KR102470871B1 - 이질바퀴로부터 유래한 페리플라네타신-5 펩타이드를 포함하는 항염증용 조성물 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 MKTFLRLYRSLINKVLH-NH2의 아미노산 서열을 갖는 펩타이드 페리플라네타신-5을 포함하는 염증성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다. 본 발명에 따른 페리플라네타신-5는 부작용이 없고, 안전성이 우수할 뿐만 아니라 항염증 효능이 우수하므로, 염증성 질환의 예방 또는 치료제, 건강식품보조제 및 사료 조성물로서 사용이 가능하다.
Description
본 발명은 펩타이드 페리플라네타신-5를 포함하는 항염증용 조성물에 관한 것이다.
염증반응은 상처와 외부 이물질의 침입 시 생체를 방어하기 위해 가장 먼저 일어나는 선천성 면역(innateimmunity) 반응이며, 염증의 작용과 기간에 따라 급성염증과 만성염증 반응으로 나눌 수 있다.
급성염증 반응은 외부 이물질로 인한 자극에 의해 대식세포(macrophage)가 활성화되어 생성된 염증매개물질인 염증성 사이토카인, 케모카인, 산화질소(NO) 및 프로스타글란딘 E2 (PGE2) 등을 생성하여 이들에 의해 활성화된 백혈구와 대식세포에 의해 이물질을 제거한 후 조직재생을 통해 종료된다. 급성염증 반응은 생체를 방어하기 위한 필수적인 반응이지만, 이 반응에서 과도하게 분비된 염증매개물질은 과도한 혈관확장으로 급성 패혈성 쇼크를 일으킬 수 있으며, 면역세포의 지속적인 생존과 활성을 일으켜 만성염증이나 면역과민반응의 원인이 되어 류마티스 관절염과 같은 만성염증질환 및 자가면역질환으로 발전될 수 있으므로, 염증반응 조절은 생명현상 유지를 위해 매우 중요하다.
면역세포에는 대식세포, 단핵구, 백혈구 및 비만세포 등이 있으며, 이 중 대식세포는 모든 조직에 존재하며 체내 유입된 염증의 원인을 가장 먼저 인식한 후 염증매개물질을 생성하여 다른 면역세포의 활성화 및 주화성을 유도시켜 염증원인을 제거하고 염증부위를 복구시키는 등 염증과정에 필수적인 역할을 수행한다.
최근 항염증 치료를 위하여 식품이나 천연물에서 효과적인 치료제를 찾고자 하는 많은 연구가 진행되고 있으며, 곤충의 약리활성에 대한 관심이 높아지고 있다. 대한민국 등록특허 제10-1730065호는 곤충유래 천연자원인 풀색꽃무지 추출물의 항염증 활성을 개시하고, 대한민국 등록특허 제10-1700605호는 참풍뎅이 추출물의 항염증 활성을 개시하며, 대한민국 등록특허 제10-066500호는 무당벌레 추출물의 항염증 활성을 개시한다.
이질바퀴(Periplaneta americana)는 미국바퀴라고도 불리우는 곤충강, 바퀴목, 왕바퀴과, 왕바퀴속, 이질바퀴 종에 속하는 곤충으로서, 한국에 서식하는 바퀴벌레 중 가장 큰 종이며, 배설물과 탈피한 허물은 알러지성 기관지천식, 비염, 아토피성 피부염 등을 일으킨다고 알려져 있다. 이질바퀴는 세균, 바이러스, 연충(helminth), 원충(protozoa) 및 곰팡이를 옮기는 대표적인 위생 해충이며, 이에 대한 연구는 미흡한 실정이다.
이에, 본 발명자들은 이질바퀴 유래 펩타이드를 이용하여 다양한 생리활성을 연구하던 중, 이질바퀴로부터 유래된 펩타이드가 항염증 효능이 우수함을 확인하여 본 발명을 완성하였다.
본 발명이 해결하고자 하는 첫 번째 과제는 하기 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 펩타이드 페리플라네타신-5(Periplanetasin-5)을 포함하는 염증성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다.
서열번호 1: MKTFLRLYRSLINKVLH-NH2
본 발명이 해결하고자 하는 두 번째 과제는 상기 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 펩타이드 페리플라네타신-5를 포함하는 염증성 질환의 예방 또는 개선용 식품 조성물, 사료 조성물 또는 건강기능식품에 관한 것이다.
본 발명은 이질바퀴(Periplaneta americana)의 전사체로부터 분리한 유전자에서 합성된 펩타이드의 항염증 효과에 관한 것이다.
상기한 과제를 해결하기 위하여 본 발명은 하기 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 펩타이드 페리플라네타신-5(Periplanetasin-5)을 포함하는 염증성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
서열번호 1: MKTFLRLYRSLINKVLH-NH2
본 발명에 따른 상기 펩타이드 페리플라네타신-5는 이질바퀴(Periplaneta americana)로부터 유래한 것일 수 있다.
본 발명에 따른 상기 펩타이드를 제공하는 방법은 하기와 같다. 바퀴벌레, 바람직하게는 이질바퀴(Periplaneta americana) 유래 펩타이드 유전자를 확인하기 위하여, 먼저 바퀴벌레를 액체질소로 급속 동결하여 전체 RNA를 분리하고, 이를 RNA seq 분석법을 이용하여 이질바퀴 전사체(transcriptome) 들에 관한 유전자 정보를 확인하며, 각각의 전사체들로부터 번역된 아미노산의 서열을 바탕으로 항염증 활성 실험을 통해 후보물질을 선별하는 방법을 포함한다.
본 발명에서, "펩타이드", 및 "단백질"은 호환적으로 사용되며 아미노산 잔기의 중합체에 대한 언급을 포함한다. 상기 용어들을 천연 아미노산 중합체들뿐만 아니라, 하나 이상의 아미노산 잔기가 상응하는 천연 아미노산의 인공적인 화학적 유사체인 아미노산 중합체들에 적용한다. 상기 용어들을 또한 단백질이 작용성으로 남아있도록 보존적인 아미노산 치환을 함유하는 상기 중합체들에 적용한다. 본 발명에서 펩타이드는 유전자 재조합과 단백질 발현 시스템을 이용하여 합성된 것일 수 있고, 바람직하게는 펩타이드 합성기 등을 통하여 시험관 내에서 합성된 것일 수 있다.
본 발명에서, "생물학적으로 활성이 있는"은 상기 서열번호 1의 폴리펩타이드와 유사한 구조적 기능, 및/또는 유사한 조절 기능, 및/또는 유사한 생화학적 기능을 갖는 펩타이드 단편 또한 본 발명에 따른 펩타이드를 의미한다.
본 발명은 상기 서열번호 1의 서열의 변이체를 포함할 수 있다. 구체적으로, 서열번호 1의 펩타이드 서열과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%의 서열 상동성을 가지는 것으로, 생물학적 활성이 유지되는 서열을 본 발명의 범주에서 포함할 수 있다.
본 발명에서, "결실"은 야생형 폴리뉴클레오타이드 또는 폴리펩타이드와 비교하여 각각 하나 이상의 뉴클레오타이드 또는 아미노산 잔기가 없는 뉴클레오타이드 또는 아미노산 서열에서의 변화로 정의된다.
본 발명에서, "삽입" 또는 "부가"는 야생형 폴리뉴클레오타이드 또는 폴리펩타이드와 비교하여 각각 하나 이상의 뉴클레오타이드 또는 아미노산 잔기의 부가로 인한 뉴클레오타이드 또는 아미노산 서열에서의 변화이다.
본 발명에서, "치환"은 야생형 폴리뉴클레오타이드 또는 폴리펩타이드와 비교하여 각각 다른 뉴클레오타이드 또는 아미노산에 의해 하나 이상의 뉴클레오타이드 또는 아미노산의 교체에서 비롯된다.
한편, 치환 위치에서 바람직한 아미노산 변이는 잔기의 극성, 전하, 용해성, 소수성, 친수성 및/또는 양친매성 특성의 유사성에 기반하여 수행되는 것일 수 있다. 예를 들어, 이에 한정되는 것은 아니나, 음으로 하전된(negatively charged) 아미노산으로서는 아스파르트산 및 글루타민산을 포함하며; 양으로 하전된(positively charged) 아미노산으로서는 리신 및 아르기닌을 포함하고; 그리고 유사한 친수성값을 가지는 비하전성 극성 헤드기를 가지는 아미노산으로서는 류신, 이소류신 및 발린; 글리신 및 알라닌; 아스파라긴 및 글루타민; 세린, 트레오닌, 페닐알라닌 및 티로신;을 들 수 있다. 상기 변이는 보존적 치환을 포함할 수 있다. '보존적 치환'이란, 어느 아미노산이 유사한 특성을 가지는 다른 아미노산으로 치환되어 당업자라면 그 폴리펩타이드의 2차 구조 및 감수성질(hydropathic nature, 소수성 또는 친수성 성질)이 실질적으로 비변화되었다고 예측할 수 있는 치환이다. 일반적으로 하기 아미노산 군이 보존성 변화를 나타낸다: (1) ala, pro, gly, glu, asp, gln, asn, ser, thr; (2) cys, ser, tyr, thr; (3) val, ile, leu, met, ala, phe; (4) lys, arg, his; 및 (5) phe, tyr, trp, his.
경우에 따라서는, 상기 변이체는 인산화(phosphorylation), 황화(sulfation), 아크릴화(acrylation), 당화(glycosylation), 메틸화(methylation), 파네실화(farnesylation), 아세틸화(acetylation) 및 아밀화(amidation) 등으로 수식(modification)될 수도 있다.
또한, 본 발명에 따른 서열은 세포 내 투과를 위해 세포 투과성 펩타이드 서열을 더 포함할 수도 있다. 세포 투과성 펩타이드란 일종의 신호 펩타이드로써 세포 내로 물질 전달을 목적하는 펩타이드 서열이다. 주로 7-30 개 정도의 아미노산 펩타이드 서열로 이루어지며, 세포 내로 전달될 수 있는 신호 펩타이드를 가지는 서열이라면 어떠한 서열이라도 본 발명에서 포함될 수 있다.
예컨대, 세포 투과성 펩타이드는 라이신/아르기닌 등 기본 아미노산 잔기들을 주로 포함하고 있어서 이와 융합된 단백질들을 세포막을 투과하여 세포내로 침투시키는 역할을 한다. 상기 세포 투과성 펩타이드는 HIV-1 Tat 단백질, 드로소필라 안테나페디아의 호메오도메인(페네트라틴), HSV VP22 전사조절단백질, vFGF에서 유도된 MTS 펩타이드, PTD-5, 트랜스포탄 또는 Pep-1 펩타이드에서 유래된 서열 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 이와 같이, 바이러스 또는 양이온성 펩타이드로부터 동정/합성된 다양한 CPPs(예를 들어, TAT48-60, 페네트라틴(pAntp)43-58, 폴리아르기닌, Pep-1, 트랜스포탄, 등)은 생물학적 활성 물질은 약물운반체들의 이동을 매개하기 위해 세포 내재화 (internalization)가 가능한 활성을 가진다.
본 발명에 따른 상기 염증성 질환은 아토피 피부염, 부종, 피부염, 알레르기, 천식, 결막염, 치주염, 비염, 중이염, 인후염, 편도염, 폐렴, 위궤양, 위염, 크론병, 대장염, 치질, 통풍, 강직성 척추염, 류마티스, 루푸스, 섬유근통(fibromyalgia), 건선관절염, 골관절염, 류마티스관절염, 견관절주위염, 건염, 건초염, 근육염, 간염, 방광염, 신장염, 쇼그렌 증후군(sjogren's syndrome) 및 다발성 경화증으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상일 수 있다.
본 발명에 따른 상기 펩타이드 페리플라네타신-5는 염증성 사이토카인 TNF-α 및 IL-6의 발현을 억제하고, 단백질인 시클로옥시게나아제-2(COX-2) 및 유도성 산화질소 생성효소(iNOS)의 발현을 억제하며, 산화질소 생성을 억제하는 것일 수 있다.
본 발명에서, "치료" 및 "치료하는"은 질병 또는 건강 관련 상태의 치료 이점을 얻을 목적의 대상체에의 치료제의 투여 또는 적용 또는 대상체에서의 절차 또는 방식의 수행을 지칭한다. "예방", "예방하는" 등은 질환 또는 병태의 발생 또는 재발 가능성을 예방하거나, 저해하거나 또는 감소시키기 위한 접근을 나타낸다. 또한 질환 또는 병태의 개시 또는 재발을 지연시키거나 또는 질환 또는 병태의 발생 또는 재발을 지연시키는 것을 지칭한다.
본 발명에서, "대상체" 및 "환자"는 인간 또는 비 인간, 예컨대 영장류, 포유류, 척추동물을 지칭한다. 특정 실시형태에서, 대상체는 인간이다.
본 발명에서, "치료 이점" 또는 "치료적으로 유효한"은 이러한 상태의 의학적 치료와 관련하여 대상체의 건강을 촉진하거나 증대시키는 임의의 것을 지칭한다. 이는 이에 제한되는 것은 아니나, 질병의 징후 또는 증상의 빈도 또는 중증도의 감소를 포함한다.
본 발명에 따른 상기 페리플라네타신-5는 본 발명의 약학 조성물에 0.001~95 중량%로 하여 첨가될 수 있다. 상기 약학 조성물은, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다. 상기 약학 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 본 발명의 펩타이드 페리플라네타신-5에 적어도 하나 이상의 부형제, 예를 들면, 전분, 탄산칼슘, 수크로스 또는 락토오스, 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.
본 발명의 약학 조성물의 투여량은 치료받을 대상의 연령, 성별, 체중과 치료할 특정 질환 또는 병리 상태, 질환 또는 병리 상태의 심각도, 투여경로 및 처방자의 판단에 따라 달라질 것이다. 이러한 인자에 기초한 투여량 결정은 당업자의 수준 내에 있으며, 일반적으로 투여량은 0.01㎎/㎏/일 내지 대략 2000㎎/㎏/일의 범위이다. 더 바람직한 투여량은 1㎎/㎏/일 내지 500㎎/㎏/일이다. 투여는 하루에 한번 투여할 수도 있고, 수회 나누어 투여할 수도 있다. 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.
본 발명의 약학 조성물은 쥐, 가축, 인간 등의 포유동물에 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여의 모든 방식은 예상될 수 있는데, 예를 들면, 경구, 직장 또는 정맥, 근육, 피하, 자궁내 경막 또는 뇌혈관내 주사에 의해 투여될 수 있다. 본 발명의 약학 조성물은 정맥 내 투여 또는 체강 내 투여를 포함하여 비경구 투여에 적합하다.
본 발명은 염증성 질환의 치료를 위한 약제의 제조에 있어 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 펩타이드 페리플라네타신-5의 용도를 제공한다.
본 발명은 치료학적으로 유효한 양의 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 펩타이드 페리플라네타신-5를 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계;를 포함하는 염증성 질환의 치료 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 펩타이드 페리플라네타신-5를 포함하는 염증성 질환 예방 또는 개선용 식품 조성물을 제공한다.
본 발명에 따르면, 상기 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 펩타이드 페리플라네타신-5를 포함하는 염증성 질환 예방 또는 개선용 건강기능식품을 제공한다.
본 발명에 의하면, 상기 건강기능식품은 염증성 질환 예컨대, 아토피 피부염, 부종, 피부염, 알레르기, 천식, 결막염, 치주염, 비염, 중이염, 인후염, 편도염, 폐렴, 위궤양, 위염, 크론병, 대장염, 치질, 통풍, 강직성 척추염, 류마티스, 루푸스, 섬유근통(fibromyalgia), 건선관절염, 골관절염, 류마티스관절염, 견관절주위염, 건염, 건초염, 근육염, 간염, 방광염, 신장염, 쇼그렌 증후군(sjogren's syndrome) 및 다발성 경화증으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나의 질환을 예방 또는 개선하기 위한 것일 수 있다.
본 발명의 식품 조성물은 통상의 식품 첨가물을 포함할 수 있으며, 상기 "식품 첨가물"로서의 적합 여부는 다른 규정이 없는 한, 식품의약품안전처에 승인된 식품 첨가물 공전의 총칙 및 일반시험법 등에 따라 해당 품목에 관한 규격 및 기준에 의하여 판정한다.
상기 "건강기능식품"이라 함은 건강기능식품에 관한 법률에 따른 인체에 유용한 기능성을 가진 원료나 성분을 사용하여 제조 및 가공한 식품을 의미하며, "기능성"이라 함은 인체의 구조 및 기능에 대하여 영양소를 조절하거나 생리학적 작용 등과 같은 보건 용도에 유용한 효과를 얻을 목적으로 섭취하는 것을 의미한다.
상기 "식품 첨가물 공전"에 수재된 품목으로는 예를 들어, 케톤류, 글리신, 구연산칼륨, 니코틴산, 계피산 등의 화학적 합성물, 감색소, 감초추출물, 결정셀룰로오스, 고량색소, 구아검 등의 천연첨가물, L-글루타민산나트륨 제제, 면류첨가알칼리제, 보존료제제, 타르색소제제 등의 혼합제제류들을 들 수 있다.
본 발명의 식품 조성물은 조성물 총 중량에 대하여 페리플라네타신-5 0.01 내지 95 중량%, 바람직하게는 1 내지 80 중량%로 포함할 수 있다.
또한, 본 발명의 식품 조성물은 정제, 캡슐, 분말, 과립, 액상, 환 등의 형태로 제조 및 가공할 수 있다.
예를 들어, 상기 정제 형태의 건강기능식품은 페리플라네타신-5, 부형제, 결합제, 붕해제, 및 다른 첨가제와의 혼합물을 통상의 방법으로 과립화한 다음, 활택제 등을 넣어 압축성형하거나, 상기 혼합물을 직접 압축성형할 수 있다. 또한, 상기 정제 형태의 건강기능식품은 필요에 따라 교미제 등을 함유할 수 있으며, 필요에 따라 적당한 제피제로 제피할 수도 있다.
캡슐 형태의 건강기능식품 중 경질캡슐제는 통상의 경질캡슐에 페리플라네타신-5 및 부형제 등의 첨가제와의 혼합물 또는 그의 입상물 또는 제피한 입상물을 충진하여 제조할 수 있으며, 연질캡슐제는 페리플라네타신-5 및 부형제 등의 첨가제와의 혼합물을 젤라틴 등 캡슐기제에 충진하여 제조할 수 있다. 상기 연질캡슐제는 필요에 따라 글리세린 또는 소르비톨 등의 가소제, 착색제, 보존제 등을 함유할 수 있다.
환 형태의 건강기능식품은 페리플라네타신-5, 부형제, 결합제, 붕해제 등의 혼합물을 적당한 방법으로 성형하여 조제할 수 있으며, 필요에 따라 백당이나 다른 적당한 제피제로 제피를, 또는 전분, 탈크 또는 적당한 물질로 환의를 입힐 수도 있다.
과립형태의 건강기능식품은 페리플라네타신-5, 부형제, 결합제, 붕해제 등의 혼합물을 적당한 방법으로 입상으로 제조할 수 있으며, 필요에 따라 착향제, 교미제 등을 함유할 수 있다. 과립형태의 건강기능식품은 12호 (1680 μm), 14호 (1410 μm) 및 45호 (350 μm) 체를 써서 다음 입도시험을 할 때에 12호체를 전량 통과하고 14호체에 남는 것이 전체량의 5.0 %이하이고 또 45호체를 통과하는 것은 전체량의 15.0 %이하일 수 있다.
상기 부형제, 결합제, 붕해제, 활택제, 교미제, 착향제 등에 대한 용어 정의는 당업계에 공지된 문헌에 기재된 것으로 그 기능 등이 동일 내지 유사한 것들을 포함한다 (대한약전 해설편, 문성사, 한국약학대학협의회, 제 5 개정판, p33-48, 1989).
상기 식품의 종류에는 특별한 제한이 없다. 본 발명의 페리플라네타신-5를 첨가할 수 있는 식품의 예로는 음료, 껌, 비타민 복합제, 드링크제 등이 있으며, 통상적인 의미에서의 건강기능식품을 모두 포함한다.
상기 식품 조성물은 식품보조첨가제를 포함할 수 있으며, 식품류는 예를 들어, 음료, 껌, 차, 비타민 복합제, 건강보조 식품류 등이 있으며, 캡슐, 정제, 분말, 과립, 액상, 환, 편상, 페이스트상, 시럽, 겔, 음료, 젤리 또는 바인 형태로 사용할 수 있다.
페리플라네타신-5의 함량은 건강기능식품 총 중량을 기준으로 0.01 내지 15 중량%로 함유할 수 있으며, 건강음료 조성물의 경우에는 총 100 g을 기준으로 0.02 내지 10 g, 바람직하게는 0.3 내지 1 g으로 함유할 수 있다.
상기 식품보조첨가제는 당업계에 통상적인 식품첨가제, 예를 들어 향미제, 풍미제, 착색제, 충진제, 안정화제 등을 포함한다. 또한, 상기 건강음료조성물은 지시된 비율로 필수 성분으로서, 상기 페리플라네타신-5 외에 첨가되는 성분에 특별한 제한은 없으며 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 예로는 모노사카라이드, 예를 들어, 포도당, 과당 등; 디사카라이드, 예를 들어 말토스, 슈크로스 등; 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 시클로덱스트린; 등과 같은 통상적인 당 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 상술한 것 이외의 향미제로서 천연 향미제 (타우마틴, 스테비아 추출물 (예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진 등)) 및 합성 향미제 (사카린, 아스파르탐 등)를 유리하게 사용할 수 있다.
상기 외, 페리플라네타신-5를 포함하는 식품 조성물 또는 건강기능식품은 여러 가지 영양제, 비타민, 광물 (전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 중진제 (치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산 음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다.
또한, 본 발명은 페리플라네타신-5를 포함하는 염증성 질환의 예방 또는 개선용 사료 조성물을 제공한다.
본 발명에 있어서 상기 사료는 어류, 조류 또는 포유류의 사료 일 수 있으며, 바람직하게, 축산법 제2조 제1호 및 동법 시행규칙 제2조 각호에서 정의하고 있는, 야생습성이 순화되어 사육하기에 적합하며 농가의 소득증대에 기여할 수 있는 가축 또는 수산생물의 사료일 수 있다. 상기 가축에는 소, 말, 노새, 당나귀, 염소, 산양, 면양, 사슴, 돼지, 토끼, 가금류 등일 수 있으며, 가금류에는 닭, 칠면조, 오리, 타조, 거위, 메추리 등, 바람직하게는 닭일 수 있으나, 사육하여 축산물을 얻기에 적합한 것이라면 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 "축산물"은 축산법 제2조 3호의 정의인, 가축에서 생산된 고기, 젖, 알, 꿀과 이들의 가공품, 원피 (원모피를 포함한다), 원모, 기타 가축의 생산물로서 농림부령이 정하는 것을 의미한다. 또한 반려동물을 포함하여 개, 고양이 등일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
발명의 용어 "사료"는 동물이 먹고, 섭취하며, 소화시키기 위한 또는 이에 적당한 임의의 천연 또는 인공 규정식, 한끼식 등 또는 상기 한끼식의 성분을 의미한다. 일 양태로, 본 발명의 페리플라네타신-5를 함유하는 사료용 조성물에는 농후사료, 조사료 및/또는 특수사료가 포함될 수 있다.
농후사료에는 밀, 귀리, 옥수수 등의 곡류를 포함하는 종자열매류, 곡물을 정제하고 얻는 부산물로서 쌀겨, 밀기울, 보릿겨 등을 포함하는 겨류, 콩, 유체, 깨, 아마인, 코코야자 등을 채유하고 얻는 부산물인 깻묵류와 고구마, 감자 등에서 녹말을 뺀 나머지인 녹말찌꺼기의 주성분인 잔존녹말질류 등의 찌꺼기류, 어분, 물고기찌꺼기, 어류에서 얻은 신선한 액상물을 농축시킨 것인 피시솔루블, 육분, 혈분, 우모분, 탈지분유, 우유에서 치즈, 탈지유에서 카제인을 제조할 때의 잔액인 훼이(whey)를 건조한 건조훼이 등의 동물질사료, 효모, 클로렐라, 해조류 등이 있다.
조사료에는 야초, 목초, 풋베기 등의 생초(生草)사료, 사료용 순무, 사료용 비트, 순무의 일종인 루터베어거 등의 뿌리채소류, 생초, 풋베기작물, 곡실(穀實)등을 사일로에 채워 놓고 젖산발효시킨 저장사료인 사일리지(silage), 야초, 목초를 베어 건조시킨 건초, 종축용(種畜用) 작물의 짚, 콩과 식물의 나뭇잎 등이 있다. 특수 사료에는 굴껍떼기, 암염 등의 미네랄 사료, 요소나 그 유도체인 디우레이드이소부탄 등의 요소사료, 천연사료 원료만을 배합했을 때 부족하기 쉬운 성분을 보충하거나, 사료의 저장성을 높이기 위해서 배합사료에 미량으로 첨가하는 물질인 사료첨가물 등이 있다.
본 발명에 따른 펩타이드 페리플라네타신-5은 염증성 사이토카인 TNF-α 및 IL-6의 발현을 억제하고, 단백질인 시클로옥시게나아제-2(COX-2) 및 유도성 산화질소 생성효소(iNOS)의 발현을 억제하며, 산화질소 생성을 억제하여 항염증 효능이 우수하므로, 염증성 질환의 예방 또는 치료제, 건강식품보조제 및 사료 조성물로서 사용이 가능하다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 페리플라네타신-5이 갖는 세포독성을 검정한 결과이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 페리플라네타신-5이 갖는 산화질소 억제 효능을 검정한 결과이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 페리플라네타신-5이 갖는 염증유발과 관련된 사이토카인 TNF-α 및 IL-6의 발현 억제 효과를 qRT-PCR로 확인한 결과이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따른 페리플라네타신-5이 갖는 염증유발과 관련된 사이토카인 TNF-α 및 IL-6의 발현 억제 효과를 ELISA로 확인한 결과이다.
도 5는 본 발명의 일 실시예에 따른 페리플라네타신-5이 갖는 염증매개인자 시클로옥시게나아제-2(COX-2) 및 유도성 산화질소 생성효소(iNOS)의 발현억제를 확인한 결과이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 페리플라네타신-5이 갖는 산화질소 억제 효능을 검정한 결과이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 페리플라네타신-5이 갖는 염증유발과 관련된 사이토카인 TNF-α 및 IL-6의 발현 억제 효과를 qRT-PCR로 확인한 결과이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따른 페리플라네타신-5이 갖는 염증유발과 관련된 사이토카인 TNF-α 및 IL-6의 발현 억제 효과를 ELISA로 확인한 결과이다.
도 5는 본 발명의 일 실시예에 따른 페리플라네타신-5이 갖는 염증매개인자 시클로옥시게나아제-2(COX-2) 및 유도성 산화질소 생성효소(iNOS)의 발현억제를 확인한 결과이다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시하나, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 범주 및 기술사상 범위 내에서 다양한 변경 및 수정이 가능함은 당업자에게 있어서 명백한 것이며, 이러한 변형 및 수정이 첨부된 특허청구범위에 속하는 것도 당연한 것이다.
<실시예 1. 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 펩타이드 페리플라네타신 -5(Periplanetasin-5)의 제조>
이질바퀴로부터 항염증 활성을 나타내는 펩타이드 유전자를 확인하기 위해 먼저 이질바퀴를 액체질소로 급속 동결하여 전체 RNA를 분리하고, 이를 RNA seq 분석법을 이용하여 이질바퀴 전사체(transcriptome) 들에 관한 유전자 정보를 확인하였으며, 각각의 전사체들로부터 번역된 아미노산의 서열을 바탕으로 항염증 활성 실험을 통해 항염증을 나타내는 펩타이드로 추정되는 유전자를 선별하였다. 선별된 아미노산 서열은 MKTFLRLYRSLINKVLH-NH2으로 17개의 아미노산 서열로 구성되어 있으며, 페리플라네타신-5(Periplanetasin-5)로 명명하였다.
페리플라네타신-5를 98% 이상의 순도로 합성하였고, 0.01% 아세트산에 용해시켜 사용하였다.
<
시험예
1. 세포 생존율 검사>
세포 배양
항염증 효과 검증을 위해 마우스의 대식세포인 Raw264.7 세포를 이용하여 실험을 진행하였다. 37℃, 5％ CO2 배양기에서 항생제 (100 units/㎖ 페니실린, 100 ㎍/㎖ 스트렙토마이신)와 10％ 우태아혈청(fetal bovine serum, FBS)이 함유된 Dulbecco's Modified Eagle Medium(DMEM) 배지를 이용하여 배양하고 실험에 사용하였다.
세포 생존율 측정(MTS assay)
96-well 배양용기에 2 × 104 cell/well 세포를 100 ㎕씩 분주한 후, 페리플라네타신-5를 농도별(10, 20, 30, 40, 50 및 60 ㎍/ml)로 24시간 동안 배양기에서 반응시켰다. 이후, MTS 시약 10 ㎕ CellTiter 96ⓡ AQueous One Solution Reagent (Promega, USA)를 첨가하고 3~4 시간 반응시켜 색의 변화를 확인하였고 이를 multi detecter (Beckman DTX8800)를 이용하여 450 nm 파장에서 흡광도 측정을 통해 확인하였다.
도 1에 나타낸 바와 같이, 페리플라네타신-5로 처리한 모든 처리군(10, 20, 30, 40, 50 및 60 ㎍/ml)에서 대조군과 비교시 100% 이상의 세포 생존율을 나타내었다. 이는, 본 발명에 따른 페리플라네타신-5가 60 ㎍/ml까지 Raw264.7 세포에 독성을 나타내지 않으며, 세포 성장에 영향을 주지 않음을 시사한다.
<
시험예
2. 항염증 활성 검정>
산화질소
억제능
검정
Raw 264.7 세포는 염증 유발 시 NO를 생산하고 이를 세포 외로 분비하는 것으로 알려져 있다. 페리플라네타신-5의 항염증 활성을 측정하기 위해 Raw264.7 세포에서 NO의 분비량을 확인하였다. 세포를 96-well에 각 2 × 104 cell/well 세포를 100 ㎕씩 준비한 후 세포 안정화를 위해 24시간 배양하였다. 그 후 펩타이드를 농도별(10, 20, 30, 40, 50 및 60 ㎍/ml)로 1시간 처리하고 염증을 유발하기 위해 lipopolysaccharide (LPS)를 0.1 μg 처리한 뒤 24시간 배양 하였다. 배양된 세포의 상등액 100 μl를 실험에 사용하였으며 NO detection kit (intron)를 이용하여 LPS에 의해 분비되는 NO의 양이 펩타이드에 의해 얼마나 감소되는지를 multi detecter (Beckman DTX8800)를 이용하여 550nm 파장에서 흡광도 측정을 통해 확인하였다.
도 2에 나타낸 바와 같이, 페리플라네타신-5의 농도의존적으로 NO의 분비량이 감소하는 것을 확인할 수 있다.
사이토카인 발현량 검정
세포에서 염증이 유발되면 염증유발인자인 사이토카인(cytokine)의 발현량이 증가된다. 이에 본 실험은 사이토카인 중에 대표적인 물질인 TNF-α, IL-6 의 발현량을 qRT-PCR과 ELISA 실험 방법을 이용하여 검정하였다.
1. 정량적 역전사 중합효소 연쇄반응(qRT-PCR)
세포를 6well에 각 2 × 105 cell/well 세포수를 준비한 후 세포 안정화를 위해 24시간 배양하였다. 그 후 페리플라네타신-5를 농도별(10, 20, 30, 40, 50 및 60 ㎍/ml)로 1시간 처리하고 염증을 유발하기 위해 lipopolysaccharide (LPS)를 0.1 μg 처리한 뒤 24시간 배양하였다. 그 후 상등액을 제거하고 PBS로 세척한 후 세포를 수거하였다. 수거한 세포에 1 ml의 TRIZOL 용액을 혼합하고 5분간 상온에서 반응시킨다. 200 ㎕ 클로로포름을 첨가하여 섞어준 후 4℃에서 12,000×g로 15분간 원심분리한 뒤 상층액을 취해 500 ㎕ 이소프로판올을 첨가하고 상온에서 10분간 반응시킨 후 4℃에서 12,000×g로 10분간 원심분리한다. 침전된 RNA는 1 ml 75％ 에탄올로 세척하고 4℃에서 7,500×g로 5분간 원심분리한다. 원심분리 후 에탄올을 제거하고 건조시킨 다음, 이를 멸균수에 녹여 RNA를 준비하였다. 그 후 1 μg의 total RNA를 이용하여 cDNA synthesis Kit로 cDNA를 준비하고 qRT-PCR 실험을 진행 하였으며 사용된 프라이머(primer)는 다음과 같다:
| cDNAs | 프라이머 시퀀스 | 서열번호 |
| Cyclooxygenase-2 (COX-2) |
Forward, 5'-CAGACAACATAAACTGCGCCTT-3' | 서열번호 2 |
| Reverse, 5'-GATACACCTCTCCACCAATGACC-3' | 서열번호 3 | |
| Inducible nitric oxide synthase (iNOS) | Forward, 5'-CAGCACAGGAAATGTTTCAGC-3' | 서열번호 4 |
| Reverse, 5'-TAGCCAGCGTACCGGATGA-3' | 서열번호 5 | |
| Iinterleukin-6 (IL-6) | Forward, 5'-GAGGATACCACTCCCAACAGACC-3' | 서열번호 6 |
| Reverse, 5'-AAGTGCATCATCGTTGTTCATACA-3' | 서열번호 7 | |
| Tumor necrosis factor-α (TNF-α) |
Forward, 5'-ATGAGAAGTTCCCAAATGGC-3' | 서열번호 8 |
| Reverse, 5'-CTCCACTTGGTGGTTTGCTA-3' | 서열번호 9 | |
| Glyceraldehyde-3-Phosphate Dehydrogenase (GAPDH) | Forward, 5'-AAGGTCATCCCAGAGCTGAA-3' | 서열번호 10 |
| Reverse, 5'-CTGCTTCACCACCTTCTTGA-3' | 서열번호 11 |
하기 도 3에 나타낸 바와 같이, 사이토카인의 발현량이 농도 의존적으로 감소하는 것을 확인하였으며, 이는 페리플라네타신-5이 염증 질환에 탁월한 효과를 보여준다.
2. ELISA 검정
세포를 6well에 각 2 × 105 cell/well 세포수를 준비한 후 세포 안정화를 위해 24시간 배양하였다. 그 후 페리플라네타신-5를 농도별(10, 20, 30, 40, 50 및 60 ㎍/ml)로 1시간 처리하고 염증을 유발하기 위해 lipopolysaccharide (LPS)를 0.1 μg 처리한 뒤 24시간 배양하였다. 배양된 세포의 상등액을 수거하여 IL-6, TNF-α의 분비량을 ELISA kit를 이용하여 multi detecter (Beckman DTX8800)로 흡광도를 측정하고 정량하였다.
하기 도 4에 나타낸 바와 같이, 사이토카인의 발현량이 농도 의존적으로 감소하는 것을 확인하였으며, 이는 페리플라네타신-5이 염증 질환에 탁월한 효과를 보여준다.
웨스턴
블롯
검정
염증 유발 시 사이토카인과 더불어 염증매개인자인 COX-2, iNOS의 발현량도 증가한다고 알려져 있다. 따라서 염증매개인자의 발현량을 qRT-PCR과 western blot 실험방법을 통해 확인하였다.
세포를 6well에 각 2 × 105 cell/well 세포수를 준비한 후 세포 안정화를 위해 24시간 배양하였다. 그 후 펩타이드를 농도별로 1시간 처리하고 염증을 유발하기 위해 lipopolysaccharide (LPS)를 0.1 μg 처리한 뒤 24 시간 배양하였다. 그 후 상등액을 제거하고 PBS로 세척한 후 lysis buffer를 이용하여 세포를 수거하였다. 다음으로 수거한 세포의 단백질(protein)을 정량하고 이를 10% SDS-PAGE gel을 이용하여 전개하였다. 전개된 단백질들은 transfer kit를 사용하여 nitrocellulose membrane으로 transfer 시켰다. 이 membrane을 5% skim milk로 1시간 동안 블로킹(blocking)하고, 1차 항체(1:1000)를 희석하여 4 ℃에서 밤샘 반응(over night)한 다음, TBST로 10분 간격으로 3회 세척하고, 각각의 2차 항체를 1:10000으로 희석하여 실온에서 3시간 동안 상온에서 반응시켰다. 다시 TBST로 10분간 3회 세척 후 ECL용액으로 반응시키고 시그널의 확인은 Image analyzer FluorChem (Alpha Innotech, USA)을 이용하여 측정했다.
도 5에 나타낸 바와 같이, 염증매개인자인 COX-2 와 iNOS는 페리플라네타신-5의 처리 농도 의존적으로 감소하였다.
상기 결과를 통해 본 발명에 따른 페리플라네타신-5가 염증유발인자 및 염증 매개인자의 발현을 억제하고, 산화질소의 분비량을 감소시킴으로써 염증성 질환의 예방, 개선 및 치료에 우수한 효과가 있음을 확인하였다.
<110> REPUBLIC OF KOREA(MANAGEMENT : RURAL DEVELOPMENT ADMINISTRATION)
<120> Composition for anti-inflammation comprising peptide,
Periplanetasin-5 isolated from Periplaneta americana
<130> nsh1.132
<160> 11
<170> KoPatentIn 3.0
<210> 1
<211> 17
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Periplaneta americana
<400> 1
Met Lys Thr Phe Leu Arg Leu Tyr Arg Ser Leu Ile Asn Lys Val Leu
1 5 10 15
His
<210> 2
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> COX-2 Forward
<400> 2
cagacaacat aaactgcgcc tt 22
<210> 3
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> COX-2 Reverse
<400> 3
gatacacctc tccaccaatg acc 23
<210> 4
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> iNOS Forward
<400> 4
cagcacagga aatgtttcag c 21
<210> 5
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> iNOS Reverse
<400> 5
tagccagcgt accggatga 19
<210> 6
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> IL-6 Forward
<400> 6
gaggatacca ctcccaacag acc 23
<210> 7
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> IL-6 Reverse
<400> 7
aagtgcatca tcgttgttca taca 24
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> TNF alpha Forward
<400> 8
atgagaagtt cccaaatggc 20
<210> 9
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> TNF alpha Reverse
<400> 9
ctccacttgg tggtttgcta 20
<210> 10
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> GAPDH Forward
<400> 10
aaggtcatcc cagagctgaa 20
<210> 11
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> GAPDH Reverse
<400> 11
ctgcttcacc accttcttga 20
Claims (12)
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 하기 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 펩타이드 페리플라네타신-5(Periplanetasin-5)을 포함하는 항염증용 식품 조성물.
서열번호 1: MKTFLRLYRSLINKVLH-NH2 - 제4항에 있어서,
상기 페리플라네타신-5는 이질바퀴(Periplaneta americana)의 전사체로부터 분리한 유전자에서 합성된 펩타이드인 것인 항염증용 식품 조성물. - 제4항에 있어서,
상기 페리플라네타신-5는 염증성 사이토카인 TNF-α 및 IL-6의 발현을 억제하고, 단백질인 시클로옥시게나아제-2(COX-2) 및 유도성 산화질소 생성효소(iNOS)의 발현을 억제하며, 산화질소 생성을 억제하는 것인 항염증용 식품 조성물. - 하기 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 펩타이드 페리플라네타신-5(Periplanetasin-5)을 포함하는 항염증용 사료 조성물.
서열번호 1: MKTFLRLYRSLINKVLH-NH2 - 제7항에 있어서,
상기 페리플라네타신-5는 이질바퀴(Periplaneta americana)의 전사체로부터 분리한 유전자에서 합성된 펩타이드인 것인 항염증용 사료 조성물. - 제7항에 있어서,
상기 페리플라네타신-5는 염증성 사이토카인 TNF-α 및 IL-6의 발현을 억제하고, 단백질인 시클로옥시게나아제-2(COX-2) 및 유도성 산화질소 생성효소(iNOS)의 발현을 억제하며, 산화질소 생성을 억제하는 것 항염증용 사료 조성물. - 하기 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 펩타이드 페리플라네타신-5(Periplanetasin-5)을 포함하는 항염증용 건강기능식품.
서열번호 1: MKTFLRLYRSLINKVLH-NH2 - 제10항에 있어서,
상기 페리플라네타신-5는 이질바퀴(Periplaneta americana)의 전사체로부터 분리한 유전자에서 합성된 펩타이드인 것인 항염증용 건강기능식품. - 제10항에 있어서,
상기 페리플라네타신-5는 염증성 사이토카인 TNF-α 및 IL-6의 발현을 억제하고, 단백질인 시클로옥시게나아제-2(COX-2) 및 유도성 산화질소 생성효소(iNOS)의 발현을 억제하며, 산화질소 생성을 억제하는 것인 항염증용 건강기능식품.
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| KR1020200071843A KR102470871B1 (ko) | 2020-06-12 | 2020-06-12 | 이질바퀴로부터 유래한 페리플라네타신-5 펩타이드를 포함하는 항염증용 조성물 |
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| KR1020200071843A KR102470871B1 (ko) | 2020-06-12 | 2020-06-12 | 이질바퀴로부터 유래한 페리플라네타신-5 펩타이드를 포함하는 항염증용 조성물 |
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|---|---|---|---|---|
| KR101889404B1 (ko) * | 2016-08-23 | 2018-08-20 | 대한민국 | 바퀴벌레에서 유래한 항균 펩타이드 페리플라네타신-5 및 그의 조성물 |
-
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- 2020-06-12 KR KR1020200071843A patent/KR102470871B1/ko active IP Right Grant
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