CN116425848A - 重组嵌合蛛丝蛋白、生物蛋白纤维及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及重组嵌合蛛丝蛋白、生物蛋白纤维及其制备方法和应用，涉及蛋白质领域，其氨基酸序列包括：m个直接串联的表现形式如[C‑ELP]所示的氨基酸序列单元，其中，C为如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列，ELP为类弹性蛋白序列，[C–ELP]表示C序列和ELP序列串联；m表示[C–ELP]序列串联的重复数，m为2‑36之间的整数；本发明通过添加ELP序列可以使重组嵌合蛛丝蛋白可以在细菌表达系统中实现稳定高效及可溶性表达，通过醛基交联可以显著提升人造纤维的机械性能。
Description
技术领域
本发明涉及蛋白质领域，尤其涉及重组嵌合蛛丝蛋白、生物蛋白纤维、生物蛋白纤维的制备方法，及它们的应用。
背景技术
蜘蛛丝是已知最坚韧的天然蛋白纤维，具有良好的机械性能和生物学品质，拉伸强度高达1.0-1.7GPa，延展性可达58％-69％，韧性可达180MJ/m3，与传统高分子纤维相比，它所具有的“高强-高韧”力学特性使其具有不可比拟的优势。同时，蛛丝纤维具有低密度、耐低温、生物相容性好及可降解等特点，因此在生物医学工程、高端运动器械以及特种装备等领域具有广阔的应用前景。
十字园蛛(Araneus diadematus)大壶腹腺分泌的牵引丝因机械性能优异得到普遍研究。它被称为蜘蛛的生命线，当蜘蛛突然坠落地面时牵引丝的强度足以承受蜘蛛自身重量，从而避免受到伤害。然而，由于天然蛛丝的产量较低且蜘蛛无法像家蚕一样进行群体饲养，人造蛛丝纤维制备主要通过表达重组蛛丝蛋白并进行人工纺丝来实现。十字园蛛大壶腹腺牵引丝特有的两种蛛丝蛋白ADF3和ADF4与力学性能密切相关。目前已有多个研究报道了通过细菌表达系统制备重组ADF3或ADF4蛋白并利用重组蛋白进行纤维制备。
但是，重组蛋白纤维的力学性能与天然蛛丝相比仍有较大差距。主要原因有以下两方面：1)天然蜘蛛丝蛋白的核心结构域由富含甘氨酸和丙氨酸的高度重复的序列组成。在用异源宿主进行表达时面临着序列不稳定、表达量低、高级结构形成困难(形成包涵体)等问题。2)天然蜘蛛丝的成丝机理和纺丝过程极其复杂，目前尚无法实现体外模拟。因此人工纺丝过程与蜘蛛生理条件相差甚远。总而言之，目前生产的重组蛛丝纤维由于机械性能差、产量低很难用于实际用途。因此，开发用于仿生纤维生产的新型重组蛛丝蛋白，同时通过调控纺丝工艺获得可媲美天然蛛丝的蛋白纤维，具有十分重要的意义。
发明内容
技术问题
有鉴于此，本发明要解决的技术问题是，如何提供重组嵌合蛛丝蛋白、生物蛋白纤维、生物蛋白纤维的制备方法，及它们的应用。
本发明通过添加ELP序列可以使重组嵌合蛛丝蛋白可以在细菌表达系统中实现稳定高效及可溶性表达，通过醛基交联可以显著提升人造纤维的机械性能。
解决方案
为解决以上技术问题，本发明提供如下技术方案：
第一方面，本发明提供重组嵌合蛛丝蛋白，其为下述A1)～A4)蛋白中任一种：
A1)其氨基酸序列包括：m个直接串联的表现形式如[C-ELP]所示的氨基酸序列单元，其中，C为如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列，ELP为类弹性蛋白序列，[C–ELP]表示C序列和ELP序列串联；m表示[C–ELP]序列串联的重复数，m为2-36之间的整数；
A2)其氨基酸序列包括：在A1)中相邻的氨基酸序列单元之间连有连接序列，可选地，连接序列包括两个或四个氨基酸；可选地，所述连接序列为同尾的不同酶切位点酶切后再连接后编码的两个、四个氨基酸；可选地，连接序列为两个氨基酸；可选地，连接序列可以为TS(其为同尾的酶切位点SpeI(A/CTAGT)酶切后的尾部和NheI(G/CTAGC)酶切后的头部，再次连接后(ACTAGC)的编码氨基酸)，由于多个重复单元直接合成具有一定的难度，以酶切位点的方式连接重复单元时就会产生这种连接序列，而且酶切位点是可以根据需求选择的，即TS也可以替换成其它因更换酶切位点产生的序列，一般来说两个氨基酸或四个氨基酸均可以；
A3)其氨基酸序列包括：A1)或A2)所示的氨基酸序列经过一个、两个或以上氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与A1)所示的蛋白质具有相同或相近性质的氨基酸序列；
A4)其氨基酸序列包括：在A1)或A2)或A3)的C端引入天然蛛丝羧基结构域CTD；
A5)其氨基酸序列包括：在A1)或A2)或A3)或A4)的N端和/或C端引入组氨酸标签。
SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列如下：
GSSAAAAAAAASGPGGYGPENQGPSGPGGYGPGGP
进一步地，m为8-24之间的整数，可选地为8-16之间的整数，可选地为10-14之间的整数，可选地为12；
进一步地，ELP的氨基酸序列包含若干如SEQ ID NO:2：VPGXG所示的氨基酸序列串联而成的氨基酸序列，表现形式为(VPGXG)i(即，类弹性蛋白以VPGXG为重复单元)，其中，X为赖氨酸或精氨酸或其它氨基酸，可选地X为赖氨酸；i为SEQ ID NO:2序列串联的重复数，i为1-40之间的整数，可选地i为3-10之间的整数，可选地i为3-8之间的整数，可选地i为4-6之间的整数，可选地i为5。
故，A1)中，氨基酸序列的表现形式为[GSSAAAAAAAASGPGGYGPENQGPSGPGGYGPGGP-(VPGKG)j]m，m表示C-ELP序列(GSSAAAAAAAASGPGGYGPENQGPSGPGGYGPGGP-(VPGKG)j)串联的重复数，m为1-36之间的整数，可选地，m为8-24之间的整数，可选地为8-16之间的整数，可选地为10-14之间的整数，可选地为12；i为1-40之间的整数，可选地i为3-10之间的整数，可选地i为3-8之间的整数，可选地i为4-6之间的整数，可选地i为5。
进一步地，氨基酸序列单元的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示，
GSSAAAAAAAASGPGGYGPENQGPSGPGGYGPGGPVPGKGVPGKGVPGKGVP GKGVPGKG
A1)～A5)蛋白可以如下表述：
A1)其氨基酸序列包括：m个直接串联的氨基酸序列单元，所述氨基酸序列单元的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示；直接串联时可以采用人工合成方式，或其它可实现的连接方式；
A2)其氨基酸序列包括：在A1)中相邻的氨基酸序列单元之间连有连接序列，可选地，连接序列包括两个或四个氨基酸(即相邻的如SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列单元中有两个或四个氨基酸)；可选地，所述连接序列为同尾的不同酶切位点酶切后再连接产生的两个、四个氨基酸；可选地，连接序列为两个氨基酸；可选地，连接序列可以为TS(其为同尾的酶切位点SpeI(A/CTAGT)酶切后的尾部和NheI(G/CTAGC)酶切后的头部，再次连接后(ACTAGC)的编码氨基酸)，由于多个重复单元直接合成具有一定的难度，以酶切位点的方式连接重复单元时就会产生这种连接序列，而且酶切位点是可以根据需求选择的，即TS也可以替换成其它因更换酶切位点产生的序列，一般来说两个氨基酸或四个氨基酸均可以；
A3)其氨基酸序列包括：A1)或A2)所示的氨基酸序列经过一个、两个或以上氨基酸残基的取代和/或缺失得到的与A1)或A2)所示的蛋白质具有相同或相近性质的氨基酸序列；
A4)其氨基酸序列包括：在A1)或A2)或A3)的C端引入天然蛛丝羧基结构域CTD；
A5)其氨基酸序列包括：在A1)或A2)或A3)或A4)的N端和/或C端引入组氨酸标签。
进一步地，A3)蛋白中，天然蛛丝的羧基结构域(CTD)包含如SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列。
SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列如下：
GAASAAVSVGGYGPQSSSAPVASAAASRLSSPAASSRVSSAVSSLVSSGPTNQAALSNTISSVVSQVSASNPGLSGCDVLVQALLEVVSALVSILGSSSIGQINYGASAQYTQMVGQSVAQALAG
进一步地，所述重组嵌合蛛丝蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示；或，
所述重组嵌合蛛丝蛋白的氨基酸序列为如SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列经过一个、两个或以上氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与SEQ ID NO:5所示的蛋白质具有相同或相近性质的氨基酸序列。
SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列如下：
MASGSSAAAAAAAASGPGGYGPENQGPSGPGGYGPGGPVPGKGVPGKGVPGKGVPGKGVPGKGTSGSSA AAAAAAASGPGGYGPENQGPSGPGGYGPGGPVPGKGVPGKGVPGKGVPGKGVPGKGTSGSSAAAAAAAASGPGGYGP ENQGPSGPGGYGPGGPVPGKGVPGKGVPGKGVPGKGVPGKGTSGSSAAAAAAAASGPGGYGPENQGPSGPGGYGPGG PVPGKGVPGKGVPGKGVPGKGVPGKGTSGSSAAAAAAAASGPGGYGPENQGPSGPGGYGPGGPVPGKGVPGKGVPGKGVPGKGVPGKGTSGSSAAAAAAAASGPGG
YGPENQGPSGPGGYGPGGPVPGKGVPGKGVPGKGVPGKGVPGKGTSGSSAAAAAA
AASGPGGYGPENQGPSGPGGYGPGGPVPGKGVPGKGVPGKGVPGKGVPGKGTSGSS
AAAAAAAASGPGGYGPENQGPSGPGGYGPGGPVPGKGVPGKGVPGKGVPGKGVPG
KGTSGSSAAAAAAAASGPGGYGPENQGPSGPGGYGPGGPVPGKGVPGKGVPGKGVP
GKGVPGKGTSGSSAAAAAAAASGPGGYGPENQGPSGPGGYGPGGPVPGKGVPGKG
VPGKGVPGKGVPGKGTSGSSAAAAAAAASGPGGYGPENQGPSGPGGYGPGGPVPGK
GVPGKGVPGKGVPGKGVPGKGTSGSSAAAAAAAASGPGGYGPENQGPSGPGGYGP
GGPVPGKGVPGKGVPGKGVPGKGVPGKGTSGAASAAVSVGGYGPQSSSAPVASAA
ASRLSSPAASSRVSSAVSSLVSSGPTNQAALSNTISSVVSQVSASNPGLSGCDVLVQAL
LEVVSALVSILGSSSIGQINYGASAQYTQMVGQSVAQALAGTS
其中，TS为同尾的酶切位点SpeI(A/CTAGT)酶切后的尾部和NheI(G/CTAGC)
酶切后的头部，再次连接后(ACTAGC)的编码氨基酸，由于多个重复单元直接合成具有一定的难度，以酶切位点的方式连接重复单元时就会产生这种连接序列，而且酶切位点是可以根据需求选择的，即TS也可以替换成其它因更换酶切位点产生的序列，一般来说两个氨基酸或四个氨基酸均可以。该连接序列的变化对蛋白的结构、功能影响较小。
进一步地，其通过含有重组表达载体的表达细胞诱导表达获得。
进一步地，所述重组表达载体为含有编码重组嵌合蛛丝蛋白的基因的pET25b表达质粒。
进一步地，所述表达细胞为大肠杆菌，可选地，所述表达细胞为大肠杆菌E.coliBLR(DE3)。
进一步地，通过IPTG诱导表达。
第二方面，提供一种生物蛋白纤维，包括第一方面所述的重组嵌合蛛丝蛋白，可选地，所述生物蛋白纤维通过第一方面所述的重组嵌合蛛丝蛋白经醛基交联获得；
可选地，醛基交联包括：第一方面所述的重组嵌合蛛丝蛋白在醛基交联剂中预交联，在含有醛基交联剂的凝固浴中纺丝成型。
第三方面，提供一种第二方面所述的生物蛋白纤维的制备方法，包括：
1)将第一方面所述的重组嵌合蛛丝蛋白溶于溶剂中制备纺丝溶液；
2)将1)中的蛋白溶液利用注射泵将所述蛋白溶液挤出到凝固浴中固化成初生纤维。
进一步地，步骤1)中，所述溶剂为甲酸溶液，溶解蛋白后获得蛋白甲酸溶液；可选地，为98％甲酸溶液(98％甲酸溶液一般是指纯甲酸)。
进一步地，步骤1)中，蛋白甲酸溶液还加入醛基交联剂进行预交联获得纺丝溶液，可选地，醛基交联剂溶液按0.05-0.1％(优选为0.05％)体积比加入到蛋白甲酸溶液进行预交联；可选地醛基交联剂为戊二醛溶液；可选地，可选地醛基交联剂为体积分数50％戊二醛溶液。
进一步地，步骤2)中，凝固浴为含有醛基交联剂的凝固浴；可选地，凝固浴为含有1-4％体积比醛基交联剂的凝固浴；可选地，凝固浴为含有1％体积比醛基交联剂的甲醇凝固浴；可选地，凝固浴为含有戊二醛的凝固浴；可选地，凝固浴为含有1％戊二醛的凝固浴；可选地，凝固浴为含有1％体积比戊二醛的甲醇凝固浴；可选地，凝固浴中，甲醇的体积分数为80～100％，可选地为90％。
进一步地，步骤1)中，蛋白甲酸溶液，蛋白溶液中的质量分数为150～200mg/mL。
进一步地，还包括对初生纤维的后拉伸：将初生纤维浸泡在拉伸浴中变软后，将其拉伸至原长的2～5倍，得后拉伸纤维；可选地，拉伸浴为0～80％的甲醇溶液，可选地拉伸浴为30～80％的甲醇溶液，可选地拉伸浴为40～60％的甲醇溶液，可选地拉伸浴为50％的甲醇溶液。
第四方面，提供与第一方面所述重组嵌合蛛丝蛋白、或第二方面所述的生物蛋白纤维或第三方面所述的制备方法制备的生物蛋白纤维相关的生物材料，所述生物材料为B1)至B4)中的任一种：
B1)编码第一方面所述的重组嵌合蛛丝蛋白的核酸分子；
B2)含有B1)所述核酸分子的表达盒；
B3)含有B1)所述核酸分子的重组载体，或含有B2)所述表达盒的重组载体；可选地，所述重组载体采用pET25b质粒或pbluescript II ks质粒；
B4)含有B1)所述核酸分子的表达细胞，或含有B2)所述表达盒的表达细胞，或含有B3)所述重组载体的表达细胞；可选地，所述表达细胞为重组大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、哺乳动物细胞、酵母细胞或昆虫细胞；可选地，所述表达细胞为大肠杆菌，可选地，所述表达细胞为大肠杆菌E.coli BLR(DE3)。
第五方面，提供一种第一方面所述的重组嵌合蛛丝蛋白或第二方面所述的生物蛋白纤维或第三方面所述的制备方法制备的生物蛋白纤维或第四方面所述的生物材料的用途，所述用途包括以下C1)至C5)中的任一种或几种：
C1)航天航空领域、军事领域或制备生物材料；
C2)纸产品；
C3)薄膜；
C4)纺织品；
C5)涂层。
有益效果
(1)本发明从仿生角度出发，利用基因工程技术，设计了一种重组嵌合蛛丝蛋白，利用天然蜘蛛牵引丝蛋白部分序列和类弹性蛋白序列进行融合，利用大肠杆菌表达系统时提高可溶性表达(可溶性表达可达20mg/L)，制备的蛋白纤维具有较好的强度和韧性，为开发高强高韧的蛋白纤维提供了新方法。
(2)本发明的生物蛋白纤维综合力学性能超过了许多重组蛛丝、重组蚕丝，尤其在韧性方面，可达到天然蜘蛛牵引丝的2-3倍。
(3)本发明的纺丝工艺简便，易重复，纤维可以得到充分交联，且经过后拉伸之后更为长程有序。
(4)本发明所用醛基交联剂交联速度快，且便宜易得，适用于这种带有赖氨酸的融合蛋白，有助于实现蛋白纤维的大批量制备。
上述说明仅为本发明技术方案的概述，为了能够更清楚地了解本发明的技术手段并可依据说明书的内容予以实施，同时为了使本发明的上述和其他目的、技术特征以及优点更加易懂，以下列举一个或多个优选实施例，并配合附图详细说明如下。
附图说明
一个或多个实施例通过与之对应的附图中的图片进行示例性说明，这些示例性说明并不构成对实施例的限定。在这里专用的词“示例性”意为“用作例子、实施例或说明性”。这里作为“示例性”所说明的任何实施例不必解释为优于或好于其它实施例。
图1.本发明的实施例1的重组嵌合蛋白多聚体表达载体构建示意图；
图2.本发明的实施例2的重组表达载体的SDS凝胶电泳图，其中，(A)为表达载体pET25b-CK5-[C-ELP]12-CTD表达的上清液及各纯化步骤的电泳图，其中，Ni流穿代表流经镍柱后收集的样品，Ni-1、Ni-2代表Ni亲和层析纯化后的蛋白，SP代表阳离子交换柱纯化后的蛋白，除盐代表分子筛纯化的蛋白；(B)为表达载体pET25b-CK5-[C-ELP]24-CTD表达的上清液及各纯化步骤的电泳图，其中，Ni流穿代表流经镍柱后收集的样品，Ni代表Ni亲和层析纯化后的蛋白，SP流穿代表流经阳离子交换柱后收集的样品，SP代表阳离子交换柱纯化后的蛋白，除盐代表分子筛纯化的蛋白；与(A)相比，(B)的目的蛋白纯度不够，有较多的杂蛋白；(C)为表达载体pET25b-CE5-[C-ELP]12-CTD菌筛的表达蛋白情况，在这里ELP序列中VPGKG变成VPGEG，“25b”为含有pET25b空载体的菌破碎后溶液，“上”代表上清液，“全”代表菌破碎后离心取上清；(D)为表达载体pET25b-CK5-[C-ELP]12-CTD菌筛的表达蛋白情况，“25b”为pET25b代表空载体的菌破碎后溶液，“上”代表上清液，“全”代表菌破碎后离心取上清。
图3.本发明实施例3的[C-ELP]12-CTD蛋白的二聚体纯化后SDS凝胶电泳图形成情况，其中，CK5-CTD代表表达的CK5-[C-ELP]12-CTD融合蛋白，CK5代表表达的CK5-[C-ELP]12融合蛋白(没有羧基结构域CTD)。
图4.本发明使用的纺丝装置示意图。
图5.本发明的实施例4的CK5-[C-ELP]12-CTD蛋白的拉伸前的力学性能；
图6.本发明的实施例4的CK5-[C-ELP]12-CTD蛋白的拉伸后的力学性能；
图7.本发明的实施例5醛基交联的CK5-[C-ELP]12-CTD蛋白的拉伸前的力学性能；
图8.本发明的实施例5醛基交联的CK5-[C-ELP]12-CTD蛋白的拉伸后的力学性能；
图9.本发明的实施例5的醛基交联的CK5-[C-ELP]24-CTD蛋白拉伸前后的力学性能，A为拉伸前，B为拉伸后。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
另外，为了更好的说明本发明，在下文的具体实施方式中给出了众多的具体细节。本领域技术人员应当理解，没有某些具体细节，本发明同样可以实施。在一些实施例中，对于本领域技术人员熟知的原料、方案、方法、手段等未作详细描述，以便于凸显本发明的主旨。
除非另有其它明确表示，否则在整个说明书和权利要求书中，术语“包括”或其变换如“包含”或“包括有”等等将被理解为包括所陈述的元件或组成部分，而并未排除其它元件或其它组成部分。
以下实施例中，力学性能检测的检测方法为：
采用纤维拉伸仪进行纤维力学性能测试。对所有原纤维测试时，拉伸速度为6mm/min，夹距间距离为3mm，检测纤维断裂强度、韧性和延展性，其中：
断裂强度为断裂时的拉伸的应力除以横截面，应力直接从机器中获取，横截面积利用圆形公式。
以下实施例中，纤维韧性检测的检测方法为：韧性为应力-应变曲线包围的面积。应力，应变直接从机器中获取。
延展性为从机器中直接读取橫坐标为延展性。
实施例1：表达载体构建
表达载体的构建方式如图1所述：
1)构建基因元件1：按如下顺序串联而成的编码序列：NdeI+NheI+[C-ELP]氨基酸序列单元的编码序列+SpeI+(CAC)6+TAATGA+EcoRI，其中，[C-ELP]氨基酸序列单元的编码序列为SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列的编码序列，NdeI酶切位点为CATATG、NheI酶切位点为GCTAGC、SpeI酶切位点为ACTAGT、(CAC)6为组氨酸标签序列、TAATGA为终止密码子和EcoRI酶切位点为GAATTC，基因元件1采用人工合成，例如苏州金唯智公司。
2)基因元件2的获得：将基因元件1和pbluescript II ks质粒(市售，在这里简称m13)通过NheI和SpeI双酶切，连接，获得嵌合蛋白单体载体，简称m13-单体；将m13-单体通过NheI和SpeI双酶切获得基因元件2。
3)嵌合蛋白二聚体载体(简称m13-二聚体载体)的获得：将基因元件2与经过NheI酶切的m13-单体，在T4连接酶(购自TaKaRa公司)作用下，获得嵌合蛋白二聚体载体(简称m13-二聚体载体)。其中，基因元件2尾部的SpeI粘性末端与m13-单体线性片段的NheI粘性末端连接，连接处变成ACTAGC(编码的氨基酸序列为TS)。
4)嵌合蛋白四聚体载体(简称m13-四聚体载体)的获得：通过NheI和SpeI双酶切从m13-二聚体上获得嵌合蛋白二聚体基因片段(嵌合蛋白二聚体基因片段可表示为：NheI粘性末端+C-ELP蛋白单元的编码序列+ACTAGC+C-ELP蛋白单元的编码序列+SpeI粘性末端)，嵌合蛋白二聚体基因片段与经过NheI酶切的m13-二聚体，在T4连接酶作用下，获得嵌合蛋白四聚体载体(简称m13-四聚体载体)。
嵌合蛋白四聚体载体(简称m13-四聚体载体)经NheI和SpeI双酶切获得的嵌合蛋白四聚体基因片段可以表示为：NheI粘性末端+C-ELP蛋白单元的编码序列+ACTAGC+C-ELP蛋白单元的编码序列+ACTAGC+C-ELP蛋白单元的编码序列+ACTAGC+C-ELP蛋白单元的编码序列+SpeI粘性末端。
5)按照上述方式可不断获得嵌合蛋白八聚体载体(简称m13-八聚体载体)、嵌合蛋白十二聚体载体(简称m13-十二聚体载体)、嵌合蛋白二十四聚体载体(简称m13-二十四聚体载体)等多聚体载体(统称m13-多聚体载体)，再通过NdeI和EcoRI双酶切分别连接到pET25b质粒上，形成pET25b-[C-ELP]m多聚体表达载体，准备转入到大肠杆菌BLR(DE3)(可市售获得)表达系统进行IPTG诱导表达。
根据[C-ELP]氨基酸序列单元的数量不同，获得多种表达载体，包括：以编码SEQID NO:3所示的氨基酸序列的基因序列为[C-ELP]氨基酸序列单元构成的十二聚体表达载体pET25b-CK5-[C-ELP]12(相邻的如SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列之间有连接序列，连接序列的氨基酸序列可以为TS)、二十四聚体表达载体pET25b-CK5-[C-ELP]24(相邻的如SEQID NO:3所示的氨基酸序列之间有连接序列，连接序列的氨基酸序列可以为TS)。
为优化蛋白，将CTD片段(SpeI+SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列+SpeI)用SpeI酶切，再将m13-多聚体载体用SpeI酶单酶切，在T4连接酶作用下，获得带CTD序列的m13-多聚体载体；再通过NdeI和EcoRI双酶切连接到pET25b质粒上，形成表达载体pET25b-[C-ELP]m-CTD(SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列和SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列之间可以有连接序列TS)。
按上述方法制备，十二聚体表达载体pET25b-CK5-[C-ELP]12加上羧基结构域CTD片段，形成表达载体pET25b-CK5-[C-ELP]12-CTD。转入到大肠杆菌BLR(DE3)(可市售获得)表达系统进行IPTG诱导表达，表达获得CK5十二聚蛋白-CTD，表示为CK5[C-ELP]12-CTD蛋白，其含有如SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列。
按上述方法制备，二十四聚体表达载体pET25b-CK5-[C-ELP]24加上羧基结构域CTD片段，形成表达载体pET25b-CK5-[C-ELP]24-CTD。转入到大肠杆菌BLR(DE3)(可市售获得)表达系统进行IPTG诱导表达，表达获得CK5[C-ELP]24-CTD蛋白。
将SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列的中的“VPGKG”替换为“VPGEG”，将其的编码序列参照上述方法获得表达载体pET25b-CE5-[C-ELP]12-CTD，表达获得CE5[C-ELP]12-CTD蛋白。
实施例2：蛋白表达、纯化及检测
将表达载体转化到大肠杆菌感受态细胞E.coli BLR(DE3)。挑取阳性克隆在10mlLB培养基(100μg/ml氨苄西林)中培养8-12小时(37℃，220rpm)，摇瓶体积为100ml，待菌液OD600至3-4时，将其转移至含10ml TB培养基(200μg/ml氨苄西林)摇瓶(体积为100ml)中培养2-2.5小时后(37℃，220rpm)，待菌液OD600至3-4时添加诱导剂IPTG至终浓度为1mM，诱导蛋白大量表达，发酵培养过夜(28.5℃，220rpm)将菌液离心(7000g,20min,4℃)，将菌体保存在-80℃。菌体超声破碎后离心(11000g,30min,4℃)取上清，上清液依次经过Ni亲和层析、阳离子交换层析和分子筛层析进行精细纯化，上清液经各纯化步骤的蛋白进行SDS凝胶电泳检测和分析。
表达载体pET25b-CK5-[C-ELP]12-CTD表达后的上清液及各纯化步骤的SDS凝胶电泳检测和分析如图2A所示。表明能够纯化获得较纯的目标蛋白。表达的蛋白记为CK5[C-ELP]12-CTD蛋白。
表达载体pET25b-CK5-[C-ELP]24-CTD表达后的上清液及各纯化步骤的SDS凝胶电泳检测和分析如图2B所示。表明目的蛋白纯度不够，有较多的杂蛋白。表达的蛋白记为CK5[C-ELP]24-CTD蛋白，说明不是[C-ELP]的重复数越多越好，重复数m优选为8～24个[C-ELP]单元，更优选为8-16个，更优选为10-14个，一般来说，数量相近的多聚体的性能较接近。
表达载体pET25b-CE5-[C-ELP]12-CTD菌筛的表达后的SDS凝胶电泳检测和分析如图2C所示，与空载体25b相比，没有差别条带，说明蛋白不表达(目标蛋白理论分子量64.28kDa)，或者表达量低，看不出来。
表达载体pET25b-CK5-[C-ELP]12-CTD菌筛的表达后的SDS凝胶电泳检测和分析如图2D所示，与空载体25b相比，有差别条带(目标蛋白理论分子量64.28kDa)，说明目的蛋白表达。
将多聚体嵌合蛋白水溶液进行真空冷冻干燥，冻干后于-80℃保存备用。
本发明表达载体pET25b-CK5-[C-ELP]12-CTD菌筛的目的蛋白可溶性表达可达20mg/L)。
本发明还参照上述方法制备了不含类弹性蛋白的重组表达载体pET25b-[C]12-CTD(C为氨基酸序列单元，其为编码SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列的基因序列，且相邻的如SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列之间有连接序列TS)，菌筛实验中也没有目的蛋白表达，或表达量较低。
实施例3：蛋白样品的检测
参照实施例1-2的制备方式对CK5-[C-ELP]12-CTD蛋白进行纯化，CTD中含有半胱氨酸可促进蛋白分子二聚化，用SDS凝胶电泳检测和分析蛋白二聚体形成情况(如图3所示)，带CTD的CK5-[C-ELP]12-CTD的融合蛋白形成上下两个条带，没有CTD的CK5-[C-ELP]12融合蛋白形成一个条带，说明带有CTD的融合蛋白形成了二聚体。
实施例4：非交联蛋白纤维的制备
将嵌合蛋白溶于纯甲酸(98％)中，蛋白终浓度为150mg/ml，再将蛋白溶液用注射器挤入90％甲醇水溶液(凝固浴)中，并用注射泵调节推进速度为5μl/min，用转筒收集器以线速度为0.6m/min的速度来收集纤维(方法如图4所示)。将收集到的纤维晾干，直接测试其力学性能，CK5-[C-ELP]12-CTD的拉伸前的力学性能如图5所示，强度：220.8±47MPa，韧性：538.4±59.77MJ/m3。或将其至于50％甲醇中浸泡至纤维变软，随后将纤维取出立即后拉伸至原长的200％，记为蛋白纤维1，对制备的纤维进行力学性能检测，CK5-[C-ELP]12-CTD的拉伸后的力学性能如图6所示，强度：326.66±10.99MPa,韧性134.21±22.42MJ/m3。
实施例5：醛基交联蛋白纤维的制备
将50％戊二醛按照0.05％体积比加入到0.2ml的C-ELP-CTD蛋白甲酸溶液(150mg/ml)中，交联0.5小时。将经过预交联后的蛋白溶液用注射器挤入1％戊二醛甲醇溶液(凝固浴)中，并用注射泵调节推进速度为5μl/min，用转筒收集器以线速度为0.6m/min的速度来收集纤维。将收集到的纤维晾干，记为蛋白纤维2，测试其力学性能，醛基交联的CK5-[C-ELP]12-CTD蛋白的拉伸前的力学性能如图7，强度：239.89±42.99MPa，韧性：417.67±76.16MJ/m3；或将其至于50％甲醇中浸泡至纤维变软，随后将纤维取出立即后拉伸至原长的80％，对制备的纤维进行力学性能检测，醛基交联的CK5-[C-ELP]12-CTD蛋白的拉伸后的力学性能如图8，强度：422.994±12.76MPa，韧性：452.376±61.06MJ/m3。
按如上方法制备CK5-[C-ELP]24-CTD蛋白的蛋白纤维，拉伸前的力学性能如图9A所示，图9A表明，拉伸前强度：201.42±23.79MPa、韧性：253.1±51.33MJ/m3；拉伸后的力学性能如图9B所示，拉伸后强度：342.58±15.24MPa、韧性：143.58±24.52MJ/m3。综合性能比CK5-[C-ELP]12-CTD蛋白纤维略差。
实施例6：本发明制备的蛋白纤维与其它产品的性能对比
本发明采用带CTD的12聚重组嵌合蛛丝蛋白纤维，与天然蛛丝纤维、其他重组蛛丝蛋白纤维、蛛丝蛋白复合物在断裂强度、韧性和延展性方面的对比(表1)；
其中，天然牵引丝1-3的断裂强度、韧性和延展性数据来源与文献：Li,J.T.；Li,S.T.；Huang,J.Y.；Khan,A.Q.；An,B.G.；Zhou,X.；Liu,Z.F.；Zhu,M.F.Spider Silk-Inspired Artificial Fibers.Adv.Sci.2022,9,e2103965.
天然牵引丝4的断裂强度、韧性和延展性数据来源于文献：Heim,M.；Keerl,D.；Scheibel,T.Spider Silk:From Soluble Protein to ExtraordinaryFiber.Angew.Chem.Int.Ed.2009,48,3584-3596.
重组蛛丝蛋白1的断裂强度、韧性和延展性数据来源于文献：An,B.；Hinman,M.B.；Holland,G.P.；Yarger,J.L.；Lewis,R.V.J.B.Inducingβ-sheets formation insynthetic spider silk fibers by aqueous post-spin stretching.Biomacromolecules.2011,12,2375-2381.
重组蛛丝蛋白2的断裂强度、韧性和延展性数据来源于文献：Adrianos S L.；Teule F.；Hinman M B.；Jones J A.；Weber W S.et al.Nephila clavipes Flagelliformsilk-like GGX motifs contribute to extensibility and spacer motifs contributeto strength in synthetic spider silk fibers.Biomacromolecules,2013,14(6):1751-1760.
重组蛛丝蛋白3的断裂强度、韧性和延展性数据来源于文献：Heidebrecht,A.；Eisoldt,L.；Diehl,J.；Schmidt,A.；Geffers,M.；Lang,G.；Scheibel,T.Biomimeticfibers made of recombinant spidroins with the same toughness as naturalspider silk.Adv.Mater.2015,27,2189-2194.
重组蛛丝蛋白4的断裂强度、韧性和延展性数据来源于文献：Zhou Y Z.；RisingA.；Johansson J.；Meng Q.Production and Properties of Triple ChimericSpidroins.Biomacromolecules,2018,19,2825–2833
重组蛛丝蛋白5的断裂强度、韧性和延展性数据来源于文献：Andersson,M.；Jia,Q.；Abella,A.；Lee,X.Y.；Landreh,M.；Purhonen,P.；Hebert,H.；Tenje,M.；Robinson,C.V.；Meng,Q.et al.Biomimetic spinning of artificial spider silk from achimeric minispidroin.Nat.Chem.Biol.2017,13,262-264.
蛛丝复合纤维数据来源于文献：Fang G Q.；Zheng Z K.；Yao J R.；Chen M.etal.Tough protein–carbon nanotube hybrid fibers comparable to natural spidersilks.J.Mater.Chem.B,2015,3,3940-3947.
表1实施例重组蛛丝蛋白纤维与天然蛛丝及其他重组蛛丝蛋白纤维对比
由上表可以看出，本发明生物蛋白纤维韧性优于其他重组蛛丝蛋白纤维和蛛丝复合纤维，甚至达到天然蛛丝牵引丝的2-3倍，尤其是本发明通过醛基交联的蛋白纤维2的断裂强度和韧性的综合性能优良，为制备柔韧性材料，例如可穿戴的织物带来了可能。
前述对本发明的具体示例性实施方案的描述是为了说明和例证的目的。这些描述并非想将本发明限定为所公开的精确形式，并且很显然，根据上述教导，可以进行很多改变和变化。对示例性实施例进行选择和描述的目的在于解释本发明的特定原理及其实际应用，从而使得本领域的技术人员能够实现并利用本发明的各种不同的示例性实施方案以及各种不同的选择和改变。针对上述示例性实施方案所做的任何简单修改、等同变化与修饰，都应落入本发明的保护范围。
Claims (10)
1.重组嵌合蛛丝蛋白，其为下述A1)～A5)蛋白中任一种：
A1)其氨基酸序列包括：m个直接串联的表现形式如[C-ELP]所示的氨基酸序列单元，其中，C为如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列，ELP为类弹性蛋白序列，[C–ELP]表示C序列和ELP序列串联；m表示[C–ELP]序列串联的重复数，m为2-36之间的整数；
A2)其氨基酸序列包括：在A1)中相邻的氨基酸序列单元[C-ELP]之间连有连接序列，可选地，连接序列包括两个或四个氨基酸；
A3)其氨基酸序列包括：A1)或A2)所示的氨基酸序列经过一个、两个或以上氨基酸残基的取代和/或缺失得到的与A1)所示的蛋白质具有相同或相近性质的氨基酸序列；
A4)其氨基酸序列包括：在A1)或A2)或A3)的C端引入天然蛛丝羧基结构域CTD；
A5)其氨基酸序列包括：在A1)或A2)或A3)或A4)的N端和/或C端引入组氨酸标签。
2.根据权利要求1所述的重组嵌合蛛丝蛋白，其特征在于，m为8-24之间的整数，可选地为8-16之间的整数，可选地为10-14之间的整数，可选地为12；
和/或，ELP的氨基酸序列包含若干如SEQ ID NO:2：VPGXG所示的氨基酸序列串联而成的氨基酸序列，表现形式为(VPGXG)i，其中，X为赖氨酸或精氨酸或其它氨基酸，可选地X为赖氨酸；i为SEQ ID NO:2序列串联的重复数，i为1-40之间的整数，可选地i为3-10之间的整数，可选地i为3-8之间的整数，可选地i为4-6之间的整数，可选地i为5；
可选地，氨基酸序列单元的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示。
3.根据权利要求1或2所述的重组嵌合蛛丝蛋白，其特征在于，A3)蛋白中，天然蛛丝的羧基结构域包含如SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列；
和/或，A2)蛋白中，所述连接序列为同尾的不同酶切位点酶切后再连接后编码的两个或四个氨基酸。
4.根据权利要求1至3任一所述的重组嵌合蛛丝蛋白，其特征在于，其氨基酸序列如SEQID NO:5所示；或，
其为如SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列经过一个、两个或以上氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与SEQ ID NO:5所示的蛋白质具有相同或相近性质的氨基酸序列。
5.根据权利要求1至4任一所述的重组嵌合蛛丝蛋白，其特征在于，其通过含有重组表达载体的表达细胞诱导表达获得；
可选地，所述重组表达载体为含有编码重组嵌合蛛丝蛋白的基因的pET25b表达质粒；
可选地，所述表达细胞为大肠杆菌，可选地，所述表达细胞为大肠杆菌E.coli BLR(DE3)；
可选地，通过IPTG诱导表达。
6.一种生物蛋白纤维，其特征在于，包括权利要求1至5任一所述的重组嵌合蛛丝蛋白，可选地，所述生物蛋白纤维通过权利要求1至5任一所述的重组嵌合蛛丝蛋白经醛基交联获得；
可选地，醛基交联包括：权利要求1至5任一所述的重组嵌合蛛丝蛋白在醛基交联剂中预交联，在含有醛基交联剂的凝固浴中纺丝成型。
7.一种权利要求6所述的生物蛋白纤维的制备方法，其特征在于，包括：
1)将权利要求1至5任一所述的重组嵌合蛛丝蛋白溶于溶剂中制备纺丝溶液；
2)将1)中的蛋白溶液利用注射泵将所述蛋白溶液挤出到凝固浴中固化成初生纤维。
8.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，步骤1)中，所述溶剂为甲酸溶液，溶解蛋白后获得蛋白甲酸溶液；可选地，为98％甲酸溶液；可选地，蛋白浓度为150～200mg/mL，可选地为150mg/mL；
可选地，步骤1)中，蛋白甲酸溶液还加入醛基交联剂进行预交联获得纺丝溶液，可选地，醛基交联剂溶液按0.05-0.1％体积比加入到蛋白甲酸溶液进行预交联；可选地醛基交联剂为戊二醛溶液；可选地，可选地醛基交联剂为体积分数50％戊二醛溶液；
可选地，步骤1)中，蛋白甲酸溶液，蛋白溶液中的质量分数为150～200mg/mL；
和/或，步骤2)中，凝固浴为含有醛基交联剂的凝固浴；可选地，凝固浴为含有1-4％体积比醛基交联剂的凝固浴；可选地，凝固浴为含有1％体积比醛基交联剂的甲醇凝固浴；可选地，凝固浴为含有戊二醛的凝固浴；可选地，凝固浴为含有1％戊二醛的凝固浴；可选地，凝固浴为含有1％体积比戊二醛的甲醇凝固浴；可选地，凝固浴中，甲醇的体积分数为80～100％，可选地为90％；
和/或，还包括对初生纤维的后拉伸：将初生纤维浸泡在拉伸浴中变软后，将其拉伸至原长的2～5倍，得后拉伸纤维；可选地，拉伸浴为0～80％的甲醇溶液，可选地拉伸浴为30～80％的甲醇溶液，可选地拉伸浴为40～60％的甲醇溶液，可选地拉伸浴为50％的甲醇溶液。
9.与权利要求1至5任一项所述重组嵌合蛛丝蛋白、或权利要求6所述的生物蛋白纤维或权利要求7或8所述的制备方法制备的生物蛋白纤维相关的生物材料，其特征在于，所述生物材料为B1)至B4)中的任一种：
B1)编码权利要求1至5任一所述的重组嵌合蛛丝蛋白的核酸分子；
B2)含有B1)所述核酸分子的表达盒；
B3)含有B1)所述核酸分子的重组载体，或含有B2)所述表达盒的重组载体；可选地，所述重组载体采用pET25b质粒或pbluescript II ks质粒；
B4)含有B1)所述核酸分子的表达细胞，或含有B2)所述表达盒的表达细胞，或含有B3)所述重组载体的表达细胞；可选地，所述表达细胞为重组大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、哺乳动物细胞、酵母细胞或昆虫细胞；可选地，所述表达细胞为大肠杆菌，可选地，所述表达细胞为大肠杆菌E.coli BLR(DE3)。
10.一种权利要求1至5任一所述的重组嵌合蛛丝蛋白或权利要求6所述的生物蛋白纤维或权利要求7或8所述的制备方法制备的生物蛋白纤维或权利要求9所述的生物材料的用途，所述用途包括以下C1)至C5)中的任一种或几种：
C1)航天航空领域、军事领域或制备生物材料；
C2)纸产品；
C3)薄膜；
C4)纺织品；
C5)涂层。
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