KR102176272B1 - 커피 실버스킨 추출물을 포함하는 근력강화 또는 근감소증의 예방 및 치료용 조성물 - Google Patents
커피 실버스킨 추출물을 포함하는 근력강화 또는 근감소증의 예방 및 치료용 조성물 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 커피 실버스킨 추출물을 포함하는 근력강화 또는 근감소증의 예방 및 치료용 조성물에 관한 것으로, 본 발명의 커피 실버스킨 추출물은 세포독성이 없고 항마이오스타틴의 활성에 효과가 뛰어나므로 근력강화 또는 근감소증의 예방 및 치료용 약학 조성물로 유용하게 이용할 수 있을 것이다.
Description
본 발명은 커피 실버스킨 추출물을 포함하는 근력강화 또는 근감소증의 예방 및 치료용 조성물에 관한 것이다.
20세기에 들어 인구의 수가 두 배로 증가한 사례는 두 차례나 있었지만, 21세기에 접어들면서 출산율 하락 및 평균 수명의 연장으로 인해 인구의 증가가 두 배로 증가하는 일은 한 번 있기도 어려운 실정이다. 2015년 유엔의 세계인구 전망 (World population prospects : the 2015 revision)에 의하면 2015년 9억 1000만 명이었던 60세 이상의 인구는 2030년 약 14억 명으로 증가할 것이며, 2050년에는 21억 명에 이를 것으로 추정하고 있다. 또한 80세 이상의 초 고령 노년층은 2050년에 약 4억 3400만 명에 달할 것이며 이러한 증가는 향후 수십 년간 지속 될 것으로 전망하고 있다. 우리나라 또한 2000년에 65세 이상의 인구가 전체 인구의 7.2%에 달해 고령화 사회 (aging society)에 들어선 이후, 2018년에는 고령사회 (aged society)로 접어들고, 2026년에는 노인인구의 비율이 20.8%에 달해 초 고령사회 (post-aged society)에 진입한다는 것이 통계청의 전망이다. 또한 다른국가에 비해 우리나라는 고령사회 또는 초고령사회까지 도달하는 기간이 매우 빠르게 접근하고 있는 것이 큰 문제점으로 지적되고 있다. 이러한 문제점은 최근 급격히 낮아지는 출산율이 원인으로 생각되어지며 이로인해 노인인구의 수가 급격히 증가하는 현상이 나타나고 있다.
노화(aging)란 생물의 신체기능이 시간이 흐름에 따라 퇴화하는 현상으로, 인간의 경우 80세가 되면 청각은 30%, 혈액박출양은 45%, 폐활량은 60%, 근육량은 50% 감소하는 것으로 알려져있다. 노화에 따른 각종 생리활성은 모두 저하되지 않고 일부 효소 활성이나 호르몬 분비기능은 증가되기도 한다. 따라서 노화에 따른 생리적 변화는 대상성 기능증진 또는 제어기구의 결함이므로 단순한 생리활성의 저하가 아닌 적응능력의 저하라고 할 수 있다.
노화에 따른 대표적인 생리적 변화는 근육량 및 근력 감소이다. 근육량 감소는 40대 이후부터 발생하여 70대까지 10년에 약 8%의 감소가 일어나는 것으로 알려져 있으며, 이후에는 급격한 감소가 발생하여 10년에 최대 15%까지 발생하는 것으로 알려져 있다. 노인의 근감소증 (sarcopenia)는 직접적인 근력 감소를 유발하여 각종 신체 기능의 감소 및 장애로 인해 사망의 위험성을 증가시킬 뿐 아니라 신진대사의 감소 및 면역력 저하 등 고혈압, 당뇨, 관절염, 비만, 암 등과 같은 대사성 질환의 유병률을 높이는 원인이 되기도 한다.
이러한 근육량의 감소와 관련하여 골격근의 성장을 억제하는 마이오스타틴의 연구가 되고 있으며, 마이오스타틴의 기능만을 억제하기 위한 항체를 제조하였으나, 부작용이 나타났으며, 천연물을 이용한 항마이오스타틴 소재에 대한 연구는 진행되고 있으나 아직까지 세포 수준에서의 연구가 대부분이며 임상실험에 도달한 연구는 전무한 상황이다.
본 발명의 목적은 커피 실버스킨(silver skin) 추출물을 포함하는 근력강화 또는 근감소증의 예방 및 치료용 약학 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 커피 실버스킨(silver skin) 추출물을 포함하는 근력강화 또는 근감소증의 예방 및 개선용 건강기능식품을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 커피 실버스킨(silver skin) 추출물을 포함하는 사료 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명자들은 근력강화 또는 노화에 의한 근감소증을 예방 및 치료하기 위한 천연물질을 개발하기 위하여 다양한 연구를 수행하던 중, 커피 원두를 로스팅하는 과정에서 발생하는 실버스킨이 항마이오스타틴에 활성을 띄는 것을 확인하였으며, 상기 실버스킨 추출물의 근력강화 또는 근감소증 치료제는 지금까지 전혀 알려지지 않았고, 본 발명자에 의하여 최초로 개발되는 점에서 그 의의가 매우 크다고 할 수 있다.
상기 과제를 해결하기 위하여 본 발명은 커피 실버스킨(silver skin) 추출물을 포함하는 근력강화 또는 근감소증의 예방 및 치료용 약학 조성물을 제공한다.
본 발명의 일실시예에서, 상기 커피 실버스킨은 생두(green bean)를 원두(coffee bean)로 로스팅(roasting)하는 과정에서 생성되는 껍질인 것이다.
본 발명의 일실시예에서, 상기 추출물은 물, 탄소수 1 내지 4의 알코올 또는 이들의 혼합용매로 구성되는 군으로부터 선택되는 용매로 추출하여 제조될 수 있다.
본 발명의 일실시예에서, 상기 추출물은 열수 추출물 또는 50 내지 99 % 에탄올 추출물인 것일 수 있다.
본 발명의 일실시예에서, 상기 근감소증은 근위축증, 근무력증, 근이영양증, 근경직증, 근긴장저하, 근력약화, 근육퇴행위축, 근위축성 측삭경화증 또는 중증 근무력증인 것일 수 있다.
본 발명의 일실시예에서, 상기 추출물은 항마이오스타틴(anti Myostatin) 활성을 갖는 것일 수 있다.
또한, 본 발명은 커피 실버스킨(silver skin) 추출물을 포함하는 근력강화 또는 근감소증의 예방 및 개선용 건강기능식품을 제공한다.
또한, 본 발명은 커피 실버스킨(silver skin) 추출물을 포함하는 사료 조성물을 제공한다.
본 발명의 커피 실버스킨 추출물은 세포독성이 없고 항마이오스타틴의 활성에 효과가 뛰어나므로 근력강화 및 근감소증의 예방 및 치료용 약학 조성물로 유용하게 이용할 수 있을 것이다.
도 1은 커피 실버스킨 추출물을 제조하는 과정을 나타낸 모식도이다.
도 2는 커피 실버스킨 추출물 처리 농도에 따른 세포독성 및 항산화 활성 결과를 나타낸 그래프이다:
A: 실버스킨 에탄올 추출물(SSEE)의 농도 1000, 100, 10 ug/ml에 따른 세포 독성 결과,
B: 실버스킨 에탄올 추출물(SSEE)의 농도 200, 100, 10, 1 ug/ml, AC(ascorbic acid) 50 ug/ml에 따른 항산화 결과.
도 3은 커피 실버스킨 추출물의 항마이오스타틴 활성, ActivinA와 GDF11 저해 활성 및 마이오스타틴 신호전달을 분석한 결과를 나타낸 그래프 및 필름 결과이다:
A: 실버스킨 에탄올 추출물 (SSEE)의 농도 10, 5.0, 1.0, 0.1, 0.01 ug/ml에 따른 항마이오타틴, Activin A, 그리고 GDF11 저해 활성결과
B: Lane 1은 대조구(control, 처리 안함), Lane 2는 마이오스타틴만 처리, Lane 3은 양성 대조구(positive control)로서 마이오스타틴과 SB431542 (마이오스타틴이 결합하는 수용체의 인산화를 억제하는 small molecule)를 동시에 처리, Lane 4, 5는 마이오스타틴과 실버스킨 에탄올 추출물(SSEE) 동시에 처리함.
도 4는 동물모델에서 실버스킨 에탄올 추출물(SSEE) 처리 일수에 따른 근력 변화를 확인한 그래프이다:
A: 몸무게, B: 근력, C: 근밀도.
도 5는 생두(green bean), 원두(coffee bean) 및 실버스킨의 열수 및 에탄올 추출에 따른 항마이오스타틴 활성을 분석한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 6은 커피 실버스킨을 분리하는 과정을 나타낸 사진이다.
도 7은 생산지별 커피 실버스킨의 항마이오스타틴 활성 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 2는 커피 실버스킨 추출물 처리 농도에 따른 세포독성 및 항산화 활성 결과를 나타낸 그래프이다:
A: 실버스킨 에탄올 추출물(SSEE)의 농도 1000, 100, 10 ug/ml에 따른 세포 독성 결과,
B: 실버스킨 에탄올 추출물(SSEE)의 농도 200, 100, 10, 1 ug/ml, AC(ascorbic acid) 50 ug/ml에 따른 항산화 결과.
도 3은 커피 실버스킨 추출물의 항마이오스타틴 활성, ActivinA와 GDF11 저해 활성 및 마이오스타틴 신호전달을 분석한 결과를 나타낸 그래프 및 필름 결과이다:
A: 실버스킨 에탄올 추출물 (SSEE)의 농도 10, 5.0, 1.0, 0.1, 0.01 ug/ml에 따른 항마이오타틴, Activin A, 그리고 GDF11 저해 활성결과
B: Lane 1은 대조구(control, 처리 안함), Lane 2는 마이오스타틴만 처리, Lane 3은 양성 대조구(positive control)로서 마이오스타틴과 SB431542 (마이오스타틴이 결합하는 수용체의 인산화를 억제하는 small molecule)를 동시에 처리, Lane 4, 5는 마이오스타틴과 실버스킨 에탄올 추출물(SSEE) 동시에 처리함.
도 4는 동물모델에서 실버스킨 에탄올 추출물(SSEE) 처리 일수에 따른 근력 변화를 확인한 그래프이다:
A: 몸무게, B: 근력, C: 근밀도.
도 5는 생두(green bean), 원두(coffee bean) 및 실버스킨의 열수 및 에탄올 추출에 따른 항마이오스타틴 활성을 분석한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 6은 커피 실버스킨을 분리하는 과정을 나타낸 사진이다.
도 7은 생산지별 커피 실버스킨의 항마이오스타틴 활성 분석 결과를 나타낸 것이다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 근력강화 또는 노화에 의한 근감소증을 예방 및 치료하기 위한 커피 실버스킨(silver skin) 추출물을 포함하는 근감소증의 예방 또는 치료용 약학 조성물에 관한 것이다.
본 발명에서 용어, "실버스킨(silver skin)"은 은피라고도 하며, 커피 생두를 원두로 로스팅하는 과정에서 생성되는 껍질 또는 껍질의 일부인 것이다(도 6 참조).
본 발명에서 용어 "근력강화"는 근력 및 근밀도가 증가하는 것을 의미한다.
본 발명에서 용어 "근감소증"은 근육의 부피 및 근력이 점진적으로 쇠퇴하는 질환을 의미한다.
본 발명에서 상기 실버스킨을 추출하는 사용되는 추출용매의 종류는 특별히 제한되지 않으며, 당해 기술 분야에서 공지된 임의의 용매를 사용할 수 있다. 상기 추출 용매의 비제한적인 예로는 물, 탄소수 1 내지 4의 알코올 또는 이들의 혼합 용매 등을 들 수 있으며, 이들은 단독으로 사용되거나 1종 이상 혼합하여 사용될 수 있다. 구체적으로 물 또는 에탄올이 사용될 수 있지만, 이에 제한되는 것은 아니며, 상기 에탄올은 1 내지 100%일 수 있지만, 이에 제한되는 것은 아니다. 본 발명에 있어서, 상기 추출물은 열수 추출물 또는 에탄올 추출물일 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.
상기 추출물은 항마이오스타틴(anti Myostatin) 활성을 갖는 것이다.
본 발명의 용어, "마이오스타틴(Myostatin, MSTN)"은 근육성장을 조절하는 단백질로서 transforming growth factor-β TGF-β) 계열에 속하고 성장분화 인자 (growth and differentiation factor-8, GDF-8)이다.
본 발명의 조성물은 약제학적 조성물로 제조될 수 있다. 본 발명의 약제학적 조성물은 경구 또는 비경구 투여할 수 있으며, 바람직하게는 경구 투여 방식으로 적용된다. 본 발명의 약제학적 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하게 처방될 수 있다. 본 발명의 약제학적 조성물의 일반적인 투여량은 성인 기준으로 0.001~100 ㎎/kg 범위 내이다.
경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 실버스킨 추출물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트(calcium carbonate), 수크로스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스티레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는 데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성 용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈 61(tween 61), 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.
한편, 본 발명의 약학조성물은 약학적으로 유효한 양으로 투여한다. 본 발명의 용어 "약학적으로 유효한 양"은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분하며 부작용을 일으키지 않을 정도의 양을 의미하며, 유효용량 수준은 환자의 건강상태, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 방법, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료기간, 배합 또는 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 본 발명의 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고, 종래의 치료제와 순차적으로 또는 동시에 투여될 수 있으며, 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기한 요소들을 모두 고려하여, 부작용없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 이는 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.
본 발명의 약학 조성물의 투여량은 사용목적, 질환의 중독도, 환자의 연령, 체중, 성별, 기왕력, 또는 유효성분으로 사용되는 물질의 종류 등을 고려하여 당업자가 결정할 수 있다. 예를 들어, 예를 들어, 본 발명의 약학 조성물은 성인 1인당 약 0.1 ng 내지 약 100 mg/kg, 구체적으로 1 ng 내지 약 10 mg/kg로 투여할 수 있고, 본 발명의 조성물의 투여빈도는 특별히 이에 제한되지 않으나, 1일 1회 투여하거나 또는 용량을 분할하여 수회 투여할 수 있다. 그러나, 투여 경로, 질병의 중증도, 성별, 체중, 연령 등에 따라서 달라질 수 있으므로, 상기 투여량이 어떠한 방법으로도 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.
또한 본 발명은 커피 실버스킨(silver skin) 추출물을 포함하는 근력증가 또는 근감소증의 예방 및 개선용 건강기능식품을 제공한다.
본 발명의 식품 조성물은 기능성 식품(functional food), 영양 보조제(nutritional supplement), 건강식품(health food) 및 식품 첨가제(food additives) 등의 모든 형태의 식품에 대한 조성물을 포함한다. 상기 유형의 식품 조성물은 당업계에 공지된 통상적인 방법에 따라 다양한 형태로 제조할 수 있다. 예를 들면, 건강식품으로는 실버스킨 추출물이 함유된 껌, 비타민 복합체, 차, 주스 및 드링크 형태로 제조 할 수 있으며, 실버스킨 추출물을 유효성분으로 하는 식품 조성물을 과립화, 캡슐화 또는 분말화하여 섭취할 수 있다. 본 발명의 기능성 식품 조성물은 식품 제조 시에 통상적으로 첨가되는 성분을 포함할 수 있으며, 예를 들어, 단백질, 탄수화물, 지방, 영양소 및 조미제를 포함할 수 있다. 예컨대, 드링크제로 제조되는 경우에는 본 발명의 실버스킨 추출물 이외에 구연산, 액상과당, 설탕, 포도당, 초산, 사과산, 과즙, 대추 추출액, 감초 추출액 등을 추가로 포함 시킬 수 있다.
상기 식품 조성물은 여러 가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 중진제(치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산 음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그밖에 천연 과일쥬스 및 과일 쥬스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 추출물을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다.
본 발명의 일실시예에서 본 발명에 따른 커피 실버스킨 추출물을 유효성분으로 포함하는 사료 조성물을 제공한다. 본 발명에서 사료 조성물의 이용을 위해 커피 실버스킨 추출물은 상기 약학 조성물이나 식품 조성물의 경우와 동일하게 준비될 수 있다.
구체적으로 본 발명의 커피 실버스킨 추출물은 골근력량의 증가 또는 근기능의 향상, 골밀도 향상으로 인하여 전체적인 근력 증가 효과를 나타내므로 동물이나 가축의 성장 촉진제로서 사료 조성물에 포함될 수 있다.
본 발명에 따른 커피 실버스킨 추출물을 포함하는 사료는 당업계에서 공지된 다양한 형태의 사료로 제조 가능하며, 바람직하게는 농후사료, 조사료 또는 특수사료가 포함될 수 있다.
농후사료에는 밀, 귀리, 옥수수 등의 곡류를 포함하는 종자 열매류, 곡물을 정제하고 남은 부산물로서 쌀겨, 밀기울, 보릿겨 등을 포함하는 겨류, 콩, 유체, 깨, 아마인, 코코야자 등을 채유하고 얻은 부산물인 깻묵류와 고구마, 감자 등에서 녹말을 뺀 나머지인 녹말찌꺼기의 주성분인 잔존녹말질류 등의 찌꺼기류, 어분, 물고기 찌꺼기, 어류에서 얻은 신선한 액상물(液狀物)을 농축시킨 것인 피시솔루블(fish soluble), 육분(肉粉), 혈분, 우모분, 탈지분유, 우유에서 치즈, 탈지유에서 카제인을 제조할 때의 잔액인 훼이(whey)를 건조한 건조훼이 등의 동물질사료, 효모, 클로렐라, 해조류 등이 있다.
조사료에는 야초, 목초, 풋베기 등의 생초(生草)사료, 사료용 순무, 사료용 비트, 순무의 일종인 루터베어거 등의 뿌리채소류, 생초, 풋베기작물, 곡실(穀實) 등을 사일로에 채워 놓고 젖산 발효시킨 저장사료인 사일리지(silage), 야초, 목초를 베어 건조시킨 건초, 종축용(種畜用) 작물의 짚, 콩과 식물의 나뭇잎 등이 있다.
특수사료에는 패각, 암염 등의 미네랄 사료, 요소나 그 유도체인 디우레이드 이소부탄 등의 요소사료, 천연사료 원료만을 배합했을 때 부족하기 쉬운 성분을 보충하거나, 사료의 저장성을 높이기 위해서 배합사료에 미량으로 첨가하는 물질인 사료첨가물, 식이보조제 등이 있다.
한편, 본 발명에 따른 사료 조성물은 사료 첨가제를 포함하거나 사료 첨가제 일 수 있다.
본 발명에서 용어 "사료 첨가제" 란 영양소 보충 및 체중감소 예방, 사료 내 섬유소의 소화 이용성 증진, 유질개선, 번식장애 예방 및 수태율 향상, 하절기 고온 스트레스 예방 등 다양한 효과를 목적으로 사료에 첨가하는 물질을 말한다. 본 발명의 사료첨가제는 사료관리법상의 보조사료에 해당하며, 탄산수소나트륨(중조), 벤토나이트 (bentonite), 산화마그네슘, 복합광물질 등의 광물질제제, 아연, 구리, 코발트, 셀레늄 등의 미량 광물질인 미네랄제제, 케로틴, 비타민 E, 비타민 A, D, E, 니코틴산, 비타민 B 복합체 등의 비타민제, 메티오닌, 리이산 등의 보호아미노산제, 지방산 칼슘염 등의 보호지방산제, 생균제(유산균제), 효모배양물, 곰팡이 발효물 등의 생균, 효모제 등이 추가로 포함될 수 있다.
본 발명에 따른 사료 조성물은 골격근량의 증가 또는 근기능의 향상, 골밀도 향상으로 인하여 전체적인 근력 증가, 골밀도 증가 효과 및 성장 촉진을 목적으로 하는 개체이면 특별히 한정되지 않고, 어떠한 것이든 적용 가능하다. 상기 개체는 동물, 예를 들어 비-영장류 (예를 들면, 소, 돼지, 말, 고양이, 개, 래트 및 마우스) 및 영장류 (예를 들면, 원숭이, 예를 들어 사이노몰구스 (cynomolgous) 원숭이 및 침팬지)를 비롯한 포유동물을 나타낸다. 또 다른 구체예에서, 상기 개체는 축산용 동물 (예를 들면, 말, 소, 돼지 등) 또는 애완용 동물 (예를 들면, 개 또는 고양이)이다. 또한, 어류, 예를 들어, 넙치, 가자미, 뱀장어, 민물장어, 바다장어, 우럭 등 이다. 또 다른 구체예에서 상개 개체는 곤충, 예를 들면, 등에, 꽃무지, 풍뎅이, 거저리, 귀뚜라미, 누에, 반모, 백강잠, 굼벵이, 지렁이, 거머리, 지네, 전갈, 거미 등 이다.
본 발명에 따른 사료 조성물의 복용량은 개체의 종(species), 크기(size), 무게(weight), 나이(age)와 같은 다수의 요인들에 좌우될 수 있다. 원칙적으로, 전형적인 복용량은 개체/일 당 0.001 내지 10 g의 범위일 수 있다. 다만, 이에 한정되지 않는다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
<실시예 1> 커피 실버스킨 추출물의 제조방법
커피의 로스팅 과정에서 생산된 실버스킨을 20 mg/ml의 농도로 에탄올 추출을 하였다. 에탄올 추출은 100% 에탄올을 이용하여 상온, 암실에서 24시간 동안 추출하였으며, 3회 반복 추출하였다. 추출된 시료(커피 실버스킨 에탄올 추출물, SSEE)는 회전 감압 농축기를 이용하여 대부분의 에탄올을 제거하고 4000 rpm에서 20분간 원심분리하여 상등액만 회수하였다. 상등액은 원심회전 농축기를 이용하여 시료의 농도를 측정하였다. 3회 반복 추출한 결과 4.14%의 추출 수율을 확인할 수 있었다.
<실시예 2> 커피 실버스킨 추출물의 세포 독성 및 항산화 활성 분석
커피 실버스킨 추출물(silver skin ethanol extract, SSEE)의 세포 독성을 확인하기 위하여, 세포독성실험은 96 well plate에 well 당 1×104 cell/100 ul (in DMEM with 10% FBS and 1% penicillin/streptomycin)세포를 seeding 하여 5% CO2 배양기에서 배양하였다. 24시간 후 실버스킨 에탄올 추출물(SSEE)을 농도별로 처리하여 5% CO2 배양기에서 12시간 동안 배양하였다. 이후 WST reagent (DaeilLab, Korea)를 10 ul 넣고 1시간 동안 반응 후 415 nm에서 흡광도를 측정하여 세포독성을 판단하였다. 대조군(Control lane)은 세포만 처리한 실험이며, H2O2는 음성대조군(negative control)로서 세포사멸을 유도하는 과산화수소를 처리한 실험이다.
그 결과, 실버스킨 에탄올 추출물(SSEE)는 Hek293 세포에서 100 ug/ml의 농도에서 세포 독성을 나타내지 않았다(도 2A).
또한, 커피 실버스킨 추출물의 항산화 활성을 확인하기 위하여, DPPH reagent 100 ul와 실버스킨 에탄올 추출물(SSEE) 100 ul를 농도별로 처리하여 상온, 암실에서 30분간 반응한 뒤 562 nm에서 흡광도를 측정하였다. 대조군(Control lane)은 추출물을 처리하지 않은 lane이며 AC (50)은 양성대조군(positive control)로서 대표적인 항산화 물질인 비타민 C(ascorbic acid)를 50 ug/ml의 농도로 처리한 lane이다
그 결과, 실버스킨 에탄올 추출물(SSEE)은 200 ug/ml은 비타민 C 50 ug/ml의 농도와 유사한 항산화 활성을 확인할 수 있었다(도 2B).
<실시예 3> 커피 실버스킨 추출물의 항마이오스타틴 활성 분석
커피 실버스킨 추출물의 항마이오스타틴의 활성을 확인하기 위하여 발광 효소 분석(luciferase assay) 시스템을 통해 확인하였다.
구체적으로, Hek293 세포는 DMEM 배지 (10% FBS, 1% penicillin/streptomycine, 1% geneticine)에서 96 well plate에 well 당 2.0×104 cell로 seeding 하여 5% CO2 배양기에서 배양하였다. 24시간 후, 배지는 FBS가 제거된 DMEM으로 교체하였고, 1 nM의 재조합 마이오스타틴 (R&D system, USA)과 실버스킨 에탄올 추출물(SSEE)을 농도별로 처리하여 CO2 배양기에서 배양하였다. 24시간 뒤 배지를 제거하고 65 ul의 DMEM 배지와 65 ul의 reagent (Bright-Glo luciferase assay system, USA)를 처리하여 micro plate luminometer에서 발광을 측정하였다. 측정된 수치는 양성대조구(positive control)와 음성대조구(negative control)의 수치를 이용하여 항마이오스타틴 활성을 %로 나타내었다. 측정된 수치는 양성대조구(positive control, 마이오스타틴만 처리한 실험구, MSTN only)와 음성대조구(negative control, 마이오스타틴을 처리하지 않은 실험구, No MSTN)의 수치를 이용하여 아래와 같은 식을 이용하여 항마이오스타틴 활성을 %로 나타내었다. 마이오스타틴 저해활성 (%) = (1nM 마이오스타틴만 처리한 실험구의 발광수치 - 커피실버스킨 처리구의 발광수치) x 100 / (1nM 마이오스타틴만 처리한 실험구의 발광수치 - 마이오스타틴을 처리하지 않은 실험구의 발광수치)
그 결과, 1 nM의 마이오스타틴에 대한 커피실버스킨 추출물의 신호전달억제는 실버스킨 1 ug/ml일 때 약 60% 억제 되었으며, 0.1 ug/ml일 때 는 20% 억제가 되었고, 0.01 ug/ml일 때 억제가 전혀 일어나지 않았다. 이 결과를 가지고 IC 50 값 0.79 ug/ml을 도출하였다(도 3A).
<실시예 4> 커피 실버스킨 추출물의 ActivinA와 GDF11 저해 활성 분석
커피 실버스킨 추출물의 ActivinA와 GDF11 저해 활성을 확인하기 위하여 발광 효소 분석(luciferase assay) 시스템을 통해 확인하였다.
구체적으로, 마이오스타틴과 같은 superfamily에 속해있는 activinA와 GDF11의 저해활성을 확인하여 마이오스타틴에 대한 커피실버스킨 추출물의 마이오스타틴 특이성을 알아보고자 하였다. Hek293 세포는 DMEM 배지 (10% FBS, 1% penicillin/streptomycine, 1% geneticine)에서 96 well plate에 well 당 2.0×104 cell로 seeding 하여 5% CO2 배양기에서 배양하였다. 24시간 후, 배지는 FBS가 제거된 DMEM으로 교체하였고, activinA 처리군은 activinA를 1 nM, GDF11 처리군은 GDF11를 1 nM를 각 well당 처리하고, 처리된 각 처리군에 커피실버스킨 에탄올 추출물(SSEE)을 농도별 (10, 1.0, 0.1 ug/ml)로 처리하여 CO2 배양기에서 배양하였다. 24시간 뒤 배지를 제거하고 65 ul의 DMEM 배지와 65 ul의 reagent (Bright-Glo luciferase assay system, USA)를 처리하여 micro plate luminometer에서 발광을 측정하였다. 측정된 수치는 양성대조구(positive control)와 음성대조구(negative control)의 수치를 이용하여 항마이오스타틴 활성을 %로 나타내었다. 측정된 수치는 양성대조구(positive control, activinA 또는 GDF11만 처리한 실험구, activinA only 또는 GDF11 only)와 음성대조구(negative control, activinA 또는 GDF11를 처리하지 않은 실험구, No activinA 또는 No GDF11)의 수치를 이용하여 아래와 같은 식을 이용하여 항activinA 또는 항GDF11 활성을 %로 나타내었다. activinA 또는 GDF11 저해활성 (%) = (1 nM activinA 또는 1 nM GDF11만 처리한 실험구의 발광수치 - 커피실버스킨 처리구의 발광수치) x 100 / (1 nM activinA 또는 1 nM GDF11만 처리한 실험구의 발광수치 - 1 nM activinA또는 1 nM GDF11를 처리하지 않은 실험구의 발광수치)
그 결과, 1.0 nM activin A에 대한 커피실버스킨 추출물의 신호전달억제는 실험을 실시한 모든 농도에서 전혀 일어나지 않았다(도 3A).
또한 1.0 nM GDF11에 대한 커피실버스킨 추출물의 신호전달억제는 커피 실버스킨 10 ug/ml일 때 약 27% 억제 되었으며, 1.0 ug/ml일 때는 11%억제가 되었고, 0.01 ug/ml일 때 억제가 전혀 일어나지 않았다(도 3A).
이러한 결과를 종합할 때, 커피실버스킨 에탄올 추출물은 마이오스타틴의 신호전달억제 특이성을 가지고 있는 것으로 확인되었다(도 3A).
<실시예 5> 커피 실버스킨 추출물의 마이오스타틴 신호 전달 분석
실버스킨 에탄올 추출물(SSEE)이 마이오스타틴 신호전달 경로에 미치는 영향을 확인해 보기 위해 western blot을 통해 smad 2 전사인자의 인산화 정도를 확인하였다.
구체적으로, Western blot을 위해 HepG2 세포는 DMEM 배지 (10% FBS, 1% penicillin/streptomycine)에서 6 well plater에 well 당 2.0×105 cell로 seeding 하여 5% CO2 배양기에서 배양하였다. 24시간 후, 배지는 FBS가 제거된 DMEM으로 교체하였고, 4시간 뒤 10 nM의 재조합 마이오스타틴과 IC100과 IC10 농도의 실버스킨 에탄올 추출물(SSEE)를 30분간 처리하였다.
세포는 PBS buffer로 2회 세척 후, RIPA buffer (20 mM tris-HCl, pH7.5, 150 mM NaCl, 1 mM Na2EDTA, 1 mM EGTA, 1% NP-40, 1% sodium deoxychloate, 2.5 mM sodium pyrophosphate, 1 mM β-glycerophosphate, 1 mM NA3VO4, 1 ug/ml leupeptin, cell signaling, USA)와 protease inhibitor cocktail, phosphatase inhibitor cocktail (Roche, USA)을 처리하여 세포를 얻었다.
세포는 sonicator를 이용하여 파쇄하였으며 4℃, 12,000 rpm에서 20분간 원심분리 하였다. 상등액은 BCA assay를 통해 단백질 정량을 하였고, 10% polyacrylamide gel에 전기영동하였다. 전기영동 후 PVDF membrane에 transfer 하였고 5% BSA 또는 5% skim milk를 이용하여 상온에서 2시간 동안 blocking 하였다. Membrane은 TBS-T buffer를 이용하여 상온에서 10분간 3회 washing 하였고 1차 항체 (Samd2, P-Smad2, Cell signaling, USA)를 상온에서 2시간 동안 반응하였다. 이후 TBS-T buffer을 이용하여 상온에서 10분간 3회 washing 하였고 2차 항체 (anti-Rabbit IgG (Cell signaling, USA))를 상온에서 2시간 동안 반응하였다. Membrane은 TBS-T buffer를 이용하여 상온에서 10분간 3회 washing 하였고 SuperSignal West Femto Maximum Sensitivity Substrate (Thermo Scientific, USA)를 이용하여 x-ray 필름에 감광하였다.
그 결과, Western blot을 통해서 실버스킨 에탄올 추출물(SSEE)이 농도의존적으로 마이오스타틴 신호 전달을 방해함으로써 세포 안쪽으로 진행되는 신호 (Smad 전사인자의 인산화)를 저해하는 것을 확인하였다. 도 3D에서 보듯이, 마이오스타틴 (10 nM), SB431542 (마이오스타틴이 결합하는 수용체의 인산화를 억제하는 small molecule) 그리고 실버스킨 에탄올 추출물(SSEE)을 단독 또는 혼합하여 Smad2의 인산화를 확인하였다. 마이오스타틴, SB431542 그리고 실버스킨 에탄올 추출물(SSEE) 모두를 세포에 처리하지 않은 경우에는 마이오스타틴의 신호가 수용체에 전달이 되지 않으므로 Smad2의 인산화가 전혀 일어나지 않았다. 마이오스타틴만 처리한 세포의 경우 마이오스타틴의 신호가 세포내로 전달되어 Smad2의 인산화가 일어났다. 마이오스타틴과 SB431542을 처리한 세포의 경우 SB431542가 마이오스타틴의 신호를 세포내로 전달하는 것을 막음으로써 Smad2의 인산화가 일어나지 않았다. 마이오스타틴과 실버스킨 에탄올 추출물(SSEE) 15 ug/ml, 2.0 ug/ml을 처리한 세포의 경우 실버스킨 에탄올 추출물(SSEE)이 마이오스타틴의 신호를 세포내로 전달하는 것을 막음으로써 Smad2의 인산화가 농도의존적으로 일어나지 않았다(도 3B). 그러므로 세포내에서 커피실버스킨 에탄올 추출물이 마이오스타틴의 신호전달을 억제하여 Smad2의 인산화를 방해하고 그 결과 핵 내로 신호 전달을 억제하는 것으로 나타났다.
<실시예 6> 동물모델에서 커피 실버스킨 추출물의 근육에 미치는 영향 분석
In vivo 수준에서 실버스킨 에탄올 추출물(SSEE)이 근육에 미치는 영향을 확인해보기 위해 ICR 마우스에 경구투여 하여 근력의 변화를 확인하였다.
구체적으로, 실험에 사용된 마우스는 4주령 된 수컷 ICR 마우스로서 14일 동안 1회/1일 경구투여 하였다. 투여량은 luciferase assay 실험을 통해 확인한 1 nM의 마이오스타틴에 대한 IC50 값에 15배를 1회 경구투여하였다.
그 결과, 실버스킨 에탄올 추출물(SSEE)의 14일간 경구투여를 통해 마우스 체중은 대조군에 비해 유의적인 차이를 나타내지 않았다(도 4A).
하지만 근력은 14일에 대조군에 비해 14.2% 유의적으로 증가 (p<0.001)하였다(도 4B).
14일의 경구투여 후 앞다리와 뒷다리의 질량과 부피결과를 바탕으로 계산한 근밀도는 뒷다리의 경우 대조군에 비해 5.5% 유의적으로 증가 (p<0.05)하였고, 앞다리는 대조군에 유의적인 차이를 나타내지 않았다(도 4C).
<실시예 7> 커피의 부위와 추출물에 따른 항마이오스타틴 활성 분석
실버스킨 에탄올 추출물 이외에 생두(green bean)와 원두(coffee bean) 상태에서의 물 또는 에탄올 추출물로부터 항마이오스타틴 활성을 분석하였다.
구체적으로, 커피 실버스킨, 생두, 원두를 열수 추출하기 위하여 각각 20 mg/ml의 농도로 증류수를 이용하여 90℃에서 20분간 추출하였다.
또한, 커피 실버스킨, 생두, 원두 에탄올 추출하기 위하여, 각각 20 mg/ml의 농도로 100% 에탄올을 이용하여 상온, 암실에서 24시간 추출하였고, 추출된 시료는 회전 감압 농축기를 이용하여 대부분의 에탄올을 제거하고 4000 rpm에서 20분간 원심분리하여 상등액만 회수하였다. 상등액은 원심회전 농축기를 이용하여 시료의 농도를 측정하였다. 총 6개의 추출물은 luciferase assay를 통해 1 nM에 대한 항마이오스타틴 활성을 확인하였다.
그 결과, 생두 열수 추출물(GBWE), 원두 열수 추출물(CFWE) 및 실버스킨 열수 추출물(SSWE)은 1 ug/ml 에서 낮은 항마이오스타틴 활성을 나타내었다(도 5A, 5B, 5C). 실버스킨 에탄올 추출물(SSEE)은 0.85 ug/ml (IC50 value)의 항마이오스타틴 활성을 나타내었다. 이러한 결과로 미루어 보아 실버스킨 에탄올 추출물(SSEE)에서 특이적인 항마이오스타틴 소재가 존재한다는 것을 확인할 수 있었다.
<실시예 8> 생산지별 커피 실버스킨에 대한 항마이오스타틴 활성 분석
다양한 나라에서 생산되는 커피로부터 얻은 실버스킨 추출물에 대한 항마이오스타틴 활성을 분석하였다.
실험 방법은 이전과 동일한 방법으로 커피 실버스킨으로부터 물 또는 에탄올 추출물을 제조하였다.
구체적으로 각 나라별 8개의 커피 실버스킨을 20 mg/ml의 농도로 100% 에탄올을 이용하여 상온, 암실에서 24시간 추출하였고, 추출된 시료는 회전 감압 농축기를 이용하여 대부분의 에탄올을 제거하고 4000 rpm에서 20분간 원심분리하여 상등액만 회수하였다. 총 8개의 추출물은 luciferase assay를 통해 1 nM에 대한 항마이오스타틴 활성을 확인하였다(도 7).
마이오스타틴에 대한 IC50을 측정한 결과 커피생산지별 커피 실버스킨 추출물은 다소 차이를 가지고 있지만, 다양한 나라에서 생산된 커피의 실버스킨에는 모두 항마이오스타틴 활성이 있는 것으로 나타났다.
이러한 결과로 미루어 보아 생산지에 상관없이 커피 실버스킨 에탄올 추출물(SSEE)에서는 모두 항마이오스타틴 효과를 확인할 수 있었다.
Claims (10)
- 커피 실버스킨(silver skin) 추출물을 포함하고,
상기 추출물의 추출용매는 100% 에탄올 또는 60-99%(v/v) 에탄올 수용액이고,
상기 커피 실버스킨은 생두(green bean)를 원두(coffee bean)로 로스팅(roasting)하는 과정에서 생성되는 껍질인 것을 특징으로 하는,
근감소증의 예방 또는 치료용 약학 조성물. - 삭제
- 커피 실버스킨(silver skin) 추출물을 포함하고,
상기 추출물의 추출용매는 100% 에탄올 또는 60-99%(v/v) 에탄올 수용액이고,
상기 커피 실버스킨은 생두(green bean)를 원두(coffee bean)로 로스팅(roasting)하는 과정에서 생성되는 껍질인 것을 특징으로 하는,
근육 강화용 조성물. - 삭제
- 제 1항에 있어서, 상기 근감소증은 근위축증, 근무력증, 근이영양증, 근경직증, 근긴장저하, 근력약화, 근육퇴행위축, 근위축성 측삭경화증 또는 중증 근무력증인 것인, 약학 조성물.
- 제 1항에 있어서, 상기 추출물은 항마이오스타틴(anti Myostatin) 활성을 갖는 것인 약학 조성물.
- 커피 실버스킨(silver skin) 추출물을 포함하고,
상기 추출물의 추출용매는 100% 에탄올 또는 60-99%(v/v) 에탄올 수용액이고,
상기 커피 실버스킨은 생두(green bean)를 원두(coffee bean)로 로스팅(roasting)하는 과정에서 생성되는 껍질인 것을 특징으로 하는,
근감소증의 예방 또는 개선용 건강기능식품. - 커피 실버스킨(silver skin) 추출물을 포함하고,
상기 추출물의 추출용매는 100% 에탄올 또는 60-99%(v/v) 에탄올 수용액이고,
상기 커피 실버스킨은 생두(green bean)를 원두(coffee bean)로 로스팅(roasting)하는 과정에서 생성되는 껍질인 것을 특징으로 하는,
사료 조성물. - 제 8항에 있어서,
상기 추출용매는 100% 에탄올인 것을 특징으로 하는 사료 조성물. - 제 8항에 있어서,
상기 추출물은 근육량 증가 효과를 갖는 것을 특징으로 하는 사료 조성물.
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Also Published As
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