DE2735690C2 - - Google Patents

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Bestimmung von Wasserstoffperoxid in wäßrigen Flüssigkeiten, bei dem man eine Probe der zu analysierenden Flüssigkeit mit einer Substanz mit peroxidativer Aktivität und einem Farbbildner, der in Gegenwart von Wasserstoffperoxid und der Substanz mit peroxidativer Aktivität unter Erzeugung eines Farbstoffes oxidiert wird, in Kontakt bringt. Des weiteren betrifft die Erfindung ein Reagenz und ein analytisches Element für die Durchführung des Verfahrens.

Die Erkennbarkeit und quantitative Bestimmbarkeit von Wasserstoffperoxid sowie Substanzen, die unter Erzeugung von Wasserstoffperoxid reagieren, ist auf vielen Gebieten von großer Wichtigkeit. Genannt sei nur beispielsweise die Erkennung und Bestimmung von Wasserstoffperoxid, das bei der enzymatischen Bestimmung von Substanzen, wie beispielsweise Glucose, Cholesterin und Harnsäure durch die Aktivität von Enzymen, beispielsweise Glucose-Oxidase, Cholesterin-Oxidase und Uricase in Gegenwart von Sauerstoff erzeugt wird. Die Menge eines in einer Probe vorhandenen Enzym-Substrates läßt sich aus der Menge an erzeugtem Wasserstoffperoxid ermitteln. Im Falle der enzymatischen Bestimmung von Harnsäure beispielsweise läuft folgende Reaktion ab:

Bekannte Reagenzien für die Erkennung und/oder quantitative Bestimmung von Wasserstoffperoxid, das in solchen Systemen erzeugt wird, enthalten im allgemeinen eine Substanz mit peroxidativer Aktivität, beispielsweise Peroxidase oder peroxidaseartige Substanzen sowie ferner eine Substanz, die in Gegenwart von Wasserstoffperoxid und der Substanz mit peroxidativer Aktivität einer erkennbaren Veränderung (im allgemeinen einer Farbveränderung) unterliegt. Derartige Reagenzien sind beispielsweise aus den US-PS 29 12 309, 29 81 606, 33 49 006, 30 92 465, 35 58 435, 35 95 755, 36 27 697, 36 27 698, 36 30 847, 36 54 179, 36 54 180 sowie 38 53 470 bekannt.

Beispiele für Farbbildner oder Farbstoffe erzeugende Verbindungen, die bei der Bestimmung von Wasserstoffperoxid mit Peroxidase sowie peroxidase-artigen Substanzen, gegebenenfalls in Kombination mit einer Kupplerverbindung, bisher verwendet wurden, sind:

• (1) Monoamin, z. B. Anilin und seine Derivate, ortho-Toluidin und para-Toluidin;
• (2) Diamine, z. B. ortho-Phenylendiamin; N,N′-Dimethyl-p-phenylendiamine; N,N′-Diäthylphenylendiamin; Benzidin sowie Dianisidin;
• (3) Phenole, z. B. Phenol, Thymol, ortho-, meta- und para-Kresole, α-Naphthol- und β-Naphthol;
• (4) Polyphenole, z. B. Brenzkatechin, Guaiacol, Orcin, Pyrogallol, p,p-Dihydroxydiphenyl sowie Phloroglucin;
• (5) aromatische Säuren, z. B. Salicyl, Pyrobrenzkatechin- und Gallensäuren;
• (6) Leucofarbstoffe, z. B. Leucomalachitgrün und Leucophenolphthalein, die zweckmäßig in alkalischen Medium verwendet werden;
• (7) Farbstoffe, beispielsweise 2,6-Dichlorphenolindophenol;
• (8) verschiedene biologische Substanzen wie beispielsweise Epinphrin, die Flavone, Tyrosin, Dihydroxyphenylalanin sowie Tryptophan;
• (9) Substanzen, wie beispielsweise Gum Guaiac, Guaiaconsäure, Kalium-, Natrium- sowie andere wasserlösliche Iodide und Bilirubin sowie
• (10) Farbstoffe, wie beispielsweise 2,2′-Azin-di(3-äthyl-benzothiazolin- (6)-sulfonsäure) sowie 3,3′-Diaminobenzidin.

Es ist somit die Kombination aus Wasserstoffperoxid, einer Substanz mit peroxidativer Aktivität und einem Farbbildner, die zu der erkennbaren Farbveränderung führt.

Zur Ermittlung des Blut-Glucosewertes durch Bestimmung des aus Glucose mit Glucoseoxidase erzeugten Wasserstoffperoxides ist besonders ein System aus Phenol und 4-Aminophenazon verwendet worden. Dieses unter der Bezeichnung "Trinder′s Reagenz" bekanntgewordene System wird näher beispielsweise in Ann. Clin. Biochem. 6 (1969), S. 24-27 und in Analyst, 97 (1972), S. 142-145 beschrieben.

Gilt es festzustellen, ob in einer zu analysierenden Probe eine Substanz mit peroxidaitiver Aktivität vorhanden ist, so wird zur Ermittlung dieser Substanz ein Reagenz mit Wasserstoffperoxid und einem Farbbildner oder einer einen Farbstoff bildenden Verbindung verwendet.

Obgleich die erwähnten bekannten Farbbildner für die Erkennung und Bestimmung von Wasserstoffperoxid (oder Substanzen mit peroxidativer Aktivität) geeignet sind, gibt es noch Fälle, in denen die Konzentration an Wasserstoffperoxid (oder Substanzen mit peroxidativer Aktivität) zu gering ist, um ausreichend erkennbare Farbänderungen hervorzurufen. Ein Beispiel für ein analytisches Bestimmungsverfahren, bei dem ein solches Konzentrationsproblem auftritt, ist die Bestimmung von Wasserstoffperoxid, das von vergleichweise geringen Konzentrationen von Harnsäure in Blutserum (1 bis 15 mg/dl) erzeugt wird. Das bekannte Verfahren ist nur dann anwendbar, wenn vergleichsweise große Volumina der zu analysierenden Flüssigkeit analysiert werden und wenn man den Durchmesser der Cuvette bei der Bestimmung vergrößert, wodurch die effektive Dichte des erzeugten Farbstoffes erhöht wird.

Nicht alle analytischen Verfahren jedoch ermöglichen derartige Modifikationen zur Erhöhung der effektiven Dichte des erzeugten Farbstoffes. In anderen Fällen ist die Menge an erzeugtem Farbstoff so gering, und zwar entweder aufgrund der vergleichsweise sehr geringen Konzentration des zu bestimmenden Stoffes oder aufgrund der Notwendigkeit bei hohen Verdünnungsgraden arbeiten zu müssen, um eine geeignete Lösung zu erreichen.

Derartige Probleme treten insbesondere auch dann auf, wenn das Bestimmungsverfahren unter Verwendung eines mehrschichtigen analytischen Elementes des aus der BE-PS 801 742 oder der US-PS 39 92 158 bekannten Typs durchgeführt wird. In diesen Fällen kann bei Verwendung von vergleichsweise dünnen Indikator- oder Reagenzschichten (einer Größenordnung von weniger als 0,025 mm) die sich in derartigen Elementen als vorteilhaft erwiesen haben, die Dichte des erzeugten Farbstoffes sehr gering sein. Die Erhöhung der Dicke der Schicht eines solchen Elementes mit dem Farbbildner mit dem Ziel eine größere effektive Farbdichte zu erzeugen, kann unzweckmäßig sein, beispielsweise deshalb, weil die Reaktionszeiten erhöht werden oder die Schichtherstellung erschwert wird.

Aufgabe der Erfindung ist es, ein Verfahren, ein Reagenz und ein analytisches Element für die Bestimmung von Wasserstoffperoxid in wäßrigen Flüssigkeiten des eingangs erwähnten Typs anzugeben, mit denen auch noch sehr geringe Konzentrationen der zu bestimmenden Substanzen bestimmbar sind, z. B. Blutserumkomponenten, wie Harnsäure und dgl..

Gelöst wird diese Aufgabe erfindungsgemäß mit einem Verfahren, einem Reagenz und einem analytischen Element, wie sie in den Ansprüchen gekennzeichnet sind.

Als Farbbildner wird somit ein Triarylimidazol der Formel

verwendet, in der R¹, R² und R³ jeweils einen gegebenenfalls substituierten Phenylrest darstellen, wovon einer ein gegebenenfalls substituierter para-Hydroxy-Phenylrest ist und die anderen Phenylreste bezüglich ihrer Substituenten derart ausgewählt sind, daß das Oxidationspotential des Imidazols, gemessen durch cyclische Voltometrie gegenüber einer Standard-Kalomel-Elektrode unter Verwendung einer Elektrode auf Kohlebasis zwischen -70 mV bis +110 mV liegt.

Triarylimidazol des erfindungsgemäß eingesetzten Typs sind an sich bekannt, z. B. aus der US-PS 32 97 710. Nach den Angaben dieser Patentschrift stellen derartige Triarylimidazole vorteilhafte Farbstoffe zum Färben von Textilien und Papier dar und eignen sich unter Umständen auch die die pH-Bestimmung.

Das erfindungsgemäße Verfahren, das Reagenz und das erfindungsgemäße analytische Element eignen sich in vorteilhafter Weise für die Bestimmung von Serumkomponenten, beispielsweise Harnsäure. Die Erfindung eignet sich jedoch nicht nur zur Bestimmung von Serumkomponenten, sondern vielmehr ganz allgemein für die Bestimmung von Wasserstoffperoxid und Substanzen mit peroxidativer Aktivität, insbesondere in den Fällen, in denen aus den verschiedensten Gründen hoch verdünnte Lösungen zu analysieren sind.

Durch Oxidation liefern die Triarylimidazole Farbstoffe, bei denen es sich um Cyclohexadienylidenimidazolfarbstoffe mit einer Oxogruppe handelt, beispielsweise der Formel:

Die Erfindung ermöglicht somit die Bestimmung von Wasserstoffperoxid und Substanzen, die unter Wasserstoffperoxidbildung reagieren, wie auch die Bestimmung von Substanzen mit peroxidativer Aktivität, z. B. Peroxidase. Dabei erfolgt eine Oxidation des Farbbildners durch Wasserstoffperoxid in Gegenwart einer Substanz mit peroxidativer Aktivität unter Erzeugung eines Farbstoffes, dessen Dichte nach üblichen bekannten Methoden bestimmt werden kann, woraus sich die Menge an Wasserstoffperoxid oder der Substanz mit peroxidativer Aktivität in der analysierten Probe ergibt.

Die Bestimmung der Farbstoffdichte kann nach üblichen bekannten Methoden beispielsweise auf optischen Wege unter Verwendung eines Spektrophotometers erfolgen oder durch Vergleich der Farbstoffdichte mit Farbskalen, durch Vergleich von Lösungen oder mit Hilfe von Farbkarten.

Die Bestimmung von Wasserstoffperoxid nach dem Verfahren der Erfindung eignet sich insbesondere für gekoppelte (d. h. kombinierte aufeinanderfolgende) und nicht gekoppelte (d. h. direkte, einstufige) Enzymreaktionen. Beispielsweise eignet sich das erfindungsgemäße Verfahren zur Bestimmung von Glucose, Galactose, Aminosäuren, Cholesterin und Harnsäure durch gekoppelte Enzymreaktionen und für die Bestimmung von Peroxiden, Hemoglobin, Peroxidase und anderen Peroxidativ-aktiven Substanzen in ungekoppelten Enzymreaktionen.

Die erfindungsgemäßen Reagenzien eignen sich für die Bestimmung von Substanzen, die unter Erzeugung von Wasserstoffperoxid reagieren, und erhalten eine Puffersubstanz, eine Substanz mit peroxidativer Aktivität, den Farbbildner sowie gegebenenfalls weitere Zusätze, die zum Ablauf einer Reaktion der zu analysierenden Substanz unter Erzeugung von Wasserstoffperoxid erforderlich sind.

Im Falle der Bestimmung von Substanzen mit peroxidativer Aktivität, beispielsweise Hemoglobin, enthält das erfindungsgemäß Reagenz Wasserstoffperoxid oder eine Substanz, die unter Erzeugung von Wasserstoffperoxid zu reagieren vermag sowie den Farbbildner.

Die erfindungsgemäßen Reagenzien können in Form von Lösungen vorliegen, d. h. unter Verwendung geeigneter Lösungsmittel hergestellt werden, gegebenenfalls unter Zusatz üblicher Zusätze, beispielsweise oberflächenaktiver Verbindungen.

Gemäß einer weiteren vorteilhaften Ausgestaltung der Erfindung verwendet man anstelle von Lösungen analytische Elemente, die in einfacher Weise beispielsweise durch Imprägnierung geeigneter absorbierender Stoffe, beispielsweise Filterpapier mit Lösungen der Reagenzien hergestellt werden können.

Gemäß einer weiteren vorteilhaften Ausgestaltung der Erfindung wendet man die Bestimmungsreagenzien in Form von analytischen Elementen mit verschiedenen Schichten an.

Wie im Falle von diagnostischen Lösungen ist es dabei häufig vorteilhaft die analytischen Elemente ausgehend von Lösungen herzustellen, die übliche Zusätze, wie beispielsweise oberflächenaktive Verbindungen erhalten.

Die erfindungsgemäßen Bestimmungsreagenzien können jedoch auch in Form von trockenen Mischungen vorliegen, die durch Zusatz von Wasser in diagnostische Lösungen überführt werden können und die dem Farbbildner enthalten sowie entweder eine Substanz, die unter Erzeugung von Wasserstoffperoxid reagiert oder einer Substanz mit peroxidativer Aktivität, wobei diese trockenen Mischungen übliche bekannte Zusätze, wie beispielsweise oberflächenaktive Verbindungen enthalten können.

Die erfindungsgemäßen Reagenzien liefern Farbstoffe mit sehr hohen Extinktions-Koeffizienten und erzeugten infolgedessen vergleichsweise hohe Dichten bei nur geringen Farbstoffkonzentrationen. Dies bedeutet, daß sich das erfindungsgemäße Verfahren insbesondere zur Erkennung und Bestimmung von vergleichsweise sehr geringen Konzentrationen an Wasserstoffperoxid, Substanzen mit peroxidativer Aktivität oder Substanzen die Wasserstoffperoxid zu erzeugen vermögen, eignet. Das erfindungsgemäße Verfahren hat sich als besonders vorteilhaft für die Durchführung von analytischen Bestimmungsverfahren geeignet, bei denen mehrschichtige analytische Elemente des aus der US-PS 39 92 158 bekannten Typs verwendet werden.

Bestimmungsreagenzien für die Bestimmung von Wasserstoffperoxid, insbesondere für die enzymatische Bestimmung von Glukose, Harnsäure, Cholesterin und anderen Enzymsubstraten sind bekannt. Derartige Bestimmungsreagenzien enthalten im allgemeinen eine Substanz mit peroxidativer Aktivität, vorzugsweise Peroxidase und einen Farbbildner, der in Gegenwart von Wasserstoffperoxid und der Substanz mit peroxidativer Aktivität einen Farbstoff liefert oder eine Farbänderung herbeiführt. Der Farbbildner kann dabei beispielsweise aus einem Leucofarbstoff bestehen, der einer direkten Farbänderung unterliegt. Andererseits kann der Farbbildner jedoch auch aus einem Stoff bestehen, der als Folge der Oxidation in Gegenwart von H₂O₂ sowie einer Substanz mit peroxidativer Aktivität keiner direkten Farbänderung unterliegt, jedoch in oxidierter Form mit einer Kupplerverbindung unter Erzeugung eines erkennbaren oder bestimmbaren Reaktionsproduktes reagiert, vorzugsweise auf stöchiometrischer Basis.

Eine Peroxidase ist bekanntlich ein Enzym, das eine Reaktion zu katalysieren vermag, bei der Wasserstoffperoxid eine andere Substanz oxidiert. Die Peroxidasen bestehen dabei im allgemeinen aus komplexen Proteinen mit Eisenporphyrin. Peroxidasen kommen dabei beispielsweise in Meerrettich vor, Kartoffeln, Feigensaft sowie Rüben, in welchem Falle es sich um pflanzliche Peroxidasen handelt, sowie in der Milch, in welchem Falle es sich um Lacto-Peroxidase handelt sowie in weißen Blutkörperchen, in welchem Falle es sich um Verdo-Peroxidase handelt. Peroxidasen kommen des weiteren in Mikroorganismen vor und können durch Fermentationsprozesse erzeugt werden. Auch können synthetische Peroxidasen zur Verwendung in H₂O₂-Bestimmungssystemen verwendet werden, beispielsweise solche synthetischen Peroxidasen, wie sie beispielsweise von Theorell und Maehly in der Zeitschrift "Acta Chem. Scand", Band 4, 1950, Seiten 422 bis 434, beschrieben werden. Verwendbar, wenn auch nicht besonders bevorzugte Substanzen sind Hämin, Methemoglobin, Oxyhämoglobin, Hämoglobin, Hämochromogen, alkalisches Hämatin, Häminderivate und bestimmte andere Substanzen, die peroxidative oder peroxidasen-gleiche Aktivität enthalten. Andere Substanzen, die selbst keine Enzyme sind, jedoch peroxidative Aktivität aufweisen sind beispielsweise Eisensulfocyanat, Eisentannat, Ferroferrocyanid, Chromisalze, (z. B. Chromisulfat), absorbiert von Silicagel und dergleichen.

In der für die erfindungsgemäß verwendbaren Triarylimidazole angegebenen Formel besteht einer der Substituenten R¹, R² und E³ aus einem gegebenenfalls substituierten para-Hydroxyphenylrest. In vorteilhafter Weise besteht mindestens einer der anderen Substituenten R¹, R² und R³ aus einem Phenylrest, der in ortho- oder para-Stellung einen Substituenten aufweist, der aus einer Elektronen-spendenden Gruppe besteht, beispielsweise einer Alkoxygruppe der Formel -OR⁴ oder einer Dialkylaminogruppe der Formel (R⁴)₂N, worin R⁴ jeweils für eine Alkylrest mit 1 bis 8 Kohlenstoffatomen steht.

Die durch R¹, R² und R³ dargestellten Phenylreste der Imidazole können durch die verschiedensten Substituenten substituiert sein, beispielsweise Halogenatome und/oder Hydroxy-, Cyano-, Haloalkyl-, Cyanoalkyl-, Hydroxyalkyl-, Aminoalkyl-, Aryl-, Aroxyl-, Aralkoxy-, Alkylthio-, Arylthio-, Aralkylthio-, Alkanoyl-, Aroyl-, Alkyl-, Sulfonyl-, Arylsulfonyl-, Dialkylamino-, Trialkylammonium-, Alkoxycarbonyl-, Aryloxycarbonyl- und Dialkylaminocarbonylreste.

Dabei weisen die Alkylreste und Alkylgruppen dieser Substituenten vorzugsweise 1 bis 5 C-Atome auf und die Arylreste bzw. Arylgruppen stehen für übliche bekannte Arylreste, beispielsweise der Phenyl- oder Naphthylreihe.

Herstellung und Reaktionsfähigkeit von geeigneten Triarylimidazol- Farbbildnern sind beispielsweise aus der US-PS 32 97 710 bekannt.

Vorteilhafte, erfindungsgemäß verwendbare Triarylimidazol-Farbstoffbildner sind beispielsweise:

Weitere erfindungsgemäß verwendbare Imidazole sind beispielsweise aus der US-PS 32 97 710 bekannt.

Zur Herstellung erfindungsgemäßer Bestimmungsreagenzien lassen sich die verschiedensten üblichen bekannten Puffersubstanzen verwenden. Geeignete Puffersubstanzen sind dabei solche, die den pH-Wert des Reaktionsmediums auf einen Wert einstellen, der dem Ablauf der farbbildenden Reaktion förderlich ist und die Reaktion nicht inibiert. Die beschriebene Testmethode, die in dem später folgenden Beispiel 1 noch näher beschrieben wird, eignet sich ebenfalls zur Auswahl speziell geeigneter Puffersubstanzen für spezielle Substanzen mit peroxidativer Aktivität und spezielle Farbbilder.

Als besonders vorteilhafte Puffersubstanzen haben sich Carbonatpuffer erwiesen, beispielsweise Natrium- und Kaliumcarbonate, Boratpuffer, z. B. Natrium- und Kaliumborate, Citrate, Phosphate und Glutarate sowie die bekannten Tris-Puffersubstanzen, beispielsweise Tris(hydroxymethyl)aminomethan. In vorteilhafter Weise puffern derartige Puffersubstanzen, die erfindungsgemäßen Bestimmungsreagenzien auf einen pH-Wert zwischen etwa 5,0 und 10,0 ab, der sich als vorteilhafter Bereich für die Bestimmung von beispielsweise Blutserumkomponenten erwiesen hat, und zwar unter Verwendung der beschriebenen Farbbilder, beispielsweise in Kombination mit enzymatischen Reaktionen, wie sie sich beispielsweise für die Bestimmung von Glucose unter Verwendung von Glucoseoxidase unter Erzeugung von Wassserstoffperoxid als vorteilhaft erwiesen haben. Bei der Bestimmung von Harnsäure unter Verwendung von Uricase hat es sich als besonders vorteilhaft erwiesen, das Bestimmungsreagenz auf einen pH-Wert zwischen etwa 8 und etwa 9 abzupuffen.

Die erfindungsgemäßen Reagenzien lassen sich beispielsweise in analytischen Elementen verwenden, die aus fasrigen Filterpapieren bestehen oder aber in besonders vorteilhafter Weise in mehrschichtigen analytischen Elementen, wie sie beispielsweise aus der US-PS 39 92 158 bekannt sind.

Kennzeichnend für derartige analytische Elemente ist:

• (1) eine Ausbreitschicht und
• (2) eine Reagenzschicht, die bei Verwendung des Elementes mit der Ausbreitschicht in Flüssigkeits- oder Strömungskontakt steht und gegebenenfalls
• (3) ein Schichtträger, auf dem die beiden Schichten aufgetragen sind.

In besonders vorteilhafter Weise weisen derartige Elemente eine nicht-fasrige Ausbreitschicht auf.

Mehrschichtige analytische Elemente dieses Typs eignen sich zur Ausführung von Einzelanalysen oder Mehrfachanalysen unter Verwendung von kontinuierlich arbeitenden Analysegeräten. Die analytischen Elemente können dabei in Form von endlosen Streifen, Blättern oder diskreten Abschnitten verwendet werden. Die Bedeutung eines "Flüssigkeitskontaktes" oder eines "Strömungskontaktes" ergibt sich aus der US-PS 39 92 158.

Ein solcher Flüssigkeitskontakt zwischen Schichten läßt sich dadurch erreichen, daß die einzelnen Schichten der Elemente benachbart zueinander angeordnet werden oder mindestens derart, daß ein Flüssigkeitsdurchtritt oder eine Flüssigkeitspassage von Schicht zu Schicht erfolgen kann. Gegebenenfalls kann es jedoch auch zweckmäßig sein, Elemente herzustellen, die Schichten aufweisen, die zunächst einander nicht benachbart sind oder nicht aneinander anstoßen und die voneinander getrennt sind, beispielsweise durch Zwischenschichten, wie es beispielsweise aus der US-PS 35 11 608 bekannt ist oder durch Verwendung eines federnden absorbierenden Materials oder deformierbarer Schichtträger, wie sie beispielsweise aus den US-PS 39 17 453 und 39 33 594 bekannt sind. Weisen die Elemente zunächst keine aneinander anstoßende oder benachbarte Schichten auf, so kann es notwendig sein Druck anzuwenden oder andere Maßnahmen zu treffen, um die Schichten des Elementes zum Zeitpunkt seiner Verwendung in Flüssigkeitskontakt oder Strömungskontakt miteinander zu bringen.

Die Ausbreitschicht besteht dabei aus einer z. B. isotrop porösen Schicht, die eine Flüssigkeitsprobe aufnehmen kann, die direkt auf die Ausbreitschicht aufgebracht wird oder der Ausbreitschicht aus einer Schicht oder aus Schichten zugeführt wird, die in Flüssigkeitskontakt mit der Ausbreitschicht stehen, wobei innerhalb der Ausbreitschicht eine Verteilung des Lösungsmittels oder Dispersionsmediums der aufgebrachten Probe und mindestens einer gelösten bzw. dispergierten Komponente erfolgt, derart, daß eine gleichförmige Konzentration der Komponente an der Oberfläche der Ausbreitschicht, die der Reagenzschicht oder einer Reagenzschicht des Elementes gegenüberliegt, erzeugt wird. Die gleichförmige Konzentration läßt sich dabei auch als gleichförmige offensichtliche Konzentration bezeichnen. Eine solche "offensichtliche" Konzentration kann dabei mit Konzentrationsgradienten erreicht werden, die durch die Dicke der Schicht verlaufen oder in anderer Weise in der Schicht vorliegen. Derartige Konzentrationsgradienten führen jedoch zu keinerlei Schwierigkeiten bei der Ermittlung quantitativer Testergebnisse und lassen sich unter Verwendung üblicher Eichmethoden ausschalten.

In vorteilhafter Weise besteht die Ausbreitschicht aus einer isotrop porösen Schicht. Unter einer isotropen Porosität ist dabei gemeint, daß die Schicht praktisch nach allen Richtungen hin porös ist. Der Grad der Porosität kann dabei verschieden sein. Beispielsweise lassen sich Porengröße und Porenvolumen verändern. Die Herstellung isotrop poröser Schichten und der Begriff der isotropen Porosität werden näher beispielsweise in der US-PS 39 92 158 erläutert.

Der Grad der Ausbreitung hängt teilweise von dem Volumen der auszubreitenden Flüssigkeiten ab. Tatsächlich jedoch ist die gleichförmige "offensichtliche" Konzentration, die bei Verwendung einer Ausbreitschicht erreicht wird, praktisch unabhängig von dem Volumen der aufgebrachten Flüssigkeit und tritt unabhängig von dem Ausmaß der Ausbreitung auf. Infolgedessen ist bei Verwendung erfindungsgemäßer analytischer Elemente die Anwendung genauer Proben-Dosierungsverfahren nicht erforderlich. Jedoch kann es im Einzelfall vorteilhaft sein, beispielsweise um vorteilhafte Ausbreitzeiten zu erreichen, bestimmte Volumina einer Flüssigkeitsprobe zu verwenden. Da sich bei Verwendung erfindungsgemäßer analytischer Elemente quantitative Ergebnisse ausgehend von vergleichsweise sehr geringen Probenvolumina erzielen lassen, die von einem bestimmten vorteilhaften Bereich der Ausbreitschicht aufgenommen werden können, beispielsweise von einem Bereich einer Größe von 1 cm², besteht keine Notwendigkeit überschüssige Flüssigkeit von dem Element nach Aufbringen der Flüssigkeitsprobe zu entfernen. Da die Ausbreitung der Flüssigkeitsprobe in der Ausbreitschicht erfolgt und die ausgebreitete Komponente der Reagenzschicht zugeführt wird, ohne daß dabei ein ins Gewicht lateraler hydrostatischer Druck anzuwenden ist, tritt kein "ringing"-Problem auf, das oftmals im Falle analytischer Elemente des Standes der Technik zu beobachten ist, wenn lösliche Reagenzien verwendet werden.

Die Ausbreitschicht braucht lediglich eine gleichförmige Konzentration der ausgebreiteten Komponenten pro Flächeneinheit auf der Oberfläche, die der Reagenzschicht gegenüberliegt, zu erzeugen. Ein geeignetes Testverfahren, nach dem möglich ist zu ermitteln, ob eine spezielle Schicht als Ausbreitschicht verwendbar ist, ist beispielsweise aus der US-PS 39 92 158 bekannt.

Isotrop poröse Schichten lassen sich ausgehend von verschiedenen Ausgangskomponenten herstellen. Beispielsweise lassen sich derartige Schichten ausgehend von teilchenförmigen Stoffen herstellen, wobei die isotrope Porosität durch die Zwischenräume zwischen den Teilchen hervorgerufen wird. Andere Verfahren zur Herstellung von istrop porösen Polymerschichten beruhen auf der Verwendung von gasförmigen oder anderen quellbaren Bestandteilen zur Erzeugung von Poren. Derartige Verfahren sind beispielsweise aus den US-PS 29 60 728 sowie 29 46 095 bekannt. Des weiteren können Ausbreitschichten auch unter Verwendung von Ausfällverfahren hergestellt werden, wie sie beispielsweise aus der US-PS 35 55 129 bekannt sind oder durch Verwendung eines lösbaren Stoffes innerhalb einer Polymerphase, der aus dieser unter Erzeugung von Poren herausgelöst wird, wie es beispielsweise aus der US-PS 38 16 575 bekannt ist. Als besonders vorteilhaft hat sich die Verwendung von sog. "Blushed"- oder ausgefällten Polymerschichten erwiesen. Die Herstellung von isotrop porösen Schichten dieses Typs ist beispielsweise aus der US-PS 39 92 158 bekannt.

Zur Herstellung der Ausbreitschicht lassen sich die verschiedensten Verbindungen verwenden. Als besonders vorteilhaft hat es sich erwiesen, wenn diese Ausgangsverbindungen vergleichweise quellresitent sind, bei Kontakt mit den Flüssigkeiten, die analysiert werden sollen. Eine Quellung von etwa 10 bis 40%, bezogen auf die Dicke der trockenen Schicht wird dabei als normal betrachtet.

Als besonders vorteilhaft hat es sich des weiteren erwiesen, wenn die Ausbreitschicht nicht-fasrig ist. Unter "nicht-fasrigen" Schichten sind dabei Schichten zu verstehen, die frei oder mindestens praktisch frei von fasrigen Stoffen sind, d. h. Schichten, die keine fasrigen Komponenten enthalten oder wenigstens nicht solche Mengen an fasrigen Komponenten, die das Ausbreiten einer Flüssigkeitsprobe stören könnten oder die die Bestimmung der erzielten analytischen Ergebnisse auf radiometrischem Weg beeinträchtigen könnten.

Bei den Reagenzschichten der erfindungsgemäßen Elemente handelt es sich in vorteilhafter Weise um permeable, vorzugsweise gleichförmig permeable und gegebenenfalls poröse Schichten, d. h. Schichten, die für die Komponenten, die durch die Ausbreitschicht ausgebreitet wurden, porös sind. Der Ausdruck "permeabel" schließt dabei eine Permeabilität ein, die durch die Porosität hervorgerufen wird, die Fähigkeit zur Quellung sowie andere Charakteristika. Kennzeichnend für derartige Reagenzschichten ist im allgemeinen eine Matrix, in der Stoffe, die mit der zu analysierenden oder zu bestimmenden Substanz zu reagieren vermögen verteilt, d. h. gelöst oder dispergiert sind.

Die Verteilung reaktionsfähiger Stoffe, d. h. der Reagenzien läßt sich durch Lösen oder Dispergieren derselben in dem Matrixmaterial erreichen. Obgleich oftmals eine gleichförmige Verteilung der Reagenzien Vorteile bietet, braucht sie nicht unbedingt erforderlich zu sein, beispielsweise dann nicht, wenn die reaktionsfähige Substanz, beispielsweise aus einem Enzym, z. B. Uricase besteht.

In vorteilhafter Weise sind die Reagenzschichten für die ausgebreiteten Komponenten gleichförmig permeabel. Unter einer gleichförmigen Permeabilität einer Schicht ist dabei eine Permeabilität zu verstehen, die derart ist, daß, wird eine homogen Flüssigkeit gleichförmig auf die Oberfläche einer Schicht gebracht und werden Konzentrationsmessungen der Flüssigkeiten innerhalb der Schicht unter Verwendung der gleichen Vorrichtung und unter gleichen Bedingungen, jedoch in verschiedenen Bereichen der Oberfläche der Schicht durchgeführt, gleiche oder praktisch gleich Ergebnisse erhalten werden. Infolge einer gleichförmigen Permeabilität werden unerwünschte Konzentrationsgradienten, beispielsweise einer Reagenzschicht des beschriebenen Typs vermieden.

Erfindungsgemäß analytische Elemente können des weiteren sog. Registrierschichten aufweisen, d. h. Schichten die unterhalb der Ausbreit- und Reagenzschichten liegen und keine reaktionsfähigen Komponenten enthalten und lediglich dazu dienen, die Farbstoffe aufzunehmen, die in den darüberliegenden Schichten erzeugt wurden. Derartige Schichten bestehen im allgemeinen aus Matrixschichten, die für den oder die erzeugten Farbstoffe und gegebenenfalls andere Komponenten, beispielsweise Beizmittel, oberflächenaktive Verbindungen und dergleichen permeabel sind. Derartige Schichten und ihre Anordnung in analytischen Elementen sind beispielsweise aus der BE-PS 831 660 bekannt.

Zur Herstellung der Reagenz- und Registrierschichten lassen sich die verschiedensten Matrixmaterialien auswählen, wobei das im Einzelfall günstigste Matrixmaterial von dem angewandten Analysenverfahren und den aktiven Komponenten abhängt, die in das Matrixmaterial eingearbeitet werden sollen. Vorteilhafte Matrixmaterialien bestehen aus hydrophilen Stoffen natürlicher oder synthetischer Herkunft. In vorteilhafter Weise lassen sich organophile Stoffe verwenden, z. B. Celluloseester. Um die Permeabilität der Reagenzschicht zu steigern, sofern diese nicht porös ist, kann es oftmals vorteilhaft sein, ein Matrixmaterial zu verwenden, das in dem Lösungsmittel- oder Dispersionsmedium der zu analysierenden Flüssigkeit etwas quellbar ist.

Abgesehen von ihrer Permeabilität weist die Reagenzschicht in vorteilhafter Weise praktisch keine Eigenschaften oder Charakteristika auf, die zu Störungen bei der Ermittlung eines analytischen Ergebnisses führen könnten. Zwecks weiterer Einzelheiten bezüglich des Aufbaues und der Eigenschaften geeigneter Reagenzschichten wird auf die US-PS 39 92 158 verwiesen.

Bei den erfindungsgemäßen analytischen Elementen kann es sich um selbsttragende Elemente handeln. Andererseits können jedoch auch die Ausbreitschicht, die Reagenzschicht und gegebenenfalls vorhandene weitere Schichten auf einen Schichtträger aufgetragen werden. Als Schichtträgermaterialien können die üblichen bekannten Schichtträgermaterialien verwendet werden, beispielsweise Papier und mit einem Polyolefin kaschierte Papiere, wie auch Schichtträger aus den verschiedensten üblichen bekannten polymeren Stoffen, z. B. Schichtträger aus Celluloseacetat, Poly(äthylenterephthalat), Polycarbonaten und Polyvinylverbindungen, z. B. aus Polystyrolen.

Der Schichtträger kann dabei aus einem opaken oder lichtundurchlässigen Material bestehen oder aber er kann für Licht oder andere Energie, je nach der angewandten Bestimmungsmethode, durchlässig sein. Die Auswahl des Schichtträgers hängt dabei von dem analytischen Verfahren ab, das angewandt werden soll. Als besonders vorteilhaft hat sich die Verwendung von transparenten Schichtträgern erwiesen, die elektromagnetische Strahlung einer Wellenlänge oder eines Wellenlängenbereichs innerhalb eines Bereiches von etwa 200 nm und etwa 900 nm durchzulassen vermögen. Gegebenenfalls kann es des weiteren vorteilhaft sein, wenn ein Schichtträger verwendet wird, der für eine oder mehrere Wellenlängenbanden durchlässig ist und für benachbarte Wellenlängenbanden undurchlässig ist. Dies läßt sich beispielsweise dadurch erreichen, daß man den Schichtträger mit einer oder mehreren färbenden Komponenten, die geeignete Absorptionscharakterstika aufweisen, imprägniert oder beschichtet.

Bei Verwendung eines Elementes mit einem Schichtträger befindet sich die Reagenzschicht zwischen dem Schichtträger und der Ausbreitschicht. Besonders vorteilhafte Durchlässigkeitsbereiche für erfindungsgemäße Elemente ergeben sich aus der Diskussion der verschiedenen, erfindungsgemäß anwendbaren Farbindikatoren.

Werden zur Herstellung der analytischen Elemente Schichtträger verwendet, so weisen diese vorzugsweise eine Stärke von etwa 0,025 bis etwa 0,25 mm auf, obgleich auch Schichtträger außerhalb dieses Bereiches verwendbar sind. Die im Einzelfalle günstigste Schichtstärke kann von verschiedenen Faktoren beeinflußt werden, beispielsweise der Intensität der zur Durchführung des analytischen Verfahrens verwendeten Strahlung und der Empfindlichkeit der Bestimmungsvorrichtung.

In vorteilhafter Weise sind die erfindungsgemäßen analytischen Elemente so ausgestaltet, daß sie im Rahmen analytischer Verfahren verwendbar sind, die auf Reflexionsmessungen spektrophotometrischer Methoden beruhen, weshalb sie in vorteilhafter Weise eine Schicht aufweisen, die die Funktion einer reflektierenden Schicht ausübt und einen geeigneten Hintergrund für spektrophotometrische Messungen cholorimetrischer oder anderer Indikatorreaktionen durch den Schichtträger des Elementes ermöglicht. Die reflektierende Schicht soll dabei den Durchtritt der zu analysierenden Substanz zur Reagenzschicht oder Registrierschicht ermöglichen und einen wirksamen Hintergrund für Reflexions-spektrometrische Messungen liefern. Ein weißer Hintergrund hat sich dabei für diesen Zweck als besonders vorteilhaft erwiesen. Im Hinblick auf ihre Funktion als Hintergrund für einen Indikator der in der Reagenz- oder Registrierschicht erzeugt wurde, liegt die reflektierende Schicht normalerweise zwischen der Ausbreitschicht und der Reagenz- oder Registrierschicht. Es ist jedoch auch möglich, daß eine solche Schicht zwischen einer Reagenzschicht und einer Registrierschicht angeordnet wird. Eine Reflexion läßt sich des weiteren beispielsweise durch eine Schicht erreichen, die gleichzeitig zum Beispiel als Ausbreitschicht dient oder aber die Reflexion kann durch eine zusätzliche Schicht bewirkt werden, die keine weitere Funktion innerhalb des Elementes hat. Zur Erzeugung von reflektierenden Schichten lassen sich in vorteilhafter Weise Pigmente, wie beispielsweise Titandioxid und Bariumsulfat verwenden. Jedoch können auch sog. "Blush"-Polymere zur Herstellung reflektierender Schichten verwendet werden. Reflektierende Schichten können somit beispielsweise aus pigmenthaltigen Ausbreitschichten bestehen wie auch aus Blush-Polymeren aufgebaute Ausbreitschichten. Gemäß einer besonders vorteilhaften Ausgestaltung der Erfindung weisen die analytischen Elemente Blush-Polymerschichten auf, die zur Steigerung der Ausbreitung und/oder Reflektivität ein Pigment enthalten. Die Pigmentmenge, die in einer Schicht mit einem Blush-Polymeren vorliegen kann, kann sehr verschieden sein. Als vorteilhaft hat es sich erwiesen, etwa 1 bis etwa 10 Gew.-Teile Pigment pro Gew.-Teil Blush-Polymer zu verwenden, vorzugsweise etwa 3 bis etwa 6 Gew.- Teile Pigment pro Gew.-Teil Blush-Polymer.

Gegebenenfalls können in den erfindungsgemäßen analytischen Elementen auch Filterschichten vorliegen. Derartige Filterschichten sowie ihre Herstellung ist bekannt. Sie können dazu dienen Probenbestandteile abzufiltrieren, die die im Element ablaufenden Reaktionen stören könnten oder in anderer Weise hinderlich bei der quantitativen Ermittlung der zu analysierenden Substanz sein könnten. Im Falle der Verwendung eines mehrschichtigen analytischen Elementes für die Bestimmung von Harnsäure in Blut kann eine separate Filterschicht beispielsweise dazu dienen, rote Blutkörperchen abzufiltrieren, während das Blutserum zu der unter der Filterschicht liegenden Schicht gelangt. Bei der Analyse von Blutserum und anderen Flüssigkeiten kann eine Filterschicht des weiteren dazu dienen um unerwünschte Komponenten zu entfernen, die den Ablauf der Bestimmungsreaktion beeinträchtigen und zu verfälschten Analysenergebnisse führen könnten. Gegebenenfalls können auch Blush-Polymerschichten als Filterschichten dienen. Bei Verwendung eines analytischen Elementes für die Analyse von Blut hat es sich als vorteilhaft erwiesen, wenn eine Filterschicht eine Porengröße von etwa 0,5 bis 5 Mikron hat.

Um die Adhäsion einer Reagenzschicht gegenüber einer darüberliegenden Ausbreitschicht, Filterschicht und/oder reflektierenden Schicht zu verbessern, kann es in manchen Fällen vorteilhaft sein, permeable Trenn- oder Zwischenschichten zu verwenden, die als Haftschichten zur Verbesserung der Haftung der einzelnen Schichten dienen. Zur Herstellung derartiger Zwischen- oder haftverbessernden Schichten können die verschiedensten Stoffe verwendet werden, solange die Schichten für die zu analysierende Substanz permeabel sind und ermöglichen, daß die zu analysierende Substanz in die Reagenzschicht gelangen kann und solange die zum Aufbau dieser Schichten verwendeten Stoffe nicht die Reagenzien in benachbarten Schichten inhibieren.

Zur Herstellung derartiger Zwischenschichten oder haftverbessernden Schichten geeignete Ausgangsverbindungen sind bekannt. Als besonders vorteilhaft hat sich die Verwendung von polymeren filmbildenden Stoffen erwiesen, beispielsweise Poly(n-vinyl-2- pyrrolidon), Poly(n-isopropylacrylamid), Copolymere aus Vinylacetat und Vinylneodecanoat mit vorzugsweise 20 Gew.-% Vinylacetat sowie Copolymeren aus Vinylneodecanoat und n-Vinyl-2- pyrrolidon, vorzugsweise mit 10 bis 30 Gew.-% Vinylneodecanoat.

Da die Permeabilität der Zwischenschichten gewahrt bleiben muß, sind diese Schichten notwendigerweise sehr dünn und weisen im allgemeinen eine Dicke auf, die der Dicke einer Monoschicht entspricht, bis zu Schichten einer Schichtstärke von etwa 0,025 mm. Werden derartige polymere Zwischenschichten verwendet, so entfallen im vorteilhafter Weise auf eine Trägerfläche von 1 m² etwa 90 bis 1000 mg, je nach den speziellen Eigenschaften der Polymeren, beispielsweise der Dichte und der erforderlichen Permeabilität der herzustellenden Schichten.

Gegebenenfalls können auch Oberflächenbehandlungen durchgeführt werden, welche die Adhäsion zwischen den Schichten fördern, beispielsweise Elektronenbestrahlung und dergleichen.

Die Herstellung der analytischen Elemente kann nach üblichen bekannten Methoden erfolgen. So ist es beispielsweise möglich, die einzelnen Schichten eines erfindungsgemäßen analytischen Elementes zunächst gesondert herzustellen und die hergestellten Schichten zu erhalten, bis sie bei Verwendung des Elementes in Flüssigkeitskontakt miteinander gelangen, Schichten, die in Form von separaten Schichten hergestellt werden, lassen sich in typischer Weise ausgehend von Lösungen oder Dispersionen herstellen, die auf eine Oberfläche aufgetragen werden, von der die hergestellte Schicht dann auf physikalischem Wege abgestreift wird, nachdem sie getrocknet ist.

Ein vorteilhaftes Verfahren zur Herstellung von erfindungsgemäßen Elementen, das die Notwendigkeit mehrfacher Abstreif- und Laminierungsstufen vermeidet, besteht darin, zunächst eine erste Schicht auf eine Abstreifoberfläche oder einen Schichtträger aufzutragen, worauf auf die zunächst erzeugte Schicht eine weitere Schicht oder mehrere weitere Schichten aufgetragen werden können. Eine solche Beschichtung kann beispielsweise von Hand erfolgen oder nach üblichen bekannten Beschichtungsmethoden, beispielsweise durch Tauchbeschichtung, Wulstbeschichtung und dergleichen. Bei einer maschinellen Beschichtung kann es vorteilhaft sein, einander benachbarte Schichten gleichzeitig aufzutragen, beispielsweise unter Verwendung der üblichen bekannten Beschichtungsvorrichtungen, die zur Herstellung lichtempfindlicher photographischer Filme und Papiere verwendet werden und die das Auftragen mehrerer Schichten gleichzeitig gestatten. Die Haftung der Schichten untereinander läßt sich gegebenenfalls durch Oberflächenbehandlungen, einschließlich der Aufbringung extrem dünner Haftschichten, wie im Falle photographischer Filme verbessern.

Gegebenenfalls können bestimmte Reagenzien auch in der Ausbreitschicht untergebracht werden. Beispielsweise lassen sich Enzyme, wie beispielsweise das Enzym Uricase in einer Ausbreitschicht unterbringen, wodurch eine Wasserstoffperoxiderzeugung bewirkt werden kann, bevor die Probe die Reagenzschicht erreicht, die die Reagenzien enthält, welche mit dem H₂O₂ unter Erzeugung einer feststellbaren Veränderung reagieren.

Erfüllt die Ausbreitschicht die Funktion einer Ausbreitschicht und einer Filterschicht, so kann die Schicht in vorteilhafter Weise dadurch hergestellt werden, daß gleichzeitig zwei Lagen eines Bindemittels, beispielsweise Celluloseacetat, gelöst in einer Mischung aus organischen Lösungsmitteln, mit dem Ziel "Blush"-Polymerschichten zu erzeugen, auf eine entsprechende Unterlage aufgetragen werden. Ein solches Verfahren vereinfacht die Herstellungsoperation dadurch, daß die Mehrfachbeschichtung zur Herstellung mehrerer Schichten auf eine Mehrfachbeschichtungsoperation vermindert wird, unter gleichzeitiger Erzeugung einer hochwirksamen Ausbreit- und Filterschicht. Gegebenenfalls kann die eine oder können beide der diskreten Schichten oder Lagen ein reflektierendes Pigment wie beispielsweise TiO₂ dispergiert enthalten.

Vorrichtungen und Verfahren, die sich zu einem gleichzeitigen Auftrag verschiedener einzelner Schichten oder Lagen innerhalb der Ausbreitschicht und/oder Reagenzschicht eignen, sind beispielsweise aus der US-PS 29 32 855 bekannt.

Die im Einzelfalle optimale Dicke der Ausbreitschicht kann verschieden sein. Sie kann teilweise von dem Probenvolumen abhängen, das auf das analytische Element aufgebracht werden kann und das aus Gründen der Einfachheit und Sauberkeit von der Ausbreitschicht absorbiert werden sollte, sowie dem Porenvolumen der Schicht, das ebenfalls die Probenmenge beeinflußt, die von der Schicht absorbiert werden kann. In vorteilhafter Weise haben die Ausbreitschichten eine Stärke von etwa 50 bis etwa 300 Mikron, obgleich in vorteilhafter Weise auch Schichten außerhalb dieses Bereiches verwendet werden können.

Bei Herstellung von isotrop porösen Ausbreitschichten hat es sich als zweckmäßig erwiesen, wenn das Porenvolumen dieser Schicht bei etwa 25% des Gesamtvolumens der Schicht liegt, vorzugsweise bei etwa 50 bis 95% des Gesamtvolumens. In vorteilhafter Weise lassen sich durch Veränderung des Porenvolumens einer porösen Ausbreitschicht die Element-Charakteristika verändern, beispielsweise die Gesamtpermeabilität der Ausbreitschicht oder die zum Ausbreiten einer Probe erforderliche Zeitspanne. Das Porenvolumen innerhalb einer Schicht läßt sich durch Auswahl beispielsweise der zur Herstellung der Schicht verwendeten teilchenförmigen Stoffe kontrollieren, beispielsweise durch die Größe der verwendeten Teilchen oder durch Auswahl der Lösungsmittel oder Trockenbedingungen, sofern isotrop poröse "Blush"-Polymere zur Herstellung der Ausbreitschicht verwendet werden. Das Porenvolumen einer solchen Schicht läßt sich nach üblichen bekannten Methoden, beispielsweise statischen Methoden ermitteln, wie sie beispielsweise von Chalkley in der Zeitschrift "Journal of the National Cancer Institute", 4 (1943), Seite 47, beschrieben werden oder durch direktes Auswiegen und Bestimmen des Verhältnisse von tatsächlichem Gewicht der Schicht zum Gewicht des festen Materials, das zum Aufbau der Schicht verwendet wurde.

Die Reagenzschichten lassen sich dadurch herstellen, daß zunächst eine Lösung oder Dispersion aus dem Matrixmaterial der Schicht und den entsprechenden Reagenzien hergestellt wird, worauf die hergestellte Lösung oder Dispersion unter Anwendung eines üblichen Beschichtungsverfahrens auf eine entsprechende Unterlage aufgetragen und unter Erzeugung einer dimensionsstabilen Schicht aufgetrocknet wird. Die Dicke der Reagenzschicht und ihr Permeabilitätsgrad können sehr verschieden sein, je nach dem Verwendungszweck der Schicht. Als zweckmäßig hat es sich erwiesen, wenn die Trockendicke der Schicht bei etwa 10 bis etwa 100 Mikron liegt.

Des weiteren kann ein erfindungsgemäßes analytisches Element mehrere diskrete Reagenzschichten aufweisen, von denen eine jede eine spezielle Funktion in dem analytischen Bestimmungsverfahren erfüllt.

Im Falle eines analytischen Elementes für die Bestimmung von Harnsäure beispielsweise kann die Reagenzschicht oder das Reagenzsystem aus zwei diskreten Schichten oder Teilschichten bestehen. Dabei kann die obere dieser Schichten die für die Wasserstoffperoxiderzeugung aus der Harnsäure erforderlichen Reagenzien enthalten und die zweite Schicht eine Farbkupplerverbindung oder ein anderes Indikatorsystem.

Im Falle eines analytischen Elementes für die Bestimmung von Harnsäure kann das Enzym Uricase in entweder der Ausbreitschicht oder der Reagenzschicht untergebracht werden, zweckmäßig in einer Konzentration von etwa 50 bis 500 Einheiten/m² und vorzugsweise in einer Konzentration von etwa 100 bis 300 Einheiten/m². Die Peroxidase kann in einem derartigen Element, beispielsweise in einer Konzentration von 1000 bis 10 000 Einheiten/m² und vorzugsweise in einer Konzentration von etwa 2000 bis 8000 Einheiten/m² vorliegen.

In vorteilhafter Weise werden die einzelnen Schichten eines erfindungsgemäßen analytischen Elementes ausgehend von Beschichtungslösungen oder Beschichtungsdispersionen hergestellt, wie sie beispielsweise in der US-PS 39 92 158 beschrieben werden.

Oftmals hat es sich als vorteilhaft oder notwendig erwiesen, den Beschichtungslösungen oder Beschichtungsdispersionen ein Beschichtungshilfsmittel zuzusetzen.

Verwendbar sind die verschiedensten üblichen bekannten Beschichtungshilfsmittel. Wesentlich ist lediglich, daß sie nicht die Aktivität der verwendeten Reagenzien, beispielsweise der Uricase inhibieren, die in den Schichten eines erfindungsgemäßen Elementes untergebracht werden. Als besonders vorteilhafte Beschichtungshilfsmittel haben sich nicht-ionogene oberflächenaktive Verbindungen erwiesen, beispielsweise Octylphenoxypolyäthoxyäthanole. Derartige nicht-ionogene oberflächenaktive Verbindungen sind im Handel erhältlich. Weitere besonders vorteilhafte nicht-ionogene Beschichtungshilfsmittel sind solche auf Basis von (p-Nonylphenoxy)- glyzerin, die ebenfalls im Handel erhältlich sind. Weitere vorteilhafte Beschichtungshilfsmittel sind solche auf Basis von Polyäthylenglykolen, beispielsweise solche, die im Handel unter der Bezeichnung "Carbowax-Polyäthylenglykol" erhältlich sind.

Weitere besonders vorteilhafte Beschichtungshilfsmittel sind Glyzerin und beispielsweise Triisopropylnaphthalinsulfonat, Natriumsalz.

Als zweckmäßig hat es sich erwiesen, derartige oberflächenaktive Verbindungen in Konzentrationen von etwa 0,5 bis etwa 4,0 g/m² in der Reagenzschicht und von etwa 1,0 bis etwa 5,0 g/m² in der Ausbreitschicht zu verwenden, in welchem Falle keine oder praktisch keine inhibierende Effekte zu beobachten sind und vorteilhafte Beschichtungs- und Probenausbreiteffekte erreicht werden.

Gegebenenfalls kann die Herstellung der einzelnen Schichten unter Verwendung von Härtungsmitteln erfolgen, um ein vorteilhaftes und rasches Festwerden des Bindemittels der Schichten zu erreichen, um eine Beschädigung bei der Handhabung der Elemente zu vermeiden und um eine unerwünschtes Vermischen einzelner Schichten untereinander zu vermeiden. Die Verwendung von Härtungsmitteln zu derartigen Zwecken ist bekannt und braucht deshalb hier nicht näher erläutert zu werden. Verwendbar sind organische wie auch anorganische Härtungsmittel, wobei darauf zu achten ist, daß sie die übrigen in den Schichten vorhandenen Reagenzien nicht nachteilig beeinflussen. Härtungsmittel, die sich als besonders vorteilhaft erwiesen haben sind Glutaraldehyd sowie Bis(vinylsulfonylmethyl) äther.

Die Verwendung der erfindungsgemäßen Elemente kann in üblicher bekannter Weise erfolgen.

Wie es beispielsweise im folgenden anhand der Bestimmungen von Harnsäure beschrieben wird, kann beispielsweise ein Tropfen der zu analysierenden Probe einer Größenordnung von etwa 5 bis etwa 50 µl auf die Ausbreitschicht oder äußere Schicht des Elementes nach üblichen bekannten Methoden aufgebracht werden. Beim Durchtritt durch die Ausbreitschicht wird der Probetropfen ausgebreitet, so daß eine abgemessene Menge hiervon der darunterliegenden Reagenzschicht zugeführt wird, in der der Abbau der Harnsäure und die Erzeugung von Wasserstoffperoxid erfolgen.

Andererseits, je nach der angewandten Bestimmungsmethode kann die Erzeugung des Wasserstoffperoxides jedoch auch in der Ausbreitschicht oder einer oberen Reagenzschicht erfolgen, worauf eine bestimmte Menge des Wasserstoffperoxides der darunterliegenden Reagenzschicht zugeführt wird. In jedem Falle wird das Wasserstoffperoxid in einer Reagenzschicht unter Verwendung eines der beschriebenen Indikatorsysteme quantitativ erfaßt, so daß die Konzentration an Harnsäure ermittelt werden kann.

Die folgenden Beispiele sollen die Erfindung näher veranschaulichen.

Beispiel 1

Um die Verwendbarkeit von bestimmten Indikatoren für die Wasserstoffperoxidermittlung und zur Herstellung von erfindungsgemäßen Bestimmungsreagenzien zu ermitteln, die sich für die Bestimmung von vergleichsweise geringen Mengen an H₂O₂ in Lösung eignen, wurde eine Anzahl von Verbindungen ausgewählt, worauf zunächst Lösungen der Verbindungen hergestellt wurden, die mit entwederr einem Carbonat-, Borat- oder Trispuffer auf einen pH-Wert von 8,5 bis 9,8 abgepuffert wurden.

Die Herstellung der Lösungen erfolgte durch Lösen einer vergleichsweise geringen Mengen der zu testenden Verbindung in Methylalkohol in einem Teströhrchen, worauf eine wäßrige Pufferlösung und eine kleine Menge an Peroxidase zugesetzt wurden. Daraufhin wurde eine geringe Menge Peroxid zugesetzt, worauf der auftretende Farbton festgestellt wurde.

Die Ergebnisse der Testversuche sind in der folgenden Tabelle zusammengestellt.

In der folgenden Tabelle bedeutet "positiv", daß eine feststellbare Menge an Farbstoff erzeugt wurde, während "negativ" bedeutet, daß keine feststellbare Farbstoffverbindung erzeugt wurde.

Tabelle

Beispiel 2

Es wurde ein analytisches Element mit sämtlichen notwendigen Reagenzien für die quantitative Bestimmung von Harnsäure in Blutserum in folgender Weise hergestellt.

Zunächst wurde ein Abschnitt eines Poly(äthylenterephthalat)- filmschichtträgers mit einer 0,18 mm dicken Gelatine-Haftschicht mit einer Reagenzschicht versehen aus: 10,8 g Gelatine/m², 2000 Einheiten Peroxidase/m², 323 mg 2-(5-Brom-4-hydroxy-3-methoxyphenyl)- 4,5-bis(p-dimethylaminophenyl)imidazol/m² sowie 72 mg Bis(vinylsulfonylmethyl) äther und einem Carbonatpuffer zur Einstellung eines pH-Wertes von 9,02.

Auf diese Reagenzschicht wurde dann eine Schicht aufgetragen aus 5,4 g Gelatine/m², 54 Einheiten Uricase/m² sowie einem Carbonatpuffer zur Einstellung eines pH-Wertes von 9,02. Auf diese Schicht wurde dann eine Zwischenschicht aus 323 g Poly(n-isopropylacrylamid) pro m² aufgetragen, worauf schließlich eine isotrop poröse Ausbreitschicht aus 56,5 g Titandioxid/m² und 8,03 g Blush- Celluloseacetat/m² aufgetragen wurden.

Des weiteren wurden Harnsäure-Standardlösungen mit 2,0 bis 30,0 g Harnsäure/dl hergestellt, worauf durch Tüpfelanalyse Tropfen von jeweils 10 µl auf Abschnitte des hergestellten Elementes aufgetragen wurden. Nach 4 Minuten bei 25°C wurde mittel eines Spektrophotometers mit einem 680 nm IF (Interferenzfilter) die Reflexionsdichte, D _R , des Elementes ermittelt. Es wurden die folgenden Ergebnisse erhalten:

HarnsäurelösungD _R 680 nm (mg/dl)4 Minuten bei 25°C

 00,07  2,00,28  5,00,49 10,00,63 20,00,74

Beispiel 3

Zunächst wurde ein weiteres analytisches Element mit sämtlichen Reagenzien für die quantitative Bestimmung von Harnsäure in Blutserum in der folgenden Weise hergestellt:

Auf einen Poly(äthylenterephthalat)filmschichtträger mit einer 0,18 mm starken Gelatine-Haftschicht wurde zunächst eine erste Reagenzschicht aus: 10,76 g Gelatine/m², 2152 Einheiten Peroxidase/ m², 108 mg 5,5-Dimethyl-1,3-cyclohexandion/m², 322 mg der Farbstoff- Vorläuferverbindung 2-(4-Hydroxy-3-methoxyphenyl)-4,5- bis(p-dimethylaminophenyl)imidazol/m² sowie ein Boratpuffer zur Einstellung eines pH-Wertes von 8,7 aufgetragen. Auf diese Schicht wurde dann eine zweite Reagenzschicht aus 5,15 g Gelatine/m², 54 Einheiten Uricase/m² und ein Boratpuffer zur Einstellung eines pH-Wertes von 8,7 aufgetragen. Auf diese Schicht wurden dann eine Zwischenschicht und eine Ausbreitschicht wie in Beispiel 2 beschrieben aufgebracht.

Gleichzeitig wurden wiederum Harnsäure-Standardlösungen mit 2 bis 20 mg Harnsäure/dl hergestellt, worauf von diesen Lösungen 10 µl Tropfen auf die Elemente aufgetüpfelt wurden. Nach 4 Minuten bei 30°C wurden mittels eine Spektrophotometers mit einem Interferenzfilter wie in Beispiel 2 beschrieben die Reflexionsdichten, D _R , der Elemente ermittelt. Es wurden die folgenden Ergebnisse erhalten:

HarnsäurelösungD _R 680 nm (mg/dl)4 Minuten bei 25°C

 2,00,30 10,00,82 20,01,16

Aus den erhaltenen Ergebnissen ergibt sich das Ansprechvermögen der analytischen Elemente auf Harnsäure-Standardlösungen.

Beispiel 4

Ein weiteres analytisches Element mit sämtlichen für die quantitative Bestimmung von Harnsäure in Blutserum erforderlichen Reagenzien wurde in der folgenden Weise hergestellt:

Auf einen Poly(äthylenterephthalat)schichtträger mit einer 0,18 mm starken Gelatine-Haftschicht wurde eine Reagenzschicht aus: 10,8 g Gelatine/m², 6456 Einheiten Peroxidase/m², 0,54 g einer Dispersion aus 2-(4-Hydroxy-3-methoxyphenyl-4,5-bis(p-dimethylaminophenyl) imidazol/m² in 5,40 g Diäthyllauramid/m² und einem Puffer aus 0,11 g H₃BO₃/m², 0,13 g KCl/m² und NaOH zur Einstellung eines pH-Wertes auf 8,8 aufgetragen. Auf die erzeugte Reagenzschicht wurde dann eine zweite Reagenzschicht aus 5,38 g Gelatine/m², 216 Einheiten Uricase/m² und einem Puffer aus 0,06 g H₃BO₃/m², 0,07 g KCl/m² und NaOH zur Einstellung eines pH-Wertes auf 9,0 aufgetragen. Auf diese Schicht wurde eine Zwischenschicht aus 0,32 g Poly(n-isopropylacrylamid/m² aufgebracht. Auf die Zwischenschicht wurde dann eine isotrop poröse Blush-Polymer-Ausbreitschicht aus 46,50 g Titandioxid/m², 6,62 g Celluloseacetat/m² und 3,6 g einer oberflächenaktiven Verbindung (Triton X-100)/m² aufgetragen, indem auf die Zwischenschicht eine Beschichtungsmasse mit den angegebenen Bestandteilen sowie einem organischen Lösungsmittel aufgebracht wurde.

Des weiteren wurden Harnsäure-Standardlösungen mit 5,0 bis 20 mg Harnsäure/dl hergestellt, worauf 10 µl große Tropfen der Lösungen auf Abschnitte des hergestellten Elementes aufgetüpfelt wurden. Nach 4 Minuten bei 25°C wurden in der beschriebenen Weise die Reflexionsdichten ermittelt. Es wurden die folgenden Ergebnisse erhalten:

HarnsäurelösungD _R 680 nm (mg/dl)4 Minuten bei 25°C

 5,00,69 10,01,03 20,01,46

Claims (17)

1. Verfahren zur Bestimmung von Wasserstoffperoxid in wäßrigen Flüssigkeiten, bei dem man eine Probe der zu analysierenden Flüssigkeit mit einer Substanz mit peroxidativer Aktivität und einem Farbbildner, der in Gegenwart von Wasserstoffperoxid und der Substanz mit peroxidativer Aktivität unter Erzeugung eines Farbstoffes oxidiert wird, in Kontakt bringt, dadurch gekennzeichnet, daß man als Farbbildner ein Triarylimidazol der Formel: in der R¹, R² und R³ jeweils einen gegebenenfalls substituierten Phenylrest darstellen, wovon einer ein gegebenenfalls substituierter para-Hydroxy-Phenylrest ist und die anderen Phenylreste bezüglich ihrer Substituenten derart ausgewählt sind, daß das Oxidationspotential des Imidazols, gemessen durch cyclische Voltometrie gegenüber einer Standard-Kalomel-Elektrode unter Verwendung einer Elektrode auf Kohlebasis zwischen -70 mV bis +110 mV liegt, verwendet.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man als Farbbildner ein Triarylimidazol der angegebenen Formel verwendet, in der R¹ und R² Phenylreste sind, die in para-Position eine aus einem elektronenspendenden Substituenten bestehende Gruppe aufweisen.

3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß man ein Triarylimidazol der angegebenen Formel verwendet, in der die aus einem elektronenspendenden Substituenten bestehende Gruppe aus einer Alkoxygruppe der Formel -OR⁷, einer Aryloxygruppe oder einer Dialkylaminogruppe der Formel: worin R⁷ jeweils ein Alkylrest mit 1 bis 8 C-Atomen ist, besteht.

4. Reagenz für die Bestimmung von Wasserstoffperoxid in wäßrigen Flüssigkeiten zur Durchführung des Verfahrens nach Ansprüchen 1 bis 3, mit einer Puffersubstanz, einer Substanz mit peroxidativer Aktivität und einem Farbbildner, der bei Kontakt mit Wasserstoffperoxid und der Substanz mit peroxidativer Aktivität einer feststellbaren Veränderung unterliegt, dadurch gekennzeichnet, daß es als Farbbildner ein Triarylimidazol der Formel: enthält, in der R¹, R² und R³ jeweils einen gegebenenfalls substituierten Phenylrest darstellen, wovon einer ein gegebenenfalls substituierter para- Hydroxy-Phenylrest ist und die Reste bezüglich ihrer Substituenten derart ausgewählt sind, daß das Oxidationspotential des Imidazols, gemessen durch cyclische Voltometrie gegenüber einer Standard-Kalomel-Elektrode unter Verwendung einer Elektrode auf Kohlebasis, zwischen -70 mV bis +110 mV liegt.

5. Reagenz nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß es als Farbbildner ein Triarylimidazol der angegebenen Formel enthält, in der R¹ und R² Phenylreste sind, die in para-Stellung eine aus einem elektronenspendenden Substituenten bestehende Gruppe aufweisen.

6. Reagenz nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß es ein Triarylimidazol der angegebenen Formel enthält, in der die aus einem elektronenspendenden Substituenten bestehende Gruppe aus einem Alkoxyrest der Formel -OR⁷, einem Aryloxyrest oder einem Dialkylaminorest der Formel: worin R⁷ jeweils ein Alkylrest mit 1 bis 8 C-Atomen ist, besteht.

7. Reagenz nach Anspruch 4 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß es als Substanz mit peroxidativer Aktivität Peroxidase enthält.

8. Reagenz nach Ansprüchen 4 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß es auf einen pH-Wert zwischen 5,0 und etwa 10,0 abgepuffert ist.

9. Reagenz nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß es als Puffersubstanz ein Borat, Zitrat, Phosphat, Glutarat, Carbonat oder eine Tris- Puffersubstanz enthält.

10. Reagenz nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß es als Farbbildner enthält: 2-(4-Hydroxy-3,5-dimethoxyphenyl) -4,5-bis(4-methoxyphenyl)- imidazol; 2-(3,5-Dibrom-4-hydroxyphenyl) 4,5-diphenylimidazol; 2-(3-Brom- 5-methoxy-4-hydroxyphenyl)-4,5-bis- (4-methoxyphenyl)-imidazol; 4,5-Bis(4- dimethylaminophenyl)-2-(4-hydroxyphenyl)- imidazol; 4,5-Bis(4-dimethylaminophenyl) -2-(4-hydroxy-3-methoxyphenyl)- imidazol; oder 4,5-Bis(4-dimethylaminophenyl)- 2-(4-hydroxy)-3,5- dimethoxyphenyl)-imidazol.

11. Reagenz nach Ansprüchen 4 bis 10, dadurch gekennzeichnet, daß es zusätzlich ein Enzym, das bei Kontakt mit einem Analyten die Erzeugung von Wasserstoffperoxid bewirkt, enthält.

12. Reagenz nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß es für die Bestimmung von Harnsäure in wäßrigen Lösungen als Enzym Uricase enthält.

13. Analytisches Element zur Durchführung des Verfahrens nach Ansprüchen 1 bis 3 mit einer nichtfaserigen, isotrop porösen Ausbreitschicht und einer Reagenzschicht sowie einem Gehalt an einem Enzym, das bei Kontakt mit einem zu bestimmenden Analyten die Erzeugung von Wasserstoffperoxid bewirkt und einem Reagenz zur Ermittlung von Wasserstoffperoxid aus: (I)einer Substanz mit peroxidativer Aktivität (II)einer Puffersubstanz und (III)einem Farbbildner,dadurch gekennzeichnet, daß es als Farbbildner ein Triarylimidazol der angegebenen Formel enthält.

14. Analytisches Element nach Anspruch 13 zur Bestimmung von Harnsäure in wäßrigen Flüssigkeiten, dadurch gekennzeichnet, daß es als Enzym Uricase enthält.

15. Analytisches Element nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, daß es als Substanz mit peroxidativer Aktivität Peroxidase enthält.

16. Analytisches Element nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, daß es auf einen pH-Wert von 8 bis 9 gepuffert ist.

17 Analytisches Element nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, daß es als Triarylimidazol enthält:
2-(4-Hydroxy-3,5-dimethoxyphenyl)-4,5- bis(4-methoxyphenyl)-imidazol; 2-(3,5- Dibrom-4-hydroxyphenyl)4,5-diphenyl- imidazol; 2-(3-Brom-5-methoxy-4-hydroxyphenyl)- 4,5-Bis(4-methoxyphenyl)- imidazol; 4,5-Bis(4-dimethylaminophenyl)- 2-(4-hydroxyphenyl)-imidazol; 4,5-Bis(4-dimethylaminophenyl)-2-(4- hydroxy-3-methoxyphenyl)-imidazol; oder 4,5-Bis(4-dimethylaminophenyl)-2- (4-hydroxy)-3,5-dimethoxyphenyl)-imidazol.