CN114685686A - 融合蛋白及其在制备生物蛋白纤维中的应用 - Google Patents

融合蛋白及其在制备生物蛋白纤维中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及融合蛋白及其在制备生物蛋白纤维中的应用。该融合蛋白为AFP蛋白和ELP蛋白的融合蛋白，或为AFP蛋白和rSRT蛋白的融合蛋白。本发明提供的融合蛋白通过与戊二醛交联获得的生物蛋白纤维断裂强度和韧性优于许多重组蛛丝，甚至可以与一些天然蛛丝相媲美，在‑40℃环境中仍然保持较高的力学性能，断裂强度和韧性均较高，为探索可耐受极端环境的蛋白材料提供了新思路。

Description

融合蛋白及其在制备生物蛋白纤维中的应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域，尤其涉及融合蛋白及其在制备生物蛋白纤维中的应用。
背景技术
轻质高强的生物蛋白纤维是一种性能优异、应用广泛的新技术材料，其主要优势在于突破了化学合成纤维密度大、高强高韧不可兼得和生物相容性差的限制。此外，基于蛋白纤维优异的生物相容性和可降解性，其在生物医学材料领域亦极具应用前景。然而，生物蛋白纤维的耐低温性能差，特别是0℃以下时，纤维的力学强度、延展性和韧性等均明显降低，这严重限制了生物蛋白纤维在低温环境中的应用。
目前，已报道的耐低温蛋白纤维主要是天然蛛丝纤维和柞蚕丝纤维。他们优异的低温韧性，特别是低温延展性，主要是基于纤维内部沿长轴排列的、规整且相对独立的微纳米级纤维结构。这些微纳纤维在低温下抵抗拉伸时，能够有效开裂并沿纤维轴发生相对运动，耗散掉纤维截面扩展的裂纹尖端的能量，从而达到延迟断裂的目的。除此之外，微纳纤维内部的“有序-无序”两相分子结构模型保证了每根微纤内部可以发生屈服和塑性形变。这些沿纤维轴高度取向却仍然保留了非晶结构特征的“无序”蛋白分子链结构是柞蚕丝和蛛丝纤维等能够发生低温塑性形变的基本原因。天然蛛丝的拉伸强度高达1.0-1.7GPa，延展性可达58％-69％，其力学性能远超蚕丝。但是由于天然蛛丝的产量较低且蜘蛛无法像家蚕一样进行群体饲养，异源表达系统合成的重组蛛丝蛋白分子量远低于天然蛋白且往往存在末端结构域缺失，同时由于对天然纺丝系统的结构和物理化学参数认识不足，目前尚无法实现天然蛛丝生产的体外模拟。因此，开发耐低温、高强高韧的蛋白纤维仍是材料科学亟待解决的问题之一。
发明内容
有鉴于此，本发明提供了融合蛋白及其在制备生物蛋白纤维中的应用。利用该融合蛋白制成的生物蛋白纤维在低温环境下能够保持较高力学性能。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
融合蛋白，包括AFP蛋白和ELP蛋白，或包括AFP蛋白和rSRT蛋白；
所述AFP蛋白包括氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的AFP1蛋白和/或氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的AFP2蛋白；
所述ELP蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示；
所述rSRT蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。
本发明中，类弹性蛋白ELP由五肽重复单元GKGVP组成，具体序列如SEQ ID NO.3所示，其中赖氨酸残基(Lysine,K)的游离氨基提供了戊二醛交联位点。通过戊二醛交联在纤维内部形成长程有序的结构，有助于提高蛋白纤维的断裂强度；ELP蛋白内在的无规卷曲的结构有助于保持蛋白纤维在低温下的韧性。
重组鱿鱼环齿蛋白rSRT由天然鱿鱼环齿蛋白晶体(β-sheets)结构域与ELP五肽重复单元嵌合形成。因此，rSRT蛋白中既存在天然蛋白的有序结构，也存在无序的卷曲柔性结构，“无序-有序”两相交替的排列在很大程度上模拟了蛛丝蛋白内部的分子结构。与蛛丝蛋白不同的是，rSRT蛋白具有较高的水溶性，可以在大肠杆菌中进行可溶性的表达，同时可在水相条件下进行纺丝，避免了有机溶剂带来的蛋白结构破坏，为模拟动物丝纤维的低温力学性能提供了有利条件。
本发明中，所述融合蛋白包括AFP和ELP两种蛋白单元，对AFP和ELP单元的个数没有具体限定，AFP单元的个数可以是一个或多个，ELP单元的个数也可以是一个或多个。所述融合蛋白包括AFP和rSRT两种蛋白单元时，对AFP和rSRT两种蛋白单元的个数没有具体限定，AFP单元的个数可以是一个或多个，rSRT单元的个数可以是一个或多个。
本发明中，ELP蛋白、rSRT蛋白还包括蛋白标签。其中，rSRT蛋白的标签为6×His标签，位于所述融合蛋白的C端。ELP蛋白的标签为6×His标签，位于所述融合蛋白的C端。
一些具体实施例中，所述融合蛋白从N端到C端包括顺序连接的AFP1、ELP和AFP1蛋白，简称AFP1-ELP-AFP1，一些具体实施例中，所述融合蛋白从N端到C端包括顺序连接的AFP1、rSRT和AFP1蛋白，简称AFP1-rSRT-AFP1。
在本发明提供的上述融合蛋白中，所述AFP蛋白与ELP蛋白，以及AFP蛋白与rSRT蛋白之间由linker连接。一些具体实施例中，所述linker的氨基酸序列如SEQ ID NO.5，其氨基酸序列为GGGGSGGGGS。
本发明还提供了编码所述融合蛋白的核酸分子。一些具体实施例中，编码所述融合蛋白的核酸分子包括编码AFP蛋白的核酸和编码ELP蛋白的核酸，或包括编码AFP蛋白的核酸和编码rSRT蛋白的核酸，编码AFP蛋白的核酸和编码ELP蛋白的核酸之间还包括编码所述linker的核酸，编码AFP蛋白的核酸和编码rSRT蛋白的核酸之间还包括编码所述linker的核酸。其中，编码AFP蛋白的核酸的核苷酸序列如SEQ ID NO.6或SEQ ID NO.7所示，编码ELP蛋白的核酸的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示；编码rSRT蛋白的核酸的核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示。编码所述linker的核酸的核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示
本发明还提供了含有所述核酸分子的重组载体。
一些具体实施例中，所述重组载体的构建方法包括：
步骤1、将ELP或rSRT基因序列连接在表达载体pET25b上，分别得到pET25b-ELP和pET25b-rSRT。
步骤2、利用Nde1内切酶将pET25b-ELP和pET25b-rSRT进行线性化，将抗冻蛋白AFP1或AFP2的基因序列连接在ELP或rSRT编码序列的5’端，分别得到融合蛋白AFP1-ELP，AFP2-ELP，AFP1-rSRT，AFP2-rSRT的表达质粒。
步骤3、利用EcoR1内切酶将pET25b-AFP1-ELP和pET25b-AFP1-rSRT进行线性化，通过同源重组的方法将将抗冻蛋白AFP1的基因序列连接在AFP1-ELP或AFP1-rSRT编码序列的3’端，分别得到融合蛋白AFP1-ELP-AFP1，AFP1-rSRT-AFP1的表达质粒。
本发明中，所述重组载体的骨架载体选自PET系列，具体可为pET25b。
本发明还提供了转染或转化有所述重组载体的宿主。
本发明还提供了所述的融合蛋白的制备方法，包括：培养本发明所述的宿主，诱导融合蛋白表达。
本发明中，所述融合蛋白的制备方法具体包括：将重组载体转化大肠杆菌BLR感受态细胞，将单克隆在100mL小摇瓶中进行种子培养，随后转接至5L大摇瓶中进行发酵培养并添加诱导剂诱导蛋白大量表达，最终将菌液离心，收集菌体。
本发明中，在收集菌体之后还包括对融合蛋白提取、纯化的步骤，包括：将菌体破碎后离心取上清，使上清液中的蛋白依次经过镍柱亲和层析、透析、阳离子交换层析和分子筛层析进行精细纯化。
本发明还提供了所述的融合蛋白、核酸分子、重组载体、宿主或所述制备方法制得的融合蛋白，在制备生物蛋白纤维中的应用。
本发明还提供了一种生物蛋白纤维，由本发明所述的融合蛋白经戊二醛交联制得。
本发明还提供了所述的生物蛋白纤维的制备方法，包括：
将0.1％戊二醛水溶液加入到200mg/mL融合蛋白水溶液中，至戊二醛终浓度稀释至质量浓度为0.01％，交联5-10min，获得预交联产物；
将预交联产物注射到0.5wt％-1wt％的戊二醛水溶液凝固浴中，以线速度为0.4-1.0m/min的速度收集纤维。
本发明中，采用注射器进行注射，所述注射器规格优选为：注射器体积为1mL，注射器针头内径为160μm，外径为310μm。本发明在进行注射时通过注射泵调节注射的速度；所述注射泵推进的速度视注射器针头挤出蛋白的交联程度决定。本发明中，所述注射泵的速度为5-20μL/min，优选为10-20μL/min。
本发明中，在获得本发明所述的生物蛋白纤维之后还包括后拉伸的步骤。所述后拉伸具体包括：从收集到的纤维中选取表面光滑均匀的纤维，在水中浸泡2-10s至纤维蜷缩变软，再将纤维拉伸到原长的50％至150％。
本发明提供的融合蛋白，包括AFP蛋白和ELP蛋白，或包括AFP蛋白和rSRT蛋白；所述AFP蛋白包括氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的AFP1蛋白和/或氨基酸序列如SEQ IDNO.2所示的AFP2蛋白；所述ELP蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示；所述rSRT蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。本发明的有益效果在于：
1)从仿生角度出发，利用基因工程技术，设计了一种含有抗冻功能单元的融合力学蛋白，利用融合力学蛋白“有序-无序”的两相分子排列模拟动物丝蛋白内部结构，同时利用抗冻功能单元保护纤维内部的力学结构部分，为开发耐低温、高强高韧的蛋白纤维提供了新方法。
2)纤维在低温下具有较高的强度和韧性，其性能超过了许多重组蛛丝、重组蚕丝，甚至可以与天然蚕丝、乃至部分天然蛛丝相媲美。
3)在蛋白的N端或两端引入抗冻蛋白单元，抗冻蛋白单元与ELP或rSRT单元之间通过柔性分子链连接，能够在不影响蛋白结构的情况下实现蛋白重组，赋予融合蛋白耐低温的功能。
4)纺丝工艺简便，易重复，纤维可以得到充分交联，且经过后拉伸之后更为长程有序。
5)所用戊二醛交联剂交联速度快，且便宜易得，适用于这种带有赖氨酸的融合蛋白。
附图说明
图1示各融合蛋白(a)表达质粒的构建及(b)模块化组成；
图2示各融合蛋白的SDS-PAGE检测；
图3示不同蛋白溶液在-8℃的重结晶分析；
图4示纺丝流程示意图；
图5示不同纤维在低温下的表面形貌观察；
图6示-40℃下AFP1-ELP纤维力学拉伸测试曲线；
图7示-40℃下AFP1-rSRT纤维力学拉伸测试曲线；
图8示-40℃下AFP1-rSRT-AFP1纤维力学拉伸测试曲线；
图9示各融合蛋白纤维在不同温度下的断裂强度比较；
图10示各融合蛋白纤维在不同温度下的韧性比较；
图11示各融合蛋白纤维在不同温度下的杨氏模量比较。
具体实施方式
本发明提供了融合蛋白及其在制备蛋白生物纤维中的应用。本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
本发明采用的试材皆为普通市售品，皆可于市场购得。
下面结合实施例，进一步阐述本发明：
实施例1融合蛋白表达质粒构建
将ELP或rSRT基因序列与表达载体pET25b分别进行Nde1/EcoR1双酶切，酶切后的样品分别进行胶回收并利用微量分光光度计表征样品浓度。按照基因序列与线性化载体摩尔比10:1-5:1的配比配置T4 DNA连接酶反应体系,25℃反应2h。连接体系转化大肠杆菌DH5α感受态并进行筛选和测序验证，最终获得pET25b-ELP和pET25b-rSRT表达质粒。按照同样的方式，利用Nde1内切酶将pET25b-ELP和pET25b-rSRT进行线性化，将抗冻蛋白AFP1或AFP2的基因序列连接在ELP或rSRT编码序列的5’端，分别得到融合蛋白AFP1-ELP，AFP2-ELP，AFP1-rSRT，AFP2-rSRT的表达质粒。利用EcoR1内切酶将pET25b-AFP1-ELP和pET25b-AFP1-rSRT进行线性化，通过同源重组的方法(采用购自Vazyme公司的重组酶ClonExpressⅡ，在体外由重组酶催化的同源重组反应只能在载体切口附近～10bp以内的位置进行)将抗冻蛋白AFP1的基因序列连接在AFP1-ELP或AFP1-rSRT编码序列的3’端，分别得到融合蛋白AFP1-ELP-AFP1，AFP1-rSRT-AFP1的表达质粒(图1)。
实施例2：融合蛋白异源表达和纯化
融合蛋白AFP1-rSRT表达载体转化大肠杆菌感受态细胞E.coliBLR(DE3)。挑取阳性克隆在含有10mLLB培养基(100μg/mL氨苄西林)的100mL小摇瓶中培养10h(37℃，220rpm)，待菌液OD600至3左右时，将其转移至含1LLB培养基(100μg/mL氨苄西林)的5L大摇瓶中培养2-3h(37℃，220rpm)，待菌液OD600至0.6-0.8时添加诱导剂IPTG(isopropylβ-D-1-thiogalactopyranoside,异丙基硫代半乳糖苷)至终浓度为1mM，诱导蛋白大量表达，继续培养5h后(37℃，220rpm)将菌液离心(8000rpm,10min,4℃)，将菌体保存在-80℃。
菌体超声破碎后离心(14000rpm,40min,4℃)取上清，上清液依次经过Ni亲和层析、透析、阳离子交换层析、分子筛层析等进行精细纯化，对各融合蛋白进行SDS凝胶电泳检测和分析(图2)。最终将AFP1-rSRT蛋白水溶液进行真空冷冻干燥，冻干后于-80℃保存备用。
实施例3：融合蛋白水溶液重结晶分析
将冻干的蛋白用超纯水配置成1mg/mL蛋白溶液，取5-10μL滴到载玻片上，置于显微镜制冷台上，先迅速降温至-60℃保持5min，再以5℃/min的速度缓慢升至-8℃，保持30min，50×*10×观察各融合蛋白溶液结晶情况并进行实时拍照，通过计算视野内冰晶的平均面积(MLGS)分析融合蛋白抑制重结晶的效果(图3)。
实施例4：融合蛋白纤维的制备
将初始质量浓度为0.1％戊二醛水溶液加入到融合蛋白水溶液(200mg/mL)中，戊二醛终浓度稀释至质量浓度为0.01％，交联5-10min。
将经过预交联后的蛋白水溶液用注射器挤入质量浓度为0.5％的戊二醛水溶液中，并用注射泵调节推进速度为10μL/min，用转筒收集器以线速度为0.6m/min的速度来收集纤维(图4)。
将收集到的纤维晾干，选取光滑均匀的一段纤维，将其至于超纯水中浸泡至纤维蜷缩变软，随后将纤维取出立即后拉伸至原长的100％。
实施例5：低温下纤维表面形貌观察与力学性能测试
低温下纤维的表面形貌观察：将后拉伸的纤维放在显微镜制冷台上，调节温度从-60℃以5℃/min的速度逐步升温至25℃，在此过程中观察纤维表面的变化情况，并进行连续拍照记录(图5)。
低温下纤维的力学性能测试：利用DMA-Q850拉伸测试仪分别在25℃、-20℃和-40℃条件下测试纤维的力学性能并进行统计分析(图6-11)。
以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 清华大学
<120> 融合蛋白及其在制备生物蛋白纤维中的应用
<130> MP21038886
<160> 10
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 69
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Met Ala Gly Gly Asn Gln Ala Ser Val Val Ala Asn Gln Leu Ile Pro
1 5 10 15
Ile Asn Thr Ala Leu Thr Leu Val Met Met Arg Ser Glu Val Val Thr
20 25 30
Pro Val Gly Ile Pro Ala Glu Asp Ile Pro Arg Leu Val Ser Met Gln
35 40 45
Val Asn Arg Ala Val Pro Leu Gly Thr Thr Leu Met Pro Asp Met Val
50 55 60
Lys Gly Tyr Ala Ala
65
<210> 2
<211> 86
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
Met Ala Gly Gly Cys Lys Gly Ala Asp Gly Ala His Gly Val Asn Gly
1 5 10 15
Cys Pro Gly Thr Ala Gly Ala Ala Gly Ser Val Gly Gly Pro Gly Cys
20 25 30
Asp Gly Gly His Gly Gly Asn Gly Gly Asn Gly Asn Pro Gly Cys Ala
35 40 45
Gly Gly Val Gly Gly Ala Gly Gly Ala Ser Gly Gly Thr Gly Val Gly
50 55 60
Gly Arg Gly Gly Lys Gly Gly Ser Gly Thr Pro Lys Gly Ala Asp Gly
65 70 75 80
Ala Pro Gly Ala Pro Ala
85
<210> 3
<211> 408
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
Met Gly Ala Gly Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Lys Gly Val Pro Gly
1 5 10 15
Lys Gly Val Pro Gly Lys Gly Val Pro Gly Lys Gly Val Pro Gly Lys
20 25 30
Gly Val Pro Gly Lys Gly Val Pro Gly Lys Gly Val Pro Gly Lys Gly
35 40 45
Val Pro Gly Lys Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Lys Gly Val
50 55 60
Pro Gly Lys Gly Val Pro Gly Lys Gly Val Pro Gly Lys Gly Val Pro
65 70 75 80
Gly Lys Gly Val Pro Gly Lys Gly Val Pro Gly Lys Gly Val Pro Gly
85 90 95
Lys Gly Val Pro Gly Lys Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Lys
100 105 110
Gly Val Pro Gly Lys Gly Val Pro Gly Lys Gly Val Pro Gly Lys Gly
115 120 125
Val Pro Gly Lys Gly Val Pro Gly Lys Gly Val Pro Gly Lys Gly Val
130 135 140
Pro Gly Lys Gly Val Pro Gly Lys Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro
145 150 155 160
Gly Lys Gly Val Pro Gly Lys Gly Val Pro Gly Lys Gly Val Pro Gly
165 170 175
Lys Gly Val Pro Gly Lys Gly Val Pro Gly Lys Gly Val Pro Gly Lys
180 185 190
Gly Val Pro Gly Lys Gly Val Pro Gly Lys Gly Val Pro Gly Val Gly
195 200 205
Val Pro Gly Lys Gly Val Pro Gly Lys Gly Val Pro Gly Lys Gly Val
210 215 220
Pro Gly Lys Gly Val Pro Gly Lys Gly Val Pro Gly Lys Gly Val Pro
225 230 235 240
Gly Lys Gly Val Pro Gly Lys Gly Val Pro Gly Lys Gly Val Pro Gly
245 250 255
Val Gly Val Pro Gly Lys Gly Val Pro Gly Lys Gly Val Pro Gly Lys
260 265 270
Gly Val Pro Gly Lys Gly Val Pro Gly Lys Gly Val Pro Gly Lys Gly
275 280 285
Val Pro Gly Lys Gly Val Pro Gly Lys Gly Val Pro Gly Lys Gly Val
290 295 300
Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Lys Gly Val Pro Gly Lys Gly Val Pro
305 310 315 320
Gly Lys Gly Val Pro Gly Lys Gly Val Pro Gly Lys Gly Val Pro Gly
325 330 335
Lys Gly Val Pro Gly Lys Gly Val Pro Gly Lys Gly Val Pro Gly Lys
340 345 350
Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Lys Gly Val Pro Gly Lys Gly
355 360 365
Val Pro Gly Lys Gly Val Pro Gly Lys Gly Val Pro Gly Lys Gly Val
370 375 380
Pro Gly Lys Gly Val Pro Gly Lys Gly Val Pro Gly Lys Gly Val Pro
385 390 395 400
Gly Lys Gly Val Pro Gly Trp Pro
405
<210> 4
<211> 1596
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
Met Pro Ala Ala Thr Ala Val Ser His Thr Thr His His Ala Pro Val
1 5 10 15
Pro Gly Lys Gly Val Pro Gly Lys Gly Val Pro Gly Lys Gly Val Pro
20 25 30
Gly Lys Gly Val Pro Gly Lys Gly Val Pro Gly Val Gly Pro Ala Ala
35 40 45
Thr Ala Val Ser His Thr Thr His His Ala Pro Val Pro Gly Lys Gly
50 55 60
Val Pro Gly Lys Gly Val Pro Gly Lys Gly Val Pro Gly Lys Gly Val
65 70 75 80
Pro Gly Lys Gly Val Pro Gly Val Gly Pro Ala Ala Thr Ala Val Ser
85 90 95
His Thr Thr His His Ala Pro Val Pro Gly Lys Gly Val Pro Gly Lys
100 105 110
Gly Val Pro Gly Lys Gly Val Pro Gly Lys Gly Val Pro Gly Lys Gly
115 120 125
Val Pro Gly Val Gly Pro Ala Ala Thr Ala Val Ser His Thr Thr His
130 135 140
His Ala Pro Val Pro Gly Lys Gly Val Pro Gly Lys Gly Val Pro Gly
145 150 155 160
Lys Gly Val Pro Gly Lys Gly Val Pro Gly Lys Gly Val Pro Gly Val
165 170 175
Gly Pro Ala Ala Thr Ala Val Ser His Thr Thr His His Ala Pro Val
180 185 190
Pro Gly Lys Gly Val Pro Gly Lys Gly Val Pro Gly Lys Gly Val Pro
195 200 205
Gly Lys Gly Val Pro Gly Lys Gly Val Pro Gly Val Gly Pro Ala Ala
210 215 220
Thr Ala Val Ser His Thr Thr His His Ala Pro Val Pro Gly Lys Gly
225 230 235 240
Val Pro Gly Lys Gly Val Pro Gly Lys Gly Val Pro Gly Lys Gly Val
245 250 255
Pro Gly Lys Gly Val Pro Gly Val Gly Pro Ala Ala Thr Ala Val Ser
260 265 270
His Thr Thr His His Ala Pro Val Pro Gly Lys Gly Val Pro Gly Lys
275 280 285
Gly Val Pro Gly Lys Gly Val Pro Gly Lys Gly Val Pro Gly Lys Gly
290 295 300
Val Pro Gly Val Gly Pro Ala Ala Thr Ala Val Ser His Thr Thr His
305 310 315 320
His Ala Pro Val Pro Gly Lys Gly Val Pro Gly Lys Gly Val Pro Gly
325 330 335
Lys Gly Val Pro Gly Lys Gly Val Pro Gly Lys Gly Val Pro Gly Val
340 345 350
Gly Pro Ala Ala Thr Ala Val Ser His Thr Thr His His Ala Pro Val
355 360 365
Pro Gly Lys Gly Val Pro Gly Lys Gly Val Pro Gly Lys Gly Val Pro
370 375 380
Gly Lys Gly Val Pro Gly Lys Gly Val Pro Gly Val Gly Pro Ala Ala
385 390 395 400
Thr Ala Val Ser His Thr Thr His His Ala Pro Val Pro Gly Lys Gly
405 410 415
Val Pro Gly Lys Gly Val Pro Gly Lys Gly Val Pro Gly Lys Gly Val
420 425 430
Pro Gly Lys Gly Val Pro Gly Val Gly Pro Ala Ala Thr Ala Val Ser
435 440 445
His Thr Thr His His Ala Pro Val Pro Gly Lys Gly Val Pro Gly Lys
450 455 460
Gly Val Pro Gly Lys Gly Val Pro Gly Lys Gly Val Pro Gly Lys Gly
465 470 475 480
Val Pro Gly Val Gly Pro Ala Ala Thr Ala Val Ser His Thr Thr His
485 490 495
His Ala Pro Val Pro Gly Lys Gly Val Pro Gly Lys Gly Val Pro Gly
500 505 510
Lys Gly Val Pro Gly Lys Gly Val Pro Gly Lys Gly Val Pro Gly Val
515 520 525
Gly Pro Ala Ala Thr Ala Val Ser His Thr Thr His His Ala Pro Val
530 535 540
Pro Gly Lys Gly Val Pro Gly Lys Gly Val Pro Gly Lys Gly Val Pro
545 550 555 560
Gly Lys Gly Val Pro Gly Lys Gly Val Pro Gly Val Gly Pro Ala Ala
565 570 575
Thr Ala Val Ser His Thr Thr His His Ala Pro Val Pro Gly Lys Gly
580 585 590
Val Pro Gly Lys Gly Val Pro Gly Lys Gly Val Pro Gly Lys Gly Val
595 600 605
Pro Gly Lys Gly Val Pro Gly Val Gly Pro Ala Ala Thr Ala Val Ser
610 615 620
His Thr Thr His His Ala Pro Val Pro Gly Lys Gly Val Pro Gly Lys
625 630 635 640
Gly Val Pro Gly Lys Gly Val Pro Gly Lys Gly Val Pro Gly Lys Gly
645 650 655
Val Pro Gly Val Gly Pro Ala Ala Thr Ala Val Ser His Thr Thr His
660 665 670
His Ala Pro Val Pro Gly Lys Gly Val Pro Gly Lys Gly Val Pro Gly
675 680 685
Lys Gly Val Pro Gly Lys Gly Val Pro Gly Lys Gly Val Pro Gly Val
690 695 700
Gly Pro Ala Ala Thr Ala Val Ser His Thr Thr His His Ala Pro Val
705 710 715 720
Pro Gly Lys Gly Val Pro Gly Lys Gly Val Pro Gly Lys Gly Val Pro
725 730 735
Gly Lys Gly Val Pro Gly Lys Gly Val Pro Gly Val Gly Pro Ala Ala
740 745 750
Thr Ala Val Ser His Thr Thr His His Ala Pro Val Pro Gly Lys Gly
755 760 765
Val Pro Gly Lys Gly Val Pro Gly Lys Gly Val Pro Gly Lys Gly Val
770 775 780
Pro Gly Lys Gly Val Pro Gly Val Gly Pro Ala Ala Thr Ala Val Ser
785 790 795 800
His Thr Thr His His Ala Pro Val Pro Gly Lys Gly Val Pro Gly Lys
805 810 815
Gly Val Pro Gly Lys Gly Val Pro Gly Lys Gly Val Pro Gly Lys Gly
820 825 830
Val Pro Gly Val Gly Pro Ala Ala Thr Ala Val Ser His Thr Thr His
835 840 845
His Ala Pro Val Pro Gly Lys Gly Val Pro Gly Lys Gly Val Pro Gly
850 855 860
Lys Gly Val Pro Gly Lys Gly Val Pro Gly Lys Gly Val Pro Gly Val
865 870 875 880
Gly Pro Ala Ala Thr Ala Val Ser His Thr Thr His His Ala Pro Val
885 890 895
Pro Gly Lys Gly Val Pro Gly Lys Gly Val Pro Gly Lys Gly Val Pro
900 905 910
Gly Lys Gly Val Pro Gly Lys Gly Val Pro Gly Val Gly Pro Ala Ala
915 920 925
Thr Ala Val Ser His Thr Thr His His Ala Pro Val Pro Gly Lys Gly
930 935 940
Val Pro Gly Lys Gly Val Pro Gly Lys Gly Val Pro Gly Lys Gly Val
945 950 955 960
Pro Gly Lys Gly Val Pro Gly Val Gly Pro Ala Ala Thr Ala Val Ser
965 970 975
His Thr Thr His His Ala Pro Val Pro Gly Lys Gly Val Pro Gly Lys
980 985 990
Gly Val Pro Gly Lys Gly Val Pro Gly Lys Gly Val Pro Gly Lys Gly
995 1000 1005
Val Pro Gly Val Gly Pro Ala Ala Thr Ala Val Ser His Thr Thr His
1010 1015 1020
His Ala Pro Val Pro Gly Lys Gly Val Pro Gly Lys Gly Val Pro Gly
1025 1030 1035 1040
Lys Gly Val Pro Gly Lys Gly Val Pro Gly Lys Gly Val Pro Gly Val
1045 1050 1055
Gly Pro Ala Ala Thr Ala Val Ser His Thr Thr His His Ala Pro Val
1060 1065 1070
Pro Gly Lys Gly Val Pro Gly Lys Gly Val Pro Gly Lys Gly Val Pro
1075 1080 1085
Gly Lys Gly Val Pro Gly Lys Gly Val Pro Gly Val Gly Pro Ala Ala
1090 1095 1100
Thr Ala Val Ser His Thr Thr His His Ala Pro Val Pro Gly Lys Gly
1105 1110 1115 1120
Val Pro Gly Lys Gly Val Pro Gly Lys Gly Val Pro Gly Lys Gly Val
1125 1130 1135
Pro Gly Lys Gly Val Pro Gly Val Gly Pro Ala Ala Thr Ala Val Ser
1140 1145 1150
His Thr Thr His His Ala Pro Val Pro Gly Lys Gly Val Pro Gly Lys
1155 1160 1165
Gly Val Pro Gly Lys Gly Val Pro Gly Lys Gly Val Pro Gly Lys Gly
1170 1175 1180
Val Pro Gly Val Gly Pro Ala Ala Thr Ala Val Ser His Thr Thr His
1185 1190 1195 1200
His Ala Pro Val Pro Gly Lys Gly Val Pro Gly Lys Gly Val Pro Gly
1205 1210 1215
Lys Gly Val Pro Gly Lys Gly Val Pro Gly Lys Gly Val Pro Gly Val
1220 1225 1230
Gly Pro Ala Ala Thr Ala Val Ser His Thr Thr His His Ala Pro Val
1235 1240 1245
Pro Gly Lys Gly Val Pro Gly Lys Gly Val Pro Gly Lys Gly Val Pro
1250 1255 1260
Gly Lys Gly Val Pro Gly Lys Gly Val Pro Gly Val Gly Pro Ala Ala
1265 1270 1275 1280
Thr Ala Val Ser His Thr Thr His His Ala Pro Val Pro Gly Lys Gly
1285 1290 1295
Val Pro Gly Lys Gly Val Pro Gly Lys Gly Val Pro Gly Lys Gly Val
1300 1305 1310
Pro Gly Lys Gly Val Pro Gly Val Gly Pro Ala Ala Thr Ala Val Ser
1315 1320 1325
His Thr Thr His His Ala Pro Val Pro Gly Lys Gly Val Pro Gly Lys
1330 1335 1340
Gly Val Pro Gly Lys Gly Val Pro Gly Lys Gly Val Pro Gly Lys Gly
1345 1350 1355 1360
Val Pro Gly Val Gly Pro Ala Ala Thr Ala Val Ser His Thr Thr His
1365 1370 1375
His Ala Pro Val Pro Gly Lys Gly Val Pro Gly Lys Gly Val Pro Gly
1380 1385 1390
Lys Gly Val Pro Gly Lys Gly Val Pro Gly Lys Gly Val Pro Gly Val
1395 1400 1405
Gly Pro Ala Ala Thr Ala Val Ser His Thr Thr His His Ala Pro Val
1410 1415 1420
Pro Gly Lys Gly Val Pro Gly Lys Gly Val Pro Gly Lys Gly Val Pro
1425 1430 1435 1440
Gly Lys Gly Val Pro Gly Lys Gly Val Pro Gly Val Gly Pro Ala Ala
1445 1450 1455
Thr Ala Val Ser His Thr Thr His His Ala Pro Val Pro Gly Lys Gly
1460 1465 1470
Val Pro Gly Lys Gly Val Pro Gly Lys Gly Val Pro Gly Lys Gly Val
1475 1480 1485
Pro Gly Lys Gly Val Pro Gly Val Gly Pro Ala Ala Thr Ala Val Ser
1490 1495 1500
His Thr Thr His His Ala Pro Val Pro Gly Lys Gly Val Pro Gly Lys
1505 1510 1515 1520
Gly Val Pro Gly Lys Gly Val Pro Gly Lys Gly Val Pro Gly Lys Gly
1525 1530 1535
Val Pro Gly Val Gly Pro Ala Ala Thr Ala Val Ser His Thr Thr His
1540 1545 1550
His Ala Pro Val Pro Gly Lys Gly Val Pro Gly Lys Gly Val Pro Gly
1555 1560 1565
Lys Gly Val Pro Gly Lys Gly Val Pro Gly Lys Gly Val Pro Gly Val
1570 1575 1580
Gly Pro Ala Ala Thr Ala Val Ser Asp Ile Trp Pro
1585 1590 1595
<210> 5
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
1 5 10
<210> 6
<211> 207
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
atggcgggtg gtaaccaggc gagcgttgtg gcgaatcagc tgattccgat taacaccgcg 60
ctgaccctgg tgatgatgcg cagcgaagtg gtgaccccgg tgggtattcc ggcggaagat 120
attccgcgtc tggtgagcat gcaggtgaac cgtgcggtgc cgctgggcac caccctgatg 180
ccggatatgg tgaaaggcta tgcggcg 207
<210> 7
<211> 258
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
atggcgggtg gttgtaaagg cgcggatggc gcgcatggtg tgaatggttg tccgggtacc 60
gccggtgcgg cgggcagcgt gggtggtccg ggttgcgatg gtggtcatgg tggtaatggc 120
ggtaatggca acccgggctg cgcgggtggc gttggtggtg cgggtggtgc gagcggtggc 180
accggtgtgg gtggccgtgg tggtaaaggt ggcagcggca ccccgaaagg tgcggatggc 240
gcgccgggtg ccccggcc 258
<210> 8
<211> 1224
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
atgggcgcgg ggccgggcgt gggtgttccg ggtaaaggtg ttccgggcaa aggtgtgcca 60
ggcaaaggtg ttccgggtaa aggtgtgccg ggtaaaggcg taccgggtaa aggcgtacca 120
ggcaaaggtg ttccgggtaa aggcgtacca ggtaaaggtg tgccgggcgt gggtgttccg 180
ggtaaaggtg ttccgggcaa aggtgtgcca ggcaaaggtg ttccgggtaa aggtgtgccg 240
ggtaaaggcg taccgggtaa aggcgtacca ggcaaaggtg ttccgggtaa aggcgtacca 300
ggtaaaggtg tgccgggcgt gggtgttccg ggtaaaggtg ttccgggcaa aggtgtgcca 360
ggcaaaggtg ttccgggtaa aggtgtgccg ggtaaaggcg taccgggtaa aggcgtacca 420
ggcaaaggtg ttccgggtaa aggcgtacca ggtaaaggtg tgccgggcgt gggtgttccg 480
ggtaaaggtg ttccgggcaa aggtgtgcca ggcaaaggtg ttccgggtaa aggtgtgccg 540
ggtaaaggcg taccgggtaa aggcgtacca ggcaaaggtg ttccgggtaa aggcgtacca 600
ggtaaaggtg tgccgggcgt gggtgttccg ggtaaaggtg ttccgggcaa aggtgtgcca 660
ggcaaaggtg ttccgggtaa aggtgtgccg ggtaaaggcg taccgggtaa aggcgtacca 720
ggcaaaggtg ttccgggtaa aggcgtacca ggtaaaggtg tgccgggcgt gggtgttccg 780
ggtaaaggtg ttccgggcaa aggtgtgcca ggcaaaggtg ttccgggtaa aggtgtgccg 840
ggtaaaggcg taccgggtaa aggcgtacca ggcaaaggtg ttccgggtaa aggcgtacca 900
ggtaaaggtg tgccgggcgt gggtgttccg ggtaaaggtg ttccgggcaa aggtgtgcca 960
ggcaaaggtg ttccgggtaa aggtgtgccg ggtaaaggcg taccgggtaa aggcgtacca 1020
ggcaaaggtg ttccgggtaa aggcgtacca ggtaaaggtg tgccgggcgt gggtgttccg 1080
ggtaaaggtg ttccgggcaa aggtgtgcca ggcaaaggtg ttccgggtaa aggtgtgccg 1140
ggtaaaggcg taccgggtaa aggcgtacca ggcaaaggtg ttccgggtaa aggcgtacca 1200
ggtaaaggtg tgccgggctg gccg 1224
<210> 9
<211> 4788
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
atgccagctg ccacagctgt cagccacacc acccatcatg ctcctgtacc gggtaaaggc 60
gtgccgggca aaggtgttcc aggcaaaggc gttccgggca aaggcgtgcc gggtaaaggc 120
gtgccgggtg tgggtccagc tgccacagcc gttagccaca ccacccatca tgccccagta 180
ccgggtaaag gcgtgccggg caaaggtgtt ccaggcaaag gcgttccggg caaaggcgtg 240
ccgggtaaag gcgtgccggg tgtgggtcca gctgccacag ccgttagcca caccacccat 300
catgctccag taccgggtaa aggcgtgccg ggcaaaggtg ttccaggcaa aggcgttccg 360
ggcaaaggcg tgccgggtaa aggcgtgccg ggtgtgggtc cagctgccac agctgtcagc 420
cacaccaccc atcatgctcc tgtaccgggt aaaggcgtgc cgggcaaagg tgttccaggc 480
aaaggcgttc cgggcaaagg cgtgccgggt aaaggcgtgc cgggtgtggg tccagctgcc 540
acagccgtta gccacaccac ccatcatgcc ccagtaccgg gtaaaggcgt gccgggcaaa 600
ggtgttccag gcaaaggcgt tccgggcaaa ggcgtgccgg gtaaaggcgt gccgggtgtg 660
ggtccagctg ccacagccgt tagccacacc acccatcatg ctccagtacc gggtaaaggc 720
gtgccgggca aaggtgttcc aggcaaaggc gttccgggca aaggcgtgcc gggtaaaggc 780
gtgccgggtg tgggtccagc tgccacagct gtcagccaca ccacccatca tgctcctgta 840
ccgggtaaag gcgtgccggg caaaggtgtt ccaggcaaag gcgttccggg caaaggcgtg 900
ccgggtaaag gcgtgccggg tgtgggtcca gctgccacag ccgttagcca caccacccat 960
catgccccag taccgggtaa aggcgtgccg ggcaaaggtg ttccaggcaa aggcgttccg 1020
ggcaaaggcg tgccgggtaa aggcgtgccg ggtgtgggtc cagctgccac agccgttagc 1080
cacaccaccc atcatgctcc agtaccgggt aaaggcgtgc cgggcaaagg tgttccaggc 1140
aaaggcgttc cgggcaaagg cgtgccgggt aaaggcgtgc cgggtgtggg tccagctgcc 1200
acagctgtca gccacaccac ccatcatgct cctgtaccgg gtaaaggcgt gccgggcaaa 1260
ggtgttccag gcaaaggcgt tccgggcaaa ggcgtgccgg gtaaaggcgt gccgggtgtg 1320
ggtccagctg ccacagccgt tagccacacc acccatcatg ccccagtacc gggtaaaggc 1380
gtgccgggca aaggtgttcc aggcaaaggc gttccgggca aaggcgtgcc gggtaaaggc 1440
gtgccgggtg tgggtccagc tgccacagcc gttagccaca ccacccatca tgctccagta 1500
ccgggtaaag gcgtgccggg caaaggtgtt ccaggcaaag gcgttccggg caaaggcgtg 1560
ccgggtaaag gcgtgccggg tgtgggtcca gctgccacag ctgtcagcca caccacccat 1620
catgctcctg taccgggtaa aggcgtgccg ggcaaaggtg ttccaggcaa aggcgttccg 1680
ggcaaaggcg tgccgggtaa aggcgtgccg ggtgtgggtc cagctgccac agccgttagc 1740
cacaccaccc atcatgcccc agtaccgggt aaaggcgtgc cgggcaaagg tgttccaggc 1800
aaaggcgttc cgggcaaagg cgtgccgggt aaaggcgtgc cgggtgtggg tccagctgcc 1860
acagccgtta gccacaccac ccatcatgct ccagtaccgg gtaaaggcgt gccgggcaaa 1920
ggtgttccag gcaaaggcgt tccgggcaaa ggcgtgccgg gtaaaggcgt gccgggtgtg 1980
ggtccagctg ccacagctgt cagccacacc acccatcatg ctcctgtacc gggtaaaggc 2040
gtgccgggca aaggtgttcc aggcaaaggc gttccgggca aaggcgtgcc gggtaaaggc 2100
gtgccgggtg tgggtccagc tgccacagcc gttagccaca ccacccatca tgccccagta 2160
ccgggtaaag gcgtgccggg caaaggtgtt ccaggcaaag gcgttccggg caaaggcgtg 2220
ccgggtaaag gcgtgccggg tgtgggtcca gctgccacag ccgttagcca caccacccat 2280
catgctccag taccgggtaa aggcgtgccg ggcaaaggtg ttccaggcaa aggcgttccg 2340
ggcaaaggcg tgccgggtaa aggcgtgccg ggtgtgggtc cagctgccac agctgtcagc 2400
cacaccaccc atcatgctcc tgtaccgggt aaaggcgtgc cgggcaaagg tgttccaggc 2460
aaaggcgttc cgggcaaagg cgtgccgggt aaaggcgtgc cgggtgtggg tccagctgcc 2520
acagccgtta gccacaccac ccatcatgcc ccagtaccgg gtaaaggcgt gccgggcaaa 2580
ggtgttccag gcaaaggcgt tccgggcaaa ggcgtgccgg gtaaaggcgt gccgggtgtg 2640
ggtccagctg ccacagccgt tagccacacc acccatcatg ctccagtacc gggtaaaggc 2700
gtgccgggca aaggtgttcc aggcaaaggc gttccgggca aaggcgtgcc gggtaaaggc 2760
gtgccgggtg tgggtccagc tgccacagct gtcagccaca ccacccatca tgctcctgta 2820
ccgggtaaag gcgtgccggg caaaggtgtt ccaggcaaag gcgttccggg caaaggcgtg 2880
ccgggtaaag gcgtgccggg tgtgggtcca gctgccacag ccgttagcca caccacccat 2940
catgccccag taccgggtaa aggcgtgccg ggcaaaggtg ttccaggcaa aggcgttccg 3000
ggcaaaggcg tgccgggtaa aggcgtgccg ggtgtgggtc cagctgccac agccgttagc 3060
cacaccaccc atcatgctcc agtaccgggt aaaggcgtgc cgggcaaagg tgttccaggc 3120
aaaggcgttc cgggcaaagg cgtgccgggt aaaggcgtgc cgggtgtggg tccagctgcc 3180
acagctgtca gccacaccac ccatcatgct cctgtaccgg gtaaaggcgt gccgggcaaa 3240
ggtgttccag gcaaaggcgt tccgggcaaa ggcgtgccgg gtaaaggcgt gccgggtgtg 3300
ggtccagctg ccacagccgt tagccacacc acccatcatg ccccagtacc gggtaaaggc 3360
gtgccgggca aaggtgttcc aggcaaaggc gttccgggca aaggcgtgcc gggtaaaggc 3420
gtgccgggtg tgggtccagc tgccacagcc gttagccaca ccacccatca tgctccagta 3480
ccgggtaaag gcgtgccggg caaaggtgtt ccaggcaaag gcgttccggg caaaggcgtg 3540
ccgggtaaag gcgtgccggg tgtgggtcca gctgccacag ctgtcagcca caccacccat 3600
catgctcctg taccgggtaa aggcgtgccg ggcaaaggtg ttccaggcaa aggcgttccg 3660
ggcaaaggcg tgccgggtaa aggcgtgccg ggtgtgggtc cagctgccac agccgttagc 3720
cacaccaccc atcatgcccc agtaccgggt aaaggcgtgc cgggcaaagg tgttccaggc 3780
aaaggcgttc cgggcaaagg cgtgccgggt aaaggcgtgc cgggtgtggg tccagctgcc 3840
acagccgtta gccacaccac ccatcatgct ccagtaccgg gtaaaggcgt gccgggcaaa 3900
ggtgttccag gcaaaggcgt tccgggcaaa ggcgtgccgg gtaaaggcgt gccgggtgtg 3960
ggtccagctg ccacagctgt cagccacacc acccatcatg ctcctgtacc gggtaaaggc 4020
gtgccgggca aaggtgttcc aggcaaaggc gttccgggca aaggcgtgcc gggtaaaggc 4080
gtgccgggtg tgggtccagc tgccacagcc gttagccaca ccacccatca tgccccagta 4140
ccgggtaaag gcgtgccggg caaaggtgtt ccaggcaaag gcgttccggg caaaggcgtg 4200
ccgggtaaag gcgtgccggg tgtgggtcca gctgccacag ccgttagcca caccacccat 4260
catgctccag taccgggtaa aggcgtgccg ggcaaaggtg ttccaggcaa aggcgttccg 4320
ggcaaaggcg tgccgggtaa aggcgtgccg ggtgtgggtc cagctgccac agctgtcagc 4380
cacaccaccc atcatgctcc tgtaccgggt aaaggcgtgc cgggcaaagg tgttccaggc 4440
aaaggcgttc cgggcaaagg cgtgccgggt aaaggcgtgc cgggtgtggg tccagctgcc 4500
acagccgtta gccacaccac ccatcatgcc ccagtaccgg gtaaaggcgt gccgggcaaa 4560
ggtgttccag gcaaaggcgt tccgggcaaa ggcgtgccgg gtaaaggcgt gccgggtgtg 4620
ggtccagctg ccacagccgt tagccacacc acccatcatg ctccagtacc gggtaaaggc 4680
gtgccgggca aaggtgttcc aggcaaaggc gttccgggca aaggcgtgcc gggtaaaggc 4740
gtgccgggtg tgggtccagc tgccacagct gtcagcgata tctggccg 4788
<210> 10
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
ggcggtggcg gtagcggtgg cggtggcagt 30

Claims (10)

1.融合蛋白，其特征在于，包括AFP蛋白和ELP蛋白，或包括AFP蛋白和rSRT蛋白；
所述AFP蛋白为氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的AFP1蛋白和/或氨基酸序列如SEQ IDNO.2所示的AFP2蛋白；
所述ELP蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示；
所述rSRT蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。
2.根据权利求1所述的融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白包括：
顺序连接的AFP1、ELP和AFP1蛋白，或
顺序连接的AFP1、rSRT和AFP1蛋白。
3.根据权利求1或2所述的融合蛋白，其特征在于，所述AFP蛋白与ELP蛋白，以及AFP蛋白与rSRT蛋白之间由linker连接；所述linker的氨基酸序列如SEQ ID NO.5。
4.编码权利要求1～3任一项所述融合蛋白的核酸分子。
5.含有权利要求4所述核酸分子的重组载体。
6.转染或转化有权利要求5所述重组载体的宿主。
7.权利要求1或2所述的融合蛋白的制备方法，其特征在于，培养权利要求6所述的宿主，诱导融合蛋白表达。
8.权利要求1或2所述的融合蛋白、权利要求4所述的核酸分子、权利要求5所述的重组载体、权利要求6所述的宿主、权利要求7制备方法制得的融合蛋白，在制备生物蛋白纤维中的应用。
9.生物蛋白纤维，其特征在于，由权利要求1～3任一项所述的融合蛋白、或权利要求6所述的宿主表达的融合蛋白、或权利要求7制备方法制得的融合蛋白，经戊二醛交联制得。
10.权利要求9所述的生物蛋白纤维的制备方法，其特征在于，包括：
将0.1％戊二醛水溶液加入到200mg/mL融合蛋白水溶液中，至戊二醛终浓度稀释至质量浓度为0.01％，交联5-10min，获得预交联产物；
将预交联产物注射到0.5wt％-1wt％的戊二醛水溶液凝固浴中，以线速度为0.4-1.0m/min的速度收集纤维；
所述注射的速度为5-20μL/min。
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN116425848A (zh) * 2023-04-11 2023-07-14 北京新诚中科技术有限公司 重组嵌合蛛丝蛋白、生物蛋白纤维及其制备方法和应用

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1729295A (zh) * 2002-12-20 2006-02-01 荷兰联合利华有限公司 抗冻蛋白的制备
CN110776569A (zh) * 2019-10-09 2020-02-11 天津大学 一种具有粘附-抗冻双功能的二嵌段融合蛋白及合成方法和应用
CN111454370A (zh) * 2020-04-16 2020-07-28 中国科学院长春应用化学研究所 一种嵌合蛋白及其制备方法和应用

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1729295A (zh) * 2002-12-20 2006-02-01 荷兰联合利华有限公司 抗冻蛋白的制备
CN110776569A (zh) * 2019-10-09 2020-02-11 天津大学 一种具有粘附-抗冻双功能的二嵌段融合蛋白及合成方法和应用
CN111454370A (zh) * 2020-04-16 2020-07-28 中国科学院长春应用化学研究所 一种嵌合蛋白及其制备方法和应用

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
LI Y等: "Bioinspired and Mechanically Strong Fibers Based on Engineered Non-Spider Chimeric Proteins", ANGEW CHEM INT ED ENGL, vol. 59, no. 21, pages 8148 - 8152 *
PENG ZHANG等: "Bioengineered Protein Fibers with Anti-Freezing Mechanical Behaviors", ADV. FUNCT. MATER, vol. 32, pages 1 - 8 *
WU X等: "Antifreeze proteins and their biomimetics for cell cryopreservation: Mechanism, function and application-A review", INT J BIOL MACROMOL, vol. 192, pages 1276 - 1291, XP086848402, DOI: 10.1016/j.ijbiomac.2021.09.211 *

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN116425848A (zh) * 2023-04-11 2023-07-14 北京新诚中科技术有限公司 重组嵌合蛛丝蛋白、生物蛋白纤维及其制备方法和应用
CN116425848B (zh) * 2023-04-11 2024-05-24 北京新诚中科技术有限公司 重组嵌合蛛丝蛋白、生物蛋白纤维及其制备方法和应用

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