DE3823996A1

DE3823996A1 - Verfahren (metall-indikator-detektion) zur komplexometrischen bestimmung von oxyanionen/ polyanionen mit picomol-empfindlichkeit anwendung zur kontinuierlichen nachsaeulendetektion bei fluessigkeitschromatographischer auftrennung und zur detektion nach trennung auf duennschichttraegern

Info

Publication number: DE3823996A1
Application number: DE19883823996
Authority: DE
Inventors: Georg W Mayr
Original assignee: MAYR GEORG W PRIV DOZ DR MED
Current assignee: MAYR GEORG W PRIV DOZ DR MED
Priority date: 1988-07-15
Filing date: 1988-07-15
Publication date: 1990-01-18

Description

Die chromatographische Trennung und Quantifizierung von Anionen und insbesondere von Polyanionen stellt mittlerweile ein allgemein verwendetes präparatives, aber auch ein sehr weitverbreitetes analytisches Verfahren dar, welches in zunehmendem Maße naßchemische Verfahren ersetzt. Diese Methodik, heute meist mit HPLC-Systemen und hochauflösenden Anionenaustauschersäulen auf Styrol- oder Silicabasis, zum Teil auch nach dem Prinzip der Ionenpaarchromatographie oder nach anderen flüssigkeitschromatographischen Verfahren durchgeführt, ist mittlerweile zum Standard in der wasserchemischen Analytik und zu einer Routinetechnik in zahlreichen anderen chemischen Disziplinen geworden. Neben der Bestimmung monovalenter sauerstofffreier Anionen spielen Oxyanionen wie Nitrit, Nitrat, Sulfat, Bicarbonat, Carbonat, Phosphat, Carbonsäuren und polyanionische sauerstoffhaltige Chelatoren, vor allem als Wasserenthärter verwendet, eine Rolle. Dies sind Pyro- und Polyphosphate aber auch Phosphatersatzstoffe z.B. Polysulfonsäuren und Polycarbonsäuren.

Auch in der biologischen und physiologischen Chemie spielt die Analytik aber auch die chromatographische Isolierung von Oxy- und Polyanionen, z. B. von Mono- Di- und Tricarbonsäuren, Phosphoglycuronsäuren, Zuckermono- und -bisphosphaten, Glycosaminoglycuronanen und deren sulfatierten Derivaten, Nucleosid(poly)phosphaten, Nucleosidphospho sulfaten, Oligonucleotiden, Phosphopeptiden, sauren Peptiden und Polypeptiden, Pyrophosphat und Pyrophosphoestern, Phosphodiestern, Polyphosphaten und den neuerdings ins Zentrum des Interesses geratenen Inositol(poly)phosphaten eine äußerst große Rolle.

Mit Ausnahme der Nucleosid- und Peptidverbindungen sind die meisten dieser Anionen nicht direkt photometrisch oder fluorimetrisch detektierbar. In der Ionenchromatographie wird deshalb vor allem die Leitfähigkeitsdetektion zur Bestimnung der aufgetrennten Anionen eingesetzt. Dies führt jedoch in der Regel zu einer Limitierung der chromatographischen Trennungen auf isokratische Verfahren. Erst in jüngster Zeit deuten sich Fortschritte an im Bemühen, auch nach Gradientenelution mittels Leitfähigkeit Anionen zu detektieren. Fortschritte brachten hier sowohl elektronische als auch chemische Verfahren zur Suppresion der bei Gradientenelution stark zunehmenden Basisleitfähigkeit.

Gerade die besonders stark negativ geladenen Polyanionen, die sowohl wasserchemisch als auch biologisch besonderes aktuelles Interesse erfahren, lassen sich ausschließlich durch steile Gradientenelution adäquat auftrennen bzw. überhaupt erst von Anionenaustauschern eluieren. Die insbesondere bei den biologisch-chemischen Fragestellungen angestrebten Empfindlichkeiten im Nanomol- bis Picomolbereich werden jedoch derzeit trotz der o.g. Suppressions verfahren bei Leitfähigkeitsdetektion nicht erreicht. Auch alternative Verfahren zur Analytik solcher Verbindungen wie etwa gaschromatogra phisch-massenspektrometrische Verfahren (Sherman, W.R. et al. (1986) Biochem. Envir. Mass. Spectrometry 13, 333-341) sind noch nicht hinreichend entwickelt und auch um ein vielfaches teurer als die Ionenchromatographie.

DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DES ERFINDUNGSGEMÄSSEN VERFAHRENS

Die Erfindung ist geeignet, die für die hochempfindliche chromatographische Trennung von Polyanionen und Oxyanionen bestehende "Detektionslücke" mit einem sehr kostengünstigen, vielseitig anwendbaren und hochsensitiven komplexometrischen Verfahren zu schließen. Sie stellt ein Verfahren dar, das, bei ionenchromato graphischen und anderen flüssigkeitschromatographischen Trennverfahren als Nachsäulendetektion angewendet, geeignet ist, auch bei steilen Gradientenelutionen jedes Polyanion/Oxyanion in quantifizierbarer Weise ohne große Basislinienprobleme zu detektieren.

Die hierbei erreichbare Empfindlichkeit erlaubt die Bestimmung von Picomolmengen derartiger Anionen. Diese Art der Anwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens ist in den Anwendungsbeispielen 1 und 2 erläutert.

Die Erfindung ist auch geeignet, chromatographisch oder ektrophore tisch/iontophoretisch auf Papier, Folien, Dünnschichtgelen oder -platten aufgetrennte Polyanionen/Oxyanionen mittels eines Sprüh- oder Tauchreagenzes mit ähnlicher Empfindlichkeit zu detektieren. Diese Anwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens ist in Anwendungsbeispiel 3 erläutert.

Die Erfindung ist schließlich dafür anwendbar, Oxyanionen/Polyanionen bei Auswahl eines geeigneten Kationenindikators und geeigneter Detektorkationen in gelösten Einzelproben photometrisch oder fluorime trisch quantitativ zu bestimmen.

Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren erfolgt diese Detektion mit einem komplexometrischen Verfahren, das die Eigenschaft von polyvalenten Oxyanionen ausnützt, mit zwei- oder insbesondere höherwertigen metallischen Kationen zum größten Teil sehr hochaffine Komplexe zu bilden. Die Dissoziationskonstanten dieser Komplexe bestimmen, in welchem Ausmaß im Elutionsmittel vorhandene derartige Kationen, die als Detektorkationen bezeichnet seien, mit den Polyanionen/Oxyanionen Komplexe bilden. Diese Dissoziationskonstanten sollen möglichst klein sein (picomolar bis nanomolar) und unter dem Konzentrationsbereich liegen, in dem die Anionen von einer Trennsäule eluieren. Die Konzentration an Detektorkationen, die dem Elutionsmittel vor der Trennsäule zugesetzt ist oder nach der Trennsäule dem Eluat zugemischt wird, kann dann so niedrig gewählt werden, daß sie durch genannte Komplexierung signifikant abnimmt. Immer wenn nun ein solches Oxyanion im Eluat auftaucht, kann man die Abnahme der freien Kationenkonzentra tion mittels eines geeigneten, dem Eluat zugesetzten kationenspezi fischen Indikators detektieren (Abb. 1). Bei genügend niedrigen Dissoziationskonstanten der Oxyanionen-Kationen-Komplexe besteht nahezu Linearität zwischen Oxyanionenkonzentration und Abnahme der freien Kationenkonzentration (Abb. 2); die Steigung dieser Geraden wird für jedes Oxyanion von der Stöchiometrie der hochaffinen Kationenbindung definiert. Die in den Anwendungsbeispielen angewendeten Detektor kationen sind Verteter der Lanthaniden bzw. Yttrium. Sie vereinen alle der für eine optimale Anwendung im erfindungsgemäßen Detektionsver fahren nötigen Eigenschaften. Sie sind dreiwertig, weisen dadurch sehr hohe Assoziationskonstanten für die meisten Oxyanionen/Polyanionen auf, sie sind stabil in ihrem Oxidationszustand und greifen deshalb die Trennharze nicht oxidativ an, sie sind sehr rein erhältlich, und darüberhinaus billig und relativ atoxisch.

Besagter Kationenindikator soll zur hochaffinen Bindung des Detektor kations geeignet sein. Seine Dissoziationskonstante für die Bindung des Kations muß ebenfalls nahe dem Bereich der freien Kationenkonzentra tion liegen. Gegenüber der Oxyanionen/Polyanionen sollte der Indikator das Kation jedoch signifikant schwächer binden. Das Kation muß ferner so ausgewählt sein, daß es vom Kationenindikator und aus bei höheren pH- Werten gebildeten Hydroxokomplexen mit ausreichender Geschwindigkeit (im für die Zumischung nach der Säule vorgesehenen Zeitintervall) abdissoziieren kann, nur so ist ein Equilibrium der Bindung an die Oxyanionen und damit der Detektion erreichbar. Der kationenspezifische Indikator sollte im Idealfall so beschaffen sein, daß er ein möglichst starkes (im Falle eines Chromophors oder Fluorophors) optisches oder andersartiges Signal erzeugt, das möglichst kationenselektiv ist, d.h. möglichst nur vom Detektorkation, nicht jedoch von kontaminierenden Kationen auslösbar und in Abwesenheit des Detektorkations nahe Null ist. Im Idealfalle ist dieses Signal nicht pH-abhängig, über die Zeit stabil und wenig temperaturabhängig. 4-(2-Pyridylazo)-Resorcinol (PAR; Elchuk, S. und Cassidy, R.M. (1979) Anal. Chem. 51, 1434-1438) erfüllt etliche dieser Voraussetzungen und ist darüberhinaus über einen weiten pH-Bereich stabil.

Eine wesentliche Bedeutung für die Detektionsempfindlichkeit spielt der pH-Wert bei der komplexometrischen Detektion. Die Detektionsempfindlichkeit ist in der Regel bei alkalischen pH-Werten höher als bei sauren pH-Werten. Dies beruht vor allem auf der pH- Abhängigkeit der Stabilitätskonstanten der Oxyanionen-Kationen- Komplexe. Oxyanionen werden bei Erniedrigung des pH-Wertes protoniert und die Protonen konkurrieren mit anderen Kationen um die Bindung. Die Folge ist eine signifikante Abnahme der apparenten Stabilitätskon stanten der Komplexe mit anderen Kationen, auch dem Detektorkation. Deprotonierung erhöht somit immer die Stabilitätskonstanten für das Detektorkation. Da Carbonsäurereste in der Regel über pH 5 deprotoniert sind, sind für deren Bestimmung entsprechend hohe pH-Werte nötig.

Phosphomonoester und terminale Phosphatgruppen von Polyphosphaten gehen erst über pH 7, in manchen Fällen (bei Inositolphosphaten hohen Phosphatgehalts) auch erst bei viel höheren pH-Werten in die dianio nische Form über, die Detektion von Phosphoverbindungen erfolgt also am empfindlichsten im alkalischen pH-Bereich.

Die meisten der kationenspezifischen Indikatoren sind ebenfalls protonierbar und zeigen ein entsprechendes pH-abhängiges Verhalten ihrer Assoziationskonstanten, oft auch des kationenspezifischen Signals. Ein möglichst konstanter pH-Wert bei der Detektion während des gesamten Elutionsprogramms, nötigenfalls herbeigeführt durch Pufferzufuhr nach der Trennsäule, trägt damit ganz entscheidend zu einer stabilen Basislinie und einer konstanten Detektionssensitivität bei pH-Variation im Elutionsprogramm bei.

Eine Limitierung des pH-Wertes nach oben hin kommt durch eine zunehmende Bildung von Hydroxokomplexen (Hydrolyse der Detektorkation- Hydratkomplexe) mit entsprechender Abnahme der freien Kationenkonzentration und durch eventuell einsetzende Präzipitation der Kationenkomplexe mit den Polyanionen/Oxyanionen bzw. dem Kationenindikator zustande. In den genannten Beispielen werden pH-Werte zwischen 7,5 und 9,5 zur Detektion eingestellt. Hier liegt eine hohe Detektionssensitivität vor, andererseits sind die oben genannten störenden Effekte bei diesen pH-Werten noch beherrschbar.

Elutionsmittel und Puffer müssen beide derart beschaffen sein, daß deren Komponenten möglichst keine unerwünschten Wechselwirkungen mit Detektorkation und Kationenindikator eingehen. Bei den Elutionsmitteln wird diese Bedingung in der Regel durch monovalente Non-Oxyanionen und monovalente Kationen, insbesondere große organische Kationen (z. B. Tetraalkylammoniumionen) besonders gut erfüllt, bei Puffern durch monobasische organische Kationen wie zum Beispiel Ammoniak, Trimethylamin, Triethylamin, Triethanolamin, Trishydroxymethylamino methan oder basische Ringverbindungen wie zum Beispiel Imidazol. Auch die Verwendung von Oxyanionen vom Monocarbonsäure- oder Sulfonsäuretyp als Eluans-Anion bzw. Puffersubstanz ist in vielen Fällen möglich. Di- oder Polycarbonsäuren, Sulfat, Orthophosphat und Orthophosphoester sind hingegen in der Regel wegen ihrer starken Komplexbildung mit den Detektorkationen als Komponenten der Elutionsmittel ungeeignet.

Die für das erfindungsgemäße Verfahren der Nachsäulendetektion nötige Gerätekonstellation richtet sich danach, welche der möglichen Verfahrensvarianten und welcher Typ von Kationenindikator gewählt wurde. In der Regel erfolgt bei dem erfindungsgemäßen Detektionsver fahren die kontinuierliche Zumischung des Detektionsreagenzes zum Säuleneluat, oder, bei präparativer Chromatographie, zu einem kontinuierlich abgezweigten Volumenanteil hiervon. Aus Empfindlichkeits gründen ist die Flußrate in der Regel im Verhältnis zur Flußrate des Eluats klein, zweckmäßigerweise unter 1:1. Wird, wie in der Regel bei präparativen Anwendungen, für die Detektion ein Teil des Eluats kontinuierlich abgezweigt, so erfolgt dies am zweckmäßigsten mittels einer möglichst konstant und mit kleinem Totvolumen fördernden peristaltischen oder Kolbenpumpe (i.d.R. HPLC-Pumpe) über ein totvolumenarmes T-Stück. Eine kontinuierliche, flußkonstante Zumischung von Detektionsreagens erfolgt am zweckmäßigsten durch eine pulsations arme Kolbenpumpe (i.d.R. eine HPLC-Pumpe), eine Perfusorpumpe, oder eine pulsationsarme peristaltische Pumpe (Rollerpumpe). Die Zuführung des Detektionsreagenz erfolgt in der Regel durch ein totvolumenarmes T- Stück. Die Vermischung des Reagenz mit dem Eluat kann über ein beliebiges Mischsystem erfolgen, etwa einen "Jetstream-Mischer", eine motorgetriebene Magnetmischkammer oder eine längere Reaktionsschleife, am zweckmäßigsten in Form einer "gestrickten Kapillare" oder durch Kombinationen hiervon. Alternativ kann das Detektionsreagens in einem sog. Membranreaktor durch Druckdiffusion über eine permeable Membran in konstanter Rate zugeführt werden. Das Totvolmen des Mischsystems ist in der Regel so bemessen, daß eine stabile, pulsationsfreie Basislinie des Detektionssignals resultiert, daß die Assoziation des Detektorkations an eluierende Anionen und Kationenindikator möglichst bis zum Equilibrium erfolgt ist, daß andererseits jedoch keine signifikante Verbreiterung der einzelnen substanzspezifischen Signalgipfel erfolgt.

Das erfindungsgemäße Verfahren erlaubt drei verschiedene Varianten zur Realisierung des ternären komplexometrischen Nachsäulen-Detektions prinzips:

1. Das Detektorkation ist im Elutionsmittel oder allen bei Gradienten- oder Stufenelution verwendeten Elutionsmitteln in gleicher oder ähnliche, in der Regel mikro- bis millimolarer Konzentration enthalten. Der Kationenindikator ist im nach der Trennsäule zugeführten Detektionsreagens, in der Regel ebenfalls in mikro- bis millimolarer Konzentration enthalten. Langsame störende Präzipita tionsreaktionen zwischen Detektorkation und Kationenindikator, welche insbesondere bei alkalischen pH-Werten auftreten können, werden dadurch umgangen. Dieses Verfahren ist insbesondere bei analytischen Chromatographien dann anwendbar, wenn das oder die Elutionsmittel deutlich saure pH-Werte aufweisen. Dies ist häufig bei Anionenaustauschchromatographien der Fall. Unerwünschte Komplexierungen des Detektorkations mit den zu trennenden Anionen vor oder während der Trennung sowie eventuell auftretende Hydrolysereaktionen des Detektorkations sind dann minimal. Ein für die Detektion in der Regel günstigerer alkalischer pH-Wert des entstehenden Gemisches wird durch Zusatz eines geeigneten Puffers mit ausreichender Pufferkapazität zum Detektionsreagens herbeige führt.
2. Das oder die Elutionsmittel sind frei von Detektorkation und Kationenindikator. Beides wird nach der Trennsäule zusammen in einem einzigen Detektionsreagens oder einzeln in zwei separat zugeführten Reagenzien zugemischt. Dieses Verfahren ist bei analytischen Chromatographien insbesondere dann günstig, wenn das oder die Elutionsmittel bereits neutrale bis basische pH-Werte aufweisen. Dies macht aus den unter 1. erläuterten Gründen den Zusatz des Detektorkations zum Elutionsmittel problematisch. Andererseits kann bei alkalischem pH-Wert des Eluats das Detektions reagenzes auf saure pH-Werte eingestellt werden, was häufig eine problemlose a priori-Vermischung von Detektorkation und Kationen indikator in mikro- bis millimolaren Konzentrationen erlaubt. Anionenaustauschchromatographien, Ionenpaarchromatographien und Adsorptions- bzw. Verteilungschromatographien von Polyanionen/ Oxyanionen werden häufig bei neutralem bis alkalischem pH durch geführt und eignen sich dann für diese Detektionsvariante. Sie ist die Methode der Wahl bei halbpräparativen und präparativen Chromato graphien, da hier in der Regel jeder Zusatz zum Elutionsmittel unerwünscht ist.
Bei sauren Elutionsmitteln muß diese Detektionsvariante in der Regel mittels zweier separater Zumischsysteme realisiert werden. Am günstigsten erfolgt hierbei die separate Zufuhr eines auf sauren pH- Wert eingestellten Gemisches aus Detektorkation und Kationenindikator und eines auf alkalischen pH-Wert eingestellten Puffers. Bei ungenügender Säurestabilität des Kationenindikators kann dieser auch dem Puffer zugesetzt werden.
3. Das oder die Elutionsmittel enthalten den Kationenindikator. Das Detektorkation wird nach der Trennsäule in der Regel aus schwach saurer Lösung zugemischt. Langsame Präzipitationsreaktionen zwischen Kationenindikator und Detektorkation werden hier ebenso wie bei Variante 1 vermieden. Da aus dem unter 1 genannten Grund das Detektionsreagens leicht sauer sein muß, ist die Anwendung dieser Variante auf neutrale bis alkalische Elutionsmittel beschränkt. Eine Einschränkung der Anwendbarkeit dieser Variante kommt von der Gefahr einer Zerstörung des Trennmaterials durch Verunreinigungen des Kationenindikators bzw. durch langsam akkumulierende Präzipitate des Kationenindikators mit im Elutionsmittel als Kontaminator vorhandenen polyvalenten Kationen.

Das erfindungsgemäße Verfahren eignet sich auch, Polyanionen/Oxyan ionen nach ihrer chromatographischen oder elektrophoretisch/iontopho retischen Auftrennung auf Papier, Folien, Dünnschichtgelen oder -platten geeigneter Beschaffenheit mit Nanomol-Empfindlichkeit semiquantitativ zu detektieren. Hierbei gelten die gleichen Prinzipien wie in den vorhergehenden Abschnitten erläutert.

Die Detektion erfolgt zweckmäßigerweise durch Entwicklung der Träger mittels eines Sprüh- oder Tauchreagenzes. Erfolgt die Trennung auf dem Dünnschichtträger im Alkalischen, so kann dies allein durch Besprühen mit oder Tauchen in einem Detektionsreagens bewerkstelligt werden. Dieses enthält Detektorkation und den Kationenindikator in der Regel beide in mikro- bis millimolaren Konzentrationen in schwach saurer nur gering gepufferter Lösung. Erfolgt die Trennung auf dem Dünnschicht träger bei sauren pH-Werten, so kann man entweder unmittelbar vor Verwendung des Reagenzes diesem eine größere Konzentration eines auf alikalische pH-Werte eingestellten Puffers zusetzen oder die mit dem Detektionsreagens behandelten Dünnschichtträger in einem Dampf einer volatilen Base, zum Beispiel in Ammoniakdampf, so lange entwickeln, bis auf dem Dünnschichtträger ausreichend alkalische pH-Werte erreicht sind.

Alternativ kann die Trennung auf dem Dünnschichtträger in Gegenwart entweder des Detektorkations oder des Kationenindikators im Chromatographie- bzw. Elektrophoresepuffer erfolgen und die Enwicklung sodann mit einem Detektionsreagens erfolgen, das die zweite nötige Komponente und gegebenenfalls auf alkalischen pH-Wert eingestellten Puffer enthält. Diese Variante ist dann gut praktikabel, wenn das Laufmittel bzw. der Elektrophoresepuffer sauer ist, dann wird zweckmäßigerweise das Detektorkation zum Laufmittel/Elektrophore sepuffer zugesetzt. Im Detektionsreagens ist dann in der Regel eine problemlose Mischung des Kationenindikators mit auf alkalischen pH eingestelltem Puffer möglich.

Bei der Anwendung dieses Detektionsverfahrens auf Dünnschichtplatten oder Folien kann häufig eine erhebliche Sensitivitätssteigerung durch geeignete Vorbehandlung der Dünnschichtträger zur Entfernung höherwertiger Kationen erreicht werden. Geeignet sind Vorbehandlungen mit verdünnten vorzugsweisen volatilen Säuren, mit mikromolaren Lösungen von Chelatoren und Vorläufe unter Trennbedingungen.

Für die Anwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens zur photometrischen oder fluorimetrischen quantitativen Bestimmung von Oxyanionen/ Polyanionen in gelösten Einzelproben gelten sinngemäß die in den vorhergehenden Abschnitten genannten Prinzipien und Bedingungen. Am zweckmäßigsten erfolgt eine solche Bestimmung, in dem man zu Proben, die bis auf das oder die zu bestimmenden Oxyanionen/Polyanionen immer eine konstante ionale Zusammensetzung aufweisen, und die gegebenenfalls durch Pufferzusatz auf konstanten alkalischen pH-Wert gebracht wurden, ein definiertes Volumen eines schwach sauren Detektionsreagenzes zumischt, welches Detektorkation und Kationenindikator, beide in der Regel in mikromolaren Konzentrationen, enthält. Die photometrische oder fluorimetrische Messung erfolgt zweckmäßigerweise bei definierter Temperatur und für alle Proben zu identischer Zeit nach Zumischung des Detektionsreagenzes.

ANWENDUNGSBEISPIELE DES ERFINDUNGSGEMÄSSEN VERFAHRENS BEISPIEL I

Picomol-Analytik zellulärer Phosphoverbindungen, speziell der Inositol polyphosphate, durch Anionenaustausch-HPLC mit Metall-Indikator-Nach säulendetektion.

Für diese Analysen wurde eine Elution mit einem stark sauren Elutionssystem auf Styrol-Anionenaustauscher mit der Detektionsvariante 1 kombiniert.

Ein HPLC-System von Pharmacia-LKB, Freiburg (zwei Pumpen P-3500, Controller LCC-500, niederdruckseitige Gradientenmischung mittels Mischventils, Monitor UV-M, und automatischer Probengeber ACT-100) wurde für die HPLC-Analysen verwendet. Alle mit Elutionsmittel benetzten Teile des HPLC-Systems wurden aus Teflon, Titan oder Plastik gefertigt. Glas-Säulen des Typs HR-5 (5, 10 oder 20 cm Länge) wurden mit Anionenaustauscherharz des Typs Mono-Q (Monodisperse Anionenaus tauscherpartikel auf Styrolbasis mit 10 µm Durchmesser und niedriger Austauscherkapazität) gepackt. Eine Filtereinheit (8 mm Durchmesser) mit einem 1 mm dicken Zellulosefilter und einem hydrophoben Filter mit 1 µm Porendurchmesser (Schleicher und Schüll) wurde der Säule zu deren Schutz vorgeschaltet. Als schwaches Elutionsmittel (A) wurde 0,2 mM HCl, welche 9 bzw. 18 µM YC1₃ enthielt, verwendet. Das starke Elutionsmittel (B) enthielt 0,4 M HC1 und 14 bzw. 28 µM YCl₃. Mit diesen beiden Elutionsmitteln wurde ein aufwärts konkaver Gradient von 40 bis 70 min Dauer geformt. Das Detektionsreagens (C) enthielt 100 bis 500 µM PAR (aus 20 mM Stammlösung in Äthanol zugegeben) und 1,3 M Triäthanolamin, mit HCl auf pH 8,4 eingestellt. Alle Lösungen wurden unmittelbar vor Benützung durch Millipore-Filter mit 1 µm Porendurch messer gefiltert und hierbei gleichzeitig entgast, zusätzlich wurden die beiden Elutionslösungen kontinuierlich durch Heliumbegasung entgast. Die Flußgeschwindigkeit des Elutionsmittels betrug 1 ml/min, das Detektionsreagens wurde mit einer Flußgeschwindigkeit von 0,5 ml/min mit einer zweiten HPLC Pumpe nach der Trennsäule über ein T-Verbindungs stück zugeführt. Vor diesem T-Stück war eine Filtereinheit analog der oben beschriebenen installiert. Sie enthielt nur ein Zellulose-Filter. Eine "gestrickte" Kapillare mit einem Totalvolumen von 200 bis 400 µl wurde zur gleichmäßigen Vermischung von Detektionsreagens und Eluans verwendet. Die Detektion erfolgte bei 546 nm über eine optische Weglänge von 5 mm. Das Detektorsignal wurde nach dem Start jedes Einzelchromatogramms automatisch auf Null gesetzt und invertiert. Das invertierte Signal wurde von einem Integrator der Firma Shimadzu, Düsseldorf (C-R5A Chromatopac) Basislinien-subtrahiert und integriert.

Biologische Extrakte wurden zum Teil durch eine Kohlebehandlung von Nukleinsäuren und zum Teil durch eine sich anschließende Festphasen extraktion von die Retentionszeiten beeinflussenden höheren Salzkon zentrationen.

Abb. 2 zeigt für einige Phosphoverbindungen die Abhängigkeit der Amplituden-Zeit-Integrale der Detektorsignale von der Substanzmenge. Mit Ausnahme einiger Nucleotide zeigten alle unter den angegebenen Bedingungen analysierten Phosphoverbindungen eine nahezu lineare Abhängigkeit der Flächenintegrale von der Substanzmenge bis herab zu etwa 50 Picomolen Substanzmenge. Die Detektionsempfindlichkeit zeigte bei den Inositolphosphaten eine Abhängigkeit von der Zahl der Phosphat reste eines Moleküls. Sie war maximal bei Inositolhexakisphosphat.

Durch die Metall-Indikator-Detektion in Verbindung mit HPLC-Trennver fahren werden Substanzen wie etwa Inositolpolyphosphate, für welche bisher keinerlei hochempfindliche On-line-Detektionsverfahren existierten, einer direkten Massenbestimmung mit Picomol-Empfindlich keit zugänglich gemacht. Dies wird in Abb. 3 und Abb. 4 gezeigt. Derartige Verbindungen finden sich in einer Vielzahl von verschiedenen Isomeren in tierischen und pflanzlichen Zellen, viele von ihnen jedoch nur in mikromolaren Konzentrationen. Gezeigt ist ein Chromatogramm, bei dem eine Gesamtmenge von etwa 10 Nanomolen verschiedener Inositolphos phate (von Inositolmono- bis -hexakisphosphat) zusammen mit einem Gemisch verschiedener Mono- bis Trinukleotide injiziert wurde. Aus dem Vergleich des unten eingeschobenen bei gleicher Empfindlichkeit vor der Derivatisierung registrierten UV-Chromatogramms mit dem durch Metall- Indikator-Detektion erhaltenen Chromatogramm (oben) wird klar, daß selbst Nukleotide mit letzterer Methode zumeist vielfach empfindlicher als mittels UV-Absorption detektierbar werden.

In Abb. 4 sind Beispiele der Analytik solcher polyvalenter Oxyanionen aus biologischem Material gezeigt. Auf dem linken Teilbild sind die Analysen von je 30 µl Vogelvollblut nach einstündiger Inkubation (im Tonometer) bei 20 Vol.% 0₂ (unteres Chromatogramm) und 0 Vol.% 0₂ (oberes Chromatogramm) dargestellt. Die Analysen wurden ohne vorherige Kohlebehandlung durchgeführt, entsprechend werden sowohl Nukleotide als auch Zucker- und Inositolphosphate detektiert. Im rechten Teilbild ist die Analyse der (Nicht-Nukleotid-)Phosphoverbin dungen von unstimulierten und stimulierten Blutplättchen (unteres bzw. oberes Chromatogramm) dargestellt. Durch eine vorausgehende Kohle extraktion wurden die zellulären Nukleotide bis auf einen kleinen Rest an ATP weitgehend entfernt.

BEISPIEL II

Hochempfindliche Analytik von Polyphosphaten, und von Di-, Tri- und Tetracarbonsäuren mittels Anionenaustausch-HPLC mit Metall-Indikator- Detektion.

Diese Verbindungen spielen als Wasserenthärter und Chelatoren in Haushalt bzw. Industrie eine große Rolle, Polyphosphate kommen darüberhinaus bei einigen, Di- und Tricarbonsäuren bei allen Lebewesen vor. Ihr empfindlicher Nachweis, von zunehmender Bedeutung v.a. in der Umweltanalytik, ist mit dem erfindungsgemäßen Verfahren möglich. Für die Analytik von Polyphosphaten kann das stark saure Elutionsmittel wie in Beispiel 1 beschrieben verwendet werden. Auf Grund der niedrigen pK_s-Werte dieser Verbindungen ist hierbei eine adäquate Trennung auf Anionenaustauschern möglich. Dies ist in Abb. 5 für ein Gemisch von Polyphosphaten gezeigt. Die verwendeten Elutions- und Detektions bedingungen sind ähnlich denjenigen von Beispiel 1. Bei niedrigeren Assoziationskonstanten der zu analysierenden Verbindungen für das Detektorkation kann es günstig sein, durch einen leicht sauren pH-Wert des Detektionsreagens auch die Stabilitätskonstante des PAR-Detektor kation-Komplexes zu erniedrigen, oder einen weniger affinen Kationen indikator (z.B. Tetramethylmurexid) zu wählen. Dies begünstigt die Linearität der Detektion. Auch (Poly)Sulfonylverbindungen, welche zunehmend als Polyphosphatersatzstoffe Verwendung finden, können mit diesem System bestimmt werden.

Für eine adäquate HPLC-chromatographische Trennung von Di-, Tri- und Tetracarbonsäuren muß auf Grund der z.T. deutlich höheren pK_s-Werte ein weniger saures Elutionssystem verwendet werden. Es eignen sich beispielsweise 5 mM Tetramethylammoniumacetat, pH 5,0, 25 µM YCl₃ als schwaches Elutionsmittel und 5 mM Tetramethylammoniumacetat, 0,6 M Tetramethylammoniumchlorid, pH 5,0, 25 µM YCl₃ als starkes Elutions mittel. Als Detektionsreagens eignet sich 300 µM PAR in 30 mM Triäthanolamin/HCl, pH 9,0, in einem Volumenverhältnis von 0,5:1 zum Säuleneluat zugemischt.

BEISPIEL III

Detektion von auf Papier oder Dünnschichten getrennten Oxyanionen mittels eines Metall-Indikator-Reagenzes.

Polyvalente Oxyanionen können elektrophoretisch/iontophoretisch auf Papier, Zellulose- und anderen hydrophilen Dünnschichtträgern oder Dünnschichtgelen aufgetrennt werden. Darüberhinaus können derartige Verbindungen auch chromatographisch auf Papier, hydrophilen Dünnschicht trägern (z.B. Zellulose, Polyäthylenimin-Zellulose, organischen Ionenaustauschharzen) aufgetrennt werden. Mit Ausnahme von Nukleotiden, die auf Fluorophor-imprägnierten Dünnschichten über die Quenchung der UV-Fluoreszenz des Trägermaterials hochsensitiv (bis zu etwa 0,2 nMolen) detektierbar sind, gibt es für Polyanionen und Oxyanionen keine vergleichbar sensitive Detektionsmöglichkeit. Phosphoverbindungen werden üblicherweise mit Hanes-Isherwood-Reagens (Hanes, C.S. & Isherwood, F.A. (1949) Nature 164, 1107-1110) detektiert, hierbei werden jedoch typischerweise Substanzmengen deutlich über 20 nMolen benötigt.

Das erfindungsgemäße Verfahren der Metall-Indikator-Detektion erlaubt eine Detektion mit Subnanomol-Empfindlichkeit.

In dem in Abb. 6 gezeigten Beispiel wurden Gemische von Nukleotiden auf vorbeschichteten HPTLC-Dünnschichtplatten der Firma E. Merck, Darm stadt, Typ NH₂ F254_s (Nr. 15647) in folgendem Laufmittel aufge trennt: 0,2 M Tetramethylammoniumchlorid, pH 6, in Aceton/Wasser (20:80, v/v). Die HPTLC-Platten wurden mit diesem Laufmittel durch mehrmaliges Tauchen vorbehandelt. Nach der Chromatographie wurden die Nukleotide über die Quenchung der UV-Fluoreszenz identifiziert.

Für die Metall-Indikator-Detektion wurden folgende Lösungen herge stellt: 25 mM Triäthanolamin/HCl, pH 9, mit 250 µM PAR (alkalische Indikatorlösung); 0,5 mM YCl₃ pH 6 (Detektorkation-Lösung). Unmittelbar vor Benutzung wurden diese beiden Lösungen im Verhältnis 4:1 gut vermischt und die Platten sofort hierin getaucht oder hiermit besprüht und angetrocknet. Die Substanzflecken lassen sich durch ihre hellere, gelbliche Färbung auf dem dunkler braunen Hintergrund erkennen. Wurden sehr kleine Substanzmengen appliziert, so läßt sich durch eine Verringerung der Konzentration von Detektorkation und Indikator die Empfindlichkeit deutlich steigern. Substanzmengen unter 1 nMol lassen sich so problemlos detektieren bzw. mittels eines Dünn schichtscanners bei 520 bis 540 nm quantifizieren.

FIGURENBESCHREIBUNGEN

Fig. 1
REALISIERUNG EINES HPLC-SYSTEMS MIT METALL-INDIKATOR-DETEKTION.

A: Prinzip der Detektion; B: Aufbau des HPLC-Systems. Me, ein zur Detektion geeignetes Übergangsmetall; InsP_x, Inositolpolyphosphat als typischer Vertreter polyvalenter Oxyanionen; PAR, 4-(2-Pyridylazo)- Resorcin; A und B, schwaches bzw. starkes Elutionsmittel; C, Indikator- Reagens.

Fig. 2
LINEARITÄT DER MASSENBESTIMMUNG VON OXYANIONEN DURCH METALL-INDIKATOR- DETEKTION.

Die Substanzen, die in der Abbildung spezifiziert sind (Ins steht für Inositol, 2,3 BPG für 2,3-Bisphosphoglyzerat) wurden auf eine Säule Mono Q (5/5) injiziert. Die Elutionsmittel A und B enthielten 9 bzw. 14 µM YCl₃. Das Detektionsreagens C enthielt 100 µM PAR. Eluiert wurden die Substanzen mit einem aufwärts konkaven Gradienten von 40 min Dauer.

Fig. 3
HPLC-ANALYSE EINES GEMISCHES VON INOSITOLPHOSPHATEN UND NUCLEOTIDEN MITTELS METALL-INDIKATOR-DETEKTION.

Die Trennung erfolgte auf einer Mono Q (5/15)-Säule. Die Elutionspuffer waren wie unter Abb. 2 beschrieben, das Reagens C enthielt jedoch 200 µM PAR. Die Flußraten für das Elutionsmittel und Reagens C waren 1,2 bzw. 0,6 ml/min. Der angelegte Gradient ist in die Abbildung eingezeichnet. Das obere Chromatogramm zeigt das Detektorsignal der Metall-Indikator- Detektion (5 mm opt. Weglänge, 546 nm), der linke Balken gibt 0,01 Absorptionseinhieten an. Unten ist das gleichzeitig durch UV-Detektion (254 nm, 5 mm opt. Weglänge) vor Zumischung von Reagens C erhaltene UV- Chromatogramm dargestellt. Die Zahlen auf den Signalgipfeln bedeuten:
(Inositol ist jeweils mit Ins abgekürzt) 1, Pi+InsP; 2, Ins(1,2)P₂ +Ins(1,6)P₂; 3, PPi; 4, nicht identifiziert; 5, Ins(1,3,5)P₃+ Ins(2,4,6)P₃; 6, Ins(1,3,4)P₃; 7, Ins(1,2,3)P₃+Ins(1,2,6)P₃+ Ins(1,4,5)P₃+Ins(2,4,5)P₃; 8, Ins(1,5,6)P₃, 9, Ins(4,5,6)P₃; 10, Ins(1,2,3,5)P₄+Ins(1,2,4,6)P₄; 11. Ins(1,2,3,4)P₄ vor Ins(1,2,4,5)P₄+Ins(1,3,4,6)P₄; 12, Ins(1,3,4,5)P₄; 13, Ins(1,2,5,6)P₄; 14, Ins(2,4,5,6)P₄; 15, Ins(1,4,5,6)P₄; 16, Ins(1,2,3,4,6)P₅; 17, Ins(1,2,3,4,5)P₅; 18, Ins(1,2,4,5,6)P₅; 19, Ins(1,3,4,5,6)P₅; 20, InsP₆. Die entsprechenden Buchstaben im unteren Chromatogramm bezeichnen:
a, AMP+CMP+NAD; b, cAMP; c, GMP; d, NADH; e, UMP; f, NADP; g, ADP+ADPR; h, ATP+CTP; i, GDP; k, IDP; l, GTP; m, UDP; n, ITP; o, UTP. Die injizierten Mengen einzelner Substanzen variierten zwischen 50 und 1500 pMol. InsP wurde in einer Menge von 5 nMol injiziert.

Fig. 4:
ANALYSE VON POLYPHOSPHOVERBINDUNGEN LEBENDER ZELLEN DURCH HPLC MIT METALL-INDIKATOR-DETEKTION.

Säulentyp und Elutionsprotokoll waren wie für Abb. 3 beschrieben, außer daß hier der letzte Teil des Gradienten etwas steiler war. Die Absorption wurde bei 546 nm (5 mm opt. Weglänge) gemessen, die Balken geben 0,01 Absorptionseinheiten an.

(A) Analyse von Perchlorsäureextrakten von normoxem und anoxem Vogelblut. Heparinisiertes Vollblut einer Hausgans wurde bei 40°C in einem Tonometer gegen eine feuchte Gasphase aus 5% CO₂, 75% N₂ und
20% O₂ bzw. 5% CO₂ und 95% N₂ für 2 Stunden equilibriert. Neutralisierte Perchlorsäureextrakte aus jeweils 30 µl Vollblut wurden injiziert. Die identifizierten Verbindungen sind mit denselben Abkürzungen wie in Abb. 3 verwendet markiert.

(B) Analyse der Nicht-Nucleotid-Phosphoverbindungen von Thrombozyten im unstimulierten Zustand (unteres Chromatogramm) und 2 min nach Zugabe von einer Einheit Thrombin/ml (oberes Chromatogramm). Jeweils 30 mg gepackter Zellen wurden Perchlorsäure-extrahiert, zur Entfernung von Nucleotiden kohlebehandelt und schließlich zur Entfernung der Salze des Suspensionsmediums auf kleinen Anionenaustauschersäulen Festphasen extrahiert. Das mit gestrichelter Linie eingezeichnete mittlere Chromatogramm stammt von einer Standardmischung aus 1 nMol ATP, 1 nMol Ins(1,4)P₂, 1 nMol 2,3-BPG, 500 pMol Ins(1,4,5)P₃, 500 pMol Ins(1,3,4,5)P₄, and 500 pMol Ins(1,4,5,6)P₄.

Fig. 5
METALL-INDIKATOR-DETEKTION VON HPLC-CHROMATOGRAPHISCH GETRENNTEN POLYPHOSPHATEN.

Die Chromatographie wurde ähnlich wie für Abb. 2 beschrieben durchge führt. Als Detektorkation wurde Lanthan verwendet. Die hierdurch erreichbare Detektionsempfindlichkeit ist etwa 1/5 derjenigen von YCl₃. Die Elutionsmittel A und B enthielten 18 bzw. 28 µM LaCl₃, das Detektionsreagens enthielt 500 µM PAR. Injiziert wurden: Pi, 5 nMol; PPi, 5 nMol, Trimetaphosphat, 2,5 nMol; Tetrapolyphosphat, 4 nMol; Pentapolyphosphat, 1 nMol. Der Balken zeigt eine Absorption von 0,01 bei 546 nm (5 nm opt. Weglänge) an.

Fig. 6
METALL-INDIKATOR-DETEKTION VON AUF HPTLC-DUNNSCHICHTPLATTEN GETRENNTEN NUCLEOTIDEN UND ANDEREN PHOSPHOVERBINDUNGEN.

Siehe Text zu Beispiel III für den HPTLC-Trägertyp, die Laufbedingungen und die Durchführung der Detektion. Mittels Metall-Indikator-Detektion identifizierte Substanzflecke für Nucleotide waren jeweils identisch mit den durch Quenchung der UV-Fluoreszenz identifizierten (punktiert). Aufgetragen wurden (jeweils 1 nMol Substanz): 1, ATP; 2, ADP; 3, AMP; 4, GTP; 5, GDP; 6, GMP; 7, UTP; 8, UMP; 9, Pi; 10, PPi; 11, Ins(1,4)P₂; 12, Ins(1,4,5)P₃.

Claims

1. Verfahren zur komplexometrischen Detektion und quantitativen Bestimmung von Oxyanionen/Polyanionen mit bis zu Picomol- Empfindlichkeit dadurch gekennzeichnet, daß man

a) die Komplexbildung von Oxyanionen/Polyanionen beliebiger Struktur mit mehrwertigen Kationen, insbesondere zwei- oder höherwertigen Metallen oder Übergangsmetallen, Scandium, Yttrium, Lanthaniden oder Actiniden als Detektionsprinzip (Detektorkation!) zugrunde legt,
b) diese Komplexbildung mittels eines kationenspezifischen Farbstoffes, oder Fluorophors, oder eines andersartigen sog. Kationenindikators (Beispiele: Murexid, Tetramethylmurexid, Pyridylazo-Resorcinol, Chlortetracyclin, Antipyrylazo, Quin, Fura, Indo, Kronenverbindungen) über die Veränderung von Absorption, Fluoreszenz, oder einer anderen Eigenschaft des entsprechenden Kationenindikators verfolgt,
c) die nach a) und b) bezeichneten Prinzipien derart zu einem ternären Detektionsprinzip kombiniert, daß hiermit eine hochsensitive, quantitative Nachsäulendetektion von flüssigkeitschromatographisch getrennten Oxyanionen/Polyanionen beliebiger Struktur ermöglicht wird,
d) die nach a) und b) bezeichneten Prinzipien derart zu einem ternären Detektionsprinzip kombiniert, daß hiermit eine semiqantitative Detektion von chromatographisch oder elektrophoretisch auf Dünnschichtträgern getrennten Oxyanionen/Polyoxyanionen mittels Sprüh oder Tauchreagens ermöglicht wird.
e) die nach a) und b) bezeichneten Prinzipien derart zu einem ternären Detektionsprinzip kombiniert, daß hiermit ein hochsensitives, quantitatives photometrisches oder fluorimetrisches Verfahren zur Bestimmung von Oxyanionen/Polyanionen aus Einzelproben ermöglicht wird.

2. Verfahren nach Anspruch 1c), dadurch gekennzeichnet, daß man eine analytische Auftrennung von Oxyanionen/Polyanionen, auf Anionenaustauschermaterialien jedweder Strukur in Trennsäulen jedweder Art bei beliebigen Drücken durchgeführt, mit einer Detektion nach dem erfindungsgemäßen Verfahren in einer der folgenden Varianten kombiniert:

a) Elutionsmittel mit beliebigem pH-Wert, vorzugsweise unter pH 5, enthält das Detektorkation. Nach der Trennsäule kontinuierliche Zumischung von Kationenindikator und, vorzugsweise bei saurem Elutionsmittel, von Puffer, eingestellt auf pH-Wert über 5, vorzugsweise über 8, dessen Kapazität so bemessen ist, daß sich ein stabiler, höherer pH-Wert einstellt. Detektion entsprechend dem verwendeten Kationenindikator durch Absorptions-, Fluoreszenz-, oder anderes adäquates Detektorsystem.
b) Elutionsmittel mit beliebigem pH-Wert enthält weder Detektorkation noch Kationenindikator. Nach der Trennsäule kontinuierliche Zumischung sowohl des Detektorkations als auch des Kationenindikators jeweils einzeln oder als Gemisch, und, bei saurem Elutionsmittel, von Puffer mit pH-Wert über 5, vorzugsweise über 8, in genügender Kapazität. Detektion wie unter a).
c) Elutionsmittel mit beliebigem pH-Wert enthält den Kationenindikator. Nach der Trennsäule kontinuierliche Zumischung des Detektorkations, und, bei saurem Elutionsmittel von Puffer mit pH-Wert über 5, vorzugsweise über 8, in genügender Kapazität. Detektion analog a).

3. Verfahren nach Anspruch 1c), dadurch gekennzeichnet, daß man eine chromatographische Auftrennung von Oxyanionen/Polyanionen im analytischen Maßstab mittels des Prinzips der Ionenpaarchromatographie, auf beliebiger hydrophober stationärer Phase mit beliebigem Ionenpaar- Reagens durchgeführt, mit dem erfindungsgemäßen Detektionsverfahren unter einer der in Anspruch 2a) bis c), genannten Varianten kombiniert.

4. Verfahren nach Anspruch 1c), dadurch gekennzeichnet, daß man im analytischen Maßstab eine Trennung von Polyanionen/Oxyanionen nach dem Prinzip der Adsorptionschromatographie, der Verteilungschromatographie, der Ionenausschlußchromatographie, der hydrophoben Chromatograpie, der Gelfiltration, der isoelektrischen Fokussierung oder einer anderen flüssigkeitschromatographischen Technik durchführt und mit dem erfindungsgemäßen Detektionsverfahren in einer der bei Anspruch 2 genannten Varianten a) bis c) kombiniert.

5. Verfahren nach Anspruch 2, 3 oder 4, dadurch gekennzeichnet, daß man die genannte chromatographische Auftrennung von Oxyanionen/ Polyanionen im halbpräparativen oder präparativen oder großtechnischen Maßstab unter Verwendung entsprechend dimensionierter Säulen und entsprechend geeigneter Säulenmaterialien jedweder Struktur durchführt, und von einem vom Eluat mit konstanter Flußrate abgezweigten Volumenanteil eine kontinuierliche Detektion nach dem erfindungsgemäßen Verfahren entsprechend einer der in Anspruch 2a) bis c) bezeichneten Varianten durchführt.

6. Verfahren nach Anspruch 1d), dadurch gekennzeichnet, daß man nach einer chromatographischen oder elektrophoretischen Auftrennung von Oxyanionen/Polyanionen auf Papier, Folie, Dünnschichtgel oder Dünnschichtplatten jedweder Beschaffenheit deren Detektion durch die Verwendung eines Sprühreagens durchführt, welches Detektorkation, Kationenindikator und, bei sauren pH-Werten von Laufmittel bzw. Elektrophoresepuffer, Puffer mit einem pH-Wert über 5, vorzugsweise über 8, enthält; oder, in dem man ein entsprechendes Reagens verwendet, das nur eine der beiden für die Detektion nötigen Komponenten enthält und die andere Komponente ins Laufmittel bzw. den Elektrophoresepuffer einbringt.

7. Verfahren nach Ansprüchen 1 mit 7, bei welchen mehrere Detektor kationen oder Kationenindikatoren gleichzeitig oder andere als die bei den Ansprüchen 1a) und 1b) beispielhaft angegebenen Detektorkationen und Kationenindikatoren angewendet werden oder bei denen abweichende Bedingungen verwendet werden, das Detektionsprinzip jedoch dem in Anspruch 1 erläuterten ternären Prinzip grundsätzlich entspricht.