DE1598589B2

DE1598589B2 - Verfahren zum chromatographischen trennen einer mischung von verbindungen mit koordinativen gruppen

Info

Publication number: DE1598589B2
Application number: DE19671598589
Authority: DE
Inventors: Yoshijiro Hitachi Arikawa (Japan)
Original assignee: Hitachi Ltd
Current assignee: Hitachi Ltd
Priority date: 1967-05-18
Filing date: 1967-05-18
Publication date: 1972-05-31
Also published as: DE1598589A1

Description

Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zum chromatographischen Trennen einer Mischung von Verbindungen mit koordinaten Gruppen, die mit schwachbasischcn Mctallionen Komplexverbindungen bilden, mit Hilfe einer lonenaustauschersäule.

Als zu trennende Verbindungen kommen insbesondere Aminosäuren. Amine und organische Säuren in Trage.

Als bekanntes Verfahren zur Trennung von Aminosäuren auf ehromatographischcm Wege wird allgemein das loncnaustauschvcrfahren angewandt. Bei diesem Verfahren werden die Unterschiede der Verteilerkoeff'izicntcn der verschiedenen Aminosäuren an einem Kationcnaustausclierharz ausgenutzt; diese Koeffizienten hängen hauptsächlich vom Dissoziationsgrad der Carboxylgruppen der Aminosäuren ab. Die Unterschiede der Verteilungskoeffizienten bedingen unterschiedliche Wiindcrungsgcschwincligkcilen der einzelnen Aminosäuren, so daß diese an einer lonenaustaiischerharzsäulc voneinander getrennt werden können.

Nun ist jedoch der Unterschied der Dissoziationsgrade zwischen den einzelnen Aminosäuren und insbesondere zwischen sauren oder neutralen Aminosäuren, insbesondere zwischen Glycin und Alanin nicht sehr groß. Demgemäß erfordert ihre Trennung nicht nur eine lange und große Säule, sondern auch Veränderungen der Arbeitsbedingungen wie der Säulentemperatur und der Elutionslösung im Rahmen einer Trennoperation. Die lonenaustauschertrennung hat daher Nachteile, die insbesondere darin bestehen, daß sie

ίο kompliziert und die Trenndauer sehr lang ist und daß man eine kompliziert·;, große Apparatur verwenden muß.

Die durch Ionenaustausch voneinander getrennten Aminosäuren werden im allgemeinen kolorimetrisch unter Verwendung von Ninhydrin bestimmt. So werden beispielsweise α-Aminosäuren nach Umsetzung mit Ninhydrin über die Lichtabsorption beim Absorptionsmaximum von Ruhemanns-Purpur nachgewiesen. Diese Arbeitsweise hat jedoch den Nachteil, daß die Farbreaktion eine Erwärmung erfordert und daß weiterhin das Ninhydrin-Reagenz an einer gekühlten, dunklen Stelle unter Luftabschluß aufbewahrt werden muß.

Ziel der Erfindung ist daher ein chrornatographisches Verfahren, bei dem die vorstehenden Nachteile weitgehend vermieden werden. Dabei soll insbesondere die Trenndauer für Aminosäuren in der Säule verkürzt, zur Vereinfachung der Gesamtapparatur die bisher erforderliche Erwärmung für die Farbentwicklung beim Nachweis der getrennten Aminosäuren vorzugsweise vermieden und die Reproduzierbarkeit der Analysenergebnisse verbessert werden. Diese Aufgabe wird bei dem Verfahren der eingangs genannten Art erfindungsgemäß dadurch gelöst, daß die lonenaustauschersäule mit für die Komplexbildung geeigneten schwachbasischen Metallionen beladen und die zu trennende Mischung auf die so vorbehandelte Säule gegeben wird, und daß als Elutionslösung eine Lösung verwendet wird, in der die gleichen wie an der lonenaustauschcrsäule angelagerten Metallionen in einer Konzentration enthalten sind, die mit dem Mctallionengehalt der Säule im Gleichgewicht steht.

Es wurde nämlich gefunden, daß eine Verkürzung der Trenndauer dadurch erreicht wird, wenn gemäß der Erfindung eine Harzsäule »in Mctallsalzform« verwendet wird. d. h. eine Säule, die mit schwachbasischen Metallionen, wie insbesondere Ni²". Cu² . Co²". Cd²¹, Hg²'. Zn²". La^3: oder Y³ beladen ist. die mit koordinativ wirksamen Verbindungen bzw. Verbindungen mit koordinativen Gruppen Komplexverbindungen bilden. Mischungen von Verbindungen mit koordinativen Gruppen können dann an dieser Säule auf Grund der unterschiedlichen »Kompicxbildungskräftc'i der einzelnen Komponenten aufgctieir.it und die von der Säule getrennt abgegebenen Probcnkompouentcn durch ein Nachweissystem geleitet bzw. kontinuierlich bestimmt werden.

Als Ionenaustauscher wird insbesondere ein lonenaustauscherharz mit Sulfonsäure-, Carbonsäure- oder Iminodiessigsäuregruppen verwendet.

Bei einer solchen Trennung über die Bildung von Komplexverbindungen ist es nunmehr möglich, die bei Aminosäuren übliche Erwärmung für den Nachweis der Komponenten zu vermeiden, und zwar durch Ver-

fiö wendung eines Reagenz, das mit dem gebundenen Metallion der Komplcwerbindung eine farbige Substanz bildet, deren Konzentration über Lichlabsorplionsmessungen bestimmt werden kann.

Das erfindungsgemäße Trennverfahren ist also kein übliches Tonenaustauschverfahren, sondern es wird für die Trennung eine Komplexbildung herangezogen, bei der die zu trennenden Komponenten als »Komplexbildnero wirken und die an einer Harzsäule in »Metallsalzform« stattfindet, wobei eine größere Selektivität und rascher^ Trennung erreicht wird.

Diese Art der Trennung unterscheidet sich grundsätzlich von der bekannten lonenaustauschchromatographie unter Verwendung von Komplexbildnern zur Steigerung der Selektivität, wie sie z. B. aus '»Ionenaustausch-Chromatographie« von K. Dorfner, S. 15 bis 17, bekannt ist. Bei dieser bekannten Trennung werden Kationen wie z. B. Na^ und K" in üblicher Weise an einem Kationenaustauscher getrennt, wobei allerdings für die Elution ein Komplexbildner — im angegebenen Fall die Uramildiessigsäure — verwendet wird. Es handelt sich dabei also um einen Ionenaustausch, bei dem die zu trennenden Komponenten wie gewohnt als — allerdings komplexe — Gegenionen zum Austauscher wirken. Erfindungsgemäß findet dagegen eine Trennung von Komplexbildnern unter Verwendung einer lonenaustauschertäule statt, die mit Metallionen beladen ist. die als Gegenionen wirken, und für die Elution wird eine Metallionen enthaltende Lösung verwendet, wobei sich tlie zu trennenden Komponenten zwischen Gegenion und Lösungsion verteilen.

Daß Verbindungen mit koordinativen Gruppen und insbesondere Aminosäuren mit Metallionen Komplexe bilden, war selbstverständlich bekannt. Eine solche Komplexbildung würde aber bei der chromatographischen Trennung solcher Verbindungen mehr als Störung empfunden, die auszuschalten man bestrebt v.ar (s. E. L e d e r e r, '»Chromatography". S. 122).

Durch das erfindungsgemäße Verfahren wird nicht nur die Ί renndauer verkürzt, sondern Änderungen von Säulentcmperatur und Elutionslösung im Rahmen der Trennoperation sind nicht mehr erfoiderlich. und es können kleinere Trennsäulen verwendet werden. Demgemäß ist die Apparatur zur Durchführung des Verfahrens einfacher und kleiner.

Weiterhin ermöglicht die Harzsäulc in Metallsalzforin gemäß der Erfindung nicht nur eine Trennung \on Aminosäuren, sondern auch von Ammen, organischcn Säuren u. dgl., das heißt von Verbindungen mit koiirdinaliven Gruppen, die zu einer Komplcxbildunj: mit schwachbasischcn Mclaliioncn befähigt sind. Dabei ist zu bemerken, daß die Bezeichnung •■>ehwachbasische Metalle«, wie sie hier gebraucht wird, die Alkalimetalle nicht mit einschließt, die auf Grund ihrer hohen Basi/ität kaum Komplexverbindungen mit i'robenkomponcntcn mit koordinativen Gruppen Hilden.

Gemäß der Erfindung verlassen die Probcnkoinponcnlcu die in Mctallsal/fonn verwendete Harzsäulc als Komplexverbindungen jeweils in einem bestimmten Anteil zur Gesamtmenge gemäß dem Gleichgewicht der Komplexbildungsreaktion. die vom pH-Wert der Elutionslösung, der loncnstärkc und der Konzentration des schwaJibasischen Metallions usw. abhängt. Die aus der Säule austretenden Probcnkomponcnicn können indirekt kolorimetrisch durch Farbentwicklung am gebundenen jMctallion der Komplcxvcrbindung nachgewiesen werdrn.

Für die Farbbildungsrcaktion mit einem schwachbasischen Mctallion werden verschiedene Reagenzien verwendet, wie 2-Carboxy-2-hydroxy-5 -formazyIbenzol, Xylenolorange oder Pyrocatecholvioleti. Diese Reagenzien erfordern keinerlei Erwärmung für die Farbbildungsreaktion, die sie mit einem schwachbasischen Metallion eingehen. Wegen ihrer chemischen Stabilität erfordern diese Reagenzien weder den Ausschluß von Luft noch die Aufbewahrung an einem dunklen, kalten Ort.

Selbstverständlich können in Verbindung mit der in Metallsalzform verwendeten Harzsäule konventionelle Nachweisverfahren mit Einsatz von Ninhydrin ebenfalls angewandt werden; es ist dann jedoch für die Farbentwicklung eine Erwärmung erforderlich.

Gemäß einer Besonderheit der Erfindung wird eine Elutionslösung verwendet, die das gleiche Metallion enthält, wie an der Säule fixiert ist, und zwar in einer Konzentration, die mit dem angelagerten Ion im Gleichgewicht steht. Wenn die Elutionslösung nicht das gleiche wie an der Harz?.'ale angelagerte Metaliion enthält, bewirkt die in die Säule zufließende Elutionslösung eine Elution des am Ionenaustauscherharz angelagerten Metallions gemäß dem Verteilungsgleichgewicht zwischen lonenaustauscherharz und Lösung, daji vom pH-Wert und der Zusammensetzung der Lösung abhängt, und der Gehalt an angelagertem Ion nimmt ab. Dadurch wird die Reproduzierbarkeit der Analysenergebnisse herabgesetzt.

Die Abnahme der angelagerter. Metallionen, die derjenigen der Austauschkapazität bei üblichen lonenaustauschverfahren entspricht, beschleunigt die Elution von Probenkomponenten übermäßig, so daß keine reproduzierbaren Analysenergebnisse erhalten werden. Bei Zusatz des gleichen Metallions zur Elutionslösung in der vorstehend angedeuteten Weise wird jedoch der Gehalt an angelagerten Metallionen nicht vermindert, und zwar selbst dann nicht, wenn die Lösung über längere Zeiten hinweg durch die Säule geleitet wird, so da(T jederzeit reproduzierbare Ergebnisse erwartet werden können.

Das Verfahren gemäß der Erfindung wird an Hand der Zeichnungen näher erläutert; es zeigt

F i g. 1 eine schematische Zusammenstellung eines automatischen Flüssigkeitschromatographen und

F i g. 2 bis 6 verschiedene Chromatogramme. die unter Verwendung des automatischen Flüssigkeits-Chromatographen gemäß F i g. I bei der Trennung von sauren und neutralen Aminosäuren oder auch basischen Aminosäuren erhalten wurden.

Der in F i g. I. angedeutete Flüssigkeits-Chromatopraph umfaßt eine Harzsäule 1 in Metallsalzforni, d. h. eine Säule mit einem lonenaustauscherhar/. mit Sulfonsäurecruppen. Carbonsäurcg^riippen oder Iminodiessigsäurcgruppcn. an dem ein schwachbasisches Mctallion. wie Ni² . Cu² . Co² . Cd²'. Hg² . Zn²-. La·¹ oder Y³ . fixiert ist.

Das obcrw Ende der Siuilc 1 ist über einen Anschlußaufsatz 18 und eine Pumpe 2 für die Zufuhr der Elutionslösung mit einem Behälter 3 für diese Lösung verbunden, und das untere Ende der Säule 1 steht mit einem Nachweissystem mit Reaktionsraum 5. Fotometer 6. Schreiber bzw. Registriervorrichtung 7 und Zufuhrpumpe 8 für eine Farbcntwicklungslösung in Verbindung. Die Pumpe 8 ist an die Vcrbindungsleitung zwischen dem Reaktionsraum 5 und dem unteren Ende der Säule 1 angeschlossen und mit einem Behälter 9 für die Fi'rbentwicklungslösung verbunden. Der RcaktionsraumS ist mit einer Mischschlange 10 und einem Heizbad 11 versehen. Das Fotometer 6 umfaßt eine Lichtquelle bzw. Lampe 12, eine Konden ■

sorliiise 13, ein Hlter 14. eine DurchfluMzelle 15 und einen Detektor 16. Die Säule 1 hat einen Doppelmantel 17 zum Durchleiten von warmem Wasser.

Bei der vorstehend angegebenen Anordnung wird die Elutionslösung dos Behälters 3 der Säule I in einer bestimmten Menge durch die Pumpe 2 zugeleitet und eine Probe mit Komponenten mit koordinativen Gruppen in den oberen Teil der Säule 1 eingebracht, und zwar mit Hilfe einer Pipette nach Entfernen des Anschlußaufsatzes 18.

Nach dem Wiederanschließen des Aufsatzes 18 wird die im Behälter 3 enthaltene Elutionslösung mit der Pumpe 2 in einer bestimmten Menge in die Säule 1 eingespeist. Durch die unterschiedlichen Wanderungsgeschwindigkeiten der Probenkomponenten auf Grund der unterschiedlichen Stabilität der Komplexe mit den im wesentlichen (substantially) am Ionenaustauscherharz der Säule 1 angelagerten schwachbasischen Metallionen bzw. der unterschiedlichen Komplexbildungskräfte werden diese voneinander getrennt und nacheinander vom unteren Ende der Säule 1 abgegeben.

Die Farbentwicklungslösung des Behälters9 wird mit Hilfe der Pumpe 8 in bestimmter zeitlicher Menge dem Reaktionsraum 5 zusammen mit den getrennt vom unteren Ende der Säule 1 eluierten Probenkomponenten zugeleitet. In diesem Reaktionsraum werden die Probenkomponenten mit der Farbentwicklungslösung mit Hilfe der Mischschlange 10 gut durchgemischt und gegebenenfalls zur Farbentwicklung durch das Heizbad 11 aufgeheizt.

Die aus der Farbentwicklungszone austretende Lösung wird zur kontinuierlichen Bestimmung der Lichtabsorption zum Fotometer 6 geleitet. Dabei werden im einzelnen die von einer Lichtquelle 12 herkommenden Strahlen durch eine Kondensorlinse 13 gesammelt und mit einem Filter 14 in ein gewünschtes monochromatisches Licht verwandelt. Dieses monochromatische Licht durchsetzt die Durchflußzelle 15 und wird dabei durch die in der Lösung gebildeten farbigen Verbindungen (teilweise) absorbiert und gelangt dann zum Detektor 16, der ein der Lichtabsorption entsprechendes Signal abgibt, das vom Schreiber 7 registriert wird. Auf diese Weise wird ein den Probenkomponenten entsprechendes Chromatogramm auf dem Registrierpapier des Schreibers 7 aufgezeichnet.

Beispiel 1

F i g. 2 zeigt ein Chromatogramm der sauren und neutralen Aminosäuren Glutaminsäure, Asparaginsäure (aspartic acid). Prolin, Alanin, Oxyprolin, Valin, Isoleucin, Glycin. Serin und Methionin, das mit dem in F i g. i gezeigten automatischen Flüssigkeitschromatographen erhalten wurde. Die Gesamtmenge der Probe mit etwa 0.5 μΜ von jeder der Aminosäuren betrug 0.5 ml.

Als Ionenaustauscherharz wurde ein Harz vom Sulfonsäuretyp verwendet. Als Elutionslösung diente eine Natriumacetat-Essigsäure-Pufferlösung von pH 6,0 mit 02 MoH Na- und 10"³ Mol/l Ni²-. Mit dieser wurde das Harz zur Herstellung der Metallsalzf orm so lange behandelt bzw. »ins Gleichgewicht gesetzt«, bis die Ni^-Konzentration in der vom unteren Ende der Säule 1 abfließenden Lösung 10~³ Mol/l erreichte. Die Säule 1 war 55 cm lang und wurde konstant bei einer Temperatur von 80"C gehalten. Die Fließgeschwindigkeit der Elutionslösung lag bei 30 ml/Min, und diejenige der Farbentwicklungslösung bei 15 ml/Min. Als Farbentwickhmgslösung wurde Nmhydrin-Reagenz verwendet. Die Temperatur des Heizbades 11 lag konstant bei 100 C. Die Lichtabsorption wurde bei einer Wellenlänge von 570 ηιμ (bzw. von 440 ιημ für Prolin und Oxyprolin) gemessen.

In F i g. 2 ist längs der Abszisse die Elutionszeit in Stunden und längs der Ordinate die Lichtabsorption (des »entwickelten« F.ffluenten) aufgetragen. Das gleiche gilt für die F i g. 3 bis 6.

Wie l· i g. 2 zeigt, wurden elf Aminosäuren in etwa

ίο 4 Stunden vollständig voneinander getrennt. Bei Alanin und Glycin und bei Glutaminsäure und Asparaginsäure stimmt die Elutionsreihenfolge mit der nach den in wäßriger Lösung erhaltenen Stabilitätskonstanten voraussehbaren Reihenfolge überein. Bei dem gebräuchlichen lonenaustauschverfahren wird Glycin vor Alanin eluiert. während bei Verwendung einer Harzsäule in Nickelsalzform Glycin, das eine relativ stabile Komplexverbindung bildet, nach Alanin von der Säule abgegeben wird.

ao Das gleiche gilt für die Elutionsreihenfolge von Glutaminsäure und Asparaginsäure. Wie an Hand der Stabilitätskonstanten vorauszusehen war, folgt die Asparaginsäureelution der Glutaminsäureelution.
Wenn die gleichen Bedingungen, wie im Beispiel 1

as angegeben, angewandt werden, jedoch kein Ni⁸* am lorwnaustauscherharz angelagert und ebenso nicht zur Elutionslösung zugegeben wird, werden die vorstehend angegebenen elf Aminosäuren nicht voneinander getrennt und nahezu gemeinsam (»als ein Peak«) eluiert.

Das zeigt, daß die vorliegende Erfindung von dem üblicherweise als Trennverfahren angewandten lonenaustauschverfahren deutlich verschieden" ist.

Es wird bemerkt, daß die gleiche Komplexbildungsreaktion ebenfalls in der Elutionslösung stattfindet, da das gleiche Ni*~-Ion der Lösung zur Konstanthaltung des Gehaltes des am Harz angelagerten Ni*Mons zugesetzt ist. Infolge der hohen Konzentration der angelagerten Ni*Monen, die etwa 200mal so hoch ist wie diejenige der Elutionslösung unter den für die Herstellung des Chromatogramms gemäß F i g. 2 ange wandten Bedingungen, werden jedoch die Wände rungsgeschwindigkeiten der einzelnen Aminosäurer hauptsächlich durch die koordinativen Kräfte zwi sehen den angelagerten Ni²-Ionen und den einzelner Aminosäuren bestimmt bzw. beherrscht, d. h. mi anderen Worten durch die Stabilität als Komplex verbindung.

Beispiel 2

F i g. 3 zeigt ein Chromatogramm von sauren um neutralen Aminosäuren, das unter Verwendung des ii F i g. 1 gezeigten automatischen Flüssigkeitschromato graphen erhalten wurde und die Aminosäuren Taurii (taurine). Glutaminsäure. Asparaginsäure, Prolin Alanin, Valin, Norleucin (n-leucine). Leucin (alloleu eine), Methionin, Threonine, Oxyprolin und Serii zeigt. Als Ionenaustauscherharz wurde ein Harz von schwachsauren Carbonsäuretyp verwendet. Als EIu tionslösung diente eine Natriumacetat-Essigsäure

δο Pufferlösung von pH 6,0 mit 0,7 Mol/l Na^ um 10-* Mol/I Cu^. Als Säule 1 wurde eir.i Harzsäule ii Kupfersalzform verwendet, die ins Gleichgewicht ge setzt wurde, bis die Cu²--Konzentration in der an unteren Ende der Säule 1 austretenden Lösun] ΙΟ-⁴ Mol/l erreichte. Die Säulentemperatur lag be 30^cC, und die Säulenlänge betrug 45 cm. Da Cu²" Ionen im Effluenten die Farbbildungsreaktion de Aminosäuren mit Ninhydrin stören, wurde voran

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gehend Nat. ium-ätliylendiamintetraacetat in einer Menge von 10 ³ Mol/l zum als Farbentwicklungslösung dienenden Ninhydrin-Reagenz zugesetzt, um diese Störung auszuschalten. Die Lichtabsorption w.r.de bei einer Wellenlänge von 570 ηψ (bzw. bei 440 ηιμ für Prolin und Oxyprolin) bestimmt. Die übrigen Bedingungen waren die gleichen wie im leispiel I.
Wie F i g. 3 zeigt, wurden die vorstehend angegebew:rdeii. und zwar ohne Veränderung der Säulentemperatur oder der Elutionslösung. Daraus folgt, daß die vorliegende Erfindung, die vom lonenaustauschvcrfahren deutlich verschieden ist. eine einfache Trennrröglichkeit bietet, wie auch die Verwendung einer vereinfachten und verkleinerten Apparatur.

Beispiel 4
F i g. 6 zeigt ein mit dem automatischen Flüssigkeits

een zwölf Aminosäuren in etwa 5 Stunden voneinander io Chromatographen gemäß F i g. 1 erhaltenes Chromato-■etrennt. Die Eluierungsreihenfolge von Glutamin- gramm von Glutaminsäure. Alanin und Glycin. Dabei

wurde eine Gesamtprobenmenge von 0,5 ml verwendet riit 0,5 μιη von jeder Aminosäure.

Als lonenaustauscherharz winde ein schwach saures Harz vom Carbonsäuretyp verwendet. Als Elutionslösung diente eine Natriumacetat-Essigsäure-Pufferlösung von pH 6,0 mit 0,2 Mol/l Na⁴ und 10 ⁴ Mol/l Cu² . Die Säule 1 war eine Säule in Kupfersalzform, die mit der Lösung behandelt worden war, bis die

iäure und Asparaginsäure sowie von Alanin und Clycin. die ähnlich wie im Beispiel 1 ist, stimmt mit der ■n Hand der in wäßriger Lösung erhaltenen Stabilitätsionstanten vorauszusehenden Reihenfolge überein.

Die Kupferkomplexe von basischen Aminosäuren, wie Lysdin. Tryptophan. Arginin und Histidin, sind l>ei pH 6,0 unter den Elutionsbedingungen, bei denen 4as Chromatogramm gemäß F i g. 3 erhalten wurde,

lehr stabil, die Elution dieser basischen Aminosäuren »o Cu²'-Konzentration in der vom unteren Ende
würde so sehr lange dauern. Diese Aminosäuren, wie Säule 1 abgegebenen Elutionslösung 10 * Mol/l er-•uch Cystin, können jedoch mit Hilfe einer Säule von reichte. Die Säulentemperatur wurde bei 25" C kon-16 cm Längt, die mit einer Elutionslösung von pH 5,0 stant gehalten, und die Säulenlänge betrug 15,8 cm. mit 0 9 Mol/l Na' und 10 ' Mol/l Cu²ⁱ behandelt Die Fließgeschwindigkeit der Elutionslösung lag bei wurde, in etwa 2.5 Stunden, wie F i g. 4 zeigt, getrennt »5 30 ml/Min, und diejenige der Farbentwicklungslösung werden bei 15 ml/Min. Als Farbentwicklungslösung wurde an

Wie man sieht, werden basische Aminosäuren in der Stelle von Ninhydrin-Reagenz 2-Carboxy-2-hydroxy-Hälfte der Zeit voneinander getrennt, die für das 5'-formazylbenzol in 50°/₀ Alkohol verwendet, das mit übliche Ionenaustauschverfahren benötigt wird. Auch den Cu^a-Aminosäureverbindungen der Elutionshier sind wiederum die Eluierungsreihenfolgen, und 30 lösung eine Farbreaktion eingeht. Die Absorptionsewar von Lysin und Tryptophan sowie von Arginin wellenlänge lag bei 600 τημ.

und Histidin im Vergleich zum Ionenaustauschverfahren umgekehrt, was wiederum besagt, daß das erfindungsgemäße Verfahren vom Ionenaustauschverfahren verschieden ist.

Beispiel 3

F i g. 5 zeigt ein unter Verwendung des automatischen Flüssigkeitschromatographen gemäß F i g. 1 erhaltenes Chromatogramm der sauren und neutralen 40 etwa Xylenolorange oder Pyrocatecholviolett.
Aminosäuren Glutaminsäure, Asparaginsäure, Alanin, Beispiel 5

Valin. Prolin, Oxyprolin, Isoleucin, Glycin, Serin, Norleucin, Threonin und Methionin.

Als lonenaustauscherharz wurde ein stark saures F i g. 6 zeigt den Verlauf der Absorption des Effluenten. Die Farbreaktion erfordert im Gegensatz zur Farbbildung mit Ninhydrin keine Wärmebehandlung, und die Farbentwicklungslösung ist chemisch sehr stabil, so daß weder der Ausschluß von Luft noch eine kühle und dunkle Aufbewahrung erforderlich ist.

Als Reagenzien dieser Art können ähnlich verschiedene weitere Verbindungen verwendet werden, wie

Die nachfolgende Tabelle zeigt Daten für die Reproduzierbarkeit der Analysenergebnisse, die mit Hilfe des

Harz vom Sulfonsäuretyp verwendet. Als Elutions- *5 automatischen Flüssigkeitschromatographen gemäß

lösung diente eine Natriumacetat-Essigsäure-Pufferlösung von pH 6,0 mit 0,05 Mol/l Na" und 10"³ Mol/I Co²'. Die Säule 1 war eine Harzsäule in Cobaltsalzform. die durch Behandlung mit der Lösung, bis die Co²"-Konzentration in der vom unteren Ende der Säule 1 abgegebenen Elutionslösung 10"³ Mol/l erreichte, erhalten wurde. Die Säule 1 war 55 cm lang, und die Säulen tempera tür wurde bei 70^: C konstant gehalten. Die übrigen Bedingungen waren die gleichen wie im Beispiel 1.

Wie F i g. 5 zeigt, wurden die vorstehenden zwölf Aminosäuren in etwa 4 Stunden voneinander getrennt.

Für eine Trennung von mehr als zehn Arten von sauren und neutralen Aminosäuren nach dem üblichen F i g. 1 mit Alanin, Glycin und Serin erhalten wurden.

Versuch Nr.	Alanin	Glycin	Serin
1	1.26	1.70	2,27
2	1.23	1,72	2,23
3	1,24	1.75	2.25
4	1.23	1.67	2.26

Als lonenaustauscherharz wurde dabei ein schwachsaures Harz vom Carbon säuretyp verwendet. Al: Elutionslösung diente eine Natriumacetat-Essigsäure Pufferlösung von pH 6,0 mit 0,5 Mol/l Na^ unc ionenaustauschverfahren wäre eine sehr lange Säule 60 10~⁴ Mol/l Cu^. Die Säule 1 war eine Harzsäule ii

Kupfersalzform, die ins Gleichgewicht gesetzt wurde

bis die Cu²^-Konzentration in der vom unteren Endi der Säule abgegebenen Elntionslösung 10~⁴ Mol/l er

reichte. Die Säulenlänge betrug 16,5 cm und di<

dauern. Gemäß der Erfindung kann, wie an Hand der 65 Säulentemperatur wurde bei 25 ⁰C konstant gehalten Beispiele 1 bis 3 verständlich ist, eine kurze Säule ver- Die Fließgeschwindigkeit der Elutionslösung lag \x

von 150 cm Höhe erforderlich, und darüber hinaus müßten im Rahmen einer Trennoperation Säulentemperatur und Elutionslösung verändert werden, und die Trennung würde außerdem langer als 10 Stunden

wendet werden, und die Trennung kann in größenordnungsmäßig 4 bis 5 Stunden vollständig erreicht 30 ml/Min, und die der Farbentwicklungslösung be 15 ml/Min. Da die Farbreaktion von Aminosäuren mi

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Ninhydrin durch die Anwesenheit von Cu²' in der Elutionslösung gestört wird, wurde als Farbentwicklungslösung ein Ninhydrin-Reagenz verwendet, dem Natrium-äthylendiamintetraacetat zugesetzt worden war. Die Lichtuosorption wurde bei einer Wellenlänge von 570 ηιμ bestimmt. Die Gesamtprobenmenge von 0,5 ml enthielt 0.5/(M von jeder Aminosäure. Die in der Zusammenstellung für Alanin, Glycin und Serin angegebenen Zahlenwerte sind die Elutionszeiten in Stunden.

An Hand der vorstehenden Angaben ist es verständlich, daß die Zugabe des gleichen Cu²'-lons zur Elutionslösung in einer Konzentration von 10~' Mol/l, wie sie zur Herstellung des Gleichgewichts der am Harz angelagerten Cu²⁺-lonen verwendet wird, den Gehalt an angelagerten Ionen ständig konstant hält, so daß dieser auch dann konstant bleibt, wenn die Elutionslösung über eine längere Zeit hinweg durch die Säule 1 vom Kupfersalztyp geleitet wird; auf diese Weise ίο können reproduzierbare Ergebnisse erhalten werden.

Hierzu 1 Blatt Zeichnungen

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Claims

Patentansprüche:

1. Verfahren zum chromatographischen Trennen einer Mischung von Verbindungen mit koordinativen Gruppen, die mit schwach basischen Metallionen Komplexverbindungen bilden, mit Hilfe einer lonenaustauschersäule, dadurch gekennzeichnet, daß die lonenaustauschersäule mit für die Komplexbildung geeigneten schwachbasischen Metallionen beladen und die zu trennende Mischung auf die so vorbehandelte Säule gegeben wird und daß als Elutionslösung eine Lösung verwendet wird, in der die gleichen wie an der lonenaustauschersäule angelagerten Metallionen in einer Konzentration enthalten sind, die mit dem Metallionengehalt der Säule im Gleichgewicht steht.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß als schwachbasische Metallionen die Ionen von Nickel. Kupfer, Kobalt, Cadmium, Quecksilber. Zink, Lanthan oder Yttrium verwendet werden.

3. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 und 2. dadurch gekennzeichnet, daß als Füllung der Säule ein lonenaustauscherharz mit Sulfonsäure-, Carbonsäure- oder Iminodiessigsäuregruppen \erwendet wird.

4. Verfahre ι nach einem der Ansprüche 1 bis 3 mit zusätzlicher Kontrolle der ausgeführten Trennung durch kontinuierliche bestimmung der Konzentration der eluierten Komronenten über eine Farbreaktion, dadurch gekennzeichnet, daß dem Eluat für die Farbreaktion ein Reagenz zugesetzt wird, das mit dem gebundenen Metallionen der Komplexverbindung reagiert und die Konzentration in bekannter Weise durch Lichtabsorptionsmessungen bestimmt wird.

5. Verfahren nach Anspruch 4. dadurch gekennzeichnet, daß als Reagenz für die Farbreaktion 2-Carbo.\y-2-hydroxy-5'-formazylbcnzol. Xylenoloranec oder Pvrocatecholviolett verwendet werden.