DE3313584A1

DE3313584A1 - Integrales vielschichtelement zur quantitativen analyse von proteinen

Info

Publication number: DE3313584A1
Application number: DE19833313584
Authority: DE
Inventors: Masao Kitajama; Asaji Asaka Saitama Kondo
Original assignee: Fuji Photo Film Co Ltd
Current assignee: Fujifilm Holdings Corp
Priority date: 1982-04-14
Filing date: 1983-04-14
Publication date: 1983-10-20
Also published as: GB8309485D0; GB2118301A; GB2118301B; JPS58179359A

Description

5
Beschreibung

Die Erfindung betrifft ein Vielschichtelement zur quantitativen Analyse von Proteinen. Die Erfindung betrifft insbesondere ein integrales Vielschichtelement zur quantitativen Analyse von Proteinen, das bei einem analytischen Verfahren vom Trocken-Typ verwendbar isti

Es ist bereits eine Vielzahl von Methoden zur quantitativen Analyse von Proteinen entwickelt worden* Diese Methoden sind auch bis jetzt verbessert Worden· Zur¹ quantitativen Analyse von Proteinen in Lösungen sind das Kjeldahl-Verfahren, das PhenolreagensverfahFeriJ das verbesserte Lowry-Verfahren, das Biuretverfahi*©*^ das UV-Verfahren, das Farbstoff-Kombinationsverfahren und dergl. bekannt. Diese Methoden werden je nach dem Analysezweck, den Analysenbedingungen, dem Probevolumen, dem Proteingehalt, Begleitstoffen und dergll ausgewählt.

Bei allen diesen bekannten Analyseverfahren wird eine Flüssigkeitsprobe in einer wäßrigen Lösung, die ein geeignetes Mittel in bestimmter Konzentratioft enthalt 4 aufgelöst, und das Reaktionsprodukt wird naöh Öeendigung der Reaktion cοIorimetrisch oder fluorometrisch bestimmt. Bei dem UV-Verfahren wird die Konstitutions-. einheit der Proteine direkt bestimmt, indem man die Absorption im UV-Bereich mißt. Demgemäß sollte der Eünfluß von Begleitstoffen sorgfältig in Betracht gezogen werden.

Die obengenannten Analyseverfahren sind auf der sog* Naßchemie aufgebaut, bei der eine Bestimmung der Proteine nach Verdünnung einer das Protein enthaltenden Flüssigkeitsprobe erfolgt.

Es sind auch Teststreifen-Verfahren bekannt und diese werden auch in der Praxis eingesetzt. Bei diesen wird ein das Reagens aufnehmender Papierstreifen, der mit einem Farbindikator imprägniert ist, verwendet. Bei diesen Verfahren wird ein Tropfen einer Flüssigkeitsprobe auf den Streifen aufgebracht und die gebildete Farbveränderung v/ird bestimmt. Die Papierstreifen-Verfahren sind für die präzise Bestimmung von Analysestoffen, wie Proteinen, nicht geeignet. Sie werden aber in. weitem Ausmaß zur halb-quantitativen Analyse oder zur 'einfachen Identifizierung angewendet, da sie billiger sind und weil die Bestimmung leicht durchgeführt werden kann.

In neuerer Zeitist ein VieIschichtelenient zur chemischen Analyse in Form eines Films oder eines Blatts vorgeschlagen worden. Dieses wurde auch auf bestimmten Ge-"bieten in der Praxis eingesetzt. Das Vielschichtelement enthält eine Grundstruktur, in der eine Reagensschicht und eine Schicht zur Ausbreitung der flüssigen Probe, die aus einem porösen Medium besteht, auf einem transparenten 'Trager vorgesehen sind.

Bei der quantitativen Analyse des zu bestimmenden Stoffes unter Verwendung eines solchen Vielschichtelements wird ein Tropfen einer Flüssigkeitsprobe auf die Schicht zur Ausbreitung der flüssigen Probe aufgebracht und die Farbbildung oder die Farbveränderung, die in der Roagensschicht erzeugt wird, wird gemessen. Somit baut sich das Analyseverfahren unter Verwendung des Vielschichtelements auf einem trockenen Analyseverfahren, bei' dem kein flüssiges Reagens verwendet wird, auf. Trotzdem ist das Vielschichtelenent zur quantitativen Analyse mit hoher Genauigkeit durch photometrische (z.B. colorimetrische oder fluqrometrische) Messung geeignet.

Bei Analysen, die unter Verwendung eines solchen Viel-Schichtelements durchgeführt werden, ist auch die Verwendung eines Farbindikators bekannt, der dazu imstande ist, nach der Kombination mit Proteinen eine Farbe zu bilden. Als Farbindikatoren für Proteine werden im allgemeinen folgende Substanzen verwendet: Bromkresol—Grün, Bromphenol-Blau, Bromkresol-Purpur, Amido-Schwarz, Orange-G, Methyl-Orange oder Buffalo-Schwarz.

Alle diese Indikatoren sind im wesentlichen Wasserlöslich und haben ein relativ niedriges Molekulargewicht. Aus diesen Gründen wird der Indikator diffundierend und bewegt sich während des Meßvorgangs leicht durch das Vielschichtelement hindurch. Demgegenüber hat das Protein (die zu bestimmende Substanz) ein hohes Molekulargewicht, und es ist daher im Vergleich zu dem Farbindikator in dem Element weniger diffundierend. Beim Aufsprenkeln einer Flüssigkeitsprobe auf die Schicht zur¹ Ausbreitung der flüssigen Probe eines herkömmlichen Vielschichtelements, das der Reihe nach einen Trager, eine Reagensschicht mit dem oben erwähnten Farbindikator und eine Schicht zur Ausbreitung der flüssigen Probe (Schicht zur Aufnahme der flüssigen Probe) enthält, bewegt sich daher der in der Reagensschicht enthaltene Farbindikator rasch in Richtung auf das Protein und bleibt immer noch in der Schicht zur Ausbreitung der flüssigen Probe zurück, weil die Diffusionsbewegung des Farbindikators in die Ausbreitungsschicht rascher erfolgt als die Diffusionsbewegung des Proteins in die Reagensschicht hinein. In diesem Zusammenhang ist von Sanford et al. über die Eigenschaften eines analytischen Vielschichtelements, bestehend aus einem transparenten Träger, einer Reagensschicht, die Bromkresol Grün enthält, und einer reflektierenden, weißen Ausbreitungsschicht,berichtet worden [Clinical Chemistry^

26(7), 1059 (1900), und JA-OS 57(1932)-5O66O (entsprechend der US-PS 4 333 733)]. Bei den dort beschriebenen Analysesystemen bleibt das Protein in der Flüssigkeitsprobe in der Ausbreitungsschicht zurück, und das in der Reagensschicht enthaltene Bromkresol Grün bewegt sich in die Ausbreitungsschicht hinein, so daß in Kombination ein Albuinin-Indikatorkomplex gebildet wird.

Es ist auch schon ein Vielschichtelement zur quantitativen Proteinanalyse bekannt, das sich auf der Biuretreaktion aufbaut [JA-OS 54(1979)-101398 (entsprechend US-PS 4 132 528)]. Das Analysenverfahren, das sich auf der photometrischen Messung der Biuretreaktion von Proteinen aufbaut, ist als solches bekannt und bis jetzt in der Praxis verwendet worden. Das beschriebene Vielschichtelement besteht aus einem transparenten Träger, einer Reagensschicht und einer Diffusionsschicht. Es ist dadurch charakterisiert, daß die Reagensschicht ein Gemisch aus einem Alkali-Schutzpolymeren und einer Base enthält. Letztere ist in einer genügenden Menge vorhanden, daß das Element zu einem pH-Wert von nicht weniger als 12 bei den Arbeitsbedingungen alkalisch gemacht wird,und die Reagensschicht enthält weiterhin im wesentlichen keine Natriumionen. Bei einer beschriebenen Ausführungsform enthält die Reagensschicht ein Biuretreagens, bestehend aus Kupfersulfat, Lithiumhydroxid und Weinsäure, und ein Alkali-Schützpolymeres, wie Agarose oder ein Acrylamid-Vinylpyrrolidon-Copolymeres. In der Publikation wird auch beschrieben, daß die Farbreaktion hauptsächlich in der Diffusionsschicht voranschreitet.

Von Eikenberry et al. wurde über Analysen aller¹ iin Serum vorhandenen Proteine unter Verwendung eines analytischen Elements, das auf die oben beschriebene Weise hergestellt worden war, berichtet [Clinical Chemistry, 25(6), 1125(1979)]. In dieser Arbeit wird beschrieben, daß das Biuretreagens, das in der Reagensschicht enthalten war, sich rasch in die Ausbreitungsschicht hineinbewegte und sich mit dem Protein unter Farbbildung umsetzte, wenn eine Flüssigkeitsprobe aufgesprenkelt worden war. Sodann wurde die Messung durch Refle&ions-Photometrie zur Bestimmung der Proteinmenge durchge»- führt.

In der US-PS 4 230 456 wird ein analytisches Viel-Schichtelement beschrieben, das ein Detektorreagens enthält, welches auf einen Träger aufgebracht isti Bei diesem System wird ein nicht-diffundierendes Detektorreagens eingesetzt und von der Tatsache Gebrauch gemacht, daß die Bindeeigenschaften und die Fluoreszenzstärke je nach der Kombination aus dem Träger¹ und dem Albumin variieren. Bei dem dort beschriebenen System sind vier Stufen erforderlich, nämlich (1) die Zurverfügungstellung eines Detektorreagens auf öiiifem Träger; (2) die Freisetzung des Detektorreagens nach Einführung des Albumins; (3) eine Kombinationsreaktion zwischen dem Albumin und dem Detektorreagens; und (4) die quantitative Messung der Erhöhung oder Verminderung der Signale, die durch die Kombinationsreaktion zwischen dem Detektorrea,gens und dem Albumin erzeugt werden. In der Patentschrift wird von "erfaßbaren Arten" gesprochen. Die in der Beschreibung und den Ausführungsbeispielen beschriebenen Detektorreagentien sind aber alle Fluoreszenzindikatoren, die dazu imstande sind, nach der Kombination mit Albumin eine erhöhte Fluoreszenzstärke zu emittieren. Dazu kommt noch, daß

als Träger nur Polyvinylalkohol, Gelatine und kationische Küpenpolymere genannt werden. Eine detaillierte Beschreibung des Trägers, des Detektorreagens und der Bedingungen des Detektorreagens, das auf den Träger aufgebracht ist, fehlt. Somit beschreibt diese Druckschrift lediglich die quantitative Analyse von Proteinen, insbesondere von Albumin, auf der Basis der Erhöhung der Fluoreszenzstärke, die durch die Bindung des Proteins mit einem Fluoreszenzindikator bewirkt wird. Letzterer ist in einer Polymermatrix enthalten, die dazu imstande ist, die Diffusion des Indikators zu verhindern.

Das erfindungsgemäße Vielschichtelement zur quantitativen Analyse von Proteinen baut sich auf dem Folgenden auf: einem Farbindikator, der mit Proteinen unter Erhalt einer Farbreaktion, nämlich einer Farbbildung, einer Farbveränderung oder einem Verschwinden von Farbe, kombinierbar ist, oder einem Fluoreszenzindikator, der mit Proteinen unter Hervorrufung einer Veränderung der Fluoreszenzstärke oder Veränderung der Wellenlänge kombinierbar ist, der auf einem Träger getragen wird und in einer Reagensschicht gehalten wird; Proteinen (zu bestimmenden Substanzen), die in die Ausbreitungsschicht in Form einer Protein enthaltenden Flüssigkeitsprobe eingeführt werden und in der Reagensschicht diffundiert oder beschleunigt diffundiert werden, wobei die Proteine sich mit dem Indikator, der auf dem Träger getragen wird, unter dem Einfluß der Anziehungskräfte zwischen dem Träger und den Proteinen umsetzen, und wobei sodann die Veränderung der Absorption oder der Fluoreszenzstärke, die durch die Reaktion bewirkt wird, gemessen wird, um die quantitative Bestimmung zu ergeben.

Durch die Erfindung wird ein integrales VielsChichtelement zur quantitativen Analyse von Proteinen zur Verfügung gestellt, das der Reihe nach einen wasserundurchlässigen, transparenten Träger, eine Reagensschicht und eine Schicht zur Ausbreitung der flüssigen Probe enthält und das dadurch gekennzeichnet ist, daß die Reagensschicht

ein Proteinadsorptionsmittel, welches einen Indikator trägt, der dazu imstande ist, nach der Kömbination mit einem Protein eine photometrisch erfaßbare Veränderung zu zeigen, und

ein nicht-proteinartiges Bindemittel, daö dazu imstande ist, die Eindringung bzw. Durchdringung des Proteins zu gestatten,
enthält.

Der wasserundurchlässige, transparente bzw. durchlässige Träger des erfindungsgemäßen, integralen Vielschichtelements zur quantitativen Analyse von Proteinen (nachstehend als "analytisches Vielschichtelement" oder "analytisches Element" bezeichnet) ist ein Träger in Form eines Filmes, eines Blattes, einer dünnen Platte oder dergl.. Dieser Träger ist so transparent bzw. durchlässig, daß er eine elektromagnetische Strahlung mit einem Linien- oder Bandspektrum im Bereich von etwa 200 nm bis etwa 900 nm, nämlich ultraviolette Strahlen, nahezu ultraviolette Strahlen, sichtbare Strahlen oder nahezu infrarote Strahlen, bis zu einem Ausmaß von mindestens etwa hO%, vorzugsweise mindestens etwa 65$>, durchläßt. Weiterhin ist der Träger gegenüber einem Eindringen bzw. Durchdringen von Wasser im wesentlichen beständig. Beispiele für geeignete Trägermaterialien sind Polymere, wie Celluloseacetat, Celluloseacetatbutyrat, Celluloseacetatpropionat, Polyethylenterephthalat, Polycarbonate von Bisphenol A und Polystyrol, sowie Glas.

ι. O * t> O CJ e 2 ti + t U *J J C Ri

•t U U

Wenn integrale, laminierte Schichten, die die Ausbreitungsschicht und die Reagensschicht enthalten, selbsttragend sind, dann können diese Schichten auch als Träger verwendet werden, wodurch auf die Verwendung des obengenannten Trägers verzichtet werden kann.

Eine Oberfläche des Trägers kann mit einer bekannten Subbing-Schicht versehen werden, um die Haftung zv/ischen dem Träger und der Reagensschicht (oder mit anderen funktionellen Schichten) zu erleichtern oder zu erhöhen, um die integral laminierte Struktur herzustellen. Ansonsten können bekannte, chemische Behandlungen, wie eine Säurebehandlung oder Alkalibehandlung, oder eine bekannte, physiko-chemische Behandlung, wie eine Koronaentladungsbehandlung, eine Glimmentladungsbehandlung, eine Bestrahlung mit Ultraviolettstrahlen oder eine Flammbehandlung, auf die Oberfläche des Trägers angewendet werden, um die Haftung bzw. Adhäsion zu verbessern.

Der erfindungsgemäß zu verwendende Indikator ist ein Farbindikator, der mit Proteinen kombinierbar ist, wodurch eine Farbreaktion, beispielsweise eine Farbbildung, Farbveränderung oder ein Verschwinden der Farbe, bewirkt wird, oder ein Fluoreszenzindikator, der sich mit Proteinen unter Veränderung der Fluoreszenzstärke oder Veränderung der Wellenlänge kombiniert. Der Indikator ist vorzugsweise im wesentlichen wasserlöslich.

Beispiele für geeignete Farbindikatoren sind Amido-Schwarz 10B [Color Index (Cl) Nr. 20 470J, saures Orange-R (CI Nr. 16 100), Buffalo-Schwarz (CI Nr. 20 480), Orange-G (CI Nr. 16 230), Methyl-Orange (CI Nr. 13 025), Bromphenol-Blau [a,a-Bis-(3,5-dibrom-4-hydroxyphenyl)-cc-hydroxy-o-toluolsulfonsäure, γ-Sulton], Bromkresol-Grün [a,a-Bis-(3,5-dibrom-4-hydroxy-o-tolyl)-

-ι q c ο /

O Q IS .. I» I^ · * f O

α-hydroxy-o-toluolsulfonsäure, γ-Sulton], Azosulfathiazol und S-p-Toluidinonaphthalin-ö-sulfonat. Beispiele für geeignete Fluoreszenzindikatoren sind Eosin-Y (CI Nr. 45 380), Safranin-Orange (CI Nr.50 240), Trinitrobenzolsulfonsäure, 1-Anilinonaphthalin-8-sulfonsäure, 5-(4'-Arsenoanilino)-2-ChIOr-?-methoxyacridin, Fluorescamin (CAS Registrierungsnr. 38183-12-9), Thiamin und 1-(Dimethylainino)-naphthalin-5-sulfonylchlorid.

Diese Indikatoren sowie die Protein-Adsorptionsmittel werden in "Experimental Methods of Biochemistry VII: The Assay of Proteins", herausgegeben von K.Sugawara und M. Fukusima (veröffentlicht von Gakkai Publication Center, Japan, 1979), Seiten 147-165 und Seiten 179-188, beschrieben.

Der Farbindikator oder der Fluoreszenzindikator ist im allgemeinen in der Reagensschicht in einer Menge von etwa 0,2 bis etwa 5,0 g/m enthalten. Eine Menge im Bereich von etwa 0,4 bis etwa 3,0 g/m wird bevorzugt.

Die Reagensschicht des erfindungsgemäßen, analytischen Elements enthält den obengenannten Proteinindikator auf einem Protein-Adsorptionsmittel. Für das erfindungsgemäße, analytische Element ist charakteristisch, daß Albumin oder andere Proteine mit hohem Molekulargewicht in die Reagensschicht eindringen können. Somit verwertet das erfindungsgemäße, analytische Vielschichtelement die Diffusion von Proteinen, die in einer Probeflüssigkeit enthalten sind, in die Reagensschicht und die Kombinationsreaktion zwischen den Proteinen und dem Indikator auf der Oberfläche des Protein-Adsorptionsmittels.

Das Protein-Adüorptionsmittel, das in dem erfindungsgemäßen, analytischen Element enthalten ist, ist dazu imstande, einen Indikator zu adsorbieren und .zu fixieren, der inhärent stärker diffusionsfähig ist als Proteine und dazu imstande ist, eine Farbreaktion (Farbbildung, Farbveränderung oder Verschwinden von Farbe) oder eine Veränderung der Fluoreszenzstärke oder eine Veränderung der Wellenlänge der Fluoreszenz zwischen dem Indikator und den Proteinen zu bewirken, wenn eine proteinhaltige Flüssigkeitsprobe auf das analytische Element aufgebracht wird und das Protein in die Reagensschicht hineindiffundiert ist.

Beispiele für geeignete Protein-Adsorptionsmittel sind eine Vielzahl von bekannten Protein-Adsorptionsmitteln, wie verschiedene Anionenaustauscherharze, verschiedene Kationenaustauscherharze, Silikagel, Calciumphosphatgel, Hydroxyapatitgel, Aluminiumoxidgel und aktivierter, weißer Ton.

¥enn das Protein-Adsorptionsmittel als Träger für den Indikator verwendet wird und wenn die Umweltbedingungen, wie der pH-Wert, die Ionenstärke und die Temperatur, für den verwendeten Farbindikator oder Fluoreszenzindikator in geeigneter Weise eingestellt werden, dann wird die gewünschte Reaktion zwischen dem Indikator und den eingeführten Proteinen auf dem Träger bewirkt. Die auf diese Weise bewirkte Reaktion wird photometrysch bestimmt, um die quantitative Analyse durchzuführen.

Erfindungsgemäß werden Protein-Adsorptionsmittel vom DEAE-Cellulose-Typ und kolloidale Kieselsäure bzw. kolloidales Siliciumdioxid als Indikatorträger bevorzugt. Mehr bevorzugt wird feine, teilchenförmige, kolloidale Kieselsäure bzw. Siliciumdioxid. Eine solche

feinverteilte, teilchenfömiige, kolloidale Kieselsäure ist am Markt unter den Warenzeichen Aerosil (DEGUSSA, Westdeutschland), Silanox (Cabbot Corp., US), Silöid (Fuji Davison Chemical Co., Ltd., Japan) und SnowteX (eine Dispersion in einem polaren Lösungsmittel; Nissan Chemical Industries, Ltd., Japan) erhältlich. Die feinverteilte, teilchenförmige, kolloidale Kieselsäure adsorbiert vorherrschend den Indikator und stört die Reaktion des Indikators kaum. Sie ist mit Proteinen gut kombinierbar. Demgemäß wird Aerosil besonders bevorzugt.

Wenn ein Indikator auf ein Adsorptionsmittel aufgebracht wird, dann wird der Indikator im allgemeinen stabilisiert, wodurch eine Verringerung der Empfindlichkeit zur Erzielung einer Farbveränderung oder dergl. resultiert. So ist beispielsweise ein starkes Ionenaustauscherharz mit Proteinen sowie den Indikatoren hoch kombinierbar. Jedoch zeigt das starke Ionenaustauscherharz, auf deni ein Farbindikator adsorbiert ist, eine Farbreaktion (Blaureaktion) und zeigt in Beziehung zu der Menge des eingeführten Proteins kaum eine Farbveränderung. Aus diesem Grund werden die pH-Bedingungen und die Ionenstärke notwendigerweise in geeigneter Weise angepaßt, wenn das starke Ionenaustauscherharz als Träger verwendet wird, Solche Einstellungen verschlechtern manchmal die Lagerungsstabilität des analytischen Elements und bewirken eine Schleierbildung, wodurch die Verläßlichkeit des analytischen Elements verschlechtert wird.

Im Gegensatz dazu zeigt feine, teilchenförmige, kolloidale Kieselsäure niemals eine Farbänderung nach der Aufnahme eines Indikators und hat eine angemessene Kapazität zur Adsorbierung des Proteins. Weiterhin ist feine, kolloidale Kieselsäure ein hoch hydrophiles Kolloid und ist in einem wäßrigen Medium gut dispergierbar. Die

feine, kolloidale Kieselsäure stört kaum die photometrische Messung, da sie nach dem Aufschichten mit einem Bindemittel und dem Trocknen nahezu transparent wird. Weiterhin zeigt die feinverteilte, kolloidale Kieselsäure die sog.Thixotropie aufgrund der Bildung von Wasserstoff bindxingen auf ihrer aktivierten Oberfläche. Die feine, kolloidale Kieselsäure zeigt daher eine niedrige Fließfähigkeit und setzt sich beim Beschichtungsvorgang leicht ab, wodurch die Bildung einer gut stabilisierten Überzugsschicht gewährleistet wird. Diese Eigenschaften sind für die Herstellung des erfindungsgemäßen, analytischen Vielschichtelements sehr vorteilhaft.

Das zur Herstellung der Reagensschicht in dem analytisehen Vielschichtelement der Erfindung verwendete Bindemittel sollte hydrophil sein und sollte keine oder nur eine geringe Eigenschaft zur Kombination mit Proteinen haben. Es sollte die Eindringung der Proteine gestatten. Naturgemäß stört das Bindemittel weder die analytisch erfaßbare Reaktion noch bewirkt es Analysenfehler. Auch zeigt das Bindemittel im wesentlichen keine oder nur eine geringe Wechselwirkung mit dem Indikator.

Geeignete Polymere für das Bindemittel der Reagensschicht des erfindungsgemäßen Elements sind Polyacrylamid undAcrylamid-Copolymere, die Acrylamid-Monomereinheiten enthalten, Beispiele für Acrylamid-Copolymere sind Acrylamid-N-Vinylpyrrolidon-Copolymere, Acrylamid-N-(Hydroxyphenyl)-acrylamid-Copolymere und Acrylamid-Z-Hydroxyethylacrylat-Copolymere. Acrylamid-Polymere quellen mit Wasser unter Bildung großer Hohlräume innerhalb der Reagensschicht, so daß Makromoleküle, wie Proteine, leicht in die Reagensschicht eindringen können. Weiterhin werden vorteilhafterweise Acrylamid-Polymere aufgrund ihrer geringen Wechselwirkung mit Proteinen und Indikatoren verwendet.

* O ι»

t) ί -1 U C

Weitere, vorzugsweise zu verwendende Polymere sind beispielsweise Agarose, Poly-N-vinylpyrrolidon, Carboxymethylcellulose, Methylcellulose, Maleinsäure-Copolymere und Maleinamid-Copolymere.
5

Kationische Polymere, wie Styrol-N-Vinylbenzyl-Ν,Ν-dimethyl-N-benzylarmnoniumchlorid-Divinylbenzol-Terpolymere und Styrol-N-Vinylbenzyl-NjN-dimethyl-N-benzylammoniumchlorid-Copolymere, können ebenfalls als Bindemittel für das erfindungsgemäße, analytische Element verwendet werden. Jedoch stören diese kationischen Polymeren manchmal die Farbreaktion zwischen dem Indikator und dem Protein und bedürfen daher beim praktischen Einsatz einer sorgfältigen Auswahl.

Die Reagensschicht hat eine Dicke im Bereich von etwa 7 bis etwa 50 /um (Dicke nach dem Trocknen) und vorzugsweise von etwa 10 bis etwa 30 /um.

Bei der Durchführung der quantitativen Analyse der Proteine unter Verwendung des erfindungsgemäßen, analytischen Elements werden vorzugsweise die Umweltbedingungen, beispielsweise der pH und die Ionenstärke, auf optimale Bedingungen eingestellt, so daß gute und verläßliehe Analysenergebnisse erhalten werden. Zu diesem Zweck enthält die funktionelle Schicht des Elements, wie die Ausbreitungsschicht, die Reagensschicht oder eine lichtabschirmende Schicht (oder strahlungsblockierende Schicht), vorzugsweise ein oder mehrere weitere Reagentien, z.B. eine Säure, ein Alkali, ein Salz, ein Pufferreagens, ein Dissoziierungsreagens, ein oberflächenaktives Mittel und dergl.. Die Mengen und die Arten dieser weiteren Reagentien werden je nach dem Zweck des Analysenverfahrens ausgewählt, da diese Auswahlen von dem Zweck stark abhängig sind.

Die Reagensschicht enthält vorzugsweise eine Säure oder ein Pufferreagens, so daß die Bindungsreaktion zwischen dem zu analysierenden Stoff und dem Indikator bei sauren Bedingungen im pH-Bereich von etwa 2,0 bis etwa 7,0, vorzugsweise etwa 3,0 bis etwa 6,5, abläuft. Im Falle von Albumin als zu bestimmender Substanz wird der pH-Bereich auf etwa 2,0 bis etwa 4,0, vorzugsweise etwa 3,0 bis etwa 3,5, eingestellt.

Beispiele für die Säure und das Pufferreagens, die zur Einstellung des pH-Wertes der Reagensschicht geeignet sind, sind aliphatische Hydroxycarbonsäuren (Beispiele: Glykolsäure, Milchsäure, a-Hydroxybuttersäure, Glycerinsäure, Tartronsäure, Apfelsäure, Weinsäure und Citronensäure, etc.), aliphatische Dicarbonsäuren (Beispiele: Malonsäure, Bernsteinsäure, 3,3-Dimethylglutarsäure und a,a'-Dimethylglutarsäure, etc.), aliphatische Monocarbonsäuren (Beispiele: Essigsäure, Propionsäure und Buttersäure, etc.), anorganische Säuren (Beispiele:

Schwefelsäure und Phosphorsäure, etc.), Pufferreagentien, beschrieben in "Kagakubinran, Kiso-hem (Chemistry Handbook, Fundamentals)", herausgegeben von der Chemical Society of Japan (Maruzen Tokyo, 1966), Seiten 1312 bis 1320, (Beispiele: Kaliumhydrogencitrat-Citronensäure und Kaliumdihydrοgenphosphat-Kaliumhydrogenphosphat, etc.), und Pufferreagentien, beschrieben in "Hydrogen Buffers for Biological Research",herausgegeben von Norman E. Goods et al.: Biochemistry, 5, 467-477 (1966) [Beispiele: 2-(N-Morpholino)-ethansulfonsäure, etc.], sowie andere Pufferreagentien (Beispiele: Natriumoder Kaliumhydrogenmalat und Natrium- oder Kaliummonohydrogen-3,3-dimethylglutarat, etc.). Unter diesen Reagentien werden Citronensäure, Weinsäure, Apfelsäure und 3,3-Dimethylglutarsäure bevorzugt. Die Schichten, mit Ausnahme der Reagensschicht, können diese Säuren oder Pufferreagentien erforderlichenfalls enthalten.

In der klinischen Analyse werden notwendigerweise spezielle Proteine in einer Körperflüssigkeit, nämlich Albumin und Globulin, gesondert analysiert. Bei dieser Analyse wird ein Indikator verwendet, der für jedes Protein spezifisch reaktiv ist. So wird beispielsweise vorteilhaft Bromkresol-Grün zur quantitativen Analyse von Albumin verwendet, da es seine Farbe nach der Kombination mit Albumin merklich verändert. Ansonsten kann nur ein spezielles Protein in die Reagensschicht eingeführt werden, indem man eine zusätzliche Schicht, z.B. eine Lichtabschiraungsschicht oder eine klebende Schicht, die ein für Protein durchlässiges, hydrophiles Bindemittel und ein die Diffusion kontrollierendes Bindemittel enthält, vorsieht, da Globulin in der Schicht weniger diffundierend ist als Albumin. Das die Diffusion kontrollierende Bindemittel kann in einer Menge von etwa 3 bis etwa 20 Gew.% des für das Protein durchlässigen Bindemittels verwendet werden. Das die Diffusion kontrollierende Bindemittel ist vorzugsweise ein hydrophiles Polymeres. Ein repräsentatives Beispiel des die Diffusion kontrollierenden Bindemittels ist Gelatine.

Die Schicht zur Ausbreitung der Flüssigkeitsprobe (nachstehend als "Ausbreitungsschicht" abgekürzt) des er-. findungsgemäßen, analytischen Elements ist an der äußersten Stelle des analytischen Elements vorgesehen. Anders ausgedrückt, die Ausbreitungsschicht ist an der äußersten Stelle weit von dem Träger durch die Reagensschicht entfernt vorgesehen. Die Flüssigkeitsprobe wird auf die Ausbreitungsschicht aufgebracht oder darauf aufgesprenkelt. Die Funktion dieser Schicht besteht darin, eine Flüssigkeitsprobe zusammen mit Albumin oder anderen wasserlöslichen Proteinen für die Reagensschicht mit einem ungefähr konstanten Volumen pro Flächeneinheit, un- geachtet des angewendeten Volumens, zuzuführen, d.h.

- * ο α -τι

einen Doiiierungaeffekt zu bewirken. Diese Schicht wirkt daher als Ausbreitungsmittel für eine Flüssigkeitsprobe. Aufgrund der Ausbreitungswirkung wird ein Volumen der Flüssigkeitsprobe, die auf die Reagensschicht pro Flächeneinheit aufgebracht wird, automatisch auf einen bestimmten Wert, ungeachtet des aufgebrachten Volumens, eingestellt. Dies bedeutet, daß eine Flüssigkeitsprobe quantitativ ohne präzise Messung.des Volumens analysiert werden kann, wenn sie auf das erfindungsgemäße, analytische Element aufgebracht wird. Es wird jedoch darauf hingewiesen, daß die Verwendung des erfindungsgemäßen, analytischen Elements niemals eine präzise Messung einer Probenflüssigkeit bei der Durchführung der quantitativen Analyse ausschließt. Die präzise Messung der Probenflüssigkeit erhöht manchmal die Genauigkeit der Analyse.

Beispiele für die Ausbreitungsschicht des erfindungsgemäßen Systems sind nicht-faserartige, isotropisch poröse Schichten, wie sie z.B. in der JA-OS 49(1974)-53888 [JA-PS 53(1978)-21677] und der US-PS 3 992 158 beschrieben werden. Einzelbeispiele sind Membranfilter, Trübungspolymerschichten, isotropisch poröse Schichten, die durch feine Kügelchen definierte Hohlräume oder miteinander durch Bindemittel verbundene Teilchen enthalten; isotropisch poröse Schichten mit kontinuierlichen Hohlräumen, die durch eine dreidimensionale Matrix gebildet sind, in der feine, kugelförmige Perlen in Punkt-zu-Punkt-Kontakt in allen Richtungen durch ein mit Wasser nicht quellbares Bindemittel verbunden sind, wie es in der JA-OS 55(1970)-90859 (entsprechend der US-PS 4 258 001) beschrieben wird; faserartige, anisotropisch poröse Ausbreitungsschichten, die aus mit Wasser gewaschenen Flächengebilden oder hydrophil behandelten Flächengebilden bestehen, wie sie in der JA-

OS 55(1970)-164356 (entsprechend der US-PS 4 292 272) beschrieben sind; faserartige, anisotropisch poröse Ausbreitungsschichten, die aus Flächengebilden bestehen, deren Oberflächen physikalisch aktiviert worden sind, wie in der JA-OS 57(1982)-66359 beschrieben; und faserartige, anisotropisch poröse Ausbreitungsschichten, bestehend aus Papier, Papierfilter oder nichtgewebten Flächengebilden, die synthetische Polymerfaserpulpen enthalten, wie sie in der JA-OS 57(1982)-66359 beschrieben sind. Alle diese Ausbreitungsschichten können in der angegebenen Weise für das erfindungsgemäße, analytische Element verwendet werden. Ansonsten kann ein Membranfilter oder eine Trübungspolymerschicht, die Titanoxid, Zinkoxid oder Bariumsulfat in Form eines feinen Pulvers enthält, wie in der JA-OS 49(1974)-53888 beschrieben, in dem analytischen Element gemäß der Erfindung verwendet werden, um als Ausbreitungsschicht und auch als Lichtabschirmungsschicht (Strahlungsbiockierungsschicht, Schicht für die Erzielung eines weißen Hintergrunds oder Lichtreflexionsschicht) zu v/irken. Einzelheiten werden später angegeben. Weiterhin kann ein Membranfilter oder eine eingetrübte Polymerschicht, die Ruß enthält, als Ausbreitungsschicht verwendet "werden, die gleichfalls als Lichtabschirmungsschicht, wie nachstehend beschrieben, wirkt. Wenn die Probeflüssigkeit Gesamtblut ist, dann ist die Ausbreitungsschicht vorzugsweise die vorgenannte, isotropisch poröse Schicht mit kontinuierlichen Hohlräumen, welche aus einer dreidimensionalen Matrix gebildet ist,oder die faserartige, anisotropisch poröse Ausbreitungsschicht.

Das erfindungsgemäße, analytische Vielschichtelement kann mit einer für das Protein durchlässigen, lichtabschirmenden Schicht (Strahlungsblockierungsschicht, Hintergrundschicht oder Lichtreflexionsschicht) zwischen

der Reagensschicht und der Ausbreitungsschicht versehen werden.

Die Lichtabschirmungsschicht ist vorteilhafterweise vorgesehen, wenn das analytische Element zur Analyse einer Probeflüssigkeit verwendet wird, die gefärbte Teilchen enthält, wie Gesamtblut, das rote Blutkörperchen enthält. Genauer gesagt werden gefärbte Teilchen, die auf einer Seite der Lichtabschirmungsschicht angeordnet sind, photometrisch durch die Lichtabschirmungsschicht vor der Beobachtung durch den transparenten Träger abgeschirmt. Demgemäß wird die colorimetrische oder fluorometrische Messung nicht durch die Anwesenheit von gefärbten Teilchen gestört. Die Lichtabschirmungsschicht kann aus einem feinen Pulver, wie feinverteiltem, teilchenförmigen! Titandioxid, Bariumsulfat, Zinkoxid, Aluminium oder Ruß, dispergiert in einem wasser- und proteindurchlässigen, hydrophilen Polymerbindemittel, bestehen. Die Lichtabschirmungsschicht hat eine Dicke im Bereich von 5 bis 100/um, vorzugsweise von 5 bis 50/um, und sie gestattet, daß die Flüssigkeitsprobe und die zu bestimmende Substanz hindurchgehen. Das Polymerbindemittel für die Herstellung der Lichtabschirmungsschicht kann beliebig aus den oben im Zusammenhang mit den Bindemitteln für die Reagensschicht genannten, proteindurchlässigen, hydrophilen Polymeren ausgewählt werden.

Die Lichtabschirmungsschicht kann eine poröse Lichtabschirmungsschicht sein, die aus einem Membranfilter (getrübte Polymerschicht), welches lichtabschirmende Teilchen, wie feinverteiltes, teilchenförmiges Titandioxid, Zinkoxid, Bariumsulfat und Ruß, enthält, besteht. Die poröse Lichtabschirmungsschicht kann in dem analytischen Element in der Weise vorgesehen sein, wie

sie in der JA-OS 49(1974)-53888 [JA-PS 53(1978)-21677] oder JA-OS 54(1979)-29700 (entsprechend der US-PS 4 166 093) beschrieben ist.

Das erfindungsgemäße, analytische Vielschichtelement kann mit einer Klebschicht zum Auflegen der Ausbreitungsschicht auf die Reagensschicht, die Lichtabschirmungsschicht oder andere, beliebig angeordnete Schichten unter erhöhter Adhäsion vorgesehen sein, um eine integrale, laminierte Struktur zu bilden. Die Klebschicht ist vorzugsweise dann vorgesehen, wenn die Ausbreitungsschicht aus einem porösen Blatt, einem porösen Film oder einer porösen Membran besteht.

Die Klebschicht kann aus einem oder mehreren der wasser- und proteindurchlässigen, hydrophilen Polymeren hergestellt sein, wie sie oben im Zusammenhang mit den Bindemitteln für die Reagensschicht beschrieben wurden. Die Anhaftung der Ausbreitungsschicht an der Klebschicht kann in der Weise durchgeführt werden, daß man ein poröses Blatt, einen porösen Film oder eine poröse Membran unter Druck auf eine Klebschicht auflegt, die aus einem halbgetrockneten, hydrophilen Polymeren oder einem solchen, das mit Wasser oder einer wäßrigen Lösung, die ein oberflächenaktives Mittel enthält, befeuchtet worden ist, besteht. Die Klebschicht hat eine Dicke im Bereich von 0,5 bis 15 /um, vorzugsweise 0,5 bis 5 /um.

Das erfindungsgemäße, integrale Vielschichtelement zur quantitativen Analyse von Proteinen kann gewünschtenfalls mit einer Vielzahl von Schichten versehen werden, wie sie in der JA-OS 49(1974)-53888 [JA-PS 53(1978)-21677], den ÜS-PSen 3 992 158 und 4 110 079, den JA-OSen 54(1979)-101398 (entsprechend US-PS 4 132 518), 55(1980)-90859, 55(1980)-164356 und 57(1982)-5O66O;

?A

und in den offengelegten Unterlagen der japanischen Gebrauchsmusteranmeldung 57(1982)-42951 beschrieben werden.Weiterhin können eine oder mehrere dieser Schichten durch Verwendung eines wasser- und proteindurchlässigen, hydrophilen Polymerbindemittels modifiziert v/erden.

Das erfindungsgemäße, analytische, integrale Vielschicht element enthält der Reihe nach folgendes: eine Ausbreitungsschicht, eine Reagensschicht und einen transparenten Träger. Eine Anordnung, die der Reihe .nach eine Ausbreitungsschicht, eine Lichtabschirmungsschicht, eine Reagensschicht und eine transparente Schicht enthält, und eine Anordnung, die der Reihe nach eine Ausbreitungsschicht, eine Klebschicht, eine Lichtabschirmungsschicht, eine Reagensschicht und einen transparenten Träger enthält, werden bevorzugt.

Das erfindungsgemäße, analytische Vielschichtelement kann nach den in den obengenannten Druckschriften beschriebenen Weisen hergestellt werden. Einzelheiten dieser Arbeitsweisen werden in den nachfolgenden Beispielen angegeben.

Das erfindungsgemäße, analytische Element kann zur quantitativen Analyse von Proteinen, die in Flüssigkeitsproben enthalten sind, in der Weise verwendet werden, wie es in der vorgenannten Patentliteratur, beschrieben wird. Das erfindungsgemäße, analytische Element wird vorzugsweise in einen Objektträgerrahmen eingefügt und in Form eines analytischen Objektträgers verwendet, wie er in den veröffentlichten Unterlagen der japanischen Gebrauchsmusteranmeldungen 54(1979)-162294 und 56(1981)-142454, der JA-OS 54(1979)-156079 (entsprechend der US-PS 4 169 751) und der JA-OS 55(1980)-138100 beschrie-

ben wird. Das analytische Element in Form eines Objektträgers wird in jeder Hinsicht, nämlich in bezug auf die Herstellung, den Transport, die Lagerung, das Meßverfahren und dergl., bevorzugt.

Beispiel 1

In 20 ml Wasser wurden 1,5g feinverteilte Kieselsäure (Aerosil, Warenzeichen) dispergiert und die Dispersion wurde 30 see mittels eines Überschau -Emulgierungsvorrichtung bearbeitet. Die erhaltene Dispersion war geringfügig trübe, jedoch nahezu klar. Zu der Dispersion wurden unter Rühren der Reihe nach die folgenden Reagentien zugesetzt:

2 ml einer 10xigen wäßrigen Lösung von Polyoxyethylen-laurylether (nichtionisches oberflächenaktives Mittel);

300 mg Bromkresol Grün im Gemisch mit 2 ml Wasser und 2 ml Ethanol;

26 g 10%ige wäßrige Polyacrylamidlösung; 0,05 ml einer 10%igen wäßrigen Citronensäurelösung; und

20 ml Wasser.

Die resultierende Lösung war eine gelbliche, transparente und viskose Lösung.

Die Lösung wurde sodann auf einen transparenten Polyethylenterephthalat (PET) -Film (Dicke = 185 /mn), der eine Gelatine-Subbingschicht hatte, aufgebracht. Die aufgeschichtete Lösung wurde getrocknet, wodurch eine Schicht mit einer Dicke von 14/um erhalten wurde.

Auf die so hergestellte Schicht wurde eine Dispersion zur Herstellung einer Lichtabschinnungsschicht von 3,4 g Titandioxid-Feinpulver, 0,34 g Gelatine, 3 g

Polyacrylamid und 1 g Citronensäure in 33 g Wasser aufgeschichtet. Die aufgeschichtete Dispersion wurde hierauf getrocknet, wodurch eine Li chtabscliirmungs schicht mit einer Dicke von etwa 5/um erhalten wurde. 5

Der so erhaltene Vielschichtfilm wurde mit einer O,2Joigen wäßrigen Lösung von Octylphenoxypolyethoxyethanol (nichtionogenes oberflächenaktives Mittel) befeuchtet. Unmittelbar darauf wurde ein poröses Celluloseacetat-Membranfilter mit einer durchschnittlichen Porengröße von 5/um und einer Dicke von 140/um (Fuji Microfilter FM-5OO, Warenzeichen der Fuji Photo Film Co., Ltd., Japan) auf die befeuchtete Lichtabschirmungsschicht gepreßt, wodurch ein Vielschichtblatt für die quantitative Analyse von Albumin erhalten wurde. Dieses Blatt wurde zu einem quadratischen Stück (15 mm χ 15 mm) zugeschnitten, welches seinerseits in einen rechteckigen Plastikrahmen (24 mm χ 28 mm) mit einer kreisförmigen Öffnung mit einem Durchmesser von 10 mm eingesetzt wurde. Auf diese Weise wurde ein analytischer Objektträger hergestellt.

Auf die Ausbreitungsschicht, nämlich die poröse Celluloseacetat-Membranfilterschicht, des analytischen Objektträgers wurden 10/ul einer physiologischen Kochsalzlösung (pH 7,2), die eine bekannte Albuminkonzentration enthielt, aufgesprenkelt. Der analytische Objektträger wurde sodann 10 min bei Raumtemperatur (etwa 23° C) inkubiert,und es wurde die optische Reflexionsdichte bei 600 nm (Wellenlänge) gemessen. Die erhaltenen Ergebnisse sind in Tabelle 1 zusammengestellt. Auf diese Weise wurde bestätigt, daß die Farbreaktion im Verhältnis zu der Albuminmenge ablief.

Tabelle 1 Albuminkonzentration (g/dl)

O O_t5 1,0 2 4 6 8 10

optische
Reflexionsdichte
(600 mn) 0,22 0,25 0,27 0,36 0,47 0,58 0,68 0,77

Beispiel

Die Reagensschicht wurde auf dem transparenten PET-FiIm in der gleichen Weise wie in Beispiel 1 vorgesehen, mit der Ausnahme, daß Polyacrylamid (Bindemittel) durch Acrylamid-N-(m-Hydroxyphenyl)-acrylamid-Copolymeres (Copolymerisationsverhältnis = 95:5) ersetzt wurde und daß Formalin (37%ige wäßrige Forinaldehydlösung) in einer Menge von 1,5 Gew.%, bezogen auf das Copolymere, zugesetzt wurde.

Die 'Ausbreitungsschicht wurde sodann auf die Reagensschicht in der gleichen V/eise wie in Beispiel 1 aufgelegt, mit der Ausnahme, daß das Membranfilter durch ein Breittuchgewebe, gewebt aus Baumwollgarn mit einer Feinheitszahl von 100, ersetzt wurde, \rodurch ein analytischer Objektträger erhalten wurde. 25

Auf die Ausbreitungsschicht des Objektträgers wurden 10/ul der gleichen physiologischen Kochsalzlösung, wie in Beispiel 1, aufgesprenkelt. Der Objektträger wurde sodann 10 min bei 37°C inkubiert, und es wurde die optisehe Reflexionsdichte bei 600 nm (Wellenlänge) gemessen. Die photometrische Messung erfolgte von dem PET-FiIm-Objektträger.

Die Beziehung zwischen der Albuminkonzentration und der optischen Reflexdichte ist in Fig. 1 graphisch dargestellt. Auf diese Weise wurde eine zufriedenstellende Beziehung bestätigt.

ι Beispiel 3

Ein Objekt/Iraker für die quantitative Analyse von Proteinen wurde wie in Beispiel 2 hergestellt, mit der Ausnahme, daß Brorakresol Grün durch 200 mg Methyl Orange ersetzt wurde.

Eine physiologische Kochsalzlösung wurde zu 2 ml Humanserum gegeben, um vier Probelösungen herzustellen, die verschiedene Proteingehalte hatten. Der Gesamtproteingehalt wurde nach der Biuretmethode für jede Probeflüssigkeit bestimmt.

Auf die Ausbreitungsschicht des Objektträgers wurden 10/Ul der Probenflüssigkeit aufgesprenkelt. Der Objektträger wurde sodann 10 min bei 37⁰C inkubiert, und danach wurde die optische Reflexionsdichte (Wellenlänge = 550 nm) gemessen.

Die Beziehung zwischen dem Gesamtproteingehalt und der optischen Reflexionsdichte ist in Tabelle 2 angegeben. Somit wurden zufriedenstellende Ergebnisse bestätigt.

Tabelle 2 Gesamtproteinkonzentration (g/dl)

1 4 8 10

optische Reflexionsdichte (550 nm) 0,32 0,56 0,83 0,97

Ende der Beschreibung.

35

Claims

KRAUS-Ä WBrS-ERT PATENTANWÄLTE DR. WALTER KRAUS DIPLOMCHEMIKER · DR ING ΑΝΝΕΚΛΤΕ1 WEISFRT DIPL ING FACHRICHTUNG CHEMIE IRMGARDSTRASSE 15 · D-8OOO MÜNCHEN 71 -TELEF-ON 089/79 7077-79 7078 · TELEX Ο5-212156 kpatd TELEGRAMM KRAUSPATENT 3637 WK/My FUJI PHOTO FIM CO., LTD. Minami-Ashigara-shi, Japan Integrales Vielschichtelement zur quantitativen Analyse von Proteinen Patentansprüche

1./ Integrales Vielschichtelement zur¹ quantitativen Analyse von Proteinen, das der Reihe nach einen Wasserundurchlässigen, transparenten Träger, eine Reagens¹-> schicht und eine Schicht zur Ausbreitung der flüssigen Probe aufweist, dadurch gekennzeichnet > daß die Reagensschicht

ein Proteinadsorptionsmittel, welches einen Indikator trägt, der dazu imstande ist, nach der Kombination mit einem Protein eine photometrisch erfaßbare Veränderung zu zeigen, und

»Ο ι) C

ein nicht-proteinartiges Bindemittel, das dazu imstande ist, die Eindringung bzw. Durchdringung des Proteins zu gestatten,-enthält.

2. Integrales Vielschichtelement nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Proteinadsorptionsmittel aus der Gruppe anionische Ionenaustauscherharze, kationische Ionenaustauscherharze, Silikagel, Calciumphosphatgel, Hydroxyapatitgel, Aluminiumoxidgel und aktivierter Ton ausgewählt ist.

3. Integrales Vielschichtelement nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß das Proteinadsorptionsmittel aus der Gruppe Proteinadsorptionsmittel vom DEAE-Cellulose-Typ und kolloidale Kieselsäure bzw. kolloidales Siliciumdioxid ausgewählt ist.

4. Integrales Vielschichtelement nach Anspruch 3» dadurch gekennzeichnet, daß das Proteinadsorptionsmittel feine, teilchenförmige, kolloide Kieselsäure bzw. Siliciumdioxid ist.

5. Integrales Vielschichtelement nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der Indikator aus der Gruppe Farbindikatoren und Fluoreszenzindikatoren ausgewählt ist.

6. . Integrales Vielschichtelement nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das nicht-proteinartige Bindemittel aus der Gruppe Polyacrylamid und Acrylamid-Copolymere ausgewählt ist.

331358A

7. Integrales Vielschichtelement nach Anspruch 6J dadurch gekennzeichnet, daß das nicht-proteinartige Bindemittel aus der Gruppe Polyacrylamid, Acrylamid-N-Vinylpyrrolidon-Copolymere, Acrylamid-N-(Hydroxyphenyl)-acrylamid-Copolymere und Acrylamid'-2-Hydroxy^J ethylacrylat-Copolymere ausgewählt ist.

8. Integrales Vielschichtelement nach Anspruch 1^ dadurch gekennzeichnet, daß die Reagensschichi eine Trockendicke im Bereich von etwa ·7 Ms etwa 5ö^um häti

9. Integrales Vielschichtelement nach Anspruch 8$ dadurch gekennzeichnet, daß die Reagensschicht eine Trockendicke im Bereich von etwa 10 bis etwa 3Öyüm hkti

10. Integrales Vielschichtelement nach Anspruch 1* dadurch gekennzeichnet, daß eine Schicht zur BlöbltieiHühg einer Strahlung oder eine lichtreflektierende Schichi zwischen der Reagensschicht und der Schicht έχίϊ¹ Aiisbreitung der flüssigen Probe vorgesehen ist.

11. Integrales Vielschichtelement nach Anspruch 5> dadurch gekennzeichnet, daß der Indikator im wesentlichen wasserlöslich ist.

12. Integrales Vielschichtelement nach Anspruch 8 oder 9, dadurch gekennzeichnet, daß die Reagensschicht den Farbindikator in einer Menge von etwa 0,2 bis etwa 5,0 g/m enthält.

13· Integrales Vielschichtelement noch Anspruch loj dadurch gekennzeichnet, daß die Schicht zur Blockierung der Strahlung oder die lichtreflektierende Schicht ein nicht-proteinartiges, hydrophiles Bindemittel^ das dazu 35

imstande ist, die Eindringung bzw. Durchdringung des Proteins zu gestatten, enthält.

14. Integrales Vielschichtelement nach Anspruch 1j5, dadurch gekennzeichnet, daß die Schicht zur Blockierung der Strahlung weiterhin ein diffusionskontrollierendes Bindemittel enthält.

15. Integrales Vielschichtelement nach Anspruch 14, *' dadurch gekennzeichnet, daß das diffusionskontrollierende Bindemittel Gelatine ist.