MX2010010517A - Antagonistas de receptor de glucagon. - Google Patents

Abstract

La presente invención se refiere a antagonistas de polipéptido de receptor de glucagón, los cuales inhiben la unión de la hormona glucagón a su receptor. Más particularmente, la presente invención se refiere a anticuerpos de receptor de glucagón de alta afinidad o fragmentos Fab de los mismos que inhiben la unión de glucagón a su receptor y su uso en el tratamiento o prevención de diabetes de tipo 2 (NIDDM) y trastornos relacionados en especies de mamíferos.

Description

ANTAGONISTAS DEL RECEPTOR DE GLUCAGON po de la invención La presente invención se refiere a antagon ipéptido del receptor de glucagón que inhiben el hormona de glucagón a su receptor. Más particuiar ención actual se refiere a anticuerpos del rec cagón de alta afinidad o fragmentos Fab de los m iben el enlace de glucagón a su receptor y su u tamiento o prevención de diabetes de tipo 2 ( stornos relacionados en especies de mamíferos. ecede es de la invención El glucagón es una hormona de péptidos de 29 am ducida por células a pancreáticas en respuesta a lucosa san uínea ba os. El luca ón se enla scrito, los anticuerpos policlonales producido siduos de aminoácidos 126-137 y 206-219 se encue oquean el enlace de glucagón al receptor en mem gado de rata (ünson et al., PNAS Vol. 93, pp. 310 96) .

Bu<?gy et al- describe la preparación de un a ocional que compite con el glucagón por el sitio la hormona del receptor en un ensayo ín vitro ( ., Horm. Metab. Res. 28 (1996) 215-219). En el e cribe el anticuerpo, dada la designación CIV39 onocen los receptores de glucagón humano y de r de ratón. Con objeto de desarrollar anticuer tamientos terapéuticos humanos es comúnmente lizar estudios de eficacia y seguridad pre-clini idar modelos de animal, rata y/o murino. Por lo ilitaria mayormente el desarrollo de fármaco eptor (Wright et al., Acta Cryst. (2000) D56, 573 icitante encuentra que el hGR-2 F6 se enlaza a f rata y murina del receptor de glucagón con solame nidad y no tiene eficacia terapéutica encontrada -2F6 en un modelo de rata diabética in vivo as. En particular, este anticuerpo fue incapaz de glucosa del suero de la sangre en el modelo de una importancia estadística (no publicada) .

El solicitante identifica una necesidad de pro anticuerpos monoclonales terapéuticos que se une a afinidad al receptor de glucagón y por ello in ace del mismo glucagón, para proporcionar trat ctivos para diabetes, preferiblemente diabetes stornos relacionados. Además, con objeto de peri arrollo del fármaco pre-clínico de un anticu ramente deseable proporcionar los anticuerpos mon murino. Además, los presentes inventores proporci icuerpos monoclonales o fragmentos Fab de los mi solamente enlazan a los receptores de glucagon de tiples, sino por primera vez proporcionan an ocionales de enlace del receptor de glucagon que cacia in vivo en su habilidad para reducir la gl ro de la sangre.

En un primer aspecto la presente invención se fragmento Fab o anticuerpo monoclonal humani prende el fragmento Fab, en donde el fragmento az de enlazar a los receptores de glucagon de hum urino e inhiben el enlace de glucagon a cada rec Ki de menos de 50 nM.

En un hallazgo además inesperado, los i porcionan por primera vez los anticuerpos o f de los mismos capaces de enlazar especifica un fragmento Fab o anticuerpo monoclonal human formidad a la' presente invención y un e macéuticamente aceptable.

En un tercer aspecto, la invención proporciona a tratar diabetes de tipo 1 o tipo 2 y en l dida de peso en un humano, en donde el método inistrar una cantidad efectiva de un fragment icuerpo monoclonal humanizado de conformidad a la ención, para un paciente que necesite del mismo.

Un cuarto aspecto de la invención comprende un o anticuerpo monoclonal humanizado de conformi sente invención para uso como un medicamento.

Un quinto aspecto de la invención se refiere a fragmento Fab o anticuerpo monoclonal humani formidad a la presente invención en la manufactu icamento para el tratamiento o prevención de dia La invención también proporciona an ocionales, los cuales en adición a los recep cagón de origen humano, rata y murino, son tambié enlazarse con una afinidad alta al receptor de gl mono cinomólogo. Preferiblemente, el fragment icuerpo monoclonal humanizado comprende el fragm mismo que también inhibe el enlace de glucag eptor de glucagón de mono cinomólogo con un Ki de nM. Preferiblemente el fragmento Fab o a ocional humanizado comprende el fragmento Fab que en cada uno de los llamados receptores de glu os de 30 nM, más preferiblemente menos de 20 ferido menos de 10 nM. El fragmento Fab más ne un Ki in Vitro en los receptores de rata, muri menos de 20 nM y Ki in vitro en el receptor h os de 5 nM. Más preferiblemente el Ki del fragmen eptores de al menos 50 nM, 50nM, más preferible os ????. En una modalidad más preferida el fragme icuerpo monoclonal humanizado comprende el fragm tiene una afinidad de enlace funcional en el re cagón humano y de rata de 1 hasta ????.

En un hallazgo particularmente no esper icitante ha observado una relación muy rápida en suero GLP-1 se incrementa y el suero de gluco gre en la exposición in vivo al fragmento Fab o a ocional humanizado comprende el fragmento Fab q propiedades de enlace identificadas de conform a invención. Con objeto de maximizar este efecto preferible que el fragmento Fab o anticuerpo m anizado que comprende el fragmento Fab no s reciablemente al receptor GLP, esto es, Ki más que Las SEQ ID NOS 35 y 36 son secuencias de amino cADN del GluR de murino: Las SEQ ID NOS 37 y 38 son secuencias de amino cADN del ciño GluR: Las SEQ ID NOS 39 y 40 son las secuencias de a región variable del ejemplo 1 (Abl) Las SEQ ID NOS 41 y 42 son las secuencias de a región variable del ejemplo 2 (Ab2) Las SEQ ID NOS 43 y 44 son las secuencias de a región variable del ejemplo 3 (Ab3) Las SEQ ID NOS 45 y 46 son las secuencias de a región variable del ejemplo 4 (Ab4) Las SEQ ID NOS 45 y 47 son las secuencias de a región variable del ejemplo 5 (Ab5) Las SEQ ID NOS 45 y 48 son las secuencias de a región variable del ejemplo 6 (Ab6) s ligeras preferidas.

Las SEQ ID NOS 56 hasta 68 se refieren a las c s pesadas preferidas.

Las SEQ ID NOS 59 y 60 son las secuencias de la cadena ligera y pesada del ejemplo 1 (Abl) .

Las SEQ ID NOS 61 y 62 son las secuencias de la cadena ligera y pesada del ejemplo 2 (Ab2) .

Las SEQ ID NOS 63 y 64 son las secuencias de la cadena ligera y pesada del ejemplo 3 (Ab3) .

Las SEQ ID NOS 65 y 66 son las secuencias de la cadena ligera y pesada del ejemplo 4 (Ab4) .

Las SEQ ID NOS 65 y 67 son las secuencias de la cadena ligera y pesada del ejemplo 5 (Ab5) .

Las SEQ ID NOS 65 y 68 son las secuencias de la cadena ligera y pesada del ejemplo 6 (Ab6) .

Las SEQ ID NOS 65 y 69 son las secuencias de la Las SEQ ID NOS 76 y 78 son las secuencias d ena ligera y pesada del ejemplo 5 (Ab5) .

Las SEQ ID NOS 76 y 79 son las secuencias d ena ligera y pesada del ejemplo 6 (Ab6) .

Las SEQ ID NOS 76 y 80 son las secuencias d ena ligera y pesada del ejemplo 7 (Ab7) . iniciones : El "receptor de glucagón" que también se refie sente como "GluR" pertenece a la familia de cía eptor acoplado a la proteina G que consiste de un racelular terminal amino largo, siete segmento nsmembrana y un dominio terminal C intracelu eptores del glucagón se expresan notablemente erficie de los hepatocitos donde se enlazan al gl nsducen la señal proporcionada por ello en la cél stancialmente antagonizar la actividad biológ eptor de glucagon. Su habilidad se refleja en los calculados del ensayo de enlace de glucagon [125I] la presente.

El término "humanizado" como se usa en referen icuerpo monoclonal de la invención se refie icuerpo con al menos unas estructuras humanas y stantes (dominios CL, CH (por ejemplo, CHl, CH2, articulación) , y los derivados de CDR de los an enlace del receptor de glucagon. Las estructuras prenden las estructuras que corresponden a las s linea germinal humanas asi como las secuen aciones somáticas. Las estructuras humanas y stantes pueden ser completamente humanas o puede las secuencias nativas por una o más substituc noácidos, adiciones terminales e interme El término anticuerpo monoclonal" se refie icuerpo que se deriva de una copia sencilla luyendo por ejemplo, cualquier clon euc cariótico o fago y no el método por el cual se feriblemente un anticuerpo monoclonal de la ste en una población homogénea o substan ogénea .

El término "eficacia in vivo" como se usa en la respecto a un anticuerpo de la invención sign ilidad del anticuerpo para impartir un efecto itivo en un modelo humano o animal. Preferible cacia in vivo se refiere a un efecto de normaliz cosa en un animal que muestra la glucosa en l vada en respuesta a un anticuerpo de la presente ndo se compara a una respuesta de control. Un m a gorda Zucker diabética (ZDF) (Horm Metab R hasta 5 mg/kg . En una modalidad más preferida la vivo se usa para significar el 100% de la normali cosa en la sangre en un modelo de rata 2DF diabét osición del animal de 1 hasta 3mg/kg de d icuerpo humanizado de conformidad a la presente i El término "normalización de glucosa" se refie ores medios de glucosa de plasma en un modelo de menos de 120mg/dL, preferiblemente en el rango ta 120 mg/dL. La glucosa en plasma puede determi formidad con Etgen et al., (Metabolism 2000; 49 ( ) o calcularse de una conversión dé la concentr cosa en la sangre completa de conformidad con D'O , (Clin. Chem. Lab. Med. 2006; 44(12): 1486-1490).

Como se usa en la presente, "fragmento Fab" se ella porción de una molécula del anticuerpo, áent ión variable, la cual contiene los residuos de a lth y Human Services, NIH Publication No. 91-3242 dominio del enlace del antigeno o los CDR del do ace del antigeno pueden derivarse de otras esp anas incluyendo, pero no limitado a, conejos, as o hámster.

Los presentes inventores han identificado las s de cadena ligera y pesada las cuales pueden u binación para preparar los fragmentos Fab del a cual demuestra particularmente alta afinidad eptores de glucagón de origen de murino, ra omólogo y humano. Los fragmentos Fab prefer prenden; (i) una cadena ligera CDRLl: S X S S S V S Y Xn. 53 (ii) una cadena ligera CDRL2 : T T S X2 L A H SEQ X = Y o A X6 = W o H Xx = o l X7 = N, D o E X2 = N o Y X8 = Y, Qr S o X3 = Q o L X9 = N, S o I X = Q o W ¾o = G o A X5 = L o I Xii = M o L Más preferiblemente, X es Y o A; Xi es I; X2 es L; X4 es Q o ; X5 es L o I; Xe es o H; X7 es D o Q, S o V; X9 es S; ??? es G o A; X es L. Más pre A; ?? es I; X2 es Y; X3 es Q; X4 es Q; X5 es L; X6 es E; X8 es Y, Q o S; X9 es S; X10 es G o A; n es L. Preferiblemente un fragmento Fab o anticuerpo m anizado comprende el fragmento Fab de la ención que comprende las secuencias de CDR: CDRL1 1 2 3 4 5 6 7 8 9 1 S A S S S V S Y I H P P G Y Y G F G P Y A L en donde el fragmento Fab tiene uno, dos stituciones de aminoácido seleccionadas del g siste de: CDRL1: A2Y, I9M; CDRL2 : Y4N; CDRL3 : Q1L, Q2W, L6I; CDRH1 : H9W, D10E, D10N; CDRH2 : Y9Q, Y9S, Y9V, S11N, S11I; CDRH3 : G3A, L12M.

Más preferiblemente el fragmento Fab comprende res substituciones de aminoácido seleccionadas de E; CDRH2: Y9Q, Y9S; CDRH3 : G3A. ün fragmento Fab o anticuerpo monoclonal h prende el fragmento Fab de conformidad a la ención preferiblemente comprende las secuenc (iii) una cadena ligera con un CDRLl de la SEQ I L2 de la SEQ ID NO: 5; CDRL3 de la SEQ ID NO: ena pesada con un CDRH1 de la SEQ ID NO: 11; CDR ID NO: 15; CDRH3 de la SEQ ID NO: 21; (iv) una cadena ligera con un CDRLl de la SEQ L2 de la SEQ ID NO: 5; CDRL3 de la SEQ ID NO: ena pesada con un CDRHl de la SEQ ID NO: 12; CDR ID NO: 15; CDRH3 de la SEQ ID NO: 21; (v) una cadena ligera con un CDRLl de la SEQ L2 de la SEQ ID NO: 5; CDRL3 de la SEQ ID NO: ena pesada con un CDRHl de la SEQ ID NO: 12; CDR ID NO: 17; CDRH3 de la SEQ ID NO: 21; (vi) una cadena ligera con un CDRLl de la SEQ L2 de la SEQ ID NO: 5; CDRL3 de la SEQ ID NO: ena pesada con un CDRHl de la SEQ ID NO: 12; CDR ID NO: 15; CDRH3 de la SEQ ID NO: 22; y preferiblemente menos de 5mg/kg, más preferid go de 0.1 hasta 5mg/kg. Más preferiblemente un a conformidad con la presente invención alcanza 10 malización de glucosa en un modelo de rata ZD is de alrededor de 1 hasta 3mg/kg. Se ha encont anticuerpos particularmente preferidos de confor presente invención son capaces de mostrar malización de glucosa en un modelo de rata ZDF in dosis baja de 3mg/kg. La presente invenció feriblemente comprende un fragmento Fab o a ocional humanizado que comprende el fragmento de el fragmento Fab comprende: (i) una cadena ligera con un CDRL1 de la SEQ L2 de la SEQ ID NO: 5; CDRL3 de la SEQ D NO: ena pesada con un CDRH1 de la SEQ ID NO: 12; CDR ID NO: 15; CDRH3 de la SEQ ID NO: 21; L2 de la SEQ ID NO: 5; CDRL3 de la SEQ ID NO: ena pesada con un CDRHl de la SEQ ID NO: 13; CDR ID NO: 18; CDRH3 de la SEQ ID NO: 22.

En una modalidad más preferida la presente inve iere a un fragmento Fab o anticuerpo monoclonal h comprende el fragmento Fab, en donde el fragm prende una cadena ligera con un CDRLl de la SEQ L2 de la SEQ ID NO: 5; CDRL3 de la SEQ ID NO: ena pesada con un CDRHl de la SEQ ID NO: 12; CDR ID NO: 17; CDRH3 de la SEQ ID NO: 21. Se ha e un anticuerpo que comprende los fragmentos formidad con esta modalidad tiene particular piedad ventajosa de mantener la eficacia in vivo iodo extendido cuando se compara a otros ant ilares dentro del género descrito.

Un fragmento Fab o anticuerpo monoclonal humani , 97% ó 99% de origen humano) . Las secuencias iones de la estructura de origen humano pueden ImMunoGenetics (IMGT) por medio de su si p: //imgt . cines . fr/textes/IMGTindex/FR. html o unoglobulin Factsbook, por Marie-Paule Lefranc, ranc, Academic Press 2001, ISBN 012441351. Por estructuras de la cadena ligera de linea germina eccionarse del grupo que consiste de: All, ?17, A , A27, A30, LI, L1I, L12, L2, L5, L15 L6, L8, 01 y las regiones de la estructura de cadena pesada minal pueden seleccionarse del grupo que consiste VH2-26, VH2-70, VH3-20, VH3-72, VHI-46, VH3-9, -74, VH4-31, VH 1-18, VH 1-69, VI-13-7, VH3-11, -21, VH3-23, VH3-30, VH3-48, VH4-39, VH4-59, y VH5 Los anticuerpos específicos descritos en la dén usarse como una plantilla o anticuerpo precur ructura puede mutarse a la estructura precu rtas posiciones basadas en el criterio e licado por Queen et al., [Queen, et al., Proc. Na . U A 88, 2869 (1991)]. Los métodos adicionales q rse incluyen, por ejemplo, Jones et al., Nature, 86); Riechmann et al., Nature, 332: 323-327 hoeyen et al., Science, 239:1534 (1988).

Más preferiblemente el fragmento Fab o an ocional humanizado comprende el fragmento formidad a la presente invención compre uientes secuencias de la estructura de la caden ) : FR1 SEQ ID NO: 23; FR2 SEQ ID NO: 24; FR3 SE FR4 SEQ ID NO: 26: y las secuencias de las est cadena variable pesada: FR5 SEQ ID NO: 27; FR 28; FR7 SEQ ID NO: 29; FR8 SEQ ID NO: 30; as se organizan como la secuencia variable d ) de un anticuerpo completo para el receptor de es necesariamente un predictor valido de la efi o. Un proceso para preparar los anticuerpos mon tiene las propiedades favorables buscadas en la lo tanto preferiblemente comprende selecci gmento Fab que enlaza a cada receptor de glucagó de menos de 50 nM en un ensayo de enlace de petitivo in Vitro usando un gen receptor de erólogamente expresado. Más preferiblemente los prenden seleccionar un fragmento Fab que tiene ro en cada uno de los receptores de glucagón de nM, más preferiblemente menos de 20 nM, más prefe os de 10 nM. Más preferiblemente, el fragmento ecciona por un Ki in Vitro en los receptores de iño y ci o de menos de 20 nM y Ki in Vitro eptor humano de menos de 5 nM. Más preferiblemen igida al sitio, hasta aminoácidos substitutos de específicos y las secuencias de la estructur sente descritas y de esa manera generar ad uencias de aminoácido de región variable derivada uencias proporcionadas en la presente. Hasta todo noácidos que se presentan naturalmente pueden int un sitio de substitución especifico. El pr ección in Vitro que se define en la presente arri go usarse adecuadamente para separar por exclusi uencias de aminoácidos de región variable adici fragmentos Fab que tienen la reactividad vindicada y el ki in Vitro que se encuentra sentes solicitantes para indicar la eficacia in v a manera, los fragmentos Fab adicionales se ide son adecuados para preparar un anticuerpo human formidad con la presente invención. Preferible los CDR de la región variable de cadena pes feriblemente la substitución del aminoácido se re o dos posiciones del aminoácido dentro del CDRH2.

Una metodología adecuada para combinar el CD stituciones de la estructura para preparar los an ernativos de conformidad a la presente invención anticuerpo descrito en la presente como un ar cursor, se proporciona en Wu et al.r J. Mol. :151-162.

Como se usa en la presente, la porción Fe unoglobulina se refiere a la región constant icuerpo de cadenas pesadas, las cuales se asocian interacciones no covalentes y enlaces de disul ción Fe puede incluir las regiones de articulac iende a través de los dominios CH2 y CH3 a la te anticuerpo. La porción Fe puede además incluir u tiene las substituciones que además reducen la fu ctor [Issacs et al., (1996) Clin. Exp. Immunol . ] . Estos pueden seleccionarse de uno o más del prende prolina para glutamato en el residuo 233, ina para la fenilalanina en el residuo 234 y a tamato para la leucina en el residuo 235 (Eü n at, ?.?. et al. (1991) Sequences of Prot unological Interest, 5th Ed. U.S. Dept. of Health vices, Bethesda, MD, N1H Publication no. 91-3242 iduos corresponden a las posiciones 15, 16 y 17 e NO: 52 y las posiciones 235, 236 y 237 de la 3? Además, se remueve el sitio de glicosilación li la región Fe IgG4 por sustituir Ala por Asn en e (numeración de E.ü.A) la cual corresponde a la de la SEQ ID NO: 52 es otra manera para asegura ividad efectora del residuo se elimine en el cont écula nativa puede también eliminarse en la po ivada del IgG4 de los anticuerpos descritos en la sición 229 de la SEQ ID NO: 52; elimine la lisina des-K) . Una porción Fe IgG4 más preferida se pr los aminoácidos 221 hasta 448 de la SEQ ID NO: 67 La invención se dirige además a una secuencia leico aislado que codifica un anticuerpo de la ir vector (o vectores) que comprenden el ácido ionalmente ligado a las secuencias de control onocen por una célula hospedera transformada tor; una célula hospedera que comprende el ve ceso para producir un anticuerpo o fragmento Fab d conformidad a la invención comprende cultivar l pedera de modo que el ácido nucleico se ex ionalmente, recupera el anticuerpo del medio de c célula hospedera. gmento Fab o anticuerpo monoclonal humanizad ención. La composición para el uso terapéutico es puede liofilizarse opcionalmente suministrada uyente apropiado.

Una modalidad adicional de la presente prende una célula hospedera o cultivo celular q ipiente de cualquier polinucleótido aislado ención o cualquier vector recombinante que compr uencia que codifica un HCVR, LCVR, anticuerpo mon gmento Fab de la invención. Las células h luyen la progenie de una célula hospedera senci genie puede no necesariamente ser completamente morfología o en el complemento de ADN total) a 1 cursora original debido a la mutación natural, a deliberada y/o cambio. Una célula hospedera inc ulas transformadas, transducidas o infectadas in v pederas adicionales para uso en la invención ulas de plantas, células de levaduras otras cé iferos y células procarióticas .

La invención abarca un articulo para la manufa prende un material empaquetado y un fragment icuerpo monoclonal humanizado de la invención tro del material empaquetado y en donde el aquetado comprende un paquete insertado el cual indi gmento Fab o anticuerpo monoclonal humanizado neut R o disminuye el nivel de la actividad GluR en el pa ayos Biológicos: paraciones de la membrana del receptor de glucag n Las preparaciones de la membrana para los est ace se prepararon de las células 293HEK que exp eptor de glucagón de rata, humano, ratón, uido por la centrifugación en 1800 x g durante 15 °C. El sobrenadante se colecta y el peletizado se pender en una solución amortiguadora preparativ brana, se vuelve a homogenizar y se centrifuga. E renadante se combina con el primer sobrenadan lve a centrifugar a 1800 x g durante 15 minut erse claro. El sobrenadante clarificado se tran os de alta velocidad y se centrifuga a 25000 x g minutos a 4°C. El peletizado de la membrana (P2) s suspender en la solución amortiguadora preparati brana (sin ADNasa) , se divide, congela rápida lo seco y almacena a -80°C hasta necesitarse. ace de glucagón [125I] por el enlsayo de proximidad intilación (SPA) .

Un experimento del receptor competitivo/enl eptor, luego se agregan al compuesto diluido segui ción de 0.15 mgs de las perlas SPA de aglutinina trigo (WGA) (GE Healthcare) previamente bloqueada BSA libre de ácido graso y 0.15 nM de [125I] rkin-Elmer) . Las placas se sellan con la tapa de esivo, mezclan al final sobre el final e i peratura ambiente durante 12 horas. El en ioactividad para el receptor (en la proximidad cer ía WGA SPA) se cuantifica en la vida PE y el con intilación de placas Analytical Sciences Trilux Mi expresa como conteo por minuto (CPM) . El enlace ermina en la ausencia del compuesto agregado y el ecifico se determina al agregar 1 uM de glucagó earch Labs) . La concentración final de 1 uM de gl quetado es capaz de inhibir completamente el en cagón [125I] a los niveles de respaldo. ámetros (curva máxima, curva minima, IC50, desviaci a) . La constante de disociación del equili ermina por inhibir el enlace del radioligando, eula del valor IC50 absoluto basado durante la ecu ICso/(l + D/Kd) ] donde D es igual a la concentra ioligando usado en el experimento y Kd es ilibrio de afinidad de enlace constante de [125I] el ensayo para cada especie del receptor individua ayo del antagonista funcional cAMP que estimula al cagón La actividad del antagonista funcional se dete inhibición dependiente de la dosis del incremen P intracelular con una dosis sub-máxima de ndo las mismas lineas de receptor clonal de rata omólogo y células 293HEK. La cuantificación d cional se realiza en 10 m de Hepes, pH 7.4, con IBMX en HBSS que contiene Mg+2 y Ca+2. Las célula receptor de glucagón clonal se suspendieron ulas por pozo y 1 unidad/pozo del cAMP biotini en un volumen total de 20 uls. Las células ubaron durante 30 minutos a temperatura ambient de ya sea compuestos diluidos en serie 3 vece P diluido serialmente 3 veces por el uso como u ándar. La reacción comenzó por la adición de 2 pM de glucagón (3X) , una dosis suficiente para del cAMP intracelular máximo. Después de 60 m peratura ambiente en la oscuridad, la reacción se la adición de 30 uls de la solución amortigu is hecha de 1% de IGEPAL CA630 (Sigma) y 0.1% re de ácido graso (Gibco) en 10 mM de Hepes, pH tiene 1 unidad cada uno del kit donador y las pe les de cAMP generadas por pozo con base en ándar cAMP. Las pmoles de cAMP producidas en la compuesto se convirtieron al % de una respuest la dosis submáxima del glucagón solo. Dentro erimento, se determina la concentración del esaría para producir una respuesta de 50% en cAMP a concentración EC50 se usa para normalizar los r re las corridas a una b donde b = (compuesto EC de glucagón usado/EC50 en p para la respuesta glucagón) ] . Los datos se analizaron usando las ru resión no lineales de 4 parámetros {curva máxim ima, IC50, desviación de la cima) (XLFit versión 3 la actividad, IDBS) . mplos Los ejemplos del anticuerpo Ab~l , Ab-2, Ab- 11, 78, 79, 80) . El medio de clarificación en anticuerpo se ha secretado se purifica iquiera de las técnicas comúnmente usadas. Por medio puede aplicarse convenientemente a una co arosa FF de la proteina A o G que se equilibra ución amortiguadora compatible, tal como rtiguadora salina de fosfato (pH 7.4) . La co a para remover los componentes del enl ecifico. El anticuerpo enlazado se eluye, por el gradiente pH (tal como solución amortigu fato de sodio 0.1 M de pH 6.8 hasta rtiguadora de citrato de sodio 0.1 de pH 2 cciones del anticuerpo se detectaron, tales c E, y luego se agruparon. La purificación adic ional, dependiendo del uso pretendido. El an de concentrarse y/o filtrar de forma estéril ed celular se altera por choque osmótico y el tiene una etiqueta His se purifica en una La tabla 1 establece las combinaciones CDR u ejemplos del anticuerpo de conformidad a la ención. La cadena ligera del anticuerpo completo intervalos de las secuencias de la estructura d era por los tres CDR de cadena ligera; Estructur NO: 23) - CDRL1 - Estructura 2 (SEQ ID NO: 24) -ructura 3 (SEQ ID NO: 25) - CDRL3 - Estructura 4 26) y la región constante de la cadena ligera 53) . Las secuencias de la estructura de caden intervalos para los tres CDR de cadena ructura 5 (SEQ ID NO: 27) - CDRH1 - Estructura 6 28) - CDRH2 - Estructura 7 (SEQ ID NO: 29) -ructura 8 (SEQ ID NO: 30) y luego la región c la 1: Los ejemplos de los anticuerpos 1 hasta 7 gmentos Fab de los mismos todos inhiben el e cagón a los receptores de glucagón de humano, rat omólogo y rata en el ensayo de enlace del rec cagón de arriba con un i de menos de 50 nM. ividad in Vitro del anticuerpo del ejemplo 4 (Ab4) la 2. Antagonismo cAMP funcional la 3. Ki in Vitro (nM) , para todos los anticue mplo 4 y el Fab respectivo Este ensayo demuestra que un ensayo de e petición de glucagón in Vitro Ab4 se enlaza con nidad (Ki) para el receptor de glucagón de o ano, ratón, rata, mono cinomólogo y afinidad eptor GLP-1 humano. ividad in vivo del anticuerpo del ejemplo 4 (Ab4) Las ratas ZDF de aproximadamente 8 semanas de oximadamente 400 g en peso se dosificaron con una la 4. Los niveles de glucosa en la sangre sigui is subcutánea sencilla de 3 ó 15 mg/kg de Ab4 o control negativo para las ratas ZDF. la 5. Los niveles GLP-1 de plasma siguen u cutánea sencilla de 3 ó 15 mg/kg de A 4 o control 15 mg/kg hasta las ratas ZDF.

El promedio y DE (desviación estándar) se d amente de aquellas ratas que tiene niveles ntificables . Si no hay animales que tengan nivel ntificables, los resultados se enlistan como <6 nifica que el valor no se determina.

Claims (1)

1. REIVINDICACIONES Un fragmento Fab o anticuerpo monoclonal human prende el fragmento Fab, caracterizado porque el es capaz de enlazar a los receptores de glu ano, rata y murino e inhiben el enlace de gluc a receptor con un i de menos de 50nM. El fragmento Fab o anticuerpo monoclonal human rende del fragmento Fab de conformidad vindicación 1, caracterizado porque el fragm ibe el enlace del glucagón a un receptor de glu o cinomólogo con un Ki de menos de 50nM. El fragmento Fab o anticuerpo monoclonal human rende del fragmento Fab de conformidad vindicación 1 ó reivindicación 2, caracterizado gmento Fab comprende; S SEQ ID NO: 57 (vi) una cadena pesada CDRH3 : P P Xi0 Y Y G F G SEQ ID NO: 58 en donde: X - Y o A X6 = W o H Xi = M o I X7 = N, D o E X2 = N o Y X8 = Y, Q, S o X3 = Q o L X9 = N, S o l X4 = Q o W Xio = G o A X5 = L o I Xn = M o L El fragmento Fab o anticuerpo monoclonal humani prende del fragmento Fab de conformidad vindicación 3, caracterizado porque X = A X6 = H Xi - I X7 = D o E X2 = Y X8 = Y, Q o S CDRL2 1 2 3 4 5 6 7 T T S Y L A H CDRL3 1 2 3 4 5 6 7 8 9 Q Q R S T L P P T CDRH1 1 2 3 4 5 6 7 8 9 1 G D D I T S G Y H D CDRH2 1 2 3 4 5 6 7 8 9 14 15 16 Y I S Y S G S T Y L K S CDRH3 1 2 3 4 5 6 7 8 9 14 Y Y G F G en donde el fragmento Fab tiene uno, do stituciones de aminoácidos seleccionados del vindicación 1 o reivindicación 2, caracterizado gmento Fab comprende (i) una cadena ligera CDRLl: S A S S S V S Y I : 3) (ii) una cadena ligera CDRL2 : T T S Y L A H (SE (iii) una cadena ligera CDRL3 : Q Q R S T (SEQ ID NO: 6) (iv) una cadena pesada CDRHl: G D D I T S G Y H 12) (v) una cadena pesada CDRH2 : Y I S Y S G S T Y S (SEQ ID NO: 15) (vi) una cadena pesada CDRH3: P P G Y Y G F G P (SEQ ID NO: 21) El fragmento Fab o anticuerpo monoclonal humani prende del fragmento Fab de conformidad 12) (v) una cadena pesada CDRH2 : Y I S Y S G S T Q S (SEQ ID NO: 17) (vi) una cadena pesada CDRH3 : P P G Y Y G F G P (SEQ ID NO: 21) El fragmento Fab o anticuerpo monoclonal humani prende del fragmento Fab de conformidad vindicación 1 o reivindicación 2, caracterizado p gmento Fab comprende (i) una cadena ligera CDRL1: S A S S S V S Y I 3) (ii) una cadena ligera CDRL2 : T T S Y L A H (SEQ (iii) una cadena ligera CDRL3 : Q Q R S T (SEQ ID NO: 6) (iv) una cadena pesada CDRHl: G D D I T S G Y H (i) una cadena ligera CDRLl: S A S S S V S Y I 3) (ii) una cadena ligera CDRL2 : T T S Y L A H (SEQ (iii) una cadena ligera CDRL3 : Q Q R S T (SEQ ID NO: 6) (iv) una cadena pesada CDRHl: G D D I T S G Y H 13) (v) una cadena pesada CDRH2 : Y I S Y S G S T S S (SEQ ID NO: 18) (vi) una cadena pesada CDRH3 : P P A Y Y G F G P (SEQ ID NO: 22) El fragmento Fab o anticuerpo monoclonal humani prende el fragmento Fab de conformidad a cualesq reivindicaciones 1 hasta 9, caracterizado p gmento Fab comprende una región de estructura d (ii) dos cadenas ligeras de la SEQ ID NO: 6 enas pesadas de la SEQ ID NO: 67; (iii) dos cadenas ligeras de la SEQ ip NO: enas pesadas de la SEQ ID NO: 68; o (iv) dos cadenas ligeras de la SEQ ID NO: 6 enas pesadas de la SEQ ID NO: 69. Un vector caracterizado porque comprende una s ácido nucleico que codifica un fragmento Fab o a ocional humanizado que comprende del fragmento formidad a cualesquiera de las reivindicaciones Una célula hospedera caracterizada porque compr uencia del polinucleótido heterólogo que codi gmento Fab o anticuerpo monoclonal humaniz prende el fragmento Fab de conformidad a cualesq reivindicaciones 1 hasta 11. gmento Fab, ele conformidad a cualesquiera vindicaciones 1 hasta 11 a un paciente humano que mismo. Un fragmento Fab o anticuerpo monoclonal h acterizado porque comprende el fragmento formidad a cualesquiera de las reivindicaciones 1 a uso como un medicamento. Un fragmento Fab o anticuerpo monoclonal h acterizado porque comprende el fragmento formidad a cualesquiera de las reivindicaciones 1 a uso en el tratamiento de diabetes de tipo 1 o a lograr la pérdida de peso en un humano. El uso de un fragmento Fab o anticuerpo m anizado que comprende del fragmento Fab, de confo lesquiera de las reivindicaciones 1 hasta 11, ufactura de un medicamento para el tratam