CN118207650A - 稀土离子调控的重组淀粉样多肽-类弹性蛋白的生物纤维及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种稀土离子调控的重组淀粉样多肽‑类弹性蛋白的生物纤维及其制备方法和应用，涉及生物纤维领域，生物纤维为重组淀粉样多肽‑类弹性蛋白经稀土金属离子作用后经人工纺丝制得的蛋白纤维，其中，重组淀粉样多肽‑类弹性蛋白包含ELP1‑AP1融合蛋白，其包含：A1)其氨基酸序列包括：m个直接串联的表现形式如[ELP1‑AP1]所示的氨基酸序列单元，其中，AP1表示如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列，m为3‑36之间的整数。本发明通过类弹性蛋白‑戊二醛交联网络与淀粉样多肽所形成的β‑折叠氢键网络相结合，辅以稀土离子(如铕离子)调控金属离子与蛋白间的相互作用力，提高重组蛋白纤维高力学性能。
Description
技术领域
本发明涉及生物纤维领域，尤其涉及一种稀土离子调控的重组淀粉样多肽-类弹性蛋白的生物纤维及其制备方法和应用。
背景技术
蛋白纤维作为一类性能优异、应用广泛的新技术材料，由于其具有高强、高韧、高延展性及高生物相容性，具有广阔应用前景，在未来有望代替传统纤维成为下一代高新技术材料。如何提升纤维内部相互作用力，从而实现重组蛋白纤维力学性能的增强，始终是一个挑战。
类弹性蛋白是一种具有Val-Pro-Gly-Xaa-Gly(VPGXG)重复氨基酸序列的蛋白质材料，X可以为除脯氨酸外的任意氨基酸。当X为赖氨酸(Lys)时，赖氨酸侧链上的伯胺基团提供了交联位点，有利于蛋白内部形成致密的交联网络。
淀粉样多肽是一种具有β-折叠纤维形态的自组装蛋白聚集体，聚集体内存在着致密的氢键网络，具有高化学稳定性，对于纤维的力学性能有促进作用。此外，多肽序列上存在着可以与金属离子进行配位反应的氨基酸侧链基团。金属离子的引入会对多肽聚集体的内部结构产生剧烈的影响。
在金属元素中，稀土金属(也称为稀土元素)，由于其独特的磁性、发光性和电化学特性，已被广泛应用于国防工业、冶金、机械、石油、化工、玻璃、陶瓷、纺织、皮革、农牧养殖等各领域。例如，作为改性添加元素添加在钢铁和有色金属中，改善金属材料性能，提高钢材的强度、耐磨性和抗腐蚀性能力。而这一掺杂思路也可以同样应用于蛋白纤维材料的调控与改性。
一种稀土改性再生纤维素纤维的制备方法(申请号：CN202110622059.4)公开了一种稀土改性再生纤维素纤维的制备方法，利用稀土离子与酰胺基团的羰基氧配位作用对粘胶纺丝液进行改性。一种稀土蛋白纤维及其制备方法(申请号：CN201910778135.3)公开了一种利用稀土离子与蛋白-表面活性剂复合物配位螯合作用制备纤维材料。这些方法中多需要其他辅助因子的加入(如：羧甲基壳聚糖、阴离子表面活性剂等)，增加了制备工艺的复杂性。此外，对于纤维的力学性能的提升仍然有限，难于满足生产应用中对于高力学性能蛋白纤维材料的需求。
因此，对于蛋白纤维材料而言，在简化制备流程的基础上，通过稀土金属调控作用，进一步提高蛋白纤维的力学性能(如断裂强度、韧性等)具有重要意义。
发明内容
技术问题
有鉴于此，本发明要解决的技术问题是，如何利用金属离子(如：稀土离子)与蛋白间的相互作用力，提高纤维力学性能。同时，提供一种稀土离子调控的重组淀粉样多肽-类弹性蛋白的生物纤维及其制备方法和应用。本发明仿照天然蛛丝结构域组成，通过将柔性类弹性蛋白与刚性淀粉样多肽单元进行融合表达，使其具有形成刚性β折叠结构和柔性弹性蛋白样结构域的能力，并将其纺成的新的蛋白质纤维材料，通过类弹性蛋白-戊二醛交联网络与淀粉样多肽所形成的β-折叠氢键网络相结合，辅以稀土离子(如铕离子)-蛋白间的相互作用力，实现纤维的高力学性能，获得了一种较现有技术而言，制备流程更为简易、力学性能更为优异的稀土调控蛋白纤维材料。
解决方案
为解决以上技术问题，本发明提供如下技术方案：
第一方面，本发明提供一种稀土离子调控的重组淀粉样多肽-类弹性蛋白的生物纤维，其为重组淀粉样多肽-类弹性蛋白经稀土金属离子作用后经人工纺丝制得的蛋白纤维，其中，
重组淀粉样多肽-类弹性蛋白包含ELP1-AP1融合蛋白，其为下述A1)～A3)蛋白中任一种：
A1)其氨基酸序列包括：m个直接串联的表现形式如[ELP1-AP1]所示的氨基酸序列单元，其中，AP1表示如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列，ELP1为类弹性蛋白序列，[ELP1-AP1]表示AP1序列和ELP1序列串联；m表示[ELP1-AP1]序列的重复数，m为3-36之间的整数；
其中，SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列为：FGAILSS；
A2)其氨基酸序列包括：A1)或A2)所示的氨基酸序列经过一个、两个或以上氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与A1)所示的蛋白质具有相同或相近性质的蛋白质；
A3)其氨基酸序列包括：在A1)或A2)或A3)的N端和/或C端引入组氨酸标签。
进一步地，ELP1-AP1融合蛋白中：m为8-24之间的整数，可选地为10-20之间的整数，可选地为12-18之间的整数，可选地为12。
ELP1的氨基酸序列包含若干如SEQ ID NO:2：VPGXG所示的氨基酸序列串联而成的氨基酸序列，表现形式为(VPGX1G)i-(VPGX2G)j，其中，X1和X2分别独立地为赖氨酸或缬氨酸或其它氨基酸，可选地X1为赖氨酸，X2为缬氨酸；i为(VPGX1G)序列的重复数，i为1-40之间的整数，可选地i为3-10之间的整数，可选地i为3-8之间的整数，可选地i为4-6之间的整数，可选地i为5；j为(VPGX2G)序列的重复数，j为1-40之间的整数，可选地j为1-10之间的整数，可选地j为1-5之间的整数，可选地j为1或2；
可选地，氨基酸序列单元的氨基酸序列[ELP1-AP1]如SEQ ID NO:3所示，序列如下：
VPGKGVPGKGVPGKGVPGKGVPGKGVPGVGFGAILSS。
当ELP1-AP1融合蛋白为12聚体时，氨基酸序列包含以下如SEQ ID NO:6的序列：GKGVPGKGVPGKGVPGKGVPGKGVPGVGFGAILSSVPGKGVPGKGVPGKGVPGKGVPGKGVPGVGFGAILSSVPGKGVPGKGVPGKGVPGKGVPGKGVPGVGFGAILSSVPGKGVPGKGVPGKGVPGKGVPGKGVPGVGFGAILSSVPGKGVPGKGVPGKGVPGKGVPGKGVPGVGFGAILSSVPGKGVPGKGVPGKGVPGKGVPGKGVPGVGFGAILSSVPGKGVPGKGVPGKGVPGKGVPGKGVPGVGFGAILSSVPGKGVPGKGVPGKGVPGKGVPGKGVPGVGFGAILSSVPGKGVPGKGVPGKGVPGKGVPGKGVPGVGFGAILSSVPGKGVPGKGVPGKGVPGKGVPGKGVPGVGFGAILSSVPGKGVPGKGVPGKGVPGKGVPGKGVPGVGFGAILSSVPGKGVPGKGVPGKGVPGKGVPGKGVPGVGFGAILSS。
可选地，氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示：
MVPGKGVPGKGVPGKGVPGKGVPGKGVPGVGFGAILSSVPGKGVPGKGVPGKGVPGKGVPGKGVPGVGFGAILSSVPGKGVPGKGVPGKGVPGKGVPGKGVPGVGFGAILSSVPGKGVPGKGVPGKGVPGKGVPGKGVPGVGFGAILSSVPGKGVPGKGVPGKGVPGKGVPGKGVPGVGFGAILSSVPGKGVPGKGVPGKGVPGKGVPGKGVPGVGFGAILSSVPGKGVPGKGVPGKGVPGKGVPGKGVPGVGFGAILSSVPGKGVPGKGVPGKGVPGKGVPGKGVPGVGFGAILSSVPGKGVPGKGVPGKGVPGKGVPGKGVPGVGFGAILSSVPGKGVPGKGVPGKGVPGKGVPGKGVPGVGFGAILSSVPGKGVPGKGVPGKGVPGKGVPGKGVPGVGFGAILSSVPGKGVPGKGVPGKGVPGKGVPGKGVPGVGFGAILSSVPGKGVPDIWPHHHHHH。
进一步地，所述稀土金属离子为铕离子。
进一步地，所述重组淀粉样多肽-类弹性蛋白与稀土金属离子的摩尔比为1：0.5～2，可选地为1：1。
第二方面，提供一种第一方面所述的生物纤维的制备方法，包括：
将所述ELP1-AP1融合蛋白溶于含稀土金属离子的水溶液中制备蛋白溶液，利用注射泵将所述蛋白溶液挤出到凝固浴中固化成初生纤维。
进一步地，所述含稀土金属离子的水溶液为铕离子(Eu3+)水溶液，可选地，铕离子(Eu3+)浓度为铕离子浓度为4～5mmol/L。
进一步地，所述重组淀粉样多肽-类弹性蛋白与金属离子的摩尔比为1：0.5～2，可选地为1：1。
进一步地，所述ELP1-AP1融合蛋白在蛋白溶液中的质量分数为150～200mg/mL，可选地为200mg/mL；蛋白浓度过稀可能会导致蛋白纤维不能成型，过浓则可能会导致蛋白在针头处堵塞，对纤维成型过程有影响。
和/或，所述凝固浴为0.5-5％(v/v)戊二醛-水溶液，可选地为1％(v/v)戊二醛-水溶液；
和/或，还包括对初生纤维的后拉伸：将初生纤维浸泡在拉伸浴中变软后，将其拉伸至原长的2～5倍，得后拉伸纤维。
第三方面，提供一种第一方面所述的生物纤维、或第二方面所述的制备方法制备的生物纤维相关的生物材料，其特征在于，所述生物材料为B1)至B4)中的任一种：
B1)编码所述的ELP1-AP1融合蛋白的核酸分子；
B2)含有B1)所述核酸分子的表达盒；
B3)含有B1)所述核酸分子的重组载体，或含有B2)所述表达盒的重组载体；可选地，所述重组载体采用pET25b质粒或pbluescript II ks质粒；
B4)含有B1)所述核酸分子的重组表达系统，或含有B2)所述表达盒的重组表达系统，或含有B3)所述重组载体的重组表达系统；可选地，所述表达系统为重组大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、哺乳动物细胞、酵母细胞或昆虫细胞。
第四方面，提供一种第一方面所述的生物纤维、或第二方面所述的制备方法制备的生物纤维相关的生物材料或第三方面所述的生物材料的用途，所述用途包括以下C1)至C6)中的任一种或几种：
C 1)航天航空领域、军事领域；
C 2)纸产品，可选地包括包装纸、标牌或广告印刷纸；
C 3)薄膜，可选地包括包装薄膜、偏光板保护膜或表面处理膜；
C 4)纺织品，可选地包括纺织原料、家用纺织品或服装衣物；
C 5)涂层，可选地包括液态涂层、涂料或导电漆；
C 6)医用材料或生物材料，可选地包括手术缝线、医用粘合剂或支架类材料。
此外，本发明的发明人发现，将稀土金属离子与蛋白进行共混、作用，可以实现稀土金属离子与多种氨基酸(如丝氨酸、甘氨酸、赖氨酸等)侧链的相互反应形成络合物，从而增强蛋白内部相互作用力，提高蛋白纤维的力学性能，甚至优于引入铜离子等其它金属离子配位的蛋白纤维性能。
有益效果
(1)本发明通过模块化组装策略，将淀粉样多肽单元与类弹性蛋白进行融合表达，形成仿天然蛛丝结构，利用淀粉样多肽的刚性β折叠序列与柔性类弹性蛋白交联网络协同作用，有助于材料内部结构的坚固与稳定。
(2)在纤维成型过程中，通过引入稀土离子与蛋白质氨基酸侧链间的相互作用，进一步调控纤维内部结构，紧密β-片层之间的排列，加强并稳定纤维内部结构，提高纤维力学性能，获得具有优异强度与韧性的重组蛋白纤维材料。
(3)本发明的纺丝工艺简便，制备流程简单、易重复，可实现大量制备且经过后拉伸之后更为长程有序。
附图说明
一个或多个实施例通过与之对应的附图中的图片进行示例性说明，这些示例性说明并不构成对实施例的限定。在这里专用的词“示例性”意为“用作例子、实施例或说明性”。这里作为“示例性”所说明的任何实施例不必解释为优于或好于其它实施例。
图1.本发明的实施例1的重组蛛丝蛋白和共表达表达重组淀粉样多肽-类弹性蛋白载体构建示意图；其中，A为ELP1-AP1重组蛋白基因在pbluescript II ks(m13)载体上的多聚化构建示意图，B为ELP1-AP1多聚重组蛋白基因由pbluescript II ks(m13)载体转移至pET25b上的构建示意图，C为ELP1-AP1多聚重组蛋白基因载体示意图。
图2.本发明的实施例1的ELP1-AP1重组蛋白表达及纯化结果图；其中，A为ELP1-AP1 12聚体重组蛋白筛选表达SDS-PAGE电泳图，红色箭头指示目的条带，B为纯化后ELP1-AP1 12聚体重组蛋白SDS-PAGE电泳图，目的条带单一，蛋白纯度高。
图3.本发明的测试例1的稀土离子(Eu3+)调控-ELP1-AP1 12聚体蛋白纤维外观图片(图中的亮黄色丝线为蛋白纤维)。
图4.本发明的测试例1的稀土离子(Eu3+)调控-ELP1-AP1 12聚体蛋白纤维扫描电镜(SEM)图片。
图5.本发明的测试例1的普通ELP1-AP1 12聚体蛋白纤维后拉伸处理后力学性能测试曲线图。
图6.本发明的测试例1的金属(Cu2+)配位-ELP1-AP1 12聚体蛋白纤维后拉伸处理后力学性能测试曲线图。
图7.本发明的测试例1的稀土离子(Eu3+)调控-ELP1-AP1 12聚体蛋白纤维后拉伸处理后力学性能测试曲线图。
图8.本发明的测试例1的ELP1-AP1 12聚体蛋白纤维、金属(Cu2+)配位-ELP1-AP112聚体蛋白纤维、以及稀土离子(Eu3+)调控-ELP1-AP1 12聚体蛋白纤维断裂强度比较图。三组纤维之间的显著性分析使用GraphPad Prism 8.0软件中的单因素方差分析(one-wayANOVA)进行。其中，*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001，****p<0.0001。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
另外，为了更好的说明本发明，在下文的具体实施方式中给出了众多的具体细节。本领域技术人员应当理解，没有某些具体细节，本发明同样可以实施。在一些实施例中，对于本领域技术人员熟知的原料、方案、方法、手段等未作详细描述，以便于凸显本发明的主旨。
除非另有其它明确表示，否则在整个说明书和权利要求书中，术语“包括”或其变换如“包含”或“包括有”等等将被理解为包括所陈述的元件或组成部分，而并未排除其它元件或其它组成部分。
融合蛋白的表达载体的构建方法：
制备例1：重组淀粉样多肽-类弹性蛋白表达载体构建
构建ELP1-AP1蛋白三聚体单元的编码序列((ELP1蛋白编码序列+AP1蛋白编码序列)×3)，以及用于同源重组的同源臂序列1(CTGCAGGAATTCGTTATC，SEQ ID NO:5中前端标粗序列)、同源臂序列2(GTTCCGGGTAAGGGCGTTCCG，SEQ ID NO:5中后端标粗序列)、XbaI酶切位点(TCTAGA)、NdeI酶切位点(CATATG)、EcoRV酶切位点(GATATC)、组氨酸标签序列((CAC)6)、终止密码子对应的DNA编码序列(TGAGAT)和EcoRI酶切位点(GAATTC)，所有元件连接获得基因元件1(pbluescript II ks-三聚体基本单元)：XbaI+同源臂序列1+NdeI+ELP1-AP1蛋白三聚体单元的编码序列+同源臂序列2+EcoRV+(CAC)6+TGAGAT+EcoRI，基因元件1委托苏州金唯智生物科技有限公司合成，并直接通过通过XbaI和EcoRV双酶切将基因元件1和m13质粒连接，获得重组淀粉样多肽-类弹性蛋白3聚体基本单元载体。基因元件1序列如SEQ ID NO:5所示：
TCTAGACTGCAGGAATTCGTTATCCATATGGTTCCGGGTAAGGGCGTTCCGGGCAAAGGTGTGCCAGGC AAGGGTGTTCCGGGTAAAGGTGTGCCGGGTAAAGGCGTGCCGGGTGTGGGTTTTGGTGCAATCTTATCATCTGTTCC GGGTAAGGGCGTTCCGGGCAAAGGTGTGCCAGGCAAGGGTGTTCCGGGTAAAGGTGTGCCGGGTAAAGGCGTGCCGG GTGTGGGTTTTGGTGCAATCTTATCATCTGTTCCGGGTAAGGGCGTTCCGGGCAAAGGTGTGCCAGGCAAGGGTGTT CCGGGTAAAGGTGTGCCGGGTAAAGGCGTGCCGGGTGTGGGTTTTGGTGCAATCTTATCATCTGTTCCGGGTAAGGGCGTTCCGGATATCCACCACCACCACCACCACTGAGATGAATTC
其中，下划线部分为ELP1-AP1蛋白三聚体单元的编码序列，加粗部分分别为同源臂1、2的序列。
重组淀粉样多肽-类弹性蛋白6聚体载体(pbluescript II ks-6聚体载体)：通过XbaI和EcoRV双酶切从pbluescript II ks-三聚体基本单元载体上获得基因元件2，基因元件2与经过NdeI单酶切的pbluescript II ks三聚体基本单元载体的质粒线性化片段，在重组酶(南京诺唯赞生物科技股份有限公司)的作用下，通过基因元件2首尾的同源臂序列1、2与质粒线性化片段进行同源重组连接，获得重组淀粉样多肽-类弹性蛋白6聚体载体(pbluescript II ks-6聚体)；
按照上述方式可不断进行基因重组，获得重组淀粉样多肽-类弹性蛋白12聚体载体(pbluescript II ks-12聚体)，再通过NdeI和EcoRI双酶切连接到pET25b质粒上，形成表达载体pET25b-12聚体，准备转入到大肠杆菌表达系统进行诱导表达。构建流程图如图1A及图1B所示，构建所得的重组蛋白多聚重组载体示意图如图1C所示。
制备例2：优势菌株筛选及菌株保存
将表达载体“pET25b-12聚体”转化大肠杆菌感受态细胞E.coli BLR(DE3)。挑取单克隆菌落，于10mL LB培养基(100μg/mL氨苄西林钠)中于100mL摇瓶中培养9-10小时(37℃，220rpm)；待菌液OD600至3-4时，将600微升菌液与400微升50％甘油混合，翻转摇匀8-10次放入-80℃冰箱保存；同时，将100微升菌液转移至10mL TB培养基(100μg/ml氨苄西林钠)中于100mL摇瓶中培养2-3小时(37℃，220rpm)；待菌液OD600至0.6-0.8时，添加诱导剂IPTG(isopropylβ-D-1-thiogalactopyranoside,异丙基硫代半乳糖苷)至终浓度为1mM，诱导蛋白表达，发酵培养过夜(28.5℃，220rpm)；取培养过夜的菌液1mL离心(6000rpm，4℃，2min)，弃去上清液，收集菌体；加入1mL Ni Lysis Buffer(NaCl 500mM，Na3PO4 50mM，咪唑20mM，pH7.8)混匀，使用φ3超声探头超声破碎(35％功率，5-10min)至溶液澄清；分别取全蛋白溶液以及离心(12000rpm，4℃，5min)后的上清液各50微升，加入10微升6×Protein LoadingBuffer，混匀后98℃水浴加热10min使蛋白变性；冷却10min后取10微升样品于已配置好的1mm厚的聚丙烯酰胺凝胶上加样；设置参数160V，400mA电泳1.5h；电泳结束后将凝胶放入染色液中，震荡染色2-3h；染色结束后回收染色液，将凝胶放入脱色液中进行震荡脱色至条带清晰；其中表达载体“pET25b-12聚体”表达的蛋白凝胶结果如图2A所示；依据目的条带深浅，筛选优势菌株并保存。
制备例3：蛋白表达
取优势菌株1mL，接种于100mL LB培养基(100μg/ml氨苄西林钠)中培养6-7小时(37℃，220rpm)；待菌液OD600至3-4时，取10mL菌液接种于1L TB培养基(100μg/ml氨苄西林钠)中于5L摇瓶中培养2-3小时(37℃，220rpm)；待菌液OD600至0.6-0.8时，添加诱导剂IPTG(isopropylβ-D-1-thiogalactopyranoside,异丙基硫代半乳糖苷)至终浓度为1mM，诱导蛋白表达，发酵培养过夜(28.5℃，220rpm)；将培养过夜的菌液离心(6000rpm，4℃，10min)，弃去上清液保留菌体，于-80℃冰箱保存。
制备例4：蛋白纯化
按照1:5的比例(m/V)向菌体中加入Ni Lysis Buffer(NaCl 500mM，Na3PO4 50mM，咪唑20mM，pH 7.8)，搅拌均匀后加入MgCl2(20mM)、溶菌酶(1mg/mL)和DNA酶(5μg/mL)室温孵育30min；使用φ20超声探头超声破碎(35％功率，2-2.5h)后离心(12000rpm，4℃，40min)，取上清过0.45微米滤膜；之后将离心、抽滤后的菌液通过Ni Lysis Buffer平衡后的镍柱，使蛋白的组氨酸标签与柱料里的镍离子结合，随后使用Ni Lysis Buffer再次平衡，经由Ni Elusion Buffer(NaCl 500mM，Na3PO4 50mM，咪唑350mM，pH 7.8)竞争性结合镍柱上的镍离子，实现目的蛋白洗脱。随后将洗脱液在SP Lysis Buffer(NaCl 50mM，Na3PO450mM，pH 7.8)中透析2-3小时后过0.45微米滤膜，样品通过阳离子交换柱，随后使用SPLysis Buffer平衡、经由SP Elusion Buffer(NaCl 2M，Na3PO4 50mM，pH 7.8)洗脱。随后，将阳离子交换层析洗脱液经过分子筛除盐，除去液体中的盐离子，最终获得经精细纯化后的蛋白溶液。将蛋白溶液于-80℃冷冻过夜后放入真空冷冻干燥机中冻干。对纯化后的融合蛋白进行SDS-PAGE蛋白电泳和分析，如图2B所示，结果表明能够纯化获得ELP1-AP1 12聚体重组淀粉样多肽-类弹性蛋白。
制备例5：稀土离子(Eu3+)调控的重组淀粉样多肽-类弹性蛋白纤维制备
将制备例4制备的ELP1-AP1 12聚体重组淀粉样多肽-类弹性蛋白溶于EuCl3水溶液中(200mg/mL)，其中Eu3+的添加量按照重组淀粉样多肽-类弹性蛋白：Eu3+摩尔比1:1的比例，制备成纺丝液；随后，将纺丝液转移到1mL注射器中，通过注射器针头挤入凝固浴(1％戊二醛水溶液)中，使用注射泵调节推进速度为10μL/min、用收集毂以线速度为0.6m/min的速度来收集纤维；将收集到的纤维在室温(25℃)下晾干30-60min。
制备获得稀土离子(Eu3+)调控-ELP1-AP1 12聚体重组淀粉样多肽-类弹性蛋白纤维(简称稀土离子(Eu3+)调控-ELP1-AP1 12聚体蛋白纤维)。纤维呈现表面光滑的亮黄色，纤维外观及形貌分别如图3及图4所示。
对比例1：重组淀粉样多肽-类弹性蛋白纤维的制备
将制备例4制备的ELP1-AP1 12聚体重组淀粉样多肽-类弹性蛋白溶于水溶液中(200mg/mL)，制备成纺丝液；将纺丝液转移到1mL注射器中，通过注射器针头挤入凝固浴(1％戊二醛水溶液)中，使用注射泵调节推进速度为10μL/min、用收集毂以线速度为0.6m/min的速度来收集纤维；将收集到的纤维在室温(25℃)下晾干30-60min。
制备获得ELP1-AP1 12聚体重组淀粉样多肽-类弹性蛋白纤维(简称普通ELP1-AP112聚体蛋白纤维)。
对比例2：金属(Cu2+)配位重组淀粉样多肽-类弹性蛋白纤维的制备
将制备例4制备的ELP1-AP1 12聚体重组淀粉样多肽-类弹性蛋白溶于铜盐-水溶液中(200mg/mL)，其中Cu2+的添加量按照重组淀粉样多肽-类弹性蛋白：Cu2+摩尔比1:1的比例，制备成纺丝液；随后，将纺丝液转移到1mL注射器中，通过注射器针头挤入凝固浴(1％戊二醛水溶液)中，使用注射泵调节推进速度为10μL/min、用收集毂以线速度为0.6m/min的速度来收集纤维；将收集到的纤维在室温(25℃)下晾干30-60min。
制备获得金属(Cu2+)配位-ELP1-AP1 12聚体重组淀粉样多肽-类弹性蛋白纤维(简称金属(Cu2+)-ELP1-AP1 12聚体蛋白纤维)。
测试例1：蛋白纤维力学性能测试
在水溶液中对制备例5、对比例1-2的蛋白纤维分别进行后拉伸处理，拉伸到原长的200％左右，采用纤维拉伸仪进行纤维力学性能测试。对所有原纤维测试时，拉伸速度为8mm/min，夹距间距离为4mm，检测纤维断裂强度、韧性和延展性，其中：
纤维强度断裂强度断裂时的拉伸的为应力除以横截面，应力直接从机器(Textechno,German)中获取，横截面积利用圆形公式。
纤维韧性为应力-应变曲线包围的面积。应力，应变直接从机器(Textechno,German)中获取。
杨氏模量为线性弹性变形范围内应力-应变曲线的斜率。所用数据处理均利用Origin2024处理。不同组别之间的差异分析使用GraphPad Prism 8.0软件进行。
对比例1的普通ELP1-AP1 12聚体蛋白纤维的纤维力学性能曲线如图5、表1所示，结果表明，纤维的断裂强度为333.92±13.70MPa，韧性为75.42±13.63MJ/m3，模量为4.78±0.23GPa。
对比例2的金属(Cu2+)-ELP1-AP1 12聚体蛋白纤维的纤维力学性能曲线如图6、表1所示，由力学性能测试结果计算可得，金属(Cu2+)配位-ELP1-AP1 12聚体蛋白纤维断裂强度为366.31±21.06MPa，韧性为78.01±8.12MJ/m3，模量为4.78±0.79GPa。发明人进一步研究发现通过调整的Cu2+加入量也较难进一步提高其断裂强度。
制备例5的稀土离子(Eu3+)调控-ELP1-AP1 12聚体蛋白纤维的纤维力学性能曲线如图7、表1所示，由力学性能测试结果计算可得，稀土金属(Eu3+)调控-ELP1-AP1 12聚体蛋白纤维断裂强度为414.87±23.85MPa，韧性为94.75±17.74MJ/m3，模量为3.36±2.49GPa。其纤维断裂强度优于上述两种纤维材料。证实稀土离子(Eu3+)的调控对纤维的力学性能有利。
表1本发明涉及各纤维力学性能汇总表
各蛋白纤维的纤维力学性能，特别是断裂强度存在明显差异，具体参见图8、表1。由表中数据和比较图可知，稀土离子(Eu3+)的加入对于纤维力学性能有增强作用，其断裂强度优于普通ELP1-AP1 12聚体蛋白纤维以及金属(Cu2+)-ELP1-AP1 12聚体蛋白纤维，证实稀土离子引入调控蛋白纤维性能的可行性。此外，由于此工艺流程制备的稀土离子(Eu3+)调控-ELP1-AP1 12聚体蛋白纤维含有强内部网络结构，具有高环境稳定性，在强酸性(pH＝1)环境中，依然能保持高力学性能，极大拓展了该纤维材料的应用场景和应用领域。
前述对本发明的具体示例性实施方案的描述是为了说明和例证的目的。这些描述并非想将本发明限定为所公开的精确形式，并且很显然，根据上述教导，可以进行很多改变和变化。对示例性实施例进行选择和描述的目的在于解释本发明的特定原理及其实际应用，从而使得本领域的技术人员能够实现并利用本发明的各种不同的示例性实施方案以及各种不同的选择和改变。针对上述示例性实施方案所做的任何简单修改、等同变化与修饰，都应落入本发明的保护范围。
Claims (10)
1.一种稀土离子调控的重组淀粉样多肽-类弹性蛋白的生物纤维，其为重组淀粉样多肽-类弹性蛋白经稀土金属离子作用后经人工纺丝制得的蛋白纤维，其中，
重组淀粉样多肽-类弹性蛋白包含ELP1-AP1融合蛋白，其为下述A1)～A3)蛋白中任一种：
A1)其氨基酸序列包括：m个直接串联的表现形式如[ELP1-AP1]所示的氨基酸序列单元，其中，AP1表示如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列，ELP1为类弹性蛋白序列，[ELP1-AP1]表示AP1序列和ELP1序列串联；m表示[ELP1-AP1]序列的重复数，m为3-36之间的整数；
A2)其氨基酸序列包括：A1)或A2)所示的氨基酸序列经过一个、两个或以上氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与A1)所示的蛋白质具有相同或相近性质的蛋白质；
A3)其氨基酸序列包括：在A1)或A2)或A3)或A4)的N端和/或C端引入组氨酸标签。
2.根据权利要求1所述的生物纤维，其特征在于，ELP1-AP1融合蛋白中：
m为8-24之间的整数，可选地为10-20之间的整数，可选地为12-18之间的整数，可选地为12；
ELP1的氨基酸序列包含若干如SEQ ID NO:2：VPGXG所示的氨基酸序列串联而成的氨基酸序列，表现形式为(VPGX1G)i-(VPGX2G)j，其中，X1和X2分别独立地为赖氨酸或缬氨酸或其它氨基酸，可选地X1为赖氨酸，X2为缬氨酸；i为(VPGX1G)序列的重复数，i为1-40之间的整数，可选地i为3-10之间的整数，可选地i为3-8之间的整数，可选地i为4-6之间的整数，可选地i为5；j为(VPGX2G)序列的重复数，j为1-40之间的整数，可选地j为1-10之间的整数，可选地j为1-5之间的整数，可选地j为1或2；
可选地，氨基酸序列单元的氨基酸序列[ELP1-AP1]如SEQ ID NO:3所示。
3.根据权利要求1所述的生物纤维，其特征在于，ELP1-AP1融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示。
4.根据权利要求1至3任一所述的生物纤维，其特征在于，所述稀土金属离子为铕离子。
5.根据权利要求1至4任一所述的生物纤维，其特征在于，所述重组淀粉样多肽-类弹性蛋白与稀土金属离子的摩尔比为1：0.5～2，可选地为1：1。
6.一种权利要求1至5任一所述的生物纤维的制备方法，其特征在于，包括：
将所述ELP1-AP1融合蛋白溶于含稀土金属离子的水溶液中制备蛋白溶液，利用注射泵将所述蛋白溶液挤出到凝固浴中固化成初生纤维。
7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述含稀土金属离子的水溶液为铕离子水溶液，可选地，铕离子浓度为4～5mmol/L；
和/或，所述重组淀粉样多肽-类弹性蛋白与金属离子的摩尔比为1：0.5～2，可选地为1：1。
8.根据权利要求6或7所述的制备方法，其特征在于，所述ELP1-AP1融合蛋白在蛋白溶液中的质量分数为150～200mg/mL，可选地为200mg/mL；
和/或，所述凝固浴为0.5-5％(v/v)戊二醛-水溶液，可选地为1％(v/v)戊二醛-水溶液；
和/或，还包括对初生纤维的后拉伸：将初生纤维浸泡在拉伸浴中变软后，将其拉伸至原长的2～5倍，得后拉伸纤维。
9.与权利要求1至5任一所述的生物纤维或权利要求6至8任一所述的制备方法制备的生物纤维相关的生物材料，其特征在于，所述生物材料为B1)至B4)中的任一种：
B1)编码所述的ELP1-AP1融合蛋白的核酸分子；
B2)含有B1)所述核酸分子的表达盒；
B3)含有B1)所述核酸分子的重组载体，或含有B2)所述表达盒的重组载体；可选地，所述重组载体采用pET25b质粒或pbluescript II ks质粒；
B4)含有B1)所述核酸分子的重组表达系统，或含有B2)所述表达盒的重组表达系统，或含有B3)所述重组载体的重组表达系统；可选地，所述表达系统为重组大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、哺乳动物细胞、酵母细胞或昆虫细胞。
10.一种权利要求1至5任一所述的生物纤维、或权利要求6至8任一的制备方法制备的生物纤维或权利要求9所述的生物材料的用途，所述用途包括以下C1)至C6)中的任一种或几种：
C 1)航天航空领域、军事领域；
C 2)纸产品，可选地包括包装纸、标牌或广告印刷纸；
C 3)薄膜，可选地包括包装薄膜、偏光板保护膜或表面处理膜；
C 4)纺织品，可选地包括纺织原料、家用纺织品或服装衣物；
C 5)涂层，可选地包括液态涂层、涂料或导电漆；
C 6)医用材料或生物材料，可选地包括手术缝线、医用粘合剂或支架类材料。
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