DE2102985C3 - Verfahren zum Bestimmen von Ammoniak und organischen Verbindungen und Reagens zum Durchführen des Verfahrens - Google Patents
Verfahren zum Bestimmen von Ammoniak und organischen Verbindungen und Reagens zum Durchführen des VerfahrensInfo
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Description
Ar
C-R,
C-R,
(D
Formel I ein bis drei Äquivalente des lieduktions-
mittcls enthält.
12. Reagens nach Anspruch 10 und I), dadurch
gekennzeichnet, daß es außerdem einen Puffer mil einem pH-Wert zwischen 6 und 13, vorzugsweise
zwischen 8 und 10, enthalt.
13. Reagens nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet,
daß das Reduktionsmittel ein Borhydrid, vorzugsweise ein Alkaliborhydrid, wie etwa Natrium-
oder Kaliumborhydrid, ist.
14. Reagens nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet,
daß das Reduktionsmittel ein Thiol, insbesondere ein Mercaptoalkohol, wie etwa 2-Mercaptoäthanol,
ist.
15. Reagens nach Anspruch 10 bis 14, dadurch gekennzeichnet, daß es eine Verbindung der
Formel I enthält, in welcher der aromatische Rest ein Phenylenrest ist, insbesondere ortho-Phthalaldehyd
oder ortho-Diacetylbenzol.
in welcher Ar ein aromatischer Rest, in welchem die beiden Substituenten sich in ortho-Stellung befinden,
und Ri und R2 Wasserstoff bedeuten, zu einem
fluoreszierenden Produkt unigesetzt wird, gekennzeichnet
durch die Verwendung eines Reduktionsmittels oder eines vorher hergestellten Reaktionsprodukts, des Reduktionsmittels und der
Verbindung der Formel I, in welcher Ri und R2
neben Wasserstoff gleiche oder verschiedene organische Reste sein können.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet,
daß man das fluoreszierende Produkt in einem Milieu mit einem pH-Wert zwischen 6 und 13
vorzugsweise zwischen 8 und 10, beispielsweise 9, herstellt.
3. Verfahren nach Anspruch I und 2, dadurch gekennzeichnet, daß der aromatische Rest der
Verbindung der Formel I ein Phenylenrest ist.
4. Verfahren nach Anspruch ! bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß man ortho-Phthalaldehyd verwendet.
5. Verfahren nach Anspruch 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß man ortho-Diacetylbenzol
verwendet.
6. Verfahren nach Anspruch 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß man ein Thiol als Reduktionsmittel
verwendet.
7. Verfahren nach Anspruch 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß man ein Borhydrid als Reduktionsmittel
verwendet.
8. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß man einen Mercaptoalkohol, insbesondere
2-Mercaptoäthanol, verwendet.
9. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß man ein Alkaliborhydrid, insbesondere
Natrium- oder Kaliumborhydnd, verwendet.
10. Reagens zum Bestimmen von Ammoniak und
organischen Verbindungen, die wenigstens eine primäre Aminogruppe enthalten, insbesondere Aminosäuren
und deren Carboxylderivaten. bestehend aus einer verbindung der im Anspruch 1 genannten
Formel I, dadurch gekennzeichnet, daß neben der Verbindung der Formel I noch ein Reduktionsmittel
oder das Reaktionsprodukt der Verbindung der Formel I mit dem Reduktionsmittel vorhanden ist.
11. Reagens nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet,
daß es pro Äquivalent der Verbindung der
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35
50
(«0 Es ist ein kolorimetrisches Verfahren zur Bestimmung von Aminosäuren und Polypeptiden bekannt, welches
darin besteht, mittels Ninhydrin eine photometrisch meßbare Färbung dieser Verbindungen zu erzeugen.
Dieses Verfahren wird zwar häufig benutzt, jedoch ist es für gewisse Bestimmungen zu unempfindlich, z. B. bei
biochemischen Vorgängen, wo die Konzentration der betreffenden Aminosäuren oder Amine häufig nur sehr
gering ist, ein Nachweis oder sogar eine Bestimmung von Ammoniak und Aminen in Mengen von Mikrogramm-Bruchteilen
notwendig ist und somit die Färbung für eine exakte kolorimeirische Bestimmung zu
schwach ist. Alis Science, Bd. 109 (1949), S. 339. ist
bekannt, daß man mit o-Phthalaldchyd Glycin, Hystidin
und Tryptophan sowie Ammoniumionen auf dem Papierchromatogramm mittels Fluoreszenzanalyse bestimmen
kann. So wichtige Aminoverbindungen, wie Alanin, Arginin, Asparagin, Cholin, Cystin, Glutaminsäure,
Leucin und viele andere, sind mit diesem Verfahren jedoch nicht nachweisbar.
Aufgabe der Erfindung ist es daher, die vorstehenden Mängel zu beseitigen und ein analytisches Bestimmungsverfahren
der gattungsgemäßen Art zur Verfügung zu stellen, welches es erlaubt, auch sehr geringe
Konzentrationen von Ammoniak und organischen Aminoverbindungen exakt nachzuweisen.
Es wurde nun überraschenderweise festgestellt, daß eine Fluoreszenzanalyse mit hoher Fluoreszenzintensität
möglich ist, wenn man die zu bestimmende Verbindung mit speziellen, in ortho-Stellung zueinander
disubsütuierten aromatischen Verbindungen und einem Reduktionsmittel oder einem vorher hergestellten
Reaktionsprodukt aus aromatischer Verbindung und Reduktionsmittel umsetzt.
Die Erfindung betriff; somit ein Verfahren zum Bestimmen von Ammoniak Lind organischen Verbindungen,
die wenigstens eine primäre Aminogruppe enthalten, insbesondere von Aminosäuren und deren
Carboxylderivaten. mittels Fluorcszenzanalyse, indem die zu bestimmende Suastanz mit einer Verbindung der
Formel
Ar
C- R,
Il '
ο
in welcher Ar ein aromatischer Rest, in welchem die
beiden Siibstituenten sich in ortho-Stellung befinden,
und Ri und R2 Wasserstoff bedeuten, zu einem
fluoreszierenden Produkt umgesetzt wird, das durch die Verwendung eines Reduktionsmittels oder eines vorher
hergestellten Reaktionsprodukts des Reduktionsmittels und der Verbindung der Formel I, in welcher Ri und R2
neben Wasserstoff gleiche oder verschiedene organische Reste sein können, gekennzeichnet ist.
Mit dem erfindungsgemäßen Verfahren kann man eine Fluoreszenz erzielen, die nicht nur direkt
proportional zur Menge der zu bestimmenden Substanz ist, sondern dazu auch bei sehr geringen Mengen in der
Größenordnung eines Mikrogramms auftritt. Dieses fluorometrische Verfahren ist sehr viel empfindlicher als
das bekannte kolorimetrische Verfahren, da man mit etwa hundertmal geringeren Mengen als beim kolorimetrischen
Verfahren arbeiten kann.
Die dabei entstehenden fluoreszierenden Verbindungen
sind in ihrer chemischen Natur nicht bekannt; es dürfte sich um komplexe Produkte handeln, die aber
eine hohe Fluoreszenzintensität aufweisen.
Das erfindungsgemäße Verfahren erlaubt somit qualitative Nachweise und quantitative Bestimmungen,
beispielsweise für Glykokoll, Valin, Serin, Alanin, Phenylalanin, Glutamin, Leucinälhylester und Leucylglycyl-glycin,
d. h. für Aminoverbindungen, die nach dem bekannten Fluoreszenzverfahren nicht erfaßt werden
können.
Es wurde außerdem festgestellt, daß das Reaktionsprodukt der Verbindung der Formel 1 mit dem
Reduktionsmittel beim Zusammenbringen mit der zu bestimmenden Substanz eine Fluoreszenz erzeugt,
welche mit derjenigen identisch ist, die man bei getrennter Anwendung der Verbindung der Formel 1
und des Reduktionsmittels erhalt.
Der aromatische Rest Ar in Formel I ist gemäß einer bevorzugten Ausführungsform ein Phenylcnrest. I lervorragende
Resultate werden mit onho-Phthalaldehyd
CHO
der Formel
CHO
oder mit ortho-Diacctylbenzol der Formel
oder mit ortho-Diacctylbenzol der Formel
L i
C CH,
Y CH1
Y CH1
Il
ο
Das erfindungsgemäß verwendete Reduktionsmittel ist vorzugsweise ein Thiol, insbesondere ein Mercaptoalkohol,
beispielsweise 2-Mercaptoiithanol der Formel
S HS-CH2-CH2-OII
Man kann auch mit gutem Erfolg ein Borhydrid, wie elwa ein Alkaliborhydrid, beispielsweise Kaliumborhydrid
oder Nairiutnborhydrid, verwenden.
ίο Bei der Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens
ist es zweckmäßig, daß man das fluoreszierende Produkt in einem Milieu herstellt, dessen pH zwischen b
und Ti, vorzugsweise zwischen 8 und 10, liegt und beispielsweise 9 beträgt. Ein Erwärmen ist nicht nötig,
da das erfindungsgemäße Verfahren den Vorteil hai, in der Kälte durchgeführt werden zu können.
Die Erfindung betrifft ferner ein Reagens zum Bestimmen von Ammoniak und organischen Verbindungen,
die wenigstens eine primäre Aminogruppe enthalten, insbesondere Aminosäuren und deren Carboxylderivaten
bestehend aus einer Verbindung der Formel I, das dadurch gekennzeichnet ist, daß neben der
Verbindung der Formel 1 noch ein Reduktionsmittel oder das Reaküonsprodukt der Verbindung der
Formel 1 mil dem Reduktionsmittel vorhanden ist.
Um den pH-Wert in den genannten Grenzen zu
hallen, kann das erfindungsgemäße Reagens außer den bereits genannten Bestandteilen noch einen Puffer
aufweisen, der einen pH-Wert zwischen b und 13, vorzugsweise zwischen 8 und 10, gewährleistet. Im
Reagens beträgt das Verhältnis zwischen Verbindung der Formel I und Reduktionsmittel vorzugsweise ein
Äquivalent zu einem bis drei Äquivalenten.
Die Beispiele erläutern die Erfindung.
Die Beispiele erläutern die Erfindung.
Beispiel 1
'/lüoml einer wäßrigen Glykokoll-Lösung mil einem
Gehalt von 0,1 mg/ml werden zu 3 ml einer wäßrigen 0,05molaren Natriumboratlösung gegeben, welche als
Puffer einen pH-Wert von 9 ergibt. Hierauf gibt man 0,1 ml einer methanolischen ortho-Phthalaldehydlösung
mit einem Gehalt von 10 mg/ml zu. Man mischt und fügt 0,1 ml einer Kaliumborhydridlösung mit einem Gehalt
von 1 mg/ml zu. Bei ultravioletter Bestrahlung beobachtet man eine blaue Fluoreszenz. Verfährt man in der
gleichen Weise mit steigenden Mengen an alpha-Aminosäure
oder einem funktioneilen Derivat davon, so stellt man fest, daß die Intensität der Fluoreszenz eine
Funktion der angewandten Mengen der Aminosäure ist.
Man mischt 1/100 ml einer wäßrigen Lösung von
Alanin mit einem Gehalt von 0,01 mg/ml mit einer wäßrigen Lösung von Natriumborai. die 0,05 Mol/Liter
Borat enthält und als Puffer vom pH 9 wirkt. Hierauf gibt man 0.1 ml einer Lösung von ortho-Phthalaldehyd
in Methanol mil einem Gehall \on 10 mg/ml und 0,1 ml einer wäßrigen Lösung von Kalitimborhydrid mit einem
Gehalt von ! mg/ml zu und mischt das Ganze. Die Fluoreszenz der erhaltenen Lösung wird in einem
ΙΊ1101 ometer mit einer Wellenlänge von 335 nm für die
Anregung und von 415 nm für die !.mission gemessen.
Die Fluoreszen/intensiläi ist mehr als doppelt so groß
als diejenige einer in der gleichen Weise, jedoch ohne Alanin, hergestellten I esiK'siing.
Zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens kann man eine Apparatur \ erw enden, wie sie in der
Zeichnung schemalisch beispielsw eise dargestellt ist.
Diese Apparatur weist eine Trennsäule 1 auf. in
welche oben die zu analysierenden Substanzen eingeführt werden. Die Säule kann beispielsweise als
Ionenaustauscher- oder als CTiromatographiersäule ausgebildet sein. Ihr unteres linde ist über eine Leitung 2
mit einem kontinuierlich messenden Fluoromctcr 3 verbunden, welches mit einem Auslaß 7 versehen ist.
Das Fluorometer 3 ist mit einem Schreiber 8 versehen.
dessen Spitze 9 eine Kurve auf dem Registriet papier 10
aufzeichnet.
Das erfindungsgemäße Verfahren kann mit der beschriebenen Apparatur wie folgt durchgeführt werden:
Man kann die An- oder Abwesenheit von verschiedenen Aminosäuren in einer Substanz feststellen und
quuntitativ die Menge der vorhandener. Aminosäuren bestimmen.
Die Substanz kann beispielsweise ein biologisches Präparat, ein Protein- oder Pcplidhydrolysai sein. Sie
wird bei 11 auf die Trennsäule 1 gegeben. Durch das Rohr 12 wird eine saure Pufferlösung eingeführt. Heim
Durchwandern der Säule 1 werden die verschiedenen Aminosäuren voneinander getrennt, was schematisch
mit 13, 14 und 15 angedeutet ist. Die Aminosäuren strömen dann nacheinander in Richtung des Pfeils 16
durch das Rohr 2, was durch Schwerkraft oder Pumpen bewirkt werden kann. Durch das Rohr 4 wird eine
alkalische Natruimboratpufferlösung eingeführt, um das pH der durch das Rohr 2 strömenden Flüssigkeit auf den
gewünschten Wert zwischen pH b und 13 einzustellen. Durch das Rohr 5 wird eine methanolische Lösung von
ortho-Phlhalaldehyd und durch das Rohr 6 eine wäßrige Lösung von Kaliumborhydrid eingeführt.
Die genannten Lösungen mischen sich und ergeben eine fluoreszierende Lösung, die durch das Fluoromeler
3 strömt und dieses durch den Auslaß 7 verläßt.
Im FluoTomctcr 3 werden die Fluoreszenzen
gemessen und mittels des Schreibers 8 auf dem Papier 10 registriert. Man erhält eine Kurve mit Maxima, deren
Flächen proportional zu den Mengen der Aminosäuren sind, die getrennt durch das Fluorometer 3 strömen.
Die Rohre 5 und 6 können durch ein einziges Rohr ersetzt werden, wenn man eine Verbindung der
Formel I und ein Reduktionsmittel zusammen in die Leitung 2 einführen will. Das kann zum Beispiel bei
Verwendung von ortho-Phthalaldehyd und 2-Mereapto· äthanol als Reduktionsmittel der Full sein.
Die drei folgenden Beispiele beziehen sich auf das erfindungsgemäße Reagens.
Eine Verpackung besteht aus zwei !laschen, von
denen tue eine Kaliumborhydnitpulvcr und die andere
eine Lösung enthält, die durch Auflösen von ortho-Phthalaldehyd in Methanol und Zugabe von wäßriger
Natriumboratlösung erhalten worden ist.
Die Inhalte der beiden Flaschen werden kurz vor
einer Bestimmung miteinander gemischt.
Das Reagens besteht aus einer einzigen Flüssigkeit, Diese enthält pro Liter 100 ml Methanol, 5 g ortho-Phthalaldchvd.
4 ml 2-Mercapto-äthanol und 0,05 Mol Natriumborat. Ihr pH wird durch Zugabe von Borsäure
auf 9 eingestellt.
Beispiel 5
In diesem Fall enthält das Reagens das Reaktionsprodukt
der Verbindung der Formel I mit dem Reduktionsmittel.
5 g ortho-Phlhalaldehyd werden in 150 ml Methanol
gelöst. Man mischt diese Lösung mit 800 ml einet wäßrigen Natriumboratpufferlösung vom pll M, fügt
dann 20 ml 2-Mercapto-äthanol zu und rührt. Nach 5 Minuten extrahiert man die Mischung mil 500 m
n-Hiitanol. Der Fxirakt wird auf dem Wasserbad untei
einem Vakuum von 12 mm Hg eingedampft. D^\- nocl'
viskose Rückstand wird auf eine Chromatographiersäu-Ie
gegeben, die mit Silicagel und Chloroform gefüllt ist Man Chromatographien mit einer Mischung vor
18 Teilen Chloroform, einem Teil Allylacetat und eineir
Teil Äthanol. Das Final enthält eine erste Fraktion welche ultraviolettes Licht absorbiert. Fs handelt siel·
um orlhoPhihakildehyd. Diese Fraktion wird verworfen.
Hierauf erscheint eine /weile Fraktion, weicht
ultraviolettes Licht absorbiert und das Reagens enthält das bei pll ^ mil Aminosäuren eine Fluoreszenz ergibt
Man kann das durch l'.nlnehmen einer Probe leieh'
lestsiellen. Diese Fraktion wird aufgefangen und /in
Trockene eingedampft. Der Rückstand wird in Aihano
gelöst und inner I .iiflabschliiß in einer gin ',erschlösse
neu Ilasehe aufbewahrt. Diese Lösung enthält da'
gereinigte Reagens.
I Hei/u I MIaIt /.cicliininr.cn
Claims (1)
1. Verfahren zum Bestimmen von Ammoniak und organischen Verbindungen, die wenigstens eine
primäre Aminogruppe enthalten, insbesondere von Aminosäuren und deren Carboxylderivaten, mittels
Fluoreszenzanalyse, indem die zu bestimmende Substanz mit einer Verbindung der Formel I
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CH226970 | 1970-02-17 | ||
| CH226970A CH508879A (fr) | 1970-02-17 | 1970-02-17 | Procédé de détermination de l'ammoniaque et de composés organiques aminés et ensemble de réactifs pour la mise en oeuvre de ce procédé |
Publications (3)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| DE2102985A1 DE2102985A1 (de) | 1971-09-02 |
| DE2102985B2 DE2102985B2 (de) | 1976-12-30 |
| DE2102985C3 true DE2102985C3 (de) | 1977-08-18 |
Family
ID=
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