CN1142423C - 定量测量荧光共振能量转移效率的方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于一种可作为生物、医学、光学、物理、化学等学科类的科研与检测，测量供体-受体的相互作用及其能量共振转移效率的测量方法。1)根据供体受体的发射谱选择适当的滤光片；2)根据供体受体的发射谱计算得到系数K_d1，K_d2，K_a1和K_a2；3)用激发光选择性地激发供体；4)测量两个通道的荧光强度计算得到比值Ratio；5)将Ratio代入公式(a)计算得到荧光共振能量转移效率E；6)将E代入公式(b)计算得到供体受体间的距离r。

Description

定量测量荧光共振能量转移效率的方法

技术领域

本发明属于测量供体—受体的相互作用及其能量共振转移效率的测量方法。可作为生物、医学、光学、物理、化学等学科类的科研与检测。

技术背景

长期以来有一种需要，即如何定量测量供体受体间的荧光共振能量转移(FRET)效率，达到定量监测供体受体间的相互作用和构形变化的目的。

目前，国内尚还没有该方面的研究。

国外已有定量测量荧光共振能量转移的方法和专利。例如，美国专利No.762245，摩洛哥1991年9月19日申请；No.065585，日本1998年4月24日申请；No.684268，日本1996年7月17日申请。这些方法和专利或者不能完全消除串扰(Cros-talk)和浓度的影响，或者因要使用的滤光片和测量的数据太多，而不能满足生物医学研究的需要。利用测量荧光强度研究荧光共振能量转移效率时的主要问题有：(1)供体发射谱与受体发射谱的串扰(Cross-talk)使实际测量时很难或不可能将它们分开；(2)荧光共振能量转移成分与非荧光共振能量转移成分混在一起；(3)供体和受体发射的荧光强度与供体和受体的浓度有关，但是其定量关系却很难确定。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术中存在的问题和不足，提出的一种能快速定量检测荧光共振能量转移效率的测量方法。

本发明所说的定量测量荧光共振能量转移效率的方法，其适用条件为：(1)供体和受体的发射谱形状与荧光共振能量转移效率无关，即荧光共振能量转移只改变供体和受体荧光发射谱的强弱而不改变其形状，或荧光共振能量转移对供体发射谱形状的影响很小以致可被忽略；(2)激发光源只选择性地激发供体而不激发受体或者对受体激发较小以致可被忽略。

本发明所说的定量测量荧光共振能量转移效率的方法，利用对供体和受体两个通道的有关参数进行测量，并通过对相关数据的处理后而得出其荧光共振能量转移效率和供体受体间的距离。两个通道性质的要求：(1)第一个通道(简称CH1)必须包括部分或全部供体荧光发射谱；(2)第二个通道(简称CH2)必须包括部分或全部受体荧光发射谱；(3)激发光不在两个通道的光谱范围；(4)两个通道的探测谱范围不能完全相同。

本发明中定量测量荧光共振能量转移效率的通用公式为： $\frac{{\mathrm{\φ}}_{A}E}{1-E}=\frac{\mathrm{Ratio}\·K_{d1}-K_{d2}}{K_{a2}-\mathrm{Ratio}{\·K}_{a1}}---\left(a\right)$ $E=\frac{R_0^6}{r^6+R_0^6}---\left(b\right)$

式中，E是荧光共振能量转移荧光共振能量转移效率，Ratio是两个探测通道的荧光强度的比值，φ_A是受体的能量量子产生额，R₀是Frster临界距离，r是供体与受体之间的距离，K_d1和K_d2分别是两个通道中供体发射荧光强度与供体发射的全部荧光强度的比值，K_a1和K_a2分别是两个通道中受体发射荧光强度与受体发射的全部荧光强度的比值。K_d1，K_d2，K_a1和K_a2由供体发射谱spd(λ)和受体的发射谱spa(λ)及两个通道的带通性质计算得到，而与样品的构形和动态性质无关。其计算公式为： $k_{d1}=\frac{\underset{\mathrm{CH}1}{\∫}\mathrm{spd}\left(\mathrm{\λ}\right)\mathrm{d\λ}}{\underset{-\∞}{\overset{+\∞}{\∫}}\mathrm{spd}\left(\mathrm{\λ}\right)\mathrm{d\λ}},$ $k_{d2}=\frac{\underset{\mathrm{CH}2}{\∫}\mathrm{spd}\left(\mathrm{\λ}\right)\mathrm{d\λ}}{\underset{-\∞}{\overset{+\∞}{\∫}}\mathrm{spd}\left(\mathrm{\λ}\right)\mathrm{d\λ}},$ $k_{a1}=\frac{\underset{\mathrm{CH}1}{\∫}\mathrm{spa}\left(\mathrm{\λ}\right)\mathrm{d\λ}}{\underset{-\∞}{\overset{+\∞}{\∫}}\mathrm{spa}\left(\mathrm{\λ}\right)\mathrm{d\λ}},$ $k_{a2}=\frac{\underset{\mathrm{CH}2}{\∫}\mathrm{spa}\left(\mathrm{\λ}\right)\mathrm{d\λ}}{\underset{-\∞}{\overset{+\∞}{\∫}}\mathrm{spa}\left(\mathrm{\λ}\right)\mathrm{d\λ}}.$

当受体的能量量子产生额φ_A已知时，只要测量出Ratio，代入(a)式，既可计算得到荧光共振能量转移效率E。

本发明所说的定量测量荧光共振能量转移效率方法的步骤为：(1)根据供体受体的发射谱选择适当的滤光片，所说的滤光片应满足以上所说的两个通道性质的要求；(2)根据供体和受体的发射谱及选择的滤光片计算得到系数K_d1，K_d2，K_a1和K_a2；(3)用激发光选择性地激发供体；(4)测量两个通道的荧光强度，并由此计算得到第二通道与第一通道的荧光光强比值Ratio；(5)将Ratio代入公式(a)计算得到荧光共振能量转移效率E；(6)将E代入公式(b)计算得到供体受体间的距离r。

附图说明

附图1：吸收谱(实线)和发射谱(虚线)。(a)受体(Yellow)；(b)供体(Cyan)

附图2：Cameleon在零钙(实线)和饱和钙(虚线)时的发射谱。激发光波长为432nm，pH值为7.3

附图3：分离YC2.1的发射谱。激发波长432nm，1mM CaCl₂，分别加入0，1mM CaM培养

本发明所说的定量测量荧光共振能量转移效率的方法具有简单易行特点。只要对两个通道中的荧光强度进行测量，利用取得的数据即可计算出其荧光共振能量转移效率和供体、受体间的距离。

具体实施例

本发明的实施实例：

1.完整供体—受体对的实施实例：选择Cameleon(简称“YC2.1”)供体一受体对，它的供体和受体连接在一起的，其供体(Cyan)和受体(Yellow)的发射谱见图1所示。Miyawaki用432纳米的激发光在体外激发完整的YC2.1，并分别测量了在零钙(-Ca²⁺)和饱和钙(+Ca²⁺)情况下的荧光发射谱，如图2所示。在图2中，实线表示完整YC2.1在饱和钙时的发射谱，而虚线表示完整YC2.1在零钙时的发射谱，图2中480DF30表示第一个通道，535DF25表示第二个通道。根据测量的供体—受体对的荧光发射谱sp(λ)可由下式得到Ratio。 $\mathrm{Ratio}=\frac{\underset{\mathrm{CH}2}{\∫}{h}_1\left(\mathrm{\λ}\right)\mathrm{sp}\left(\mathrm{\λ}\right)\mathrm{d\λ}}{\underset{\mathrm{CH}1}{\∫}{h}_2\left(\mathrm{\λ}\right)\mathrm{sp}\left(\mathrm{\λ}\right)\mathrm{d\λ}}---\left(c\right)$

其中h₁(λ)和h₂(λ)分别表示第一个通道和第二个通道的带通性质。

对零钙有Ratio＝2.2358，K_d1＝0.3589，K_d2＝0.2540，K_a1＝0.0027，K_a2＝0.7341。Frster临界距离R₀取50，受体能量量子产生额φ_A取0.71，则由(a)式和(b)式计算得到常量荧光共振能量转移效率E＝51.49％，供体与受体间的距离r＝49.5083。

2.分离供体-受体对的实施实例：供体和受体是两个独立的标记物。分离的Cameleon(YC2.1)的结构见图3所示，供体ECFP与CaM结合在一起，受体EYFp-V68L/Q69K与M13结合在一起。Miyawaki测量了分离YC2.1在几种不同CaM浓度时的荧光发射谱(见图3)。按照本专利所说的方法计算了分离YC2.1的Ratio，E和r。当第一个通道带通性质是476/40，第二个通道带通性质是535/60时，计算结果为：加入0_μM的CaM时，比值Ratio、荧光共振能量转移效率E及r分别为3.0721，59.01％和47.0537；加入1_μM的CaM时，比值Ratio、荧光共振能量转移效率E及r分别为1.6676，32.37％和56.5333；加入8_μM的CaM时，比值Ratio、荧光共振能量转移效率E及r分别为1.2031，14.02和67.6460；加入100mM的EGTA时，比值Ratio、荧光共振能量转移效率E及r分别为1.14，10.7％和72.2。

Claims (1)

1、一种定量测量荧光共振能量转移效率的方法，利用对供体和受体两个通道的有关参数进行测量，并通过对相关数据的处理后而得出其荧光共振能量转移效率和供体受体间的距离；其特征在于，对两个通道性质要求：

(1)第一个通道必须包括部分或全部供体荧光发射谱；

(2)第二个通道必须包括部分或全部受体荧光发射谱；

(3)激发光不在两个通道的光谱范围；

(4)两个通道的探测谱范围不能完全相同；

所说的定量测量荧光共振能量转移效率方法的步骤为：

(1)根据供体和受体的发射谱选择适当的滤光片，所说的滤光片应满足以上所说的两个通道性质的要求；

(2)根据供体和受体的发射谱以及选择的滤光片计算得到系数K_d1，K_d2，K_a1和K_a2；其系数K_d1，K_d2，K_a1和K_a2分别为： $k_{d1}=\frac{\underset{\mathrm{CH}1}{\∫}\mathrm{spd}\left(\mathrm{\λ}\right)\mathrm{d\λ}}{\underset{-\∞}{\overset{+\∞}{\∫}}\mathrm{spd}\left(\mathrm{\λ}\right)\mathrm{d\λ}},$ $k_{d2}=\frac{\underset{\mathrm{CH}2}{\∫}\mathrm{spd}\left(\mathrm{\λ}\right)\mathrm{d\λ}}{\underset{-\∞}{\overset{+\∞}{\∫}}\mathrm{spd}\left(\mathrm{\λ}\right)\mathrm{d\λ}},$ $k_{a1}=\frac{\underset{\mathrm{CH}1}{\∫}\mathrm{spa}\left(\mathrm{\λ}\right)\mathrm{d\λ}}{\underset{-\∞}{\overset{+\∞}{\∫}}\mathrm{spa}\left(\mathrm{\λ}\right)\mathrm{d\λ}},$ $k_{a2}=\frac{\underset{\mathrm{CH}2}{\∫}\mathrm{spa}\left(\mathrm{\λ}\right)\mathrm{d\λ}}{\underset{-\∞}{\overset{+\∞}{\∫}}\mathrm{spa}\left(\mathrm{\λ}\right)\mathrm{d\λ}};$

其中：spd(λ)为供体发射谱；spa(λ)为受体的发射谱；

(3)用激发光选择性地激发供体；

(4)测量两个通道的荧光强度，并由此计算得到第二通道与第一通道的荧光光强比值Ratio； $\mathrm{Ratio}=\frac{\underset{\mathrm{CH}2}{\∫}{h}_1\left(\mathrm{\λ}\right)\mathrm{sp}\left(\mathrm{\λ}\right)\mathrm{d\λ}}{\underset{\mathrm{CH}1}{\∫}{h}_2\left(\mathrm{\λ}\right)\mathrm{sp}\left(\mathrm{\λ}\right)\mathrm{d\λ}},$

其中：sp(λ)为供体—受体对的荧光发射谱；h₁(λ)和h₂(λ)分别表示第一个通道和第二个通道的带通性质；

(5)将Ratio代入公式(a)计算得到荧光共振能量转移效率E；

公式(a)为： $\frac{{\mathrm{\φ}}_{A}E}{1-E}=\frac{\mathrm{Ratio}\·K_{d1}-K_{d2}}{K_{a2}-\mathrm{Ratio}\·K_{a1}},$ 其中φ_A是受体的量子产额；

(6)将E代入公式(b)计算得到供体受体间的距离r；

公式(b)为： $E=\frac{R_0^6}{r^6+R_0^6},$ 其中：R₀是Frster临界距离。

Images