DE1598589C - Verfahren zum chromatographischen Trennen einer Mischung von Verbindungen mit koordinativen Gruppen - Google Patents

Description

Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zum chromatographischen Trennen einer Mischung von Verbindungen mit koordinaten Gruppen, die mit schwachbasischen Metallionen Komplexverbindungen bilden, mit Hilfe einer Ionenaustauschersäule.

Als zu trennende Verbindungen kommen insbesondere Aminosäuren, Amine und organische Säuren in Frage.

Als bekanntes Verfahren zur Trennung von Aminosäuren auf chromatographischem Wege wird allgemein das Ionenaustauschverfahren angewandt. Bei diesem Verfahren werden die Unterschiede der Verteilerkoeffizienten der verschiedenen Aminosäuren an einem Kationenaustauscherharz ausgenutzt; diese Koeffizienten hängen hauptsächlich vom Dissoziationsgrad der Carboxylgruppen der Aminosäuren ab. Die Unterschiede der Verteilungskoeffizienten bedingen unterschiedliche Wanderungsgeschwindigkeiten der einzelnen Aminosäuren, so daß diese an einer lonenaustauscherharzsäule voneinander getrennt werden können.

Nun ist jedoch der Unterschied der Dissoziationsgrade zwischen den einzelnen Aminosäuren und insbesondere zwischen sauren oder neutralen Aminosäuren, insbesondere zwischen Glycin und Alanin nicht sehr groß. Demgemäß erfordert ihre Trennung nicht nur eine lange und große Säule, sondern auch Veränderungen der Arbeitsbedingungen wie der Säulentemperatur und der Elutionslösung im Rahmen einer Trennoperation. Die lonenaustauschertrennung hat daher Nachteile, die insbesondere darin bestehen, daß sie

ίο kompliziert und die Trenndauer sehr lang ist und daß man eine komplizierte, große Apparatur verwenden muß.

Die durch Ionenaustausch voneinander getrennten Aminosäuren werden im allgemeinen kolorimetrisch unter Verwendung von Ninhydrin bestimmt. So werden beispielsweise α-Aminosäuren nach Umsetzung mit Ninhydrin über die Lichtabsorption beim Absorptionsmaximum von Ruhemanns-Purpur nachgewiesen. Diese Arbeitsweise hat jedoch den Nachteil, daß die Farbreaktion eine Erwärmung erfordert und daß weiterhin das Ninhydrin-Reagenz an einer gekühlten, dunklen Stelle unter Luftabschluß aufbewahrt werden muß.

Ziel der Erfindung ist daher ein chromatographisches Verfahren, bei dem die vorstehenden Nachteile weitgehend vermieden werden. Dabei soll insbesondere die Trenndauer für Aminosäuren in der Säule verkürzt, zur Vereinfachung der Gesamtapparatur die bisher erforderliche Erwärmung für die Farbentwicklung beim Nachweis der getrennten Aminosäuren vorzugsweise vermieden und die Reproduzierbarkeit der Analysenergebnisse verbessert werden. Diese Aufgabe wird bei dem Verfahren der eingangs genannten Art erfindungsgemäß dadurch gelöst, daß die Ionenaustauschersäule mit für die Komplexbildung geeigneten schwachbasischen Metallionen beladen und die zu trennende Mischung auf die so vorbehandelte Säule gegeben wird, und daß als Elutionslösung eine Lösung verwendet wird, in der die gleichen wie an der Ionenaustauschersäule angelagerten Metallionen in einer Konzentration enthalten sind, die mit dem Metallionengehalt der Säule im Gleichgewicht steht.

Es wurde nämlich gefunden, daß eine Verkürzung der Trenndauer dadurch erreicht wird, wenn gemäß der Erfindung eine Harzsäule »in Metallsalzform« verwendet wird, d. h. eine Säule, die mit schwachbasischen Metallionen, wie insbesondere Ni²⁺, Cu²⁺, Co²⁺, Cd²⁺, Hg²⁺, Zn²⁺, La³⁺ oder Y³⁺ beladen ist, die mit koordinativ wirksamen Verbindungen bzw. Verbindungen mit koordinativen Gruppen Komplexverbindungen bilden. Mischungen von Verbindungen mit koordinativen Gruppen können dann an dieser Säule auf Grund der unterschiedlichen »Komplexbildungskräfte« der einzelnen Komponenten aufgetrennt und die von der Säule getrennt abgegebenen Probenkomponenten durch ein Nachweissystem geleitet bzw. kontinuierlich bestimmt werden.

Als Ionenaustauscher wird insbesondere ein lonenaustauscherharz mit Sulfonsäure-, Carbonsäure- oder Iminodiessigsäuregruppen verwendet.

Bei einer solchen Trennung über die Bildung von Komplexverbindungen ist es nunmehr möglich, die bei Aminosäuren übliche Erwärmung für den Nachweis der Komponenten zu vermeiden, und zwar durch Verwendung eines Reagenz, das mit dem gebundenen Metallion der Komplexverbindung eine farbige Substanz bildet, deren Konzentration über Lichtabsorptionsmessungen bestimmt werden kann.

Das erfindungsgemäße Trennverfahren ist also kein übliches Ionenaustauschverfahren, sondern es wird für die Trennung eine Komplexbildung herangezogen, bei der die zu trennenden Komponenten als »Komplexbildner« wirken und die an einer Harzsäule in »Metallsalzform« stattfindet, wobei eine größere Selektivität und raschere Trennung erreicht wird.

Diese Art der Trennung unterscheidet sich grundsätzlich von der bekannten Ionenaustauschchromatographie unter Verwendung von Komplexbildnern zur Steigerung der Selektivität, wie sie z. B. aus »Ionenaustausch-Chromatographie« von K. Dorfner, S. 15 bis 17, bekannt ist. Bei dieser bekannten Trennung werden. Kationen wie z. B. Na^f und K+ in üblicher Weise an einem Kationenaustauscher getrennt, wobei allerdings für die Elution ein Komplexbildner — im angegebenen Fall die Uramildiessigsäure — verwendet wird. Es handelt sich dabei also um einen Ionenaustausch, bei dem die zu trennenden Komponenten wie gewohnt als — allerdings komplexe — Gegenionen zum Austauscher wirken. Erfindungsgemäß findet dagegen eine Trennung von Komplexbildnern unter Verwendung einer lonenaustauschersäule statt, die mit Metallionen beladen ist, die als Gegenionen wirken, und für die Elution wird eine Metallionen enthaltende Lösung verwendet, wobei sich die zu trennenden Komponenten zwischen Gegenion und Lösungsion verteilen.

Daß Verbindungen mit koordinativen Gruppen und insbesondere Aminosäuren mit Metallionen Komplexe bilden, war selbstverständlich bekannt. Eine solche Komplexbildung würde aber bei der chromatographischen Trennung solcher Verbindungen mehr als Störung empfunden, die auszuschalten man bestrebt war (s. E. Lederer, »Chromatography«, S. 122).

Durch das erfindungsgemäße Verfahren wird nicht nur die Trenndauer verkürzt, sondern Änderungen von Säulentemperatur und Elutionslösung im Rahmen der Trennoperation sind nicht mehr erforderlich, und es können kleinere Trennsäulen verwendet werden. Demgemäß ist die Apparatur zur Durchführung des Verfahrens einfacher und kleiner.

Weiterhin ermöglicht die Harzsäule in Metallsalzform gemäß der Erfindung nicht nur eine Trennung von Aminosäuren, sondern auch von Aminen, organischen Säuren u.dgl., das heißt von Verbindungen mit koordinativen Gruppen, die zu einer Komplexbildung mit schwachbasischen Metallionen befähigt sind. Dabei ist zu bemerken, daß die Bezeichnung »schwachbasische Metalle«, wie sie hier gebraucht wird, die Alkalimetalle nicht mit einschließt, die auf Grund ihrer hohen Basizität kaum Komplexverbindungen mit Probenkomponenten mit koordinativen Gruppen bilden.

Gemäß der Erfindung verlassen die Probenkomponenten die in Metallsalzform verwendete Harzsäule als Komplexverbindungen jeweils in einem bestimmten Anteil zur Gesamtmenge gemäß dem Gleichgewicht der Komplexbildungsreaktion, die vom pH-Wert der Elutionslösung, der Ionenstärke und der Konzentration des schwachbasischen Metallions usw. abhängt. Die aus der Säule austretenden Probenkomponenten können indirekt kolorimetrisch durch Farbentwicklung am gebundenen Metallion der Komplexverbindung nachgewiesen werden.

Für die Farbbildungsreaktion mit einem schwachbasischen Metallion werden verschiedene Reagenzien verwendet, wie 2-Carboxy-2-hydroxy-5'-formazylbenzol, Xylenolorange oder Pyrocatecholviolett. Diese Reagenzien erfordern keinerlei Erwärmung für die Farbbildungsreaktion, die sie mit einem schwachbasischen Metallion eingehen. Wegen ihrer chemischen Stabilität erfordern diese Reagenzien weder den Ausschluß von Luft noch die Aufbewahrung an einem dunklen, kalten Ort.

Selbstverständlich können in Verbindung mit der in Metallsalzform verwendeten Harzsäule konventionelle Nachweisverfahren mit Einsatz von Ninhydrin ebenfalls angewandt werden; es ist dann jedoch für die Farbentwicklung eine Erwärmung erforderlich.

Gemäß einer Besonderheit der Erfindung wird eine Elutionslösung verwendet, die das gleiche Metallion enthält, wie an der Säule fixiert ist, und zwar in einer Konzentration, die mit dem angelagerten lon im Gleichgewicht steht. Wenn die Elutionslösung nicht das gleiche wie an der Harzsäule angelagerte Metallion enthält, bewirkt die in die Säule zufließende EIutionslösung eine Elution des am Ionenaustauscherharz angelagerten Metallions gemäß dem Verteilungsgleichgewicht zwischen lonenaustauscherharz und Lösung, das vom pH-Wert und der Zusammensetzung der Lösung abhängt, und der Gehalt an angelagertem Ion nimmt ab. Dadurch wird die Reproduzierbarkeit der Analysenergebnisse herabgesetzt.

Die Abnahme der angelagerten Metallionen, die derjenigen der Austauschkapazität bei üblichen Ionenaustauschverfahren entspricht, beschleunigt die Elution von Probenkomponenten übermäßig, so daß keine reproduzierbaren Analysenergebnisse erhalten werden. Bei Zusatz des gleichen Metallions zur Elutionslösung in der vorstehend angedeuteten Weise wird jedoch der Gehalt an angelagerten Metallionen nicht vermindert, und zwar selbst dann nicht, wenn die Lösung über längere Zeiten hinweg durch die Säule geleitet wird, so daß jederzeit reproduzierbare Ergebnisse erwartet werden können.

Das Verfahren gemäß der Erfindung wird an Hand der Zeichnungen näher erläutert; es zeigt

F i g. 1 eine schematische Zusammenstellung eines automatischen Flüssigkeitschromatographen und

F i g. 2 bis 6 verschiedene Chromatogramme, die unter Verwendung des automatischen Flüssigkeits-Chromatographen gemäß F i g. 1 bei der Trennung von sauren und neutralen Aminosäuren oder auch basischen Aminosäuren erhalten wurden.

Der in F ig. 1 angedeutete Flüssigkeits-Chromatograph umfaßt eine Harzsäule 1 in Metallsalzform,

d. h. eine Säule mit einem lonenaustauscherharz mit Sulfonsäuregruppen, Carbonsäuregruppen oder Iminodiessigsäuregruppen, an dem ein schwachbasisches Metallion, wie Ni²+, Cu²⁺, Co²⁺, Cd²⁺, Hg²⁺-, Zn²⁺, La³⁺ oder Y³⁺, fixiert ist.

Das obere Ende der Säule 1 ist über einen Anschlußaufsatz 18 und eine Pumpe 2 für die Zufuhr der Elutionslösung mit einem Behälter 3 für diese Lösung verbunden, und das untere Ende der Säule 1 steht mit einem Nachweissystem mit Reaktionsraum 5, Fotometer 6, Schreiber bzw. Registriervorrichtung 7 und Zufuhrpumpe 8 für eine Farbentwicklungslösung in Verbindung. Die Pumpe 8 ist an die Verbindungsleitung zwischen dem Reaktionsraum 5 und dem unteren Ende der Säule 1 angeschlossen und mit einem Behälter 9 für die Farbentwicklungslösung verbunden. Der Reaktionsraum 5 ist mit einer Mischschlange 10 und einem Heizbad 11 versehen. Das Fotometer 6 umfaßt eine Lichtquelle bzw. Lampe 12, eine Koiideu-

5 . 6

sorlinse 13, ein Filter 14, eine Durchftußzelle 15 und verwendet. Die Temperatur des Heizbades 11 lag koneinen Detektor 16. Die Säule 1 hat einen Doppel- stant bei 100⁰C. Die Lichtabsorption wurde bei einer mantel 17 zum Durchleiten von.warmem Wasser. Wellenlänge von 570 ιτιμ (bzw. von 440 ΐημ für Prolin

Bei der vorstehend angegebenen Anordnung wird die und Oxyprolin) gemessen.

Elutionslösung des Behälters 3 der Säule 1 in einer be- 5 In F i g. 2 ist längs der Abszisse die Elutionszeit in

stimmten Menge durch die Pumpe 2 zugeleitet und eine Stunden und längs der Ordinate die Lichtabsorption

Probe mit Komponenten mit koordinativen Gruppen (des »entwickelten« Effluenten) aufgetragen. Das gleiche

in den oberen Teil der Säule 1 eingebracht, und zwar gilt für die F i g. 3 bis 6.

mit Hilfe einer Pipette nach Entfernen des Anschluß- Wie F i g. 2 zeigt, wurden elf Aminosäuren in etwa

aufsatzes 18. . io 4 Stunden vollständig voneinander getrennt. Bei Alanin

Nach dem Wiederanschließen des Aufsatzes 18 wird und Glycin und bei Glutaminsäure und Asparagin-

die im Behälter 3 enthaltene Elutionslösung mit der säure stimmt die Elutionsreihenfolge mit der nach den

Pumpe 2 in einer bestimmten Menge in die Säule 1 in wäßriger Lösung erhaltenen Stabilitätskonstanten

eingespeist. Durch die unterschiedlichen Wanderungs- voraussehbaren Reihenfolge überein. Bei dem ge-

geschwindigkeiten der Probenkomponenten auf Grund 15 bräuchlichen Ionenaustauschverfahren wird Glycin vor

der unterschiedlichen Stabilität der Komplexe mit den Alanin eluiert, während bei Verwendung einer. Harz-

im wesentlichen (substantially) am Ionenaustauscher- säule in Nickelsalzform Glycin, das eine relativ stabile

harz der Säule 1 angelagerten schwachbasischen Komplexverbindung bildet, nach Alanin von der Säule

Metallionen bzw. der unterschiedlichen Komplex- abgegeben wird.

bildungskräfte werden diese voneinander getrennt und 20 Das gleiche gilt für die Elutionsreihenfolge von Glut-

nacheinander vom unteren Ende der Säule 1 abgegeben. aminsäure und Asparaginsäure. Wie an Hand der

Die Farbentwicklungslösung des Behälters 9 wird mit Stabilitätskonstanten vorauszusehen war, folgt die ψ.

Hilfe der Pumpe 8 in bestimmter zeitlicher Menge dem Asparaginsäureelution der Glutaminsäureelution. . ^- &

Reaktionsraum 5 zusammen mit den getrennt vom Wenn die gleichen Bedingungen, wie im Beispiel 1

unteren Ende der Säule 1 eluierten Probenkomponen- 25 angegeben, angewandt werden, jedoch kein Ni²⁺ am

ten zugeleitet. In diesem Reaktionsraum werden die lonenaustauscherharz angelagert und ebenso nicht zur

Probenkomponenten mit der Farbentwicklungslösung Elutionslösung zugegeben wird, werden die vorstehend

mit Hilfe der Mischschlange 10 gut durchgemischt und angegebenen elf Aminosäuren nicht voneinander ge-

gegebenenfalls zur Farbentwicklung durch das Heizbad trennt und nahezu gemeinsam (»als ein Peak«) eluiert.

11 aufgeheizt. 30 Das zeigt, daß die vorliegende Erfindung von dem übli-

Die aus' der Farbentwicklungszone austretende cherweise als Trennverfahren angewandten Ionen-Lösung wird zur kontinuierlichen Bestimmung der austauschverfahren deutlich verschieden ist.
Lichtabsorption zum Fotometer 6 geleitet. Dabei wer- Es wird bemerkt, daß die gleiche Komplexbildungsden im einzelnen die von einer Lichtquelle 12 her- reaktion ebenfalls in der Elutionslösung stattfindet, da kommenden Strahlen durch eine Kondensorlinse 13 35 das gleiche Ni²⁺-Ion der Lösung zur Konstanthaltung gesammelt und mit einem Filter 14 in ein gewünschtes des Gehaltes des am Harz angelagerten Ni²⁺-Ions zugemonochromatisches Licht verwandelt. Dieses mono- setzt ist. Infolge der hohen Konzentration der angelachromatische Licht durchsetzt die Durchflußzelle 15 gerten Ni²⁺-Ionen, die etwa 200mal so hoch ist wie und wird dabei durch die in der Lösung gebildeten diejenige der Elutionslösung unter den für die Herfarbigen Verbindungen (teilweise) absorbiert und ge- 40 stellung des Chromatogramms gemäß F i g. 2 angelangt dann zum Detektor 16, der ein der Lichtabsorp- wandten Bedingungen, werden jedoch die Wandetion entsprechendes Signal abgibt, das vom Schreiber 7 rungsgeschwindigkeiten der einzelnen Aminosäuren registriert wird. Auf diese Weise wird ein den Proben- hauptsächlich durch die koordinativen Kräfte zwi- .; komponenten entsprechendes Chromatogramm auf sehen den angelagerten Ni²Monen und den einzelnen . ·/.' dem Registrierpapier des Schreibers 7 aufgezeichnet. 45 Aminosäuren bestimmt bzw. beherrscht, d. h. mit ^

. , _ anderen Worten durch die Stabilität als Komplex-

^BeisP^ie11 verbindung.

F i g. 2 zeigt ein Chromatogramm der sauren und B e i s d i e 1 2
neutralen Aminosäuren Glutaminsäure, Asparaginsäure (aspartic acid), Prolin, Alanin, Oxyprolin, Valin, 5° F i g. 3 zeigt ein Chromatogramm von sauren und Isoleucin, Glycin, Serin und Methionin, das mit dem neutralen Aminosäuren, das unter Verwendung des in in F i g. 1 gezeigten automatischen Flüssigkeits- F i g. 1 gezeigten automatischen Flüssigkeitschromatochromatographen erhalten wurde. Die Gesamtmenge graphen erhalten wurde und die Aminosäuren Taurin der Probe mit etwa 0,5 μΜ von jeder der Aminosäuren (taurine), Glutaminsäure, Asparaginsäure, Prolin, betrug 0,5 ml. . 55 Alanin, Valin, Norleucin (n-leucine),· Leucin (alloleu-

AIs lonenaustauscherharz wurde ein Harz vom eine), Methionin, Threonine, Oxyprolin und Serin Sulfonsäuretyp verwendet. Als Elutionslösung diente zeigt. Als Ionenaustauscherharz wurde ein Harz vom eine Natriumacetat-Essigsäure-Pufferlösung von pH6,0 schwachsauren Carbonsäuretyp verwendet. Als EIumit 0,2 Mol/l Na⁺ und 10~³ Mol/l Ni²⁺. Mit dieser tionslösung diente eine Natriumacetat-Essigsäurewurde das Harz zur Herstellung der Metallsalzform so 60 Pufferlösung von pH 6,0 mit 0,7 Mol/l Na⁺ und lange behandelt bzw. »ins Gleichgewicht gesetzt«, bis 10~⁴ Mol/l Cu²⁺. Als Säule 1 wurde eine Harzsäule in die Ni^2h-Konzentration in der vom unteren Ende der Kupfersalzform verwendet, die ins Gleichgewicht geSäule 1 abfließenden Lösung 1O^-3 Mol/l erreichte. Die setzt wurde, bis die Cu²⁺-Konzentration in der am Säule 1 war 55 cm lang und wurde konstant bei einer unteren Ende der Säule 1 austretenden Lösung Temperatur von 80^uC gehalten. Die Fließgeschwindig- 65 10~⁴ Mol/l erreichte. Die Säulentemperatur lag bei keil der lilutionslösung lag bei 30 ml/Min, und die-, 30^uC, und die Säulenlänge betrug 45cm. Da Cu²··- jcnige der Farbentwicklungslösung bei 15 ml/Min. Als Ionen im Effluenten die Farbbildungsreaktion der Jarbcntwicklungslösung wurde Ninhydrin-Reagcnz Aminosäuren mit Ninhydrin stören, wurde voran-

Beispiel 3

gehend Natrium-äthylendiamintetraacetat in einer Menge von 10~³ Mol/l zum als Farbentwicklungslösung dienenden Ninhydrin-Reagenz zugesetzt, um diese Störung auszuschalten. Die Lichtabsorption wurde bei einer Wellenlänge von 570 πιμ (bzw. bei 5 440 ηψ für Prolin und Oxyprolin) bestimmt. Die übrigen Bedingungen waren die gleichen wie im Beispiel 1. . ■ .

Wie F i g. 3 zeigt, wurden die vorstehend angegebenen zwölf Aminosäuren in etwa 5 Stunden voneinander getrennt. Die Eluierungsreihenfolge von Glutaminsäure und Asparaginsäure sowie von Alanin und Glycin, die ähnlich wie im Beispiel 1 ist, stimmt mit der an Hand der in wäßriger Lösung erhaltenen Stabilitätskonstanten vorauszusehenden Reihenfolge überein.

Die Kupferkomplexe von basischen Aminosäuren, wie Lysdin, Tryptophan, Arginin und Histidin, sind bei pH 6,0 unter den Elutionsbedingungen, bei denen das Chromatogramm gemäß F i g. 3 erhalten wurde, sehr stabil, die Elution dieser basischen Aminosäuren würde so sehr lange dauern. Diese Aminosäuren, wie auch Cystin, können jedoch mit Hilfe einer Säule von 16 cm Länge, die mit einer Elutionslösung von pH 5,0 mit 0,9 Mol/l Na⁺ und 10~⁴ Mol/1 Cu²⁺ behandelt wurde, in etwa 2,5 Stunden, wie F i'g. 4 zeigt, getrennt werden.

Wie man sieht, werden basische Aminosäuren in der Hälfte der Zeit voneinander getrennt, die für das übliche Ionenaustauschverfahren benötigt wird. Auch hier sind wiederum die Eluierungsreihenfolgen, und zwar von Lysin und Tryptophan sowie von Arginin und Histidin im Vergleich zum Ionenaustauschverfahren umgekehrt, was wiederum besagt, daß das erfindungsgemäße Verfahren vom Ionenaustauschverfahren verschieden ist.

35

■ F i g. 5 zeigt ein unter Verwendung des automatischen Flüssigkeitschromatographen gemäß F i g. 1 erhaltenes Chromatogramm der sauren und neutralen Aminosäuren Glutaminsäure, Asparaginsäure, Alanin, Valin, Prolin, Oxyprolin, Isoleucin, Glycin, Serin, Norleucin, Threonin und Methionin.

Als lonenaustauscherharz wurde ein stark saures Harz vom Sulfonsäuretyp verwendet. Als Elutionslösung diente eine Natriumacetat-Essigsäure-Pufferlösung von pH 6,0 mit 0,05 Mol/l Na⁺ und Ip-³ Mol/l Co²⁺. Die Säule 1 war eine Harzsäule in Cobaltsalzform, die durch Behandlung mit der Lösung, bis die Co²⁺-Konzentration in der vom unteren Ende der Säule 1 abgegebenen Elutionslösung 10~³ Mol/l erreichte, erhalten wurde. Die Säule 1 war 55 cm lang, und die Säulentemperatur wurde bei 70^QC konstant gehalten. Die übrigen Bedingungen waren die gleichen wie im Beispiel 1.

Wie F i g. 5 zeigt, wurden die vorstehenden zwölf Aminosäuren in etwa 4 Stunden voneinander getrennt.

Für eine Trennung von mehr als zehn Arten von sauren und neutralen Aminosäuren nach dem üblichen Ionenaustauschverfahren wäre eine sehr lange Säule von 150 cm Höhe erforderlich, und darüber hinaus müßten im Rahmen einer Trennoperation Säulentemperatur und Elutionslösung verändert werden, und die Trennung würde außerdem länger als 10 Stunden dauern. Gemäß der Erfindung kann, wie an Hand der Beispiele 1 bis 3 verständlich ist, eine kurze Säule verwendet werden, und die Trennung kann in größenordnungsmäßig 4 bis 5 Stunden vollständig erreicht werden, und zwar ohne Veränderung der Säulentemperatur oder der Elutionslösung. Daraus folgt, daß die vorliegende Erfindung, die vom Ionenaustauschverfahren deutlich verschieden ist, eine einfache Trennmöglichkeit bietet, wie auch die Verwendung einer vereinfachten und verkleinerten Apparatur.

Beispiel 4

F i g. 6 zeigt ein mit dem automatischen Flüssigkeitschromatographen gemäß F i g. 1 erhaltenes Chromatogramm von Glutaminsäure, Alanin und Glycin. Dabei wurde eine Gesamtprobenmenge von 0,5 ml verwendet mit 0,5 μπι von jeder Aminosäure.

Als lonenaustauscherharz wurde ein schwach saures Harz vom Carbonsäuretyp verwendet. Als Elutionslösung diente eine Natriumacetat-Essigsäure-Pufferlösung von pH 6,0 mit 0,2 Mol/l Na⁺ und IO-⁴ Mol/l Cu²⁺. Die Säule 1 war eine Säule in Kupfersalzform, die mit der Lösung behandelt worden war, bis die Cu²⁺-K onzentration in der vom unteren Ende der Säule 1 abgegebenen Elutionslösung IO"⁴ Mol/l erreichte. Die Säulentemperatur wurde bei 25 ⁰C konstant gehalten, und die Säulenlänge betrug 15,8 cm. Die Fließgeschwindigkeit der Elutionslösung lag bei 30 ml/Min, und diejenige der Farbentwicklungslösung bei 15 ml/Min. Als Farbentwicklungslösung wurde an Stelle von Ninhydrin-Reagenz 2-Carboxy-2-hydroxy-5'-formazylbenzol in 50% Alkohol verwendet, das mit den Cu²⁴"-Aminosäureverbindungen der Elutionslösung eine Farbreaktion eingeht. Die Absorptionswellenlänge lag bei 600 πιμ.

F i g. 6 zeigt den Verlauf der Absorption des Effluenten. Die Farbreaktion erfordert im Gegensatz zur Farbbildung mit Ninhydrin keine Wärmebehandlung, und die Farbentwicklungslösung ist chemisch sehr stabil, so daß weder der Ausschluß von Luft noch eine kühle und dunkle Aufbewahrung erforderlich ist.

Als Reagenzien dieser Art können ähnlich verschiedene weitere Verbindungen verwendet werden, wie etwa Xylenolorange oder Pyrocatecholviolett.

B e i s ρ i e 1 5

Die nachfolgende Tabelle zeigt Daten für die Reproduzierbarkeit der Analysenergebnisse, die mit Hilfe des automatischen Flüssigkeitschromatographen gemäß F i g. 1 mit Alanin, Glycin und Serin erhalten wurden.

Versuch Nr.	Alanin	Glycin	Serin
1	1,26	1,70	2,27
2	1,23	1,72	2,23
3	1,24	1,75	2,25
4	1,23	1,67	2,26

Als lonenaustauscherharz wurde dabei ein schwachsaures Harz vom Carbonsäuretyp verwendet. Als Elutionslösung diente eine Natriumacetat-Essigsäure-Pufferlösung von pH 6,0 mit' 0,5 Mol/l Na⁺ und ΙΟ"⁴ Mol/l Cu²⁺. Die Säule 1 war eine Harzsäule in Kupfersalzform, die ins Gleichgewicht gesetzt wurde, bis die Cu²⁺-Konzentration in der vom unteren Ende der Säule abgegebenen Elutionslösung 1O^-4 Mol/l erreichte. Die Säulenlänge betrug 16,5 cm und die Säulentemperatur wurde bei 25° C konstant gehalten. Die Fließgeschwindigkeit der Elutionslösung lag bei 30 ml/Min. und die der Farbentwicklungslösung bei 15 ml/Min. Da die Farbreaktion von Aminosäuren mit

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Ninhydrin durch die Anwesenheit von Cu²⁺ in der Elutionslösung gestört wird, wurde als Farbentwicklungslösung ein Ninhydrin-Reagenz verwendet, dem Natrium-äthylendiamintetraacetat zugesetzt worden war. Die Lichtabsorption wurde bei einer Wellenlänge von 570 ΐημ bestimmt. Die Gesamtprobenmenge von 0,5 ml enthielt 0,5 μΜ von jeder Aminosäure. Die in der Zusammenstellung für Alanin, Glycin und Serin angegebenen Zahlehwerte sind die Elutionszeiten in Stunden.

10

An Hand der vorstehenden Angaben ist es verständlich, daß die Zugabe des gleichen Cu²⁺-Ions zur Elutionslösung in einer Konzentration von 10~⁴ Mol/l, wie sie zur Herstellung des Gleichgewichts der am Harz angelagerten Cu²⁺-Ionen verwendet wird, den Gehalt an angelagerten Ionen ständig konstant hält, so daß dieser auch dann konstant bleibt, wenn die Elutionslösung über eine längere Zeit hinweg durch die Säule 1 vom Kupfersalztyp geleitet wird; auf diese Weise können reproduzierbare Ergebnisse erhalten werden.

Hierzu 1 Blatt Zeichnungen

Claims (5)

Patentansprüche:

1. Verfahren zum chromatographischen Trennen einer Mischung von Verbindungen mit koordinativen Gruppen, die mit schwach basischen Metallionen Komplexverbindungen bilden, mit Hilfe einer Ionenaustauschersäule, dadurch gekennzeichnet, daß die Ionenaustauschersäule mit für die Komplexbildung geeigneten schwachbasischen Metallionen beladen und die zu trennende Mischung auf die so vorbehandelte Säule gegeben wird und daß als Elutionslösung eine Lösung verwendet wird, in der die gleichen wie an der Ionenaustauschersäule angelagerten Metallionen in einer Konzentration enthalten sind, die mit dem Metallionengehalt der Säule im Gleichgewicht steht.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß als schwachbasische Metallionen die Ionen von Nickel, Kupfer, Kobalt, Cadmium, Quecksilber, Zink, Lanthan oder Yttrium verwendet werden.

3. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß als Füllung der Säule ein Ionenaustauscherharz mit Sulfonsäure-, Carbonsäure- oder Iminodiessigsäuregruppen verwendet wird.

4. Verfahren nach, einem der Ansprüche 1 bis 3 mit zusätzlicher Kontrolle der ausgeführten Trennung durch kontinuierliche Bestimmung der Konzentration der eluierten Komponenten über eine Farbreaktion, dadurch gekennzeichnet, daß dem Eluat für die Farbreaktion ein Reagenz zugesetzt wird, das mit dem gebundenen Metallionen der Komplexverbindung reagiert und die Konzentration in bekannter Weise durch Lichtabsorptionsmessungen bestimmt wird.

5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß als Reagenz für die Farbreaktion 2-Carboxy-2-hydroxy-5'-formazylbenzol, Xylenolorange oder Pyrocatecholviolett verwendet werden.