CN107805283B

CN107805283B - 一种拟蛛丝蛋白及其生物合成方法

Info

Publication number: CN107805283B
Application number: CN201711104463.2A
Authority: CN
Inventors: 刘斌
Original assignee: Jinggangshan University
Current assignee: Jinggangshan University
Priority date: 2017-11-10
Filing date: 2017-11-10
Publication date: 2021-01-15
Anticipated expiration: 2037-11-10
Also published as: CN107805283A

Abstract

本发明提供了一种拟蛛丝蛋白及其生物合成方法，该拟蛛丝蛋白为包括蛛丝蛋白和类胶原蛋白的“ABA型”三嵌段共聚物，其氨基酸序列和核苷酸序列分别为SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2；类胶原蛋白为三聚体(Pro‑Gly‑Pro)₁₅，其位于蛛丝蛋白两端。拟蛛丝蛋白的生物合成方法包括步骤：(1)拟蛛丝蛋白基因的设计与优化；(2)基因表达载体构建；(3)工程菌转化和发酵培养；(4)诱导表达；(5)产物提取纯化。本发明的拟蛛丝蛋白具有良好的生物相容性、定向性和成纤维的潜力，其可满足成人工蛛丝纤维分子量的要求；且该拟蛛丝蛋白的生物合成过程温和，工艺简单；该拟蛛丝蛋白是一种潜在的蛋白纤维材料，具有产业化实施的广阔前景。

Description

一种拟蛛丝蛋白及其生物合成方法

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及生物材料领域，具体涉及一种可定向自组装的由蛛丝蛋白与胶原蛋白结构融合成的拟蛛丝蛋白及其生物合成方法。

背景技术

蜘蛛丝是目前已知的最为坚韧的天然纤维之一，其主要成分是蛛丝蛋白。蜘蛛丝作为一种天然蛋白质纤维，具有生物可降解性和温度的耐受性，同时具有优秀的力学性能；蜘蛛丝还有抵抗紫外线辐射的性能和特殊的抗溶解性，可以抵抗大部分水解蛋白酶的作用。优异的力学性能和机械性能使蜘蛛丝在航天飞机复合材料、军事防护服、降落伞绳索等高性能材料上具有很大的应用潜力，同时蜘蛛丝良好的生物相容性和生物可降解性令其在诸如手术缝合线、生物医学移植、药物转运载体、细胞生长支架、器官替换等医疗材料及器械方面的应用研究也得到长足的发展。虽然蜘蛛丝有着广泛的应用前景，但是由于蜘蛛同类相食，很难驯养，无法象蚕那样大批量饲养，导致天然蜘蛛丝的产量低且难以大量收集，这限制了蜘蛛丝的研究和利用。

随着对蛛丝蛋白基因尤其是拖牵丝蛋白基因分子结构的深入解析及基因工程技术的发展，许多科研工作者采用化学合成蛛丝蛋白基因或从蜘蛛丝腺cDNA文库中克隆蛛丝蛋白基因，并选择植物、动物及微生物等不同的表达系统进行重组蛛丝蛋白的表达，尝试仿制性能优越的蛛丝蛋白纤维。近年来相比于植物或动物的表达体系，采用微生物发酵方法进行表达的技术相对成熟，且易于规模化大生产而受到广泛关注。

通过细菌发酵的方法来获得蛛丝蛋白，其主要策略是将不同的重复序列重组或加倍后克隆到表达载体中进行表达。与高分子量的重组蛛丝蛋白纤维相比，低分子量的重组蛛丝蛋白纤维性能较差，推测重组蛛丝蛋白纤维的机械性能与其蛋白的分子量相关。随着重组蛋白表达技术的不断改进，大肠杆菌表达系统可有效表达的蛋白长度已有很大的提高，纺丝得到与天然蜘蛛丝机械性能接近的重组蛛丝。但已有的研究表明，利用大肠杆菌表达类蛛丝蛋白时，由于原核生物与真核生物在氨基酸密码子使用频率上存在着差异，且宿主细菌常通过同源重组而去掉重复序列，使蛛丝蛋白基因容易提前终止翻译，编码蛛丝蛋白重复序列的基因会发生内部删除或错位配对从而造成遗传不稳定。

目前，采用在上述表达系统进行人工合成蛛丝蛋白方面取得了很大进展，但其任然存在技术上的不足；和天然蛛丝蛋白相比，人工蛛丝蛋白基因表达产物的分子量通常不够大；表达的蛛丝蛋白一般不具有分子取向，还不能实现蜘蛛丝的纤维化过程，即不能制成具有天然丝纤维特性的人工丝；系统表达效率还较低，且表达系统的稳定性也存在问题。

胶原蛋白是分子结构独具特色的生物大分子，其具有良好的生物相容性、力学性能、可生物降解性，以及较低免疫原性等优良特性，在生物医药、组织工程、食品、化妆品等领域有着广泛的应用。在分子结构上，胶原蛋白是具有绕轴周期性螺旋(三重螺旋)结构的纤维状蛋白，由平行线型链组成，每一线型链由三条扭曲左旋的α-肽链通过链间相互作用紧密结合而形成一极强的右旋三重螺旋结构。借助类胶原蛋白定向形成三重螺旋结构的特性，将其与其它蛋白进行融合以提升彼此的理化性能，已引起部分科研人员的兴趣，但尚未见蛛丝蛋白与胶原蛋白融合的报道

发明内容

本发明为了克服现有技术的不足，提供了一种拟蛛丝蛋白及其生物合成方法，该拟蛛丝蛋白包括蛛丝蛋白和类胶原蛋白结构，其具有定向性和优良的成纤维潜力，且生物合成过程反应温和，工艺简单，成本低廉。

本发明采用如下技术方案：

一种拟蛛丝蛋白，其由蛛丝蛋白和类胶原蛋白融合构成，其为“ABA型”三嵌段共聚物；两端(A段)为(Pro-Gly-Pro)_n同聚体延伸段，其是一种粘性末端，可定向形成类胶原蛋白的三重螺旋结构；中间为优化设计的蛛丝蛋白。

所述拟蛛丝蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，其含有615个氨基酸，分子量为52.0kDa。

所述拟蛛丝蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

所述类胶原蛋白为(Pro-Gly-Pro)_n结构的同聚体延伸段，三聚体重复数n为15。

所述拟蛛丝蛋白的生物合成方法，包括以下步骤：

(1)根据蜘蛛拖丝蛋白基因序列、蛛丝蛋白基因序列的结构特点和密码子的简并性，设计改造出蛛丝蛋白基因，设计类胶原蛋白同聚体延伸段的(Pro-Gly-Pro)₁₅结构的基因；

(2)拟蛛丝蛋白基因表达载体的构建；

(3)基因工程菌大肠杆菌的转化和发酵培养；

(4)拟蛛丝蛋白基因的诱导表达；

(5)拟蛛丝蛋白的提取和纯化。

上述设计的基因采用化学法进行合成，通过一系列的体外酶切连接反应，制备含不同重复数的同向串联基因的重组质粒，最终将重组表达载体转入基因工程菌大肠杆菌进行拟蛛丝蛋白的表达。

基因工程菌的的发酵培养的培养基：

(1)一代种子培养基：蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，NaCl 5g/L，pH7.0；高压灭菌，使用前加入30μg/mL卡那霉素和34μg/mL氯霉素；

(2)二代种子培养基：酵母粉10g/L，蛋白胨10g/L，KH₂PO₄1.2g/L，K₂HPO₄3g/L，NaCl 4g/L，葡萄糖5g/L；高压灭菌，使用前加入30μg/mL卡那霉素和34μg/mL氯霉素；

(3)发酵培养基：酵母粉23g/L，胰蛋白胨17g/L，KH₂PO₄1.2g/L，K₂HPO₄3g/L，NaCl4g/L，泡敌6ml；高压灭菌，使用前加入30mg/L卡那霉素和34mg/L氯霉素。

基因工程菌的发酵培养条件：

将甘油保存的菌种，以1:100比例接种于一代种子培养基中，37℃，200r/min培养4h，OD₆₀₀达0.6；再以1:50比例转接于二代种子培养基中，37℃，200r/min过夜扩大培养10～12h，OD₆₀₀达3～5；然后，以1:20比例接种于30L国产发酵罐中培养，培养温度37℃，pH控制在6.8～7.2，罐压为常压，通过控制通气量和纯氧量使溶氧在30％以上。

基因工程菌中的诱导表达条件：

待基因工程菌OD₆₀₀达到15～18时，加终浓度为1mmol/L的IPTG，30℃诱导表达6h。诱导过程中根据养分消耗情况进行补料，并根据菌体生长情况调整pH和氧溶解度。

补料培养基的成分：

酵母粉10g/L，胰蛋白胨10g/L，葡萄糖50g/L，MgSO₄6g/L，混合备用，使用前加入微量元素(每10L含FeCl₃0.323g，ZnSO₄0.096g，CuSO₄0.096g，CoCl₂0.084g，MnSO₄0.068g，H₃BO₄0.024g，CaCl₂0.13g，VB₁0.05g)；接种1h后开始流加，流加速率根据菌体生长情况及溶解氧与pH变化情况进行时时调节，在IPTG诱导前半小时停止流加。

对IPTG诱导培养后基因工程菌离心、超声破碎菌体，然后离心、收集上清液。再对上清液进行镍琼脂糖凝胶柱亲和层析，收集一定量样品，透析脱盐后，经冷冻干燥得到目的蛋白成品。

镍琼脂糖凝胶柱亲和层析条件：

在色谱柱中装载5ml Ni-IDA，用10倍柱床体积的Binding buffer清洗平衡柱子，流速5mL/min；然后将样品上柱，流速为2mL/min，收集穿透液；用10倍柱床体积的Bindingbuffer清洗柱子，流速10mL/min；再用Washbuffer洗杂，流速5mL/min，收集洗脱液；最后用Elutionbuffer洗脱，流速2mL/min，收集洗脱液。

本发明有以下有益效果：

(1)设计的拟蛛丝蛋白是全新的序列，实现了在分子水平的操作简单化，更易实现拟蛛丝蛋白的基因工程菌发酵生产；

(2)该拟蛛丝蛋白基因包含天然蛛丝蛋白基因的特征，其表达的蛋白将具有天然蛛丝蛋白的生物相容性，强力学性能等优良特征；

(3)在拟蛛丝蛋白的分子长度方面，通过制备不同重复数同向串联基因重组质粒，可在进一步的研究中实现接近较大的分子量的天然蛛丝蛋白的拟蛛丝蛋白的表达生产；

(4)可诱导表达的基因工程菌能实现拟蛛丝蛋白在胞内的高水平表达，其培养易于放大，纯化标签有利于表达产物的分离纯化，降低生产成本。

附图说明

图1为拟蛛丝蛋白基因表达载体的构建流程图。

图2为拟蛛丝蛋白的SDS-PAGE电泳的结果图。

图3为拟蛛丝蛋白质谱分析的结果示意图。

图4为拟蛛丝蛋白红外光谱分析的结果示意图。

图5为拟蛛丝蛋白圆二色谱分析的结果示意图。

图6为拟蛛丝蛋白二阶导数含酰胺Ⅰ的FTIR原始光谱和曲线拟合分析的结果示意图。

图7为拟蛛丝蛋白的扫描电镜图谱。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施方式对本发明进行进一步说明。

实施例1：拟蛛丝蛋白基因的构建、表达及产物的纯化：

根据GenBank的蜘蛛拖丝蛋白基因序列AY555585和AH015065、蛛丝蛋白基因序列的结构特点和密码子的简并性，在原有基础上对相应DNA序列进行修改，设计出蛛丝蛋白基因单体S，并利用Antheprot软件的Garnier法预测蛋白质的二级结构。在基因单体S两端加上同尾酶DraIII和Van91I的识别位点；设计接头A1(A1-1、A1-2)和A2(A2-1、A2-2)共四段单链DNA片断，A1-1和A1-2含EcoRI的识别位点，A2-1和A2-2含NotI的识别位点。设计(Pro-Gly-Pro)_n类胶原蛋白同聚体延伸段基因，确定三聚体重复数n取值为15，其两端亦加上同尾酶DraIII和Van91I的识别位点。所设计的基因采用化学法进行合成。

拟蛛丝蛋白利用三嵌段共聚物形成超分子的特性，满足人工蛛丝纤维对分子量的要求。为了获得大片段或近似于天然的蛛丝蛋白，拟蛛丝蛋白两端的(Pro-Gly-Pro)_n同聚体延伸段经自组装在蛛丝蛋白两端定向形成三重螺旋结构的三聚节段；三重螺旋结构需由三条拟蛛丝蛋白肽链构成，每条肽链头尾两端各连上两条肽链，形成空间网状结构，并有组织的聚集体，保持一定的完整性，成为具有明确的微观结构和宏观特性的超分子，同时具有足够大的分子量，从而规避了常规方法追求重组蛛丝蛋白在分子量上达到天然蛛丝蛋白所面临的困难。

而拟蛛丝蛋白通过两端同聚体延伸段定向排列形成的三重螺旋结构，赋予拟蛛丝蛋白确定的分子取向。拟蛛丝蛋白经自组装形成三重螺旋结构时，是以头尾衔接的方式定向排列的，这赋予拟蛛丝蛋白特定的分子取向。中段的蛛丝蛋白仍然保留有β-转角结构，β-转角结构串联折叠在一起，形成类似弹簧的结构，以保持丝蛋白纤维的弹性；同时，其β-片层结构可通过分子间的相互作用将蛋白质分子紧密结合在一起构成丝纤维的结晶区，也可以提高其形成高强度纤维的能力。

拟蛛丝蛋白在进行头尾衔接定向排列自组装中形成化学键，这使拟蛛丝蛋白在纤维化过程中形成有序的纤维排列，湿法纺丝制备该拟蛛丝蛋白纤维将有广阔的应用前景。Ⅰ

拟蛛丝蛋白的整个基因表达载体的构建的过程如图1所示，整个基因表达载体的过程包括以下步骤：

1.筛选Top10F’/pUC57-A1S4转化子

化学合成A1S，插入到pUC57载体的SmaI位点，定名为pUC57-A1S。对pUC57-A1S进行EcoRI和Van91I双酶切得到A1S片段(381bp)。

再对pUC57-A1S进行EcoRI和DraIII双酶切，连接并转化Top10F’，得到pUC57-A1S2。对质粒pUC57-A1S2进行EcoRI和Van91I双酶切得到A1S2片段。

再对pUC57-A1S2进行EcoRI和DraIII双酶切得到大片段。连接并转化Top10F’，得到pUC57-A1S4。

2.筛选Top10F’/pUC57-A1TS4转化子

化学合成A1TA2，插入到pUC57载体的SmaI位点，定名为pUC57-A1TA2。对质粒pUC57-A1TA2进行EcoRI和Van91I双酶切得到A1T片段(174bp)。

A1T再与EcoRI和DraIII双酶切pUC57-A1S4得到的大片段连接并转化Top10F’，得到pUC57-A1TS4转化子。

3.筛选Top10F’/pUC57-A1TS4TA2转化子

对质粒pUC57-A1TS4进行EcoRI和Van91I双酶切，可得到A1TS4片段(1590bp)。

再与EcoRI和DraIII双酶切pUC57-A1TA2得到的大片段连接并转化Top10F’，得到Top10F’/pUC57-A1TS4TA2转化子。

4.大肠杆菌表达载体pET28a-TS6T的构建和筛选

对质粒pPIC9K-TS4T进行EcoRI和NotI双酶切，可得到A1TS4TA2片段(1747bps)，再与EcoRI和NotI双酶切pET28a得到的大片段连接得表达载体，然后热击转化Rosetta(DE3)菌株，转化后涂布于LB(含30μg/mL卡那霉素和34μg/mL氯霉素)平板，待长出具有抗性的单菌落，随机挑取单菌落进行LB(含30μg/mL卡那霉素和34μg/mL氯霉素)液体培养。

其中接头和相关基因的序列分别为：接头A1-1：SEQ ID NO.3，接头A1-2：SEQ IDNO.4，接头A2-1：SEQ ID NO.5，接头A2-2：SEQ ID NO.6，A1S基因：SEQ ID NO.7，A1TA2基因:SEQ ID NO.8。

对基因工程菌进行IPTG诱导培养，使拟蛛丝蛋白目的基因在工程菌大肠杆菌中得到表达。表达完成后，进行离心、超声破碎菌体，然后离心并收集上清液。再对上清液进行镍琼脂糖凝胶柱亲和层析(目的蛋白含一段由pET28a载体自带基因编码的组氨酸纯化标签)，收集一定量样品，透析脱盐后，经冷冻干燥得到目的蛋白，对目的蛋白进行初步鉴定。

对纯化的目的蛋白进行SDS-PAGE电泳检测分析，结果如图2所示。结果显示，经镍琼脂糖凝胶亲和层析得到的纯度达99％的拟蛛丝蛋白条带(条带1)，其分子量约为52.0kDa，与理论值一致。在细胞裂解液条带(条带4)的相应位置上，可以找到对应的条带，这表示拟蛛丝蛋白的构建、表达和纯化过程取得成功。

实施例2：拟蛛丝蛋白的结构表征分析

对分离纯化后的拟蛛丝蛋白进行质谱分析，结果如图3所示，质谱分析结果表明拟蛛丝蛋白的分子量为52032.46Da；理论上设计的拟蛛丝蛋白含有615个氨基酸，分子量为52242.93Da；实际的拟蛛丝蛋白的精确分子量与设计的拟蛛丝蛋白的理论分子量相近。

对分离纯化后的拟蛛丝蛋白进行红外光谱分析，结果如图4所示，由红外光谱分析中的酰胺A、酰胺B、酰胺I、酰胺II、酰胺III的波数可判断拟蛛丝蛋白与天然蛛丝蛋白具有相似的结构特征。

对分离纯化后的拟蛛丝蛋白进行圆二色谱分析，结果如图5所示，圆二色谱在190-260nm波长下的检测结果显示，拟蛛丝蛋白中α-螺旋占12.38％、β-折叠占40.66％、β-转角占15.24％、无序结构占31.72％；应用PeakFit v4.12软件对拟蛛丝蛋白进行二阶导数含酰胺Ⅰ的FTIR原始光谱和曲线拟合分析，结果如图6所示，结果显示拟蛛丝蛋白中α-螺旋占31.80％、β-折叠占49.62％、β-转角占18.58％、无序结构占0.00％。以上分析结果相互印证，说明拟蛛丝蛋白与天然蛛丝蛋白具有相似的结构特征。

拟蛛丝蛋白的扫描电镜图谱如图7所示，结果显示拟蛛丝蛋白呈海绵状结构，这预示其具备作为生物医学材料的潜质。

以上所述仅表达了本发明的优选实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形、改进及替代，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

序列表

<110> 井冈山大学

<120> 一种拟蛛丝蛋白及其生物合成方法

<160> 8

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 615

<212> PRT

<213> 拟蛛丝蛋白的氨基酸序列(Argiope trifasciata)

<400> 1

Met Gly Ser Ser His His His His His His Ser Ser Gly Leu Val Pro

1 5 10 15

Arg Gly Ser His Met Ala Ser Met Thr Gly Gly Gln Gln Met Gly Arg

20 25 30

Gly Ser Glu Phe Leu Glu Lys Arg Gly Pro Pro Gly Ala Pro Pro Gly

35 40 45

Pro Pro Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly Pro

50 55 60

Pro Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly Pro Pro

65 70 75 80

Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly Pro Ala Gly Ala Ser Gly

85 90 95

Pro Gly Gln Gln Gly Arg Gly Gly Tyr Gly Pro Gly Gln Gln Gly Pro

100 105 110

Ser Gly Pro Gly Ser Gly Ala Ala Ala Ala Ala Ala Gly Gly Ala Gly

115 120 125

Gln Gly Gly Tyr Gly Gly Leu Gly Gly Gln Gly Ala Gly Arg Gly Gly

130 135 140

Leu Gly Gly Gln Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ser Gly Pro Gly Gly Tyr

145 150 155 160

Gly Pro Gly Gln Gln Gly Pro Gly Gly Tyr Gly Pro Gly Gln Gln Gly

165 170 175

Pro Ser Gly Pro Gly Ser Met Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Met Gly

180 185 190

Pro Gly Gly Tyr Gly Pro Gly Gln Gln Gly Pro Gly Gly Tyr Gly Ser

195 200 205

Pro Ala Gly Ala Ser Gly Pro Gly Gln Gln Gly Arg Gly Gly Tyr Gly

210 215 220

Pro Gly Gln Gln Gly Pro Ser Gly Pro Gly Ser Gly Ala Ala Ala Ala

225 230 235 240

Ala Ala Gly Gly Ala Gly Gln Gly Gly Tyr Gly Gly Leu Gly Gly Gln

245 250 255

Gly Ala Gly Arg Gly Gly Leu Gly Gly Gln Ala Ala Ala Ala Ala Ala

260 265 270

Ser Gly Pro Gly Gly Tyr Gly Pro Gly Gln Gln Gly Pro Gly Gly Tyr

275 280 285

Gly Pro Gly Gln Gln Gly Pro Ser Gly Pro Gly Ser Met Ala Ala Ala

290 295 300

Ala Ala Ala Ala Met Gly Pro Gly Gly Tyr Gly Pro Gly Gln Gln Gly

305 310 315 320

Pro Gly Gly Tyr Gly Ser Pro Ala Gly Ala Ser Gly Pro Gly Gln Gln

325 330 335

Gly Arg Gly Gly Tyr Gly Pro Gly Gln Gln Gly Pro Ser Gly Pro Gly

340 345 350

Ser Gly Ala Ala Ala Ala Ala Ala Gly Gly Ala Gly Gln Gly Gly Tyr

355 360 365

Gly Gly Leu Gly Gly Gln Gly Ala Gly Arg Gly Gly Leu Gly Gly Gln

370 375 380

Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ser Gly Pro Gly Gly Tyr Gly Pro Gly Gln

385 390 395 400

Gln Gly Pro Gly Gly Tyr Gly Pro Gly Gln Gln Gly Pro Ser Gly Pro

405 410 415

Gly Ser Met Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Met Gly Pro Gly Gly Tyr

420 425 430

Gly Pro Gly Gln Gln Gly Pro Gly Gly Tyr Gly Ser Pro Ala Gly Ala

435 440 445

Ser Gly Pro Gly Gln Gln Gly Arg Gly Gly Tyr Gly Pro Gly Gln Gln

450 455 460

Gly Pro Ser Gly Pro Gly Ser Gly Ala Ala Ala Ala Ala Ala Gly Gly

465 470 475 480

Ala Gly Gln Gly Gly Tyr Gly Gly Leu Gly Gly Gln Gly Ala Gly Arg

485 490 495

Gly Gly Leu Gly Gly Gln Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ser Gly Pro Gly

500 505 510

Gly Tyr Gly Pro Gly Gln Gln Gly Pro Gly Gly Tyr Gly Pro Gly Gln

515 520 525

Gln Gly Pro Ser Gly Pro Gly Ser Met Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala

530 535 540

Met Gly Pro Gly Gly Tyr Gly Pro Gly Gln Gln Gly Pro Gly Gly Tyr

545 550 555 560

Gly Ser Pro Ala Gly Ala Pro Pro Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly Pro

565 570 575

Pro Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly Pro Pro

580 585 590

Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly

595 600 605

Pro Pro Gly Pro Ala Gly Gly

610 615

<210> 2

<211> 1740

<212> DNA

<213> 拟蛛丝蛋白的核苷酸序列(Argiope trifasciata)

<400> 2

ctcgagaaaa gaggtccacc cggtgcacca ccaggaccac caggaccacc aggaccacca 60

ggaccaccag gaccaccagg accaccagga ccaccaggac caccaggacc accaggacca 120

ccaggaccac caggaccacc aggaccacca ggaccaccag gaccagccgg tgcatctggt 180

ccaggtcaac aaggtagagg tggttacggt ccaggtcaac aaggtccatc tggtcctggt 240

tctggtgctg ctgctgctgc tgctggtggt gctggtcaag gtggttatgg tggtttgggt 300

ggtcaaggtg ctggtagagg tggtttgggt ggtcaagctg ctgctgctgc tgcttctggt 360

ccaggtggtt atggtccagg tcaacaaggt ccaggtggtt acggtccagg tcaacaaggt 420

ccatctggtc caggttctat ggctgctgct gctgctgctg ctatgggtcc aggtggttac 480

ggtccaggtc aacaaggtcc aggtggttac ggttctccag ccggtgcatc tggtccaggt 540

caacaaggta gaggtggtta cggtccaggt caacaaggtc catctggtcc tggttctggt 600

gctgctgctg ctgctgctgg tggtgctggt caaggtggtt atggtggttt gggtggtcaa 660

ggtgctggta gaggtggttt gggtggtcaa gctgctgctg ctgctgcttc tggtccaggt 720

ggttatggtc caggtcaaca aggtccaggt ggttacggtc caggtcaaca aggtccatct 780

ggtccaggtt ctatggctgc tgctgctgct gctgctatgg gtccaggtgg ttacggtcca 840

ggtcaacaag gtccaggtgg ttacggttct ccagccggtg catctggtcc aggtcaacaa 900

ggtagaggtg gttacggtcc aggtcaacaa ggtccatctg gtcctggttc tggtgctgct 960

gctgctgctg ctggtggtgc tggtcaaggt ggttatggtg gtttgggtgg tcaaggtgct 1020

ggtagaggtg gtttgggtgg tcaagctgct gctgctgctg cttctggtcc aggtggttat 1080

ggtccaggtc aacaaggtcc aggtggttac ggtccaggtc aacaaggtcc atctggtcca 1140

ggttctatgg ctgctgctgc tgctgctgct atgggtccag gtggttacgg tccaggtcaa 1200

caaggtccag gtggttacgg ttctccagcc ggtgcatctg gtccaggtca acaaggtaga 1260

ggtggttacg gtccaggtca acaaggtcca tctggtcctg gttctggtgc tgctgctgct 1320

gctgctggtg gtgctggtca aggtggttat ggtggtttgg gtggtcaagg tgctggtaga 1380

ggtggtttgg gtggtcaagc tgctgctgct gctgcttctg gtccaggtgg ttatggtcca 1440

ggtcaacaag gtccaggtgg ttacggtcca ggtcaacaag gtccatctgg tccaggttct 1500

atggctgctg ctgctgctgc tgctatgggt ccaggtggtt acggtccagg tcaacaaggt 1560

ccaggtggtt acggttctcc agccggtgca ccaccaggac caccaggacc accaggacca 1620

ccaggaccac caggaccacc aggaccacca ggaccaccag gaccaccagg accaccagga 1680

ccaccaggac caccaggacc accaggacca ccaggaccac caggaccagc cggtggttaa 1740

<210> 3

<211> 31

<212> DNA

<213> A1-1

<400> 3

cgcgaattcc tcgagaaaag aggtccaccc g 31

<210> 4

<211> 28

<212> DNA

<213> A1-2

<400> 4

gcgcttaagg agctcttttc tccaggtg 28

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> A2-1

<400> 5

gtggttaagc ggccgcatgc 20

<210> 6

<211> 23

<212> DNA

<213> A2-2

<400> 6

ggccaccaat tcgccggcgt acg 23

<210> 7

<211> 397

<212> DNA

<213> A1S

<400> 7

cgcgaattcc tcgagaaaag aggtccaccc ggtgcatctg gtccaggtca acaaggtaga 60

ggtggttacg gtccaggtca acaaggtcca tctggtcctg gttctggtgc tgctgctgct 120

gctgctggtg gtgctggtca aggtggttat ggtggtttgg gtggtcaagg tgctggtaga 180

ggtggtttgg gtggtcaagc tgctgctgct gctgcttctg gtccaggtgg ttatggtcca 240

ggtcaacaag gtccaggtgg ttacggtcca ggtcaacaag gtccatctgg tccaggttct 300

atggctgctg ctgctgctgc tgctatgggt ccaggtggtt acggtccagg tcaacaaggt 360

ccaggtggtt acggttctcc agccggtggt taaagaa 397

<210> 8

<211> 198

<212> DNA

<213> A1TA2

<400> 8

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Claims

1.一种拟蛛丝蛋白，其特征在于，所述拟蛛丝蛋白为包括蛛丝蛋白和类胶原蛋白的三嵌段共聚物；

所述拟蛛丝蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；

所述拟蛛丝蛋白的编码核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

2.根据权利要求1所述的一种拟蛛丝蛋白，其特征在于，所述类胶原蛋白的结构为三聚体(Pro-Gly-Pro)_n。

3.根据权利要求2所述的一种拟蛛丝蛋白，其特征在于，所述类胶原蛋白的三聚体重复数n为15。

4.一种权利要求1所述的拟蛛丝蛋白的生物合成方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

(1)拟蛛丝蛋白基因的设计与优化；

(2)拟蛛丝蛋白基因表达载体的构建；

(3)基因工程菌的转化及发酵培养；

(4)拟蛛丝蛋白基因的诱导表达；

(5)拟蛛丝蛋白的提取与纯化。

5.根据权利要求4所述的一种拟蛛丝蛋白的生物合成方法，其特征在于，所述基因工程菌为大肠杆菌。