JPH09507579A

JPH09507579A - 試料の化学分析用信号処理方法および装置

Info

Publication number: JPH09507579A
Application number: JP8507417A
Authority: JP
Inventors: ジェイオブレムスキ、ロバート; ダブリューシルゼル、ジョン
Original assignee: ベックマンインスツルメンツインコーポレーテッド
Priority date: 1994-08-17
Filing date: 1995-08-03
Publication date: 1997-07-29
Also published as: CA2173981A1; US5498875A; EP0723657A1; WO1996005500A1

Abstract

(57)【要約】第１および第２の入力信号を発生して前記入力信号を試料へ指向することにより前記試料の分析内容を決定する方法ならびにその装置である。両入力信号の波長は、少くとも３ナノメートル異なる。入力信号と試料との相互作用により、第１および第２の出力信号が発生される。それぞれの出力信号は、ピーク波長がそれぞれの入力信号の波長に実質的に依存しない共鳴信号と、ピーク波長がそれぞれの入力信号の波長に依存する非共鳴信号とを含む。検出器を用いて２つの出力信号を検出し、非共鳴出力信号から共鳴出力信号を識別することにより前記試料の分析内容に関するデータを決定する。共鳴および非共鳴信号の識別の目的で主成分回帰分析または多変量定量解析を出力信号に適用することができる。本発明の方法ならびに装置は共鳴出力信号同士、また非共鳴出力信号同士の識別も行なえる。

Description

【発明の詳細な説明】試料の化学分析用信号処理方法および装置技術分野本発明は、最小限の人手の介入で化学試料類を自動的に分析する方法に関する。一般に、人為的な関与が少いほど、有毒化学物質類による危険が少く、また分析コストも低い。本発明は、また化学試料類に関する情報を得る上で感度の改善された装置ならびにその方法に関する。背景技術化学試料の自動分析の一方式に、該試料が励起入力信号に当てられる「励起」技術がある。試料内の異なる化合物は、異なる出力信号類を生成する。出力信号は、該出力信号を放射する試料中の化合物の同定または定量のために分析される。出力信号を分析する一つの方法は、その出力信号の波長と、出力信号を発生する励起入力信号の波長とを比較することによる。出力信号は、「共鳴」および「非共鳴」信号を含むことができる。出力信号の波長が入力信号の波長に実質的に依存する場合、出力信号は「非共鳴」信号であるとされる。このような非共鳴信号の例として、レイリー（Rayleigh）信号、ミー（Mie）拡散、ブリユアン（Bri llouin）拡散およびラーマン（Raman）拡散等がある。出力信号の波長が入力信号の波長に対して実質的に非依存性の場合、出力信号は「共鳴」信号であるとされる。このような共鳴信号の例として、蛍光信号およびリン光信号等がある。既存の励起技術における問題は、共鳴信号および非共鳴信号が互いに干渉しかつ周波数的に重なり合うことがあることである。したがって、共鳴信号および非共鳴信号の間の識別は容易に可能にならない。励起技術の別の問題は、入力信号の拡散により生ずる。このような拡散は、基本以外の入力信号の拡散により、また非弾性拡散たとえば水のラーマン拡散により生ずる。したがって、入力信号で励起されたときに共鳴信号および非共鳴信号を発生する試料の分析内容を正確に決定するための方法およびにその装置が必要とされている。発明の開示本発明は、上記要求を充たす方法および装置を提供する。本発明の方法によれば、試料の分析内容は、第１および第２の入力信号を発生し、該入力信号群を前記試料へ指向することにより決定する。両入力信号の波長は、少くとも３ｎｍだけ異なる。両入力信号と試料との相互作用により、第１および第２の出力信号が発生する。各出力信号は、ピーク波長がそれぞれの入力信号の波長に対して実質的に非依存性の共鳴信号と、ピーク波長がそれぞれの入力信号の波長に依存する非共鳴出力信号とを含む。２つの出力信号の検出には、検出器を用いる。共鳴出力信号類と非共鳴出力信号とを弁別することにより、試料の分析内容に関するデータを決定する。たとえば、共鳴信号と非共鳴信号とを識別するために、主成分の回帰分析または多変量定量解析を出力信号類に適用することが出来る。本発明の別の態様において、共鳴信号を非共鳴出力信号から識別する代わりに、共鳴出力信号を相互に、または非共鳴出力信号を相互に識別することが可能である。共鳴出力信号の例として、蛍光標識またはリン光標識もしくは分析物により発生される信号がある。分析物が蛍光性またはリン光性の場合には、両入力信号の波長はいずれもリン光分子の蛍光の励起スペクトル内にある必要がある。「励起スペクトル」は、分子による有意な吸収がみられ、続いて分子からの光子の放出がみられる、波長である。好ましくは、２つの入力信号の蛍光波長またはリン光波長は約５〜４０ｎｍ離れ、さらに好ましくは約１０〜約３０ｎｍ離れるのがよい。本発明の１つの態様において、共鳴出力信号は関連する、すなわち出力信号群のそれぞれのスペクトルが形状的に一定であって、信号類がほぼ同じ周波数にピークを有する。これは蛍光放射の典型的な状態でり、蛍光化合物のスペクトル形状および出力ピークは、入力信号が励起波長域にある限り、入力信号の特定波長に依存しない。入力信号の発生には、各種方法を使用することができる。たとえば、別々の波長で動作する、たとえば光ファイバー導波管を用いて試料へ導波されるレーザダイオードのような２つの独立した光供給源を有する発生器とすることができる。信号は、液晶フィルタまたは何らかの波長変調手段を用いて変調することができる。出力信号の成分を識別する際、４つの出力信号（第１および第２の共鳴出力信号と第１および第２の非共鳴出力信号）の各々を表わす固有ベクトルを使用することができる。共鳴出力信号が相関する場合、すなわち実質的に同一のピーク出力の同一スペクトルを有する場合、単一の固有ベクトルの２つの共鳴出力信号を表すことが可能である。本発明は、また、この方法を実施するための装置に関する。本発明の装置において、入力信号類を発生する信号発生器を使用し、入力信号類を試料に指向するために案内を設けている本発明は、有意な利点を有する。試料を分析するためには、２つの入力信号で試料を励起するだけでよい。多数試料を必要としない。したがって、本発明によれば、迅速かつ効率的である。わずかな試料調整時間と実際の分析のためのわずかな時間とが必要とされるのみである。実際、複数の入力信号を使用することにより、複数の試料の使用の必要性が排除される。さらに、複数の励起入力信号を、たとえば別の入力信号間での電子的切り換えによって試料に当てることができるため、効率的なシステムが提供される。本発明の上記ならびにその他の特徴、態様および利点は、以下の詳細な説明と、添付の請求の範囲と、付属の図面とを参照することにより理解されよう。図面の簡単な説明図１は、化学試料の分析のための本発明によるシステムの構成要素を表わすブロック図である。図２は、２つの波長Ｗ１およびＷ２での励起波長における試料の蛍光放射応答を表わすグラフを示す図である。図３は、２つの波長Ｗ１およびＷ２での入力信号に応答する試料のラーマン分散出力を表わすグラフを示す図である。図４は、２つの波長Ｗ１およびＷ２での入力信号に応答する試料のレイリー「ウィング」出力を表わすグラフを示す図である。図５は、２つの波長Ｗ１およびＷ２での励起波長の変調において蛍光およびレイリー分散を発生する試料の放射スペクトルを表わすグラフを示す図である。図６Ａおよび図６Ｂは、ＨＤＩＴＣＰ（1,1',3,3'-ヘキサメチル(hexamethyl) -4,4',5,5'-ジベンゾ(dibenzo)-2,2'-インドリカルボシニアン過塩素酸塩(indot ricarbocyanine perchlorate)、コダック社レーザグレード）放射スペクトルのスケーリングをすることにより発生したスペクトルを示す図である。図７は、放射フィルタの変更によりピーク波長がシフトする異なる２つの波長において励起したＨＤＩＴＣＰ蛍光体からの放射スペクトルを示す図である。図８は、ＨＤＩＴＣＰ試料の７５０ｎｍ励起からの背景スペクトルであって、信号強度において背景以上の蛍光ウェルからのスペクトルと強度的に等しくなるような強度で増加する背景スペクトルを示す図である。図９は、ＨＤＩＴＣＰ試料の７９０ｎｍ励起からの背景スペクトルであって、号強度において背景以上の蛍光ウェルからのスペクトルと強度的に等しくなるような強度で増加する背景スペクトルを示す図である。図１０は、Ｋ行列すなわち古典的最小自乗法較正で線形回帰最小自乗法を用いるフローチャートを示す図である。図１１は、それぞれのスペクトルの固有ベクトル表現について因子分析（ＰＦＡ）と逆最小自乗法較正（ＩＬＳ）による全スペクトル定量分析のフローチャートを示す図である。図１２は、サビツキー・ゴリー（Savitzky-Golay）スムージングによる前処理または前瀘過を行なった主成分回帰（ＰＣＲ）定量分析のフローチャートを示す図である。図１３は、高速フーリエ変換（ＦＦＴ）と丸めによる時間領域でのＰＣＲ定量分析のフローチャートを示す図である。図１４は、２つの異なる波長Ｗ１およびＷ２で励起された試料に２つの蛍光体がある多重系での蛍光放射応答の略図である。図１５は、６８０ｎｍにおいて異なるフッ素濃度の放射スペクトルのグラフを示す図である。図１６は、６９０ｎｍにおいて異なるフッ素濃度の放射スペクトルのグラフを示す図である。図１７は、図１５および図１６のデータセットから抽出した３つの固有ベクトルを示す図である。発明を実施するための最良の形態検出装置図１を参照するに、分光分析機１０は、２つの励起入力信号を発生する２つの狭帯域供給源１１，１２を含む。両供給源１１，１２は、２つの選択した波長の１のレーザ信号を提供するように、それぞれが動作するレーザダイオードとすることができる。両供給源１１，１２からの信号は、第１の光ファイバー導波器１３，１４により指向される。両光ファイバー導波器１３，１４は分岐光ファイバー導波装置１５の一部であり、入力信号は接合した光ファイバー導波装置１５により指向される。両供給源１１，１２の各々から信号を得るための他の方法を使用することができ、たとえば、ダイクロイック・ミラーまたは反射ミラー切り換え技術等を使用することができる。さらに、両光ファイバー導波器１３，１４の代わりに、ビームスプリッタを用いて信号を案内してもよい。光ファイバー導波装置１５の端部からの信号はコリメートレンズ１１６に向けられ、ここで平行にされた信号１１５は波長変調器１６へ案内される。波長変調器１６は、液晶フィルタまたは機械切り換え式フィルタとすることができる。変調器１６は、両供給源１１、１２からの２つの波長の各々をさらなる処理のために通過させるべく、効率的に動作する。信号１１５は、変調蓋１６から収束レンズ１１７に向かう。第１の波長の収束された第１の入力信号１１８Ａと第２の波長の収束された第２の入力信号１１８Ｂとは、分析物を含む試料１７と相互作用する。試料１７は、２つの出力信号を放射する、すなわち２つの励起入力信号１１８Ａおよび１１８Ｂに対応する第１および第２の出力信号１８Ａおよび１８Ｂを相互作用の結果として放射する。試料１７からの両出力信号１８Ａ，１８Ｂは、両入力信号１１８Ａ，１１８Ｂの径路と直交する径路に沿って指向される。この横断径路は、両出力信号１８Ａ，１８Ｂが共鳴信号のとき、たとえばリン光信号または蛍光信号等であるときに使用するのが好ましい。これは、検出器に到達する励起入力信号からの光量を制限するために好適である。試料１７からの両出力信号１８Ａ，１８Ｂは、フィルタと、拡散要素および／またはモノクロメータを含むことができる信号処理器１９を通過する。信号処理器１９からの出力信号群は、径路２０により検出器２１へ向けられる。検出器２１からの信号群は、両出力信号１８Ａ，１８Ｂを識別分析するための識別手段２２へ径路１２１により向けられる。識別手段２２は、多変量分析パッケージとすることができる。両供給源１１，１２と、波長変調器１６と、信号処理器１９と、検出器２１とは、ハードウェア・インタフェース２００に接続される。インタフェース２００はコンピュータ２０１に接続されており、このコンピュータは、典型的には、識別手段２２のソフトウェアと、印刷機と、ディスプレイと、端末と、メモリと、マイクロプロセッサとを含む。インタフェース２００は、ユーザが操作してインタフェース部材を動作させ、必要に応じて識別手段２２からの処理済みデータを得る。試料への各入力信号は強度レベルを有し、試料は励起係数を有する。好ましくは、入力信号の波長Ｗ１における強度と試料の波長Ｗ１における励起計数との数学的積が波長Ｗ２およびその他全ての本発明で使用しているＷでの数学的積とほぼ等しくなるはずである。こうようになる場合、入力信号群から得られた出力信号群の強度はほぼ等しい。これにより、両レーザ１１，１２の波長Ｗ１，Ｗ２がそれぞれ装置感度を最大にするように選択され、制御される。光源１１，１２のそれぞれのための単一波長調整可能レーザは、システム内の光学系の部材数を少くするために好適である。場合によっては、２つの異なる波長に調整可能な単一のレーザを使用して、異なる２つの波長の２つの信号を出力することができる。近赤外域で有効な方法は、１つのダイオード・レーザを使用することである。別の方法は、図示したように、それぞれが別の波長でレーザ発振する２つまたはそれ以上の独立したダイオード１１，１２からの高速選択を使用することである。多数の波長における多数の入力信号は、複数の調節可能なまたは固定式すなわち独立したレーザから得られる。調節可能なレーザ群を使用する場合、基本波長より長い波長域のスペクトル成分は、光学フィルタ、たとえば変調器１６において除去される。これは、識別手段２２により除去しようとする余分な信号の量を最小限に抑えるために必要である。処理器１９内のフィルタ類は、励起波長における拡散光を減少させ、長い波長の光を通過させる。これにより、検出器２１の飽和を防止し、識別手段２２により影響をもたらす必要のある拡散光の破棄量を最小限に抑える。入力信号群の変調励起レーザ光源１１，１２の変調には、決定の間、フィルタを連続的に変化させることが必要である。この機械光学的作業は、複雑である。フィルタの機械的な切り換えを避けるため、強誘電液晶装置が変調器１６として機能する。変調器１６は、フィルタを波長変調と同期して励起波長に電子的に適応させる。好適な種類の液晶フィルタは、コロラド大学から入手可能であり、以下の米国特許に開示されている。第５，１３２，８２６号「ＦＬＣ調整可能なフィルタおよび色発生」、第５，２３１，５２７号「キラルスメクチック液晶偏光干渉フィルタ」、第５，２４３，４５５号「キラルスメクチック液晶偏光干渉フィルタの改良」、および１９９３年５月１７日付米国特許出願第０８１０６２５８５号「スプリットエレメント式液晶調整可能な光学フィルタ」。これらの特許および特許出願の内容は本明細書の参照に含まれる。試料内の分析物が蛍光性またはリン光性の場合、異なる２つの波長Ｗ１，Ｗ２はどちらも分子の励起スペクトル内にある。「励起スペクトル」は、試料中の分子による有意な吸収があり、これにより光子が放出されるようになる、スペクトルをいう。Ｗ１，Ｗ２の差は、少くとも３ナノメートルで、典型的には約５〜約４０ナノメートルまた約１０〜約３０ナノメートルが好適である。２つまたはそれ以上のレーザがある場合、この波長差はフィルタおよび／またはモノクロメータの機械的切り換えによるのではなく、変調器１６内の電子的変調により実現する。変調器１６の強誘電液晶装置は、高速変調が可能で、機械的可変フィルタからの解放をもたらす。別の構成において、高速切り換え式レーザを使用して異なる波長の２つの入力信号群を提供する場合でも、フィルタは必要とされる。出力信号：信号間の識別放射出力信号１８Ａ，１８Ｂ（それぞれ第１および第２の入力波長Ｗ１およびＷ２において）は、両出力信号間の識別のための励起放射マトリクス（ＥＥＭ）の少くとも一部を構成するのに用いられる少ない励起波長シフトから定量的情報を抽出する能力は、基本成分の回帰分析の使用によるものである。このような技術は、入力波長でのシフトで変化する非共鳴出力信号のスペクトル成分を、実質的に一定で共鳴周波数の励起スペクトル内での入力波長の変化に依存しない共鳴出力信号のスペクトル成分から分離する。一度分離されれば、これらの信号は破棄されるかまたは定量モデル内に維持される。第１の出力信号１８Ａは、第１の波長Ｗ１で試料１７と第１の入力信号１１８Ａとの相互作用により発生される。第２の出力信号１８Ｂは、第２の波長Ｗ２で試料１７と第２の入力信号１１８Ｂとの相互作用により発生される。試料１７の特性を得るためには、波長Ｗ１，Ｗ２の同じ両入力信号１１８Ａ，１１８Ｂが異なる濃度の試料１７に照射される。各濃度について異なる出力信号１８Ａ，１８Ｂが決定される。異なる色素濃度のこれらの異なるスペクトルの表現が図６Ａと図６Ｂに図示してあり、さらに詳細を後述する。典型的には、第１の出力信号１８Ａは、（ｉ）ピーク波長が第１の入力信号１１８Ａの波長Ｗ１に実質的に非依存性である第１の共鳴出力信号と、（ｉｉ）ピーク波長が第１の入力信号１１８Ａの波長Ｗ１に依存性である第１の非共鳴出力信号とを含む。第２の出力信号は、（ｉ）ピーク波長が第２の入力信号１１８Ｂの波長Ｗ２に実質的に非依存性である第２の共鳴出力信号と、（ｉｉ）ピーク波長が第２の入力信号１１８Ｂの波長Ｗ２に依存性である第２の非共鳴出力信号とを含む。識別手段２２は、共鳴出力信号と非共鳴出力信号を識別するように作動する。図２は分光分析に関して本発明の態様を示す蛍光を決定するためのスペクトルを示しており、出力信号は共鳴出力信号を含む。図２において、励起スペクトルは、Ｗ０とＷ４との間の波長として定義される。共鳴信号の波長は、試料１７の放射分子の電子遷移により支配される。入力信号蛍光決定のための分光処理において、両出力信号１８Ａ，１８Ｂを試料１７から発生させるために少くとも２つの入力信号１１８Ａ，１１８Ｂが提供される。入力信号１１８Ａ，１１８Ｂは、光源ダイオード１１，１２から放射されて変調器１６で処理され、Ｗ１からＷ２まで変化する選択した励起波長を有する。この範囲は、Ｗ０からＷ４までの波長として定義された励起スペクトル内にある。Ｗｍは、最大励起波長を表わす。入力信号群１１８Ａ，１１８Ｂの波長がＷ０以下またはＷ４以上の場合には、試料１７内の分子による有意でない吸収がある。したがって、分子からの光子放射が不十分となる。試料１７内の分析物は吸収レベルを有し、レーザ光源は１以上の出力レベルを有する。波長Ｗ１およびＷ２は、それぞれ、レーザ出力レベルと分析物の吸収レベルとの数学的積が第１および第２の波長Ｗ１およびＷ２で同じになるように選択するのが好ましい。Ｗ１，Ｗ２は、どちらも、たとえばＷｍの下側またはＷｍの両側に有り得る（図２を参照）。Ｗ１からＷ２の範囲は、最大励起の近くにあり、最大蛍光応答すなわち励起スペクトル内での最大放射が得られる。励起スペクトル２３は、図２においてＷ０からＷ４までの間に模式的に示している。第１の入力信号１１８Ａは第１の波長Ｗ１を中心としており、第２の入力信号１１８Ｂは第２の波長Ｗ２を中心としている。共鳴出力信号のスペクトル第１の出力信号１８Ａは放射スペクトル２４Ａを有する第１の共鳴出力信号２４を含み、第２の出力信号１８Ｂは放射スペクトル２５Ａを有する第２の共鳴出力信号２５を含む。図２で説明した実施例において、共鳴出力信号は蛍光信号ある。両出力信号２４，２５は、その放射スペクトル２４Ａ，２５Ａのそれぞれが形状的に一定であり、両信号２４，２５がほぼ同じ周波数にピークを有することから、「関連性がある」。両信号２４，２５は、それぞれの振幅が異なっても、それらの一定の形状のため、振幅とは無関係にまだ関連する。図２から明かなように、放射スペクトル２４Ａ，２５Ａの形状は、一定であり、また線２８で示すように同一波長を中心としている。両信号２４，２５の振幅は、変化することができる。これは、Ｗ１における第１の定量信号２４のピーク２６により示されている（図２を参照）。Ｗ２における第２の定量信号２５のピーク２７は、ピーク強度２６より小さい。本発明の別の実施例において、両ピーク２６，２７は等しいか、またはピーク２７がピーク２６より高くなることがある。強度の相対的な値は、強度値が同一の強度範囲内で動作可能な関連がある限り、すなわち約１０００：１以下である限り識別手段２２により決定されるべき所望のデータに影響しない。図２ではＷ１，Ｗ２の２つの入力信号および線２８で示した同じ波長付近のスペクトルを有する２つの出力信号を示したが、適宜複数の異なる波長の複数の入力信号を有することが可能である。したがって、同じスペクトルを有する３つの出力信号群を有することが所望の場合には、Ｗ１と、ＷＭと、Ｗ２とに入力信号が存在することがある。また、波長Ｗ１からＷ２が変化する場合、出力信号群の放射スペクトルは線２８を中心とする極大に残る。たとえば参照番号２６，２７で示したように、強度が波長Ｗ１からＷ２へ変化する。効果的には、異なる入力波長Ｗ１からＷ２における別の放射スペクトルを表わす曲線２４，２５が縦方向に移動する。曲線は線２８を中心としており、放射スペクトルは一定である。すなわち、スペクトルは図示した出力信号２４，２５と類似した同様の形状を有することになる。共鳴出力信号同士を互いに識別する上で、両共鳴出力信号のスペクトルを比較する。図１４を参照するに、入力信号は別の励起波長Ｗ１，Ｗ２を有しており、出力信号は別の放射スペクトルを有する。第１の出力スペクトルＡは、第１の成分スペクトル曲線Ａ１，Ａ２を有する。第２の出力スペクトルＢは、第２の成分スペクトル曲線Ｂ１，Ｂ２を有する。これら第１および第２の成分の波形は、図１４に図示すように関連している。このように、曲線Ａ１は曲線Ｂ１と相関し、曲線Ａ２は曲線Ｂ２と相関する。第１の共鳴信号についてのスペクトルＡ，Ｂの組み合せが曲線Ｃである。第２の共鳴信号に対するスペクトルＡ，Ｂの組み合せが曲線Ｄである。信号自身が関連した放射スペクトルを有していても、別の共鳴出力信号の励起波長が異なるため、異なる共鳴信号を識別することができる。非共鳴出力信号のスペクトル図３および図４は、出力信号が非共鳴出力信号を含むような分光分析に関連したスペクトルを示す。入力信号と励起スペクトルは、図示していない。波長Ｗ１，Ｗ２は、２つの入力信号の波長を表わす。入力信号の基準は、図２を参照して説明したのと同じである。ラーマン分散（図３）図３に関して説明した実施例において、第１の出力信号１８Ａは放射スペクトル２９Ａを有する非共鳴出力信号２９を含み、第２の出力信号１８Ｂは放射スペクトル３０Ａを有する非共鳴出力信号３０を有する。両出力信号２９，３０は、それぞれの放射スペクトル２９Ａ，３０Ａが形状的に一定ではなく、入力信号の波長に依存して位置的に移動するため、「関連性がない」。非共鳴出力信号２９および３０は、それぞれ、ラーマンスペクトル２９Ａおよび３０Ａを有するラーマン信号群を含む。スペクトル２９Ａはスペクトル位置Ｒ１に強度ピーク３１を有し、スペクトル３０Ａはスペクトル位置Ｒ２に強度ピーク３２を有する。出力ラーマン信号の波長は、入力信号の波長変化に対応して、図３に示すように予測可能な方法で変化する。入力波長がＷ１からＷ２へシフトすると、スペクトル２９Ａのスペクトル位置Ｒ１がスペクトル３０Ａのスペクトル位置Ｒ２へシフトする。Ｒ１からＲ２へのシフトは、関連しない出力信号２９，３０を表す。両ラーマンピーク３１，３２の正確な位置は、ラーマンシフトを決定する分散中心の非弾性と、拡散光がシフトする基準を決定する励起波長Ｗ１，Ｗ２との両者に依存する。第１および第２の非共鳴出力信号２９，３０のスペクトルは実質的に一定または同一ではないので、信号は関連しない。レイリー分散（図４）レイリー分散が起る波長も、図４に示すように励起波長に依存する。蛍光分光計の場合、レイリー分散または背景信号成分は、負の傾斜を取る基線またはウィングとして一般的にみられる。図４に示す実施例では、２つの入力信号１８Ａおよび１８Ｂは、それぞれ、波長Ｗ１およびＷ２を中心としている。第１の出力信号１８Ａは放射スペクトルまたはウィング３３Ａを有する非共鳴出力信号３３を含み、第２の出力信号１８Ｂは放射スペクトルまたはウィング３４Ａを有する非共鳴出力信号３４を含む。両出力信号３３および３４は、それぞれ、それらの放射スペクトル３３Ａおよび３４Ａが形状的に一定ではなく、位置が両入力信号の波長によって移動するため、関連性がない。レイリー分散を有する出力信号と蛍光信号（図５）図５は、レイリーおよび蛍光出力信号両者のスペクトルを示す。図５に示す実施例では、２つの入力信号１８Ａおよび１８Ｂは、それぞれ、波長Ｗ１およびＷ２を心とする。第１の出力信号１８Ａは第１のレイリー出力信号３５Ａと第１の蛍光出力信号３５Ｂとを含み、第２の出力信号は第２のレイリー出力信号３６Ａと第２の蛍光出力信号３６Ｂとを含む。第１および第２の出力信号は、それぞれ、スペクトル３５および３６で表わされる。スペクトル３５および３６は、それぞれ、関連性のある両蛍光信号３５Ｂおよび３６Ｂと、関連性のない両レイリー信号３５Ａおよび３６Ａとの両者を含むスペクトルを表わす。出力信号識別のための信号処理識別手段２２は、検出器２１から得られた両出力信号１８Ａ，１８Ｂをこれらの出力特性に基づいて成分信号に分離する。出力信号の処理は、出力信号の放射スペクトルの主成分分析を含む。図２を参照するに、第１の共鳴出力信号は、第１のスペクトル２４Ａを有する第１の蛍光信号２４を含む。第２の共鳴出力信号は、第２のスペクトル２５Ａを有する第２の蛍光信号２５を含む。第１および第２のスペクトル２４Ａおよび２５Ａは一定であり、このことから第１および第２の蛍光出力信号２４および２５は関連している。スペクトルは、単一スペクトル中の線の組み合せとして図示してある。スペクトルは、試料１７中の蛍光成分の放射スペクトルを表わす１つの固有ベクトルとして定義することができる。単一の係数は、蛍光物質の全放射強度におけるあらゆる変化の尺度を定量し提供するように使用される。図３を参照するに、第１の非共鳴出力信号は、第１のスペクトル２９Ａを有する第１のラーマン分散２９を含む。第２の非共鳴出力信号は、第２のスペクトル３０Ａを有する第２のラーマン分散３０を含む。非共鳴信号群は、図４に示すようにレイリー信号群も含む。ラーマン分散の放射スペクトルを図３に示し、レイリー信号の放射スペクトルを図４に示す。図３のラーマン分散の放射スペクトル２９Ａ，３０Ａが一定のスペクトル形状を有していないので、両信号は関連しない。つまり、これらは単一の固有ベクトルによって表すことができない。同様に、図４のレイリー信号の放射スペクトルは単一の固有ベクトルを使って表することができない。前述の共鳴信号および非共鳴信号のスペクトル形状間の差は、Ｗ１およびＷ２の間で励起波長を変化させて得た単一試料からのデータの主成分回帰分析により分離可能である。多変量解析の他の技術たとえば偏最小自乗法を用いることもできる。蛍光信号とたとえばレイリー分散のような分散信号との両者を含むＷ１およびＷ２における励起に対応する放射データセットは、多変量モデルを使用して処理される。このようなモデルでは、励起波長に依存しないような固有ベクトルを基準にして定量化が行なわれる。この手法においては、分散信号群、すなわち関連性のない出力信号は、定量モデルすなわち関連信号たとえば共鳴信号から排除される。多変量定量分析検出器２１から得られた出力信号を表わすデータは識別手段２２で処理され、出力信号はその特性に基づいて成分に分解される。両出力信号１８Ａ，１８Ｂの処理は、多変量定量分析を含む。この分析は、出力信号を表わすデータの前処理と、検出装置の較正と、未知の試料の属性の定量的決定とを含むことができる。処理と計算は、ラボカルク（LabCalc(R)）分光分析ソフトウェア・パッケージ（バージョンＡ２．２２、ギャラクティック・イングストリーズ・コーポレーション、ニューハンプシャー州セーラム（Galactic Industries Corporation，Sal em，New Hampshire））で行なうことができる。スペクトルの読み込み、記憶、データの操作と表示、ならびにデータを表わすアレイやベクトルの処理機能がこのプログラムで可能である。他に多くのソフトウェアプログラムがスペクトル分析を行なうために入手可能である。たとえば、ニコレット（ニコレット社、ウィスコンシン州マジソン（Nicolet，Nicolet in Madison，WI））、パーキン・エルマー（コネチカット州ノーウォーク（Perkin-Elmer，Norwalk，Ct.））、デジラボおよびパイロベット（インフォメトリクス社、ワシントン州シアトル（Digi lab and Pirovette，Infometrix of Seattle，WA））の定量分析パッケージがある。スペクトル分析の手順は、周知であり、たとえば、マリノフスキーとハワリーの「因子分析と化学」、ワイリー・インターサイエンス社、１９８０年（"Fac tor Analysis & Chemistry by Malinowski and Howery，Wiley-Interscience，1 980）に記述されている。この参考文献の内容は本明細書の参照に含めてある。データの分析とデータに対するその影響について簡単に述べる。データの前処理多変量モデルは、標準試料から収拾したデータと、これらの標準物質での所望の分祈物の特性の既知の値とを相関させることにより経験的に較正を行なっている。フーリエ変換は、定量精度と処理を行なう速度との両者を改善する。有限非周回関数のフーリエ変換、すなわちスペクトルは、多変量定量分析のためのデータにとって有用な前処理技術である。このような変換は、オリジナルデータの全ての定量的情報の独自かつ有効な表現を保持する。フーリエ変換は、線形変換であり、従来の吸収または強度単位と同様の分析物濃度に線形比例する周波数および規模のデータ点を保存する。スペクトルの紫外域、可視光、近赤外および赤外領域における濃縮相物質のスペクトルが波長に対して比較的ゆっくり変化する信号成分の有用な定量情報のほとんどを保持するようにフーリエ分析で示される。検出器の雑音、光源の揺動、およびその他のもっと速く変化することの多い干渉は、弁別により分離される。その他の方法をデータの前処理または前漉波として用いることができる。この関連において、移動平均技術、たとえばサビツキー・ゴリーフィルタを高周波雑音の除去に使用することができる。しかし、このようなフィルタは、一般に、フーリエ枝術で可能な範囲までデータ点の個数を減少し得ない。データの前処理についてのさらなる情報は、米国特許第４，６６０，１５１号（チャップマン）に記載されている。この特許の内容は本明細書の参考に含まれる。前処理により、信号中の冗長データや雑音の量が効果的に減少する。本発明の意味においてこのような前処理は任意選択である。多変量処理両出力信号１８Ａ，１８Ｂを表わす実検データは、識別手段２２において、古典的最小自乗法、逆最小自乗法、主成分回帰、および偏最小自乗法のいずれか１つまたはそれ以上により処理することができる。データは、時間ドメインでまた生スペクトルとして処理される。それぞれの技術の精度基準として、標準予測誤差（ＳＥＥ）および標準推定誤差（ＳＥＰ）が求められる。逆最小自乗法は、古典的最小自乗法に基づいている。単一の行列の反転が較正段階の間に必要であり、計算で用いる要素数、波長数、または混合に制約はない。逆最小自乗法は、濃度変動を最小に抑える。分光決定は、ある程度の不確実性を有する。不確実性の主体が分光データ内にない場合、逆最小自乗法が好適である。それ以外では、古典的最小自乗法が好適である。逆最小自乗法で必要とされるより少い行列の反転は、回帰段階の間の座標変化の潜在的な利点より、影響が大きくなる傾向にある。逆最小自乗法は、ほぼ単一の行列における問題に対する抵抗が大きいことから好適な方法である。多数の線形回帰判定における行列の特異性の問題は、直交法を用いることで減少される。これは、単独の値の分解による固有ベクトル分析、または因子分析である。直交行列は、全ての列ベクトル類が事実上直交する行列である。逆最小自乗法以前の行列の直交により特異性の問題なしに行列の反転が可能になる。この技術は、主成分回帰である。この技術は、また、Ｐ行列法、標的変型因子分析、または標的因子分析としても公知である。古典的最小自乗法以前の行列の直交では、特異性の問題なしに未知の行列の判定もすることができる。第２の直交処理は、第１の行列が正方形でない場合に、未知の濃度の予測を行なえるようにするために必要である。主成分回帰計算で使用する固有ベクトルの個数は、最低の標準予測誤差値が特定のデータセットで得られるようなものである。固有ベクトルは、データセットと前処理法との組み合せのそれぞれについて経験的に求められる。基本セット内の固有ベクトル数を増加すると、モデル内において使用される自由度が多くなるので、標準推定誤差が低下する。雑音と背景分散の除去一般に、データのプリプロセシングまたは前処理は、分析物データに無作意なスペクトル特性を有するような信号成分たとえば雑音、無作意な大きさの懸濁粒子による拡散、無作意に発生する汚染物質等が含まれる場合に、有用である。必要とする共鳴および関連出力信号を得るためにデータを前処理して処理する別の方法が可能である。図１０は、放射スペクトルの分析の方式を示す。２波長古典的線形回帰（古典的最小自乗法またはＫ行列）較正は、各放射ピークの、基線について補正した最大強度が濃度に適合するように、用いられる。この例では、データの前処理は行なっていない。図１１は、主成分回帰分析を用いる全スペクトル較正を示す。この例では、データの前処理は行なっていない。図１２はサビツキー・ゴリー・アルゴリズムにより平滑化または前処理したデータの全スペクトル分析を示しており、波長における強度は波長群における決定した強度群の重み付け手段により置換されている。サビツキー・ゴリー平滑化は、高周波雑音の除去に充分である。丸めフーリエ級数としてデータを表すと、高いデータ圧縮および低周波背景成分の弁別能力というさらなる利点が得られる。図１３は時間ドメインにおけるデータの主成分回帰分析を示しており、高速フーリエ変換によりデータを処理している。図１０から図１３に示す４つの定量モデルは、有意なスペクトルの重複または干渉を有していない蛍光放射スペクトルに適用した場合、類似の標準誤差を示している。データにわずかな雑音しか存在しない場合、各種の前処理法または前処理法が比較的密接に関連する。スペクトルの重複が大きな度合で存在し、たとえばレイリー拡散からまたエネルギー転移から信号成分に干渉する場合、多変量解析法は、データの前処置または前処理がない場合であっても、干渉を解決することができる。背景信号のスペクトル形状が適合している場合、また単純に試料間で大きさだけが変化する場合、標準混合物のセットが信号レベルから背景の非依存性を見つけ出せるだけ充分に広がっているならば、因子分析と標的変型とを用いて背景からの信号の分離を行なうことができる。実施例実施例１（図６Ａ，図６Ｂ，図７）近赤外蛍光体ＨＤＩＴＣＰ1,1',3,3'-ヘキサメチル（hexamethyl）-4,4',5,5' -ジベンゾ(dibenzo)-2,2'-インドリカルボシニアン過塩素酸塩(indotricarbocya nine perchlorate)、コダック社レーザーグレード）の７５０ｎｍダイオードレーザ励起を用いて、９つの異なる色素濃度に希釈した一連の試料でスペクトル振幅の変化が得られるようにして放射スペクトルが得られた。図６Ａは、これらを示しており、波長７５０ｎｍでの試料の励起後にＨＤＩＴＣＰ放射スペクトルのスケーリングをして発生したスペクトルを示す。これらのスペクトルは関連している出力信号を表わしているが、これはそのスペクトルが分析物濃度にしたがって均一に変化しているためである。「関連」信号群は２つまたはそれ以上の見かけ上異なった出力信号で、均一なまたは予測可能な方法で分析物濃度にしたがい変化するようなものである。同様な一連のスペクトルが７９０ｎｍの励起波長についても展開され、それを図６Ｂに示す。これらのスペクトルも、スペクトルが分析物濃度にしたがって均一に変化することから、関連する出力信号群を表わしている。スケーリングをしたスペクトルは、７５０ｎｍおよび７９０ｎｍの励起を用いて適宜得られた背景スペクトルとのベクトル加算により、それぞれ組み合せた。データならびに濃度の信号対背景雑音比を独立に操作して、一組の分析物濃度を得た。スケーリングをしたスペクトルのそれぞれには、スペクトルの信号の大きさの１％に等しい無作意な「白色」雑音成分を加えて実際の測定の不確実性のシミュレーションをした。スケーリングをし雑音を加えたデータは、LabCalc ベーシック・プログラム・モジュール（ギャラクティック・インダストリーズ、ニューハンプシャー州）を用いて主成分回帰により多変量分析を行なった。行列として計算した標準予測誤差（ＳＥＰ）および標準推定誤差（ＳＥＥ）を用いてデータを分析し、多変量計算により非重畳励起変調蛍光データならびにこの作業を実行するために必要な有意成分ベクトル数を求めた。スケーリングをしたスペクトルは、非常に大きな信号対雑音比を有していた。スケーリングをしていない背景スペクトルは、ピーク強度が１０の−４乗程度で、蛍光信号のそれに追加した。追加した背景成分は、蛍光信号に対して有意ではなく、また非重畳処理に対して挑戦するものでもなかった。図７は、単一試料の２つの放射スペクトルを示す。図７は、７５０ｎｍ励起における図６Ａの系列の１つのスペクトル５２と、７９０ｎｍ励起における図６Ｂの励起スペクトルからの系列の１つのスペクトル５３を表わしている。２つの異なる放射フィルタをそれぞれ７５０ｎｍおよび７９０ｎｍで励起した蛍光信号の発生に使用した。それぞれの放射スペクトル５２，５３の放射ピーク５０，５１は、両データセットに共通の独自の形状を有していない。スペクトルは、図７に示すように、励起波長に依存した別の度合にフィルタで畳込み積分した。図７において、データのスケーリングで発生したスペクトルを分析して、放射スペクトルの形状が励起波長に依存している部分において良好な定量（＜２％誤差）が可能であることが分かった。分析には、２つの固有ベクトルを用いた。第１の固有ベクトルは、７５０ｎｍと７９０ｎｍの放射スペクトルの平均である。第２のベクトルは、バイポーラ固有ベクトルで、７５０ｎｍから７９０ｎｍへ移動するピーク放射の見かけシフトを表わしている。定量は放射スペクトルが一定の形状でないが、濃度とともに一定変化する場合励起波長で変調したデータについて行なうことができる。これによって励起波長と同期して放射フィルタ群をどこで多重化して、拡散ピークによる検出器の飽和を回避するかがわかる。つまり、光の拡散等の非共鳴信号からの共鳴信号の定量情報の非重畳は、多変量解析を用いて得ることができる。実施例２（図８および図９）全ての測定について、放射チャネル内に同じ干渉フィルタを用いた７５０ｎｍおよび７９０ｎｍ励起を使ってＨＤＩＴＣＰでの一組のスケーリングをしたスペクトルを発生した。この実験では、背景スペクトルは、必要な係数（１０⁴）によりスケーリングをして、最低の蛍光「濃度」でほぼ１となる信号対背景雑音比を得た。スケーリングをした背景雑音をスケーリングをした蛍光スペクトルに加え、「白色」雑音を得られた和に加えて実験的測定の不確実性のシミュレーションをし、数学的に完全なデータを供給した場合に起り得る特異性の発生を回避した。図８および図９の平滑スペクトルは、蛍光を表わす。蛍光スペクトルは、励起波長と関わりなく共通のピーク形状を有している。図８と図９の不規則な線は、背景のミーおよびラーマン出力スペクトルを表わす。多変量解析は、ラーマンおよびミー信号のような非共鳴信号から蛍光のような共鳴信号を分解する。固有ベクトル群は、ラーマンおよびミー信号に割り当てられ、またそれぞれの入力信号波長で蛍光信号に割り当てた。つまり、固有ベクトル群は、共鳴信号群（即ち蛍光）と非共鳴信号（即ちラーマンおよびミー）とに割り当てられた。このような割り当てと多変量解析の適用によって、非共鳴信号が識別された。蛍光および背景データのためのシステムのモデリングをするためには、５つの固有ベクトルが必要であった。未知データの％誤差は、およそ７％であった。固有ベクトル数が低信号／背景の比の結果により２〜５に増大した。固有ベクト自体に加えて７５０ｎｍと７９０ｎｍの背景と、７５０ｎｍおよび７９０ｎｍの光との両者の検出器への弾性拡散について考慮に入れるためにさらなる自由度が必要である。光源波長と放射フィルタ通過帯域の両者の同期変調により背景非共鳴信号から解析できるデータが得られる。時間に依存する波長感度が放射チャンネルへ導入されて拡散光を抑圧し検出器のダイナミックレンジを保存するようなシステムを使用できる。１つまたはそれ以上のさらなる固有ベクトルを基本セットに追加することにより、所望の定量情報をデータから抽出することができる。実施例３ＮＩＲ蛍光ＩＲ１４４−プロパンジアミン（ＩＲ１４４−ＰＤＡ）溶液を、１０^-8モルから１０^-9モルの範囲の濃度に調整した（表１）。これらの試料の溶液は、凍結乾燥した形状から再構成したベックマンＡＰＯコントロール血清とした。このマトリクスは、多少混濁しており、使用した励起波長に依存し、また選択した濃度でＩＲ１４４−ＰＤＡからの蛍光と大きさが比較できるような背景信号を発生する。試料は、ＦＷＨＭが１６ｍｍとなるように選択したスリットを使用するＳＬＭ−ＡＭＩＮＣＯＳＬＭ４８００Ｃ装置の回折モノクロメータを通過させた後、４５０ワット・キセノン電弧ランプの出力により励起した。モノクロメータの中心波長は、励起波長の変調を行なうために６８０ｎｍまたは６９０ｎｍのいずれかに設定した。試料からの放射は、ＳＬＭ４８００Ｃのハママツ（商標）Ｒ９２８の電流モード動作の光電子増倍管により通常の角度において検出した。得られた放射スペクトルは、ネットワーク上のファイルサーバへアップロードしてＧｒａｍｓ／３８６（バージョン２．０１Ａ、レベルＩＩＩ、ギャラクティック・インダストリーズ、ニューハンプシャー州セーラム）によりでサポートされているアレイ・ＢＡＳＩＣ言語(Array Basic)で書かれたモジュールを使用して分析に適切なフォーマットに変換した。多変量解析は主成分回帰を用いて行なった。観測データの固有ベクトル分析により非共鳴背景成分からの共鳴信号の抽出ができ、これによって分析モデルの定量精度が改善された。図１５と図１６に示すオリジナルのデータは、それぞれ、６８０ｎｍおよび６９０ｎｍの励起についてである。データにおいて、拡散信号は、６９０ｎｍ励起を使用したときに存在しており、７１０ｎｍおよびそれより長い波長域に位置することが分かる。励起が６９０ｎｍに移行すると、拡散信号は大幅に不明瞭になるが、これは励起と放射波長の間の隔たりが大きいためである。図１７は参照番号１，２，３で示す３つの固有ベクトルを示し、これは「トレーニング・セット」（表１）を含むように選択したデータのサブセットの因子分析から得られたものである。トレーニング・セットの説明や多変量解析のその他の態様については、マリノフスキー著「化学における因子分析」第２版、米国ニューヨーク、ワイリー・インターサイエンス社、１９９１年（"Factor An alysis in Chemistry"2nd ed.，by E．Malinowski，Wiley-Interscience，New Y ork，USA，1991）を参照されたい。第１と第２の固有ベクトルはそれぞれ（蛍光＋背景）と（背景）信号成分を表わしており、これら２つのベクトルの直線的な組み合せが作成され蛍光データから背景信号が減算される。第３の固有ベクトルの追加は、７１０ｎｍ付近の尖鋭な「スパイク」として追加の背景成分が存在することを表わすさらなる自由度を提供する。データの因子分析では、実験データに３つの異なる信号が存在することと、これらの信号を加算して観察された放射スペクトルが得られることを示唆している。（全体としてみて）データに２つの別個の背景が存在することを考えた場合、これは理解可能である。これらの背景は、励起波長６８０ｎｍを使用した試料の拡散および内因性行列蛍光と６９０ｎｍの使用による別の背景に対応する。しかし、ラベルＩＲ１４４−ＰＤＡは、励起波長の変調によって形状が変化しない一定の放射スペクトルを発生するので、データセットに広がる全体で３つの固有ベクトルのうち１つの固有ベクトルにだけ関与する。図１７に示す微分固有ベクトルに基づく主成分群回帰（主成分回帰）に基づいたデータの定量モデルは、一般に混合物の蛍光物質濃度が６８０ｎｍと６９０ｎｍ両者の励起放射スペクトルに主成分回帰予測を適用してそれぞれのスペクトルについての濃度計算の平均（表２）を取ることにより未知のスペクトルから計算できることを示している。このレベルの精度では、必要とする固有ベクトルが３つだけである。以上の例は、次の結論を支持する。１．ＩＲ１４４−プロパンジアミンとコントロール血清とを使用して発生したデータは、励起波長を変化させて得られた一組の放射スペクトルから共鳴および非共鳴の両信号を分離するための主成分回帰能力を示している。２．得られた多変量定量モデルは、優秀な背景排除特性を示しており、６８０または６９０ｎｍいずれかで励起した放射スペクトルからの蛍光物質濃度の予測が可能である。３．励起波長を６８０ｎｍから６９０ｎｍへ変化させた場合、所望の分析物から２つの関連しない背景スペクトルと２つの関連する蛍光スペクトルが発生される。固有ベクトル分析では、２つの関連しない信号が２つの関連しない固有ベクトルを発生させるが、同一形状を有する２つの関連した蛍光スペクトルは全体で３つのうちの１つだけの固有ベクトルを発生する。本発明の変化本発明には、その他多くの態様が存在し、そのそれぞれが詳細においてのみその他から異なっている。たとえば、Ａ．２つの波長を有する入力信号に説明が基づいているが、２つ以上の入力信号に２つ以上の独立した波長が適用できる。Ｂ．システムのレーザ光源の代わりに、広帯域励起光源、たとえば電弧ランプ、レーザポンプ音響光学的調整可能なフィルタまたはタングステンランプを使用することができる。Ｃ．本システムは、少くとも近赤外領域と可視光領域の周波数帯で動作可能である。図２、図３、図４に示すように、開示した範囲はおよそ７００から８５０ナノメートルの間にある。もっと広い周波数範囲での信号を上記で説明した実施例に説明した信号と同様に処理することもできる。Ｄ．検出方法ならびに装置は、あらゆる適当な検出システム、たとえば分光システム、色分解システム等に適用することができる。従来のシステムと較べ、必要な試料情報を得るためには少い試料を調整分析すればよいことから、本発明は既知の検出方法およびその装置に対して明らかな利点を提供する。本システムを使用できる分析物には、蛍光化合物、リン光化合物があり、これらの種類の化合物がラベルまたはプローブとして使用されるようなあらゆる既知の方法、たとえばＤＮＡハイブリダイゼーション・アッセイおよびルミノアッセイがある。本発明の上述の実施例は、本発明の装置ならびに方法の幾つかの考えられる実施例でしかない。本発明は、本明細書で説明した実施例による動作に制限されるべきものではなく、また本発明の趣旨と範囲を逸脱することなく、本発明をどのように変更して等価な結果を得るかが当業者には容易に理解できるであろうことは理解されるべきである。本発明は後述の請求の範囲の記載によってのみ限定されるべきものである。

Claims

【特許請求の範囲】１．試料の分析内容を決定する装置であって、（ａ）第１の波長を有する第１の入力信号と、前記第１の波長に対し少くとも約３ナノメートル異なる第２の波長を有する第２の入力信号とを発生する信号発生器と、（ｂ）前記入力信号と前記分析物との間の相互作用による第１および第２の出力信号を発生させるべく前記第１と第２の入力信号を分析物を含む試料に指向する手段であって、前記第１の出力信号は、（ｉ）ピーク波長が前記第１の入力信号の波長とは実質的に独立している第１の共鳴出力信号と、（ｉｉ）ピーク波長が前記第１の入力信号の波長に依存する第１の非共鳴出力信号とを含み、また、前記第２の出力信号は、（ｉ）ピーク波長が前記第２の入力信号の波長とは実質的に独立している第２の共鳴出力信号と、（ｉｉ）ピーク波長が前記第２の入力信号の波長に依存する第２の非共鳴出力信号とを含む、指向手段と、（ｃ）前記第１および第２の出力信号を検出する検出器と、（ｄ）前記試料の分析内容に関するデータを得るべく前記共鳴出力信号を前記非共鳴出力信号と識別する手段とを含む、試料の分析内容決定装置。２．前記信号発生器は、（ｉ）それぞれが光源信号を発生する２つの独立した光源と、（ｉｉ）前記光源信号を前記試料へ前記入力信号として選択的に指向する変調器と、（ｉｉｉ）前記光源信号を前記変調器へ指向する手段とを含む、請求の範囲第１項に記載の装置。３．前記光源は異なる波長で動作するレーザダイオードである、請求の範囲第２項に記載の装置。４．前記変調器は波長変調器を含み、前記第１および第２の入力信号を指向する指向手段は共通の導波手段と２つの分岐路とを有する光ファイバー導波器を含み、各分岐路は前記光源の１つへ向けられており、共通の導波手段は前記波長変調器へ向けられている、請求の範囲第２項に記載の装置。５．前記波長変調器は液晶フィルタである、請求の範囲第４項に記載の装置。６．さらに、前記試料と前記検出器の間に配置された処理手段を含み、該処理手段は、フィルタと、拡散要素と、モノクロメータとのうちの少くとも１つを含む、請求の範囲第１項に記載の装置。７．前記処理手段は、前記フィルタと、前記拡散要素と、前記モノクロメータとを含む、請求の範囲第６項に記載の装置。８．前記共鳴出力信号は蛍光またはリン光信号の少くとも一方を含む分子放射に応じた信号である、請求の範囲第１項に記載の装置。９．前記非共鳴信号は、レイリー信号、ミー、ブリュアン、ラーマン拡散信号のうちの少くとも１つを含む、請求の範囲第１項に記載の装置。１０．前記信号発生器は、前記第１および第２の共鳴出力信号が実質的に同じスペクトルを有するように、入力信号を発生する、請求の範囲第１項に記載の装置。１１．前記信号発生器は、前記第１および第２の入力信号を順次発生する手段をさらに含む、請求の範囲第１０項に記載の装置。１２．前記出力信号を識別する手段は前記第１および第２の共鳴出力信号を単一の固有ベクトルとして表す手段を含み、前記第１および第２の非共鳴出力信号は単一の固有ベクトルとして表すことができない、請求の範囲第１項に記載の装置。１３．前記出力信号を識別する手段は、前記第１および第２の共鳴出力信号を表す所定数の固有ベクトルを選択する手段を含む、請求の範囲第１項に記載の装置。１４．前記識別手段は、前記共鳴出力信号を前記非共鳴出力信号から識別すべく前記第１および第２の出力信号に主成分回帰分析を適用する手段を含む、請求の範囲第１項に記載の装置。１５．前記識別手段は、前記第１および第２の共鳴出力信号を前記第１および第２の非共鳴出力信号から識別すべく多変量定量解析を前記第１および第２の出力信号に適用する手段を含む、請求の範囲第１項に記載の装置。１６．前記第１および第２の入力波長は、約３ナノメートルから約４０ナノメートル離れている、請求の範囲第１５項に記載の装置。１７．前記第１および第２の共鳴出力信号はそれぞれ第１および第２のスペクトルを有し、前記第１および第２の非共鳴出力信号はそれぞれ第３および第４のスペクトルを有し、前記信号発生器は、前記第１および第２のスペクトルが実質的に同じになるように、また前記第３および第４のスペクトルが異なるように、入力信号群を発生し、前記主成分回帰分析を適用する手段は、（ｉ）同一のスペクトルを有する前記第１および第２の共鳴出力信号を保持する手段と、（ｉｉ）異なるスペクトルを有する前記第１および第２の非共鳴出力信号とを破棄するための手段とを含む、請求の範囲第１４項に記載の装置１８．前記分析物は吸収レベルを有し、前記発生器は１以上の出力レベルを有し、前記発生器はさらに前記発生器出力レベルと前記分析物吸収レベルとの数学的積が前記第１および第２の波長においてそれぞれ同一となるように前記第１および第２の波長を選択する手段を含む、請求の範囲第１項に記載の装置。１９．前記信号発生器は前記第１および第２の入力信号を順次発生し、前記第１および第２の非共鳴出力信号はそれぞれ第１および第２のラーマン信号を含み、前記第１および第２のラーマン信号はそれぞれ第１および第２のラーマンスペクトルを有し、前記第１のラーマンスペクトルは第１のスペクトル部分において前記第１の波長に依存し、前記第２のラーマンスペクトルは第２のスペクトル部分において前記第２の波長に依存し、前記第１のスペクトル部分は前記第２のスペクトル部分とは異なる、請求の範囲第１項に記載の装置。２０．前記信号発生器は前記第１および第２の入力信号を順次発生し、前記第１および第２の非共鳴出力信号はそれぞれ第１および第２のレイリー分散信号を含み、前記第１および第２のレイリー信号はそれぞれ第１および第２のレイリースペクトルを有し、前記第１のレイリースペクトルは第１のスペクトル部分において前記第１の波長に依存し、前記第２のレイリースペクトルは第２のスペクトル部分において前記第２の波長に依存し、前記第１のスペクトル部分は前記第２のスペクトル部分とは異なる、請求の範囲第１項に記載の装置。２１．試料の分析内容を決定する装置であって、（ａ）第１の波長を有する第１の入力信号と、前記第１の波長に対し少くとも約３ナノメートル異なる第２の波長を有する第２の入力信号とを発生する信号発生器と、（ｂ）前記入力信号と前記分析物との間の相互作用による第１および第２の出力信号を発生させるべく前記第１および第２の入力信号を分析物を含む試料に指向する手段であって、前記第１の出力信号は、（ｉ）ピーク波長が前記第１の入力信号の波長とは実質的に独立している第１の共鳴出力信号と、（ｉｉ）ピーク波長が前記第１の入力信号の波長に依存する第１の非共鳴出力信号とを含み、また、前記第２の出力信号は、（ｉ）ピーク波長が前記第２の入力信号の波長とは実質的に独立している第２の共鳴出力信号と、（ｉｉ）ピーク波長が前記第２の入力信号の波長に依存する第２の非共鳴出力信号とを含む、指向手段と、（ｃ）前記第１および第２の出力信号を検出する検出器と、（ｄ）前記試料の分析内容に関するデータを得るべく前記第１の共鳴出力信号を第２の共鳴出力信号と識別する手段とを含む、試料の分析内容決定装置。２２．前記第１の共鳴信号は第１および第２の成分スペクトル曲線を含む第１のスペクトルを有し、前記第２の共鳴信号は第３および第４の成分スペクトル曲線を含む第２のスペクトルを有し、前記第１および第３の成分スペクトル曲線は相関し、前記第２および第４の成分スペクトル曲線は相関し、前記識別手段は前記第１および第３の相関するスペクトル曲線と前記第２および第４の相関するスペクトル曲線とを識別する手段を含む、請求の範囲第２１項に記載の装置。２３．前記共鳴出力信号は、分子放射に応答して、蛍光またはリン光信号の少くとも一方を含む信号である、請求の範囲第２１項に記載の装置。２４．前記非共鳴出力信号は、レイリー信号、ミー、ブリュアン、ラーマン分散信号の少くとも１つを含む、請求の範囲第２１項に記載の装置。２５．試料の分析内容を決定する装置であって、（ａ）第１の波長を有する第１の入力信号と、前記第１の波長に対し少くとも約３ナノメートル異なる第２の波長を有する第２の入力信号とを発生する信号発生器と、（ｂ）前記入力信号と前記分析物との間の相互作用による第１および第２の出力信号を発生させるべく前記第１および第２の入力信号を分析物を含む試料に指向する手段であって、前記第１の出力信号は、（ｉ）ピーク波長が前記第１の入力信号の波長とは実質的に独立している第１の共鳴出力信号と、（ｉｉ）ピーク波長が前記第１の入力信号の波長に依存する第１の非共鳴出力信号とを含み、また、前記第２の出力信号は、（ｉ）ピーク波長が前記第２の入力信号の波長とは実質的に独立している第２の共鳴出力信号と、（ｉｉ）ピーク波長が前記第２の入力信号の波長に依存する第２の非共鳴出力信号とを含む、指向手段と、（ｃ）前記第１および第２の出力信号を検出する検出器と、（ｄ）前記試料の分析内容に関するデータを得るべく前記第１の非共鳴出力信号を第２の非共鳴出力信号と識別する手段とを含む、試料の分析内容決定装置。２６．前記第１の非共鳴出力信号は第１のスペクトルを有し、前記第２の非共鳴出力信号は第２のスペクトルを有し、前記第１および第２のスペクトルは相関せず、前記識別手段は前記相関しないスペクトル同士を識別するための手段を含む、請求の範囲第２５項に記載の装置。２７．試料の分析内容を決定する方法であって、（ａ）第１の波長を有する第１の入力信号と、前記第１の波長に対し少くとも約３ナノメートル異なる第２の波長を有する第２の入力信号とを発生する段階と、（ｂ）前記入力信号と前記分析物の間の多数相互作用による第１および第２の出力信号を発生させるべく前記第１および第２の入力信号を分析物を含む試料に指向する段階であって、前記第１の出力信号は、（ｉ）ピーク波長が前記第１の入力信号の波長とは実質的に独立している第１の共鳴出力信号と、（ｉｉ）ピーク波長が前記第１の入力信号の波長に依存する第１の非共鳴出力信号とを含み、また、前記第２の出力信号は、（ｉ）ピーク波長が前記第２の入力信号の波長とは実質的に独立している第２の共鳴出力信号と、（ｉｉ）ピーク波長が前記第２の入力信号の波長に依存する第２の非共鳴出力信号とを含む、段階と、（ｃ）前記第１および第２の出力信号を検出する段階と、（ｄ）前記試料の前記分析内容に関するデータを得るべく前記共鳴出力信号を前記非共鳴出力信号と識別する段階とを含む、試料の分析内容決定方法。２８．前記第１および第２の入力信号を発生する段階は、（ｉ）それぞれが光源信号を発生する２つの独立した光源から信号を発生する段階と、（ｉｉ）前記光源信号を前記試料へ入力信号として選択的に指向するべく前記光源信号を変調する段階とを含む、請求の範囲第２７項に記載の方法。２９．前記光源は異なる波長で動作するレーザダイオードである、請求の範囲第２８項に記載の方法。３０．前記光源信号を変調する段階は波長変調器を使用して前記信号群を変調することを含み、前記光源信号を指向する段階は共通の導波手段と２つの分岐路を有し、各分岐路は前記光源の１つへ向けられており、前記共通の導波手段は前記波長変調器へ向けられている光ファイバー導波器を介して前記信号を案内することを含む、請求の範囲第２８項に記載の方法。３１．前記発生された信号を変調する段階は液晶フィルタにより信号を変調することを含む、請求の範囲第３０項に記載の方法。３２．前記複数の出力信号を検出する段階の直前に前記出力信号を漉波するさらなる段階を含む、請求の範囲第２７項に記載の方法。３３．前記共鳴出力信号は、分子放射に応じ、蛍光またはリン光信号の少くとも一方を含む信号である、請求の範囲第２７項に記載の方法。３４．前記非共鳴信号は、レイリー信号、ミー、ブリュアン、ラーマン拡散信号の少くとも１つを含む、請求の範囲第２７項に記載の方法。３５．前記入力信号を発生する段階は前記第１および第２の共鳴出力信号が実質的に同じスペクトルを有するように入力信号を発生する、請求の範囲第２７項に記載の方法。３６．前記出力信号を識別する段階は前記第１および第２の共鳴出力信号を単一の固有ベクトルとして表すことを含み、前記第１および第２の非共鳴信号は単一の固有ベクトルとして表すことができない、請求の範囲第２７項に記載の方法。３７．前記複数の出力信号を識別する段階は前記第１および第２の共鳴出力信号を表すために所定数の固有ベクトルを選択することを含む、請求の範囲第２７項に記載の方法。３８．前記出力信号を識別する段階は、前記共鳴出力信号を前記非共鳴出力信号から識別すべく前記第１および第２の出力信号に主成分回帰分析を適用することを含む、請求の範囲第２７項に記載の方法。３９．前記複数の出力信号を識別する段階は、前記第１および第２の共鳴出力信号が前記第１および第２の非共鳴出力信号から識別すべく前記第１および第２の出力信号に多変量定量解析を適用することを含む、請求の範囲第２７項に記載の方法。４０．前記入力信号を発生する段階は前記第１および第２の波長が約３ナノメートルから約４０ナノメートル離れるように信号を発生することを含む、請求の範囲第３９項に記載の方法。４１．前記第１および第２の共鳴出力信号はそれぞれ第１および第２のスペクトルを有し、前記第１および第２の非共鳴出力信号はそれぞれ第３および第４のスペクトルを有し、前記入力信号を発生する段階は、前記第１および第２のスペクトルが実質的に同じになるように、また前記第３と第４のスペクトルが異なるように、前記第１および第２の波長を選択することを含み、前記主成分回帰分析を適用する段階は、（ｉ）前記同じスペクトルを有する前記第１および第２の共鳴出力信号を保持し、（ｉｉ）異なるスペクトルを有する前記第１および第２の非共鳴出力信号を破棄することを含む、請求の範囲第３８項に記截の方法。４２．前記入力信号を発生する段階は前記第１および第２の入力信号を順次発生することを含み、前記第１および第２の非共鳴出力信号はそれぞれ第１および第２のラーマン信号を含み、前記第１および第２のラーマン信号はそれぞれ第１および第２のラーマンスペクトルを有し、前記第１のラーマンスペクトルは第１のスペクトル位置において前記第１の波長に依存し、前記第２のラーマンスペクトルは第２のスペクトル位置において前記第２の波長に依存し、前記第１のスペクトル位置は前記第２のスペクトル位置と異なる、請求の範囲第２７項に記載の方法。４３．前記入力信号を発生する段階は第１および第２の入力信号を順次発生することを含み、前記第１および第２の非共鳴出力信号はそれぞれ第１および第２のレイリー拡散信号を含み、前記第１および第２のレイリー信号は第１および第２のレイリースペクトルを有し、前記第１のレイリースペクトルは第１のスペクトル位置において前記第１の波長に依存し、前記第２のレイリースペクトルは第２のスペクトル位置において前記第２の波長に依存し、前記第１のスペクトル位置は前記第２のスペクトル位置と異なる、請求の範囲第２７項に記載の方法。４４．試料の分析内容を決定する方法であって、（ａ）第１の波長を有する第１の入力信号と、前記第１の波長に対し少くとも約３ナノメートル異なる第２の波長を有する第２の入力信号とを発生する段階と、（ｂ）前記入力信号と前記分析物との間の相互作用による第１および第２の出力信号を発生させるべく前記第１および第２の入力信号を分析物を含む試料に指向する段階であって、前記第１の出力信号は、（ｉ）ピーク波長が前記第１の入力信号の波長とは実質的に独立している第１の共鳴出力信号と、（ｉｉ）ピーク波長が前記第１の入力信号の波長に依存する第１の非共鳴出力信号とを含み、また、前記第２の出力信号は、（ｉ）ピーク波長が前記第２の入力信号の波長とは実質的に独立している第２の共鳴出力信号と、（ｉｉ）ピーク波長が前記第２の入力信号の波長に依存する第２の非共鳴出力信号とを含む、指向段階と（ｃ）前記第１および第２の出力信号を検出する段階と、（ｄ）前記試料の分析内容に関するデータを得るべく前記第１の共鳴出力信号を前記第２の共鳴出力信号と識別する段階とを含む、試料の分析内容決定方法。４５．前記第１の共鳴出力信号は第１および第２の成分スペクトル曲線を含む第１のスペクトルを有し、前記第２の共鳴出力信号は第３と第４の成分スペクトル曲線を含む第２のスペクトルを有し、前記第１および第３の成分スペクトル曲線は相関し、前記第２および第４の成分スペクトル曲線は相関し、前記出力信号を識別する段階は前記第２および第４の相関するスペクトル曲線と第１および第３の相関するスペクトル曲線とを識別することを含む、請求の範囲第４４項に記載の方法。４６．前記共鳴出力信号は分子放射に応じて蛍光またはリン光信号の少くとも一方を含む信号である、請求の範囲第４４項に記載の方法。４７．前記複数の非共鳴信号は、レイリー信号、ミー、ブリュアン、ラーマン拡散信号の少なくとも１つを含む、請求の範囲第４４項に記載の方法。４８．試料の分析内容を測定するための方法であって、（ａ）第１の波長を有する第１の入力信号と、前記第１の波長に対し少くとも約３ナノメートル異なる第２の波長を有する第２の入力信号とを発生する段階と、（ｂ）前記入力信号と前記分析物との間の相互作用による第１および第２の出力信号とを発生させるべく前記第１および第２の入力信号を分析物を含む試料に指向する段階であって、前記第１の出力信号は、（ｉ）ピーク波長が前記第１の入力信号の波長とは実質的に独立している第１の共鳴出力信号と、（ｉｉ）ピーク波長が前記第１の入力信号の波長に依存する第１の非共鳴出力信号とを含み、また、前記第２の出力信号は、（ｉ）ピーク波長が前記第２の入力信号の波長とは実質的に独立している第２の共鳴出力信号と、（ｉｉ）ピーク波長が前記第２の入力信号の波長に依存する第２の非共鳴出力信号とを含む、指向段階と、（ｃ）前記第１および第２の出力信号を検出する段階と、（ｄ）前記試料の分析内容に関するデータを得るべく前記第１の非共鳴出力信号を前記第２の非共鳴出力信号と識別する段階とを含む試料の分析内容決定方法。４９．前記第１の非共鳴信号は第１のスペクトルを有し、前記第２の非共鳴信号は第２のスペクトルを有し、前記第１および第２のスペクトルは相関せず、前記出力信号を識別する段階は前記相関しないスペクトル同士しを識別する、請求の範囲第４８項に記載の方法。