反応に関して必要な試薬をすべて含有する複
数のシグナル形成層がある。

有利な本発明によるテスト担体の実施形は、これらのシ
グナル形成層が全面的に相互に接触しているように、又
は相互に接触がもたらされるように配置されたシグナル
形成層を有する。このような接触は、液体が域る層から
他の層に移行することができるように働かなくてはなら
ない。

測定反応に必要な試薬が複数のシグナル形成層に含有さ
れている場合、すべてが細孔性反応媒体と液体移行を可
能とする接触にあるか、又は細孔性反応媒体とそのよう
な接触にもたらされることができなければならない。本
発明によるテスト担体の有利な実施形においては、測定
試薬のそれぞれの多くの部分の１つを含有する層だけが
細孔性材料と直接に接触しているか、又はこれと直接的
に接触されることができる。測定反応に必要な試薬の残
りを含有する他の層は前記の層を介して細孔性反応媒体
と間接的に接触しているか、又は細孔性反応媒体と間接
的な接触をもたらされることができる。“間接的な接
触”とはここではこれらの層が液体移行を可能とする接
触を直接的に有さず、液体はその間にある層を介しての
み移行することができることをいう。

本発明によるテスト担体のシグナル形成層は、阻止され
ていない酵素の測定にとつて必要な試薬すべて、又はそ
の一部を含有する材料からなる。この試薬担体材料は原
則的にこのために常用の材料すべてから選択することが
できる。例えば吸収性又は膨潤性、多孔性又は非多孔性
材料を使用するか、又は試験すべき液体と接触する際に
その中に溶けるようなものも使用することができる。

セルロース、フイルターペーパー、プラスチツクフアイ
バーフリース、グラスフアイバーフリース、ポリビニル
エステルフイルム、ポリアミドフイルム、又は例えばキ
サンタン・ゴムからなるフイルムを挙げることができ
る。

細孔性反応媒体からシグナル形成層中への良好な液体移
行が達せられる。吸収性、膨潤性及び／又は多孔性材料
が有利である。

シグナル形成層において生じたシグナルは、変色の場合
視覚的にも、測光法によつても測定することができる。
生じたシグナルの反射測光法による測定が特に有利であ
る。

血液中のアイソザイム混合物から１つの酵素を測定する
ために本発明によるテスト担体を使用すべき場合、この
テスト担体が試料供給域に細胞成分を血液から分離する
ための層を有しているのが有利である。例えばヨーロッ
パ特許公開第００４５４７６号公報から公知であるよう
な多孔性層を使用可能である。分離層は、本発明による
テスト担体中で、試験すべき試料がこの層を通過した後
に粗孔性層と接触するように設けられている。

本発明の利点は区にアイソザイム混合物から１つの酵素
を５分間より短時間に、有利には３分間より短時間に測
定することがはじめて可能になる、ということにある。
このことは特に、妨害アイソザイムが非常に迅速に、有
利には１分より短時間で、本発明による細孔性反応媒体
中で阻害されることにより達せられる。更に、本発明に
よる酵素測定のためには、妨害アイソザイムに関する特
別な分離工程が必要でない。一般的に非希釈液体試料、
特に体液を試験することができ、この際特に有利にきわ
だつのは、血液と血漿試料又は血清試料とが比較可能な
結果をもたらすということである。更に、特に本発明に
よるテスト担体を使用する際に、所望の酵素の測定のた
めに３０μｌ又はそれより少ない量の試料量で十分であ
る。

実施例 次に図面に概略的に図示した実施例につき本発明をより
詳細に説明する。

第１、２及び３図は本発明によりテスト担体の種々の実
施形の断面図である。

第４図は本発明によるテスト担体の有利な実施例の側面
図である。

第１図はすべてのテスト層が液体移行を可能にする接触
にあるテスト担体の断面を示す。テスト層はフレーム８
により一緒に保持される。フレーム８は種々の材料から
なつていてよい。このフレームはテスト層相互を一緒に
保持するという目的のみをみたせばよい。例えば溶融接
着テープ又は、例えば写真スライドから公知であるよう
な厚紙フレームが好適である。

試料供給域は層１及び２からなる。１は血液から細胞成
分、特に赤血球を分離するための層である。この血液細
胞分離層は全血中のアイソザイム混合物から１つの酵素
を測定する本発明方法を、あらかじめ血液細胞を分離除
去することなく実施することを可能とする。血液細胞分
離層の材料としては原則的にすべてのこのために公知の
材料を使用することができる。しかしながら、例えばヨ
ーロツパ特許公開Ａ第００４５４７６号公報に記載され
ているようなグラスフアイバーフリースが特に有利であ
る。本発明によるテスト担体で全血を使用せず、細胞成
分の除去の必要のないような試料を調べる場合、分離層
１は必要がない。しかしながら、テスト担体全面にわた
つての均質な湿潤を達成するためにも、細胞試料成分を
分離しなくとも、供給した試料液を広げることを可能と
する層１をその他のテスト層の上に設けるのが有利であ
る。そのような展開層の材料はすでに公知である。ヨー
ロツパ特許公開Ａ第００４５４７６号公報によるグラス
フアイバーフリースは細胞血液成分の分離に作用するだ
けでなく、その下に存在するテスト層をその全面にわた
つて均質にぬらす。２は妨害アイソザイムを阻害する物
質を含有する粗孔性材料からなる。３はその中で妨害ア
イソザイムを阻害する細孔性反応媒体である。４は阻害
されなかつた酵素を測定するために必要な試薬を含有
し、かつテスト担体の評価域を形成するシグナル形成層
である。

アイソザイム混合物中の１つの酵素を測定するために第
１図のテスト担体を使用する際には、試験すべき液体を
層１上に供給し、ここでテスト層の全面に均質な分布が
行なわれる。試験すべき試料が全血である場合、層１は
更に細胞性血液成分を分離することのできる材料であ
る。液体はその重力に従い、かつ毛管現象の力により粗
孔性層２中に達し、ここでこの液体は妨害アイソザイム
を阻害する物質を受け取る。この物質と混合した液体は
非常に迅速に細孔性反応媒体３中に吸引される。試料の
定量測定のためには層２の液体保持能はできるだけ小さ
い方がよい。層３中では所望の酵素の測定を妨害するア
イソザイムの阻害が行なわれ、その後この液体はシグナ
ル形成層に達し、そこで試料中の測定すべき酵素の量に
関する尺度であるシグナルが形成される。測定すべき酵
素によりシグナル形成層の変色が惹起されるのが有利で
ある。この変色を層４の試料供給側の反対側から視覚的
に又は測光法、特に有利には反射測光法により測定する
ことができる。

第２図は、ここに図示した本発明によるテスト担体の実
施形が測定すべき酵素の測定に必要なすべての試薬を唯
１のシグナル形成層中に含有していないということによ
り第１図とは異なつている。ここでは試薬は層５及び６
に分配されており、この両方の層が一緒になつて評価域
を形成する。こうして、相互に認容性でない試薬を有利
に相互に空間的に分離することができる。試験すべき液
体は層５を通過する際に層６の試薬との反応のために必
要な試薬を取り込むか、又は層５中でそこに存在する試
薬と反応系の第１工程を経過し、次いで層６中に存在す
る試薬で反応が完結する。

第３図中では評価域がフラツプのように構成されてい
る。層５及び６は測定反応にとつて必要な試薬を空間的
に分離した形で含有する。より良好な取り扱かいのため
に層６を測定反応に不活性な、透明なシート７上に担持
させ、かつ可動性のちようつがい様の要素９でフレーム
８と結合する。フラツプ様に配置された層５及び６を用
いて、時間を正確に定義した測定反応を開始することも
可能である。試料供給の後、液体は層５まで透過し、そ
こに存在する試薬を溶かすか、又はそこに存在する試薬
と多くの反応工程からなる反応列の第１の反応工程を行
ない、次いで一定の時点に閉じることにより層６を層５
と接触させると、液体はこの層中に移行する。測定反応
は終結し、可視で、又は測光法により正確に知られた時
間にわたつて透明なシート７を介して観察することがで
きる。

第４図はテープ状のテスト担体の有利な実施形を示す。
硬いベースシート１０上に溶融接着テープ１１及び２０
で測定に必要なテスト層を固定する。試料供給域１８中
にはプラスチツク、有利にポリエステルからなる被覆ネ
ツト１２の下に血液から細胞成分を分離するためのフリ
ース１３、有利にグラスフアイバーフリース及び粗孔性
インヒビター担体１４が設けられている。細孔性反応媒
体１５はインヒビター担体１４と液体移行を可能とする
ように接触しており、かつベースシート１０上に位置し
て試料供給域１８から評価域１９に達する。シグナル形
成層１６及び１７は溶融接着テープ２０でテープ状ベー
スシート１０上に、それらが評価域中に存在するが、細
孔性媒体１５と接触しないように固定されている。

本発明による方法を第４図のテスト担体を用いて実施す
るためには液状試料、例えば全血を被覆ネツト１２上に
付与する。液体試料は被覆ネツトを介して層１３中に達
し、試料が全血の場合にはここで細胞性血液成分は保持
される。

重力と毛管現象の力により試料はインヒビター担体１４
中に達し、ここで妨害アイソザイムを阻害する物質が解
放される。インヒビターを有する試料は非常に迅速に細
孔性反応媒体１５中に吸引され、ここで阻害が非常に迅
速に行なわれる。毛管現象により、試料は細孔性反応媒
体中を試料供給域１８から評価域１９中に搬送される。
妨害アイソザイムの阻害の終了後、阻害されていない酵
素の測定のために備えられている層１６及び１７を細孔
性反応媒体１５上に押しつけ、この層中に存在する試薬
を試験すべき液体と接触させる。試料中の測定すべき酵
素の量に関する尺度として層１７中に生じた変色を可視
で、又は測光法、有利に反射測光法によりベースシート
１０の反対側からこの層で測定する。

テスト担体の寸法及び特に個々のテスト層の寸法は試験
すべき試料容量に適合していなければならないことは当
然である。

次に、本発明と実施例につきより詳細に説明するが本発
明はこれにのみ限定されるものではない。

例１ インヒビター担体及び細孔性反応媒体に関して種々の材
料組合わせを有する種々のテスト担体の比較 A)テスト担体の製造 第４図によるテスト担体を４つ製造し、この際モデル１
におけるインヒビター担体１４は孔径１００μｍのポリ
エステル織物マルチ１４ノーマル（Polyester-Gewebe m
ulti １４ normal；Schweizer Seidengazefabrik社、
Thal、スイス在）からなり、モデル２においても同様に
孔径１００μｍのポリエステル織物マルチ１３ノーマル
（Schweiger Seidengazefabrik社）からなり、モデル３
においては面積重量約１７ｇ／m²で、孔径約５０〜３０
０μｍのロングフアイバー紙（Ｓｃｈｌｌｅｒ ＆
Ｈｓｃｈ社、西独在）からなり、かつモデル４におい
ては孔径1.2μｍのナイロン膜（Pall社製、Glengrove、
ニユーヨーク、ＵＳＡ在）からなり、かつこれらの材料
はそれぞれ次の成分を含有する水溶液で含浸される： 燐酸塩緩衝液、pH7.0 １００ｍ
Ｍ、 塩化ナトリウム ５ｍＭ、 クロテインＣ（CroteinC： Croda、Cheschire、英国） １重量％、 及び 織物１cm²あたり抗体の量が約１０〜１２μｇになるよ
うな量の寄託番号８４１２２００４及び８４１１１３０
１（５：１）の抗唾液アミラーゼ抗体。

細孔性反応媒体１５はモデル１においては孔径約１〜５
μｍのグラスフアイバーフリース（Binzer社製、Hatzfe
ld、西独在）からなり、モデル２においては孔径0.45μ
ｍのナイロン膜（Pall社製、Glengrove、ニユーヨー
ク、ＵＳＡ在）からなり、モデル３においては孔径約１
〜５μｍのグラスフアイバーフリース（Binzer社製、Ha
tzfeld、西独在）からなり、モデル４においては同様に
孔径約１〜５μｍのグラスフアイバーフリース（Binzer
社製、Hatzfeld、西独在）からなる。

すべてのモデルにおいてシグナル形成層１６はポリアミ
ド織物（NY20HC、Ｚｒｃｈｅｒ Beuteltuchfabrik社
製、チユーリッヒ、スイス在）からなり、これは次の水
溶液で含浸された： ２−メトキシ−４−モルホリノ−ベンゾール ジアゾニウムクロリド×塩化亜鉛 5.8ｇ／、 メタノール ２０重量％、 こうしてジアゾニウム塩約15.5μｇ／cm²の量が生じ
た。

層１７はプラスチツクシートからなる試薬フイルムであ
る。このフイルムは水１中の： ケルトロールＦ（KeltrolF；Kelco社、 Dreieich、西独在） ３ｇ 燐酸塩緩衝液pH７用 燐酸ナトリウム 15.5ｇ 塩化ナトリウム 0.6ｇ α−グルコシダーゼ １ＭＵ インドキシルマルトヘプタオキシド（ベーリンガ ーマンハイム社製、Mannheim、西独在） ２５ｇ からなる溶液を０〜４℃の温度でポリカーボネートシー
ト（Lonza社、Weyl、西独在）上に、酵素６Ｕ／cm²もし
くはインジケーター１４０μｇ／cm²の量が生じるよう
に被覆することにより製造される。

赤血球分離フリース１３としては孔径５／２５μｍのグ
ラスフアイバーフリース（Binzer社製、Hatzfeld、西独
在）をすべてのモデルに使用する。同様に４つのすべて
のモデルにポリエステルネツト（Ｚｒｃｈｅｒ Beut
eltuchfabrik社製、チユーリツヒ、スイス在）１２を使
用する。このポリエスネツト１２及び赤血球分離フリー
ス１３を大きさ６×６mmの切片に、インヒビター担体１
４を６×７mmに、細孔性反応媒体１５を１６×６mmに、
かつシグナル形成層１６及び１７を１３×６mmに切断
し、第４図に示したように、配置し、かつ溶融接着テー
プでベースシート１０としての硬いポリスチロールシー
ト１００×６mm上に固定する。

B)測定法の実施 供血者の血液及び血清試料は膵臓−α−アミラーゼ４２
Ｕ／を含有する。この試料を唾液アミラーゼと共に全
体で唾液−α−アミラーゼ８５００Ｕ／に増す。試料
各々３０μｌをモデル１から４までの個々のテスト担体
の被覆ネツト１２上に供給する。このテスト担体をレフ
ロトロン（Reflotron） のタイプの反射測光機（ベー
リンガーマンハイム社、マンハイム、西独在）中で調べ
る。テスト時間は全体で１７０秒である。試料供給１分
後に層１７及び１６を反応媒体上に押しつけ、こうして
阻害されていないアミラーゼ分の測定反応は開始する。
色形成を５６７mmにおいて反射測光法により追跡する。
次の結果が得られる： 結果は、モデル１に関してのみ短時間内に唾液−α−ア
ミラーゼの非常に良好な抑制（９７％をうわまわる）が
達せられ、血清及び血液に関して良好に一致する測定結
果が得られるということを示している。モデル２におい
ては細孔性反応媒体の孔が明らかに小さすぎるので、試
料が非常にゆつくりと浸透し、唾液−α−アミラーゼの
阻害がテスト時間内に完全に行なわれない。モデル３で
は唾液−α−アミラーゼの阻害は良好である。しかしな
がら血清と血液試料に関する結果は相互に１６％を越え
て離れる。このことは粗孔性材料として用いたロングフ
アイバー紙の約３０％の液体保持能に明らかに起因す
る。血液及び血清に関して同容量の実験においては、血
液においてそれぞれのヘマトクリツト値によるが、使用
した試料容量の半分までが液体に関して実験に提供され
るということを考慮しなければならない。ここで実験さ
れたような非常に少容量の場合には個々の層材料の液体
保持能は非常に問題である。モデル４においては、イン
ヒビター担体１５の小さい孔径が、試料が非常にゆつく
りと細孔性反応媒体中に達し、かつテスト時間の間に阻
害が完全に終了しないということに導びく。特に血液に
おいては、非常にわずかな液体のみが細孔性反応媒体中
に達し、こうしてこの液体は測定時間中に乾燥し、測定
することができなかつた。

例２ 膵臓−α−アミラーゼの特異的検出用テスト担体 第４図によるテスト担体を製造する。インヒビター担体
１４は次の水溶液で含浸したポリエステル織物マルチ１
４ノーマル（Schweizer Seidengazefabrik社、Thal、Sch
weiz在）である： 燐酸塩緩衝液、pH7.0 １００ｍＭ、 塩化ナトリウム ５０ｍＭ、 クロテインＣ（CroteinC；Croda、 Cheschire、英国） １重量％、 寄託番号８４１２２００４及び８４１１１３０１を５：
１の比で有する抗唾液アミラーゼ抗体２mg／ml、こうし
て１０〜１２μｇ抗体／cm²の量が生じる。

細孔性反応媒体１５として約１〜５μｍの孔径を有する
グラスフアイバー（Binzer社製、Hatzfeld、西独在）を
使用する。

シグナル形成層１６及び１７、被覆ネツト１２及び赤血
球分離フリース１３は例１に記載したと同じものであ
る。

個々の層を例１に記載したように切断して形を整え、溶
融接着テープで大きさ１００×６mmのポリスチロールシ
ート上に接着し、第４図によるテスト担体とする。

被覆ネツト１２上に血清３０μｌを供給し、テストテー
プはレフロトロン（Reflotron） 装置（Firma Boehrin
ger Mannheim GmbH社製、Mannheim、西独在）中で測定
波５６７ｎｍで反射測光法により評価する。試料供給１
分後に、シグナル形成層１６及び１７を細孔性反応媒体
１５上に押圧する。測定は試料供給から全体で１７０秒
後に終了する。次の結果が得られる。

膵臓−α−アミラーゼに関する実測測定値は使用したア
ミラーゼ活性と著しく良好な一致を示す。第１の実施例
においては唾液−アイソザイムの大過剰を９９％まで阻
止することができ、こうして検出された膵臓値はこのよ
うな条件下には優れた結果を示す。

例３ 唾液アミラーゼの阻害：湿式テストに対する比較 唾液アミラーゼ４２５０Ｕ／を含有する血清を調べ、
かつ本発明による方法を類似の阻害抗体を使用する市販
の湿式テストＰＮＰ−膵臓−アミラーゼ（ベーリンガー
マンハイム社、西独）と比較した。このテスト担体を例
２に記載したように製造した。抗体との種々の恒温保持
時間の後、この測定をテストテープ上で常法で行なつ
た。恒温保持時間を５〜１２０秒に選択した。

ＰＮＰ−膵臓−アミラーゼ法を製造者の記載に従つて実
施したが、前恒温保持時間を３０〜１８０秒の間で変化
させた。

生じた結果を第３表に示す。

本発明による方法は５秒間の恒温保持の後９５％の阻害
を、そして１分後には９７％を越える阻害を保障する。

湿式テストは同じ阻害に作用するために５〜１０倍の長
さ（６０秒及び１８０秒以上）を必要とする。

【図面の簡単な説明】

第１図、第２図及び第３図はそれぞれ本発明によるテス
ト担体の種々の実施形の断面図であり、第１図はすべて
の層が液体移行を可能にする接触にあるテスト担体の断
面図であり、第２図は評価域が２層からなるテスト担体
の断面図であり、第３図は評価域がフラツプ状に形成さ
れているテスト担体の断面図である。第４図は本発明に
よるテスト担体の有利な実施形の側面図である。 １，２，３，４，５，６……層、７……シート、８……
フレーム、９……ちようつがい様の要素、１０……ベー
スシート、１１，２０……溶融接着テープ、１２……被
覆ネツト、１３……フリース、１４……インヒビター担
体、１５……細孔性反応媒体、１６，１７……シグナル
形成層、１８……試料供給域、１９……評価域。

Claims (7)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】妨害アイソザイムを阻害し、かつ阻害され
   ていない酵素を測定することにより液体試料中のアイソ
   ザイム混合物から１つの酵素を測定するために、アイソ
   ザイム混合物を妨害アイソザイムを阻害することのでき
   る１種又は複数種の物質と接触させ、この阻害物質を含
   有する試料を細孔性反応媒体中に導入し、そこで妨害酵
   素を阻害し、かつ生じた液体中の阻害されていない酵素
   の測定を実施することを特徴とするアイソザイム混合物
   から１つの酵素を測定する方法。
2. 【請求項２】粗孔性材料の存在においてアイソザイム混
   合物を妨害アイソザイムを阻害することのできる１種又
   は複数種の物質と接触させる請求項１記載の方法。
3. 【請求項３】粗孔性材料が細孔性反応媒体と直接接触し
   ており、かつ阻害物質を含有する試料を粗孔性材料から
   細孔性反応媒体中に吸引する請求項２記載の方法。
4. 【請求項４】妨害アイソザイムを阻害することのできる
   物質として抗体を使用する請求項１から３までのいずれ
   か１項記載の方法。
5. 【請求項５】膵臓−α−アミラーゼ及び唾液−α−アミ
   ラーゼの混合物から膵臓−α−アミラーゼを測定するた
   めに、唾液−α−アミラーゼを阻害する抗体又は抗体の
   組合わせを使用する請求項１から４までのいずれか１項
   記載の方法。
6. 【請求項６】妨害アイソザイムを阻害し、阻害されてい
   ない酵素を測定することにより液体試料中のアイソザイ
   ム混合物から１つの酵素を迅速に測定するための、試料
   供給域、評価域並びに多数のテスト層を有するテスト担
   体において、試料供給域中で粗孔性材料が妨害アイソザ
   イムを阻害することのできる１種又は複数種の物質を含
   有しており、ここに細孔性反応媒体が、粗孔性材料から
   の液体搬送を可能とするように直接に接触しており、か
   つ評価域には阻害されていない酵素を特徴的なシグナル
   により測定するために必要な物質を含有する１つ又は複
   数の層が配置されており、かつこれらの層は細孔性反応
   媒体と液体移行を可能とする接触にあるか、又は細孔性
   反応媒体とそのような接触にもたらされることができる
   ことを特徴とするアイソザイム混合物から１つの酵素を
   測定するテスト担体。
7. 【請求項７】粗孔性材料と細孔性反応媒体との孔径の比
   が２より大である請求項６記載のテスト担体。