CN1729295A - 抗冻蛋白的制备 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种提高III型抗冻蛋白特异活性的方法，所述蛋白是通过降低蛋白糖基化程度的方式，在异源真菌物种中表达编码蛋白序列的基因而制备的。

Description

抗冻蛋白的制备
发明背景
抗冻蛋白(AFPs)是一种多肽，多种物种均能产生，尤其是那些较冷气候地区的原生物种，它们具有抑制水和含水物质在低于0℃的温度下结冰的能力。一般认为上述蛋白通过与冰晶相互作用而抑制冰晶的生长，但现在已经清楚地认识到，实际上存在多种不同种类的抗冻蛋白，它们可能具有不同的作用机制，并具有不同的作用效果。例如，AFPs除对冰/水体系的冷冻/融化行为导致热滞后之外，它还影响冷冻时所形成的冰晶的大小和形状，并抑制冰的重结晶。最近的研究表明，上述蛋白应当是曾被称作冰结构蛋白(ISPs)的已知蛋白(Clarke，C.J.，Buckley，S.L.，和Lindner，N.，Cryoletters.，23(2002)89-92)。
AFPs所具有的这些特性意味着它们可能对各种冷冻产品的性质，如生产时的难易程度、在各种冷冻制剂储存期间的品质和稳定性，带来深刻的影响，最近几年，人们特别关注这些蛋白的商业用途，特别是在食品工业中。例如，在冷冻糖果时，需要控制冰晶的大小以提高产品品质。同样，在配方中加入AFPs也能够改善产品的储存特性。关于AFPs在食品工业中的应用，Griffith和Vanya Ewart在文献Biotechnology Advances，13卷，375-402页(1995)中曾做过综述。
为了适用于上述目的，AFP需要对与之混合的冷冻物质具有预期的作用效果，而且需要能够容易地进行工业化生产。尤其是后者是问题的关键，因为许多已经鉴定出来的AFPs种类不太容易商品化生产或制备。已经发现一些种类的AFPs非常容易变性，这严重制约了所使用的分离方法。考虑到这些难题，人们非常关注通过在更加有利于表达的宿主中表达编码上述蛋白的克隆基因的方法来制备AFPs，表达宿主如微生物或易于培植和加工处理的植物。然而，对于多种AFPs来说，这也是一个问题，因为通常情况下蛋白在表达宿主中的产率很低，而且有时缺乏活性。
已经鉴定出的AFPs中，最具有潜力的是来自海洋大头鱼(OceanPout)的III型AFP，命名为HPLC-12。发现该蛋白在控制冰晶的形状和大小方面具有卓越的能力。例如，在重结晶试验中，该蛋白的表现优于已知的I类AFPs。III类HPLC-12的一个更加有利的特性是，尽管它在大肠杆菌(E.coli)中生产量很低，但是它能够在转化的酵母中通过表达编码蛋白序列的克隆基因而生产出大量的蛋白，从而提供了一种潜在的比从天然鱼类提取更加方便、更加经济有效的蛋白来源，以更加适应工业化生产。
蛋白糖基化涉及到大量的酶，其中一种或多种酶缺乏可以会改变糖基化模式。负责将第一个糖残基转移到蛋白上的酶如果丧失活性，将会抑制任一糖基化过程。因此提示，使用这样的蛋白甘露糖基转移酶(pmt)-缺陷型的突变酵母株，来克服异源表达蛋白的不正常糖基化所带来的问题(WO94/04687)。然而，实际的情况却是复杂的，因为具有上述功能的酶不仅仅有一种，而是有多种，而且它们具有不同的蛋白特异性。例如，对于O-甘露糖基化蛋白，Strahl-Bolsinger等(Biochimica et Biophysica Acta 1426(1999)297-307)指出，在所研究的十种O-糖基化的蛋白中，其中六种在酵母中被酶Pmt1和Pmt2糖基化，另外四种在丧失Pmt4酶活性的菌株中表现出O-甘露糖基化降低或缺乏。在另外一种丧失Pmt3酶活性的突变菌株中，在所分析的蛋白中没有观察到糖基化降低的现象，然而该突变在带有Pmt1Pmt2双突变遗传背景的菌株中却能够导致壳多糖酶O-甘露糖基化的降低。已经证实，甘露糖基化特异性与蛋白底物的序列或结构特征之间没有相关性，因此不可能预测何种特定转移酶可能负责启动何种特定蛋白的糖基化，不管蛋白是糖基化物种的天然蛋白，还是在物种中异源表达的外源蛋白。
发明概述
本发明人发现，在酵母中生产的III型HPLC-12具有特殊的活性，在重结晶抑制试验中检测到，HPLC-12所形成的冰晶要小于分离自海洋大头鱼类血液的蛋白。发明人能够证明这是酵母对蛋白的O-糖基化所带来的结果，这种糖基化过程在鱼类生产的天然蛋白中不会发生。令人惊奇的是，只有未被糖基化的蛋白种类才具有上述活性。
这是意料之外的，因为本申请有关AFPs的试验证据没有表明糖基化和功能之间具有清楚一致的模式：事实上，一些AFPs在自然情况下糖基化程度很高。例如，DeVries等(Science 172(1971)1152)报道在北方鳕鱼和南极notothenioids中发现的一种AFP，当去掉二糖侧链后，其活性即会丧失。另外一种情况表明自然发生的糖基化对AFP活性并不重要。例如，Worrall等(Science 282(1998)115-117)发现胡萝卜中的一种自然糖基化的AFP，在生产时虽然没有表面多糖，但其重结晶抑制活性却不受影响。本发明人异源表达黑麦草AFP的试验同样表明，AFP的活性不依赖于糖基化，即使蛋白在天然情况下是糖基化的。因此，在有关AFPs的研究文献，没有明确显示糖基化和活性之间具有必然的联系。
进一步，基于上述意料之外的发现，本发明人提供了一种基本上抑制III型AFP发生不正常糖基化的方法，并由此提供了一种生产III型AFPs，如III型HPLC-12蛋白的方法，该方法以酵母为宿主，不仅方便、成本低、效率高，而且与获取天然蛋白相比，显著提高了产物产量。发明人发现使用该方法，不仅能提高重组蛋白的产量，而且还能提高重组蛋白的特异活性，也就是说可以从宿主细胞中收获更多的蛋白，并且在上述蛋白中，具有活性的蛋白的比例更高。
因此，本发明的第一个方面是提供一种生产III型抗冻蛋白(AFP)的方法，该方法包含在蛋白糖基化缺陷型的真菌宿主细胞中表达编码AFP的核酸序列。
在一个优选实施方式中，真菌宿主细胞是蛋白糖基化缺陷型，其是由一个或多个编码蛋白糖基化相关酶的基因发生突变引起的。
优选地，真菌细胞是O-糖基化缺陷型，更优选地是缺乏一种或多种蛋白甘露糖基转移酶活性的缺陷型。
在一个优选实施方式中，真菌宿主细胞是酵母，如啤酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)，优选pmt1缺陷型和/或pmt2缺陷型的突变酵母菌株。
在另一相关方面，本发明还提供了一种通过降低蛋白的糖基化程度来提高III型抗冻蛋白(AFP)或其功能等同物抗冻活性的方法，其中所述蛋白是通过在异源真菌物种中表达编码蛋白的基因/核酸序列来制备的。
优选使用冰重结晶抑制试验来测定特定AFP的活性。
在一个优选实施方式中，降低蛋白糖基化程度是通过如下方法获得的，方法如下：筛选缺乏一种或多种蛋白糖基化相关酶活性，优选缺乏一种或多种蛋白甘露糖基转移酶活性的表达物种菌株。
典型的，合适的糖基化缺陷型菌株是通过当编码所述蛋白的基因在所述菌株中表达时，对生产出的III型AFP蛋白进行分析而筛选的。优选地，对III型AFP蛋白的活性或功能进行分析，更优选地，对蛋白的冰重结晶抑制活性进行分析。
在第二个方面，本发明提供了一种包含重组III型抗冻蛋白(AFP)的组合物，其中大约50％-99％的AFP是未被糖基化的。优选地，III型AFP是III型HPLC-12。
在一个优选实施方式中，该组合物是可获得的，更加优选通过本发明第一方面的方法来获得。
在第三方面，本发明提供了一种鉴定能够表达III型AFP的真菌宿主菌株的方法，其中所表达出的AFP糖基化的比例小于大约50％，所述方法包含：
(i)提供多种真菌宿主细胞，其在宿主细胞中包含表达AFP的核酸序列；
(ii)在能够表达AFP的条件下培养宿主细胞；和
(iii)检测所表达出的AFP的糖基化程度。
在一个优选实施方式中，上述多种宿主细胞还经历了诱变步骤。
发明详述
本发明基于如下的发现：当使用正常酵母菌株表达编码蛋白的核酸序列来制备抗冻蛋白III型HPLC-12时，相当比例的分泌蛋白产物是糖基化的。天然蛋白中不存在这些糖基化，对分离到的糖基化组分和未糖基化的组分进行重结晶抑制试验，结果出人预料地表明，糖基化使蛋白丧失了AFP活性。
基于上述意外的发现，本发明进一步提供了一种通过降低蛋白的糖基化程度来提高III型抗冻蛋白HPLC-12或其功能等同物特异活性的方法，其中所述蛋白是通过在异源真菌物种中表达编码蛋白序列的核酸序列来制备的。
除非另有说明，在本申请中所使用的所有科技术语的含义等同于本领域普通技术人员对上述术语的一般理解(如在细胞培养、分子遗传、核酸化学、杂交技术和生物化学中)。本发明使用分子、遗传和生物化学方法的标准技术(参见Sambrook等，Molecular Cloning：ALaboratory Manual，3rd ed.(2001)Cole Spring Harbor LaboratoryPress，Cold Spring Harbor，N.Y.和Ausubel等，Short Protocols inMolecular Biology(1999)4th ed，John Wiley和Sons，Inc.-和题目为Current Protocols in Molecular Biology的译文文本，上述文献在此引作参考)和化学方法的标准技术。
抗冻蛋白
用于本发明目的的抗冻蛋白是一类具有显著冰重结晶抑制特性的蛋白，并因此是一类冰结构蛋白(ISP)。通过一种改进的板分析方法可以很方便地检测冰重结晶抑制特性，上述方法记载在WO 00/53029中。显著的冰重结晶抑制活性指的是：在30％重量比的蔗糖溶液中溶解0.01％重量比的AFP，快速冷却至-40℃(至少Δ50℃/每分钟)，之后快速升温至-6℃(至少Δ50℃/每分钟)，然后保持该温度，则在一小时内冰晶尺寸平均增大小于5μm。蛋白的特异活性检测每单位浓度的溶解的AFP在给定时间内抑制由重结晶导致的冰晶尺寸增大的程度的能力。
根据本发明的抗冻蛋白是III型AFPs。迄今为止，已经在多种Zoarcidae家族的极地鱼类中鉴定出上述AFPs蛋白，如Macrozoarcesamericanus(Eel pout，Ocean pout)和Anarhichas lupus(Wolffish)-Barrett，2001，Int.J.Biochem.Cell Biol.33：105-117。III型AFPs的分子量一般在约6.5-约14kDa之间，具有β夹心二级结构和球状三级结构。
已经克隆了多个编码III型AFPs的基因(Davies和Hew，1990，FASEB J.4：2460-2468)。本发明特别优选地III型AFP是HPLC-12 III。
SEQ ID NO：1是海洋大头鱼(Ocean pout)III型HPLC-12的氨基酸序列。根据本发明的HPLC-12 III多肽包括具有SEQ ID NO：1显示的氨基酸序列的多肽和其功能等同物。
“功能等同物”是指与SEQ ID NO：1所示III型HPLC-12的序列具有至少80％同一性，更优选具有至少85％、90％或95％序列同一性，并且具有AFP活性，特别是冰重结晶抑制(RI)活性的多肽。优选功能等同物具有SEQ ID NO：1所示III型HPLC-12氨基酸序列的多肽的至少50％的RI活性，更优选具有SEQ ID NO：1所示III型HPLC-12氨基酸序列的多肽的至少60％、70％或80％的RI活性。使用一种改进的板分析方法可以很方便地测定RI活性，该方法记载在文献WO 00/53029中。
可以使用易获得的序列比较程序来统计序列的同一性。这些商品化的计算机程序可以统计两个或多个序列之间的％同源性，特别是％同一性。
大部分的序列比较方法在设计时是被用于设计最佳的序列排列，其考虑到可能的不影响总体同源性评分的插入和缺失。这一点是通过在序列排列中插入“缺口”，使局部同源性最大化而完成的。
此外，有些更为复杂的方法为每一出现在排列中的缺口赋予了“缺口扣分”的概念(gap penalties)，如此以来，即使相同氨基酸的数量相同，但序列排列中缺口少的比缺口多的所得到的评分要高，缺口越少反应出两个比较序列间的相关程度越高。“仿射缺口扣分”(Affine gap cost)的概念也应用于该方法中，该概念的含义是：对缺口的存在扣分相对较高，对缺口内每个随后残基的扣分较少。这是最常用的缺口扣分系统。对缺口扣分高，当然能够产生具有更少缺口的最佳序列排列。在大多数的序列排列程序中，允许对缺口扣分进行调整。但是，当使用选定的软件进行序列比较时，还是优选使用该软件的预设值。例如，当使用GCG Wisconsin Bestfit软件包(见下文)时，预设的氨基酸序列缺口扣分是每个缺口扣12分，每个延伸扣分是4分。
因此要想计算最大同源性，首先需要综合考虑缺口扣分而生成最优化的序列排列。GCG Wisconsin Bestfit软件包(University ofWisconsin.U.S.A.；Devereux等，1984，Nucleic Acids Research12：387)是其中一种适于进行上述序列排列的计算机程序。其它的能够进行序列比较的软件的例子，包括但不限于，BLAST软件包(参见Ausubel等，1999 ibid-Chapter 18)、FASTA(Atschul等，1990，J.Mol.Biol.，403-410)和比较工具的GENEWORKS组合。BLAST和FASTA能够进行联机检索和脱机检索(参见Ausubel等，1999 ibid，页码7-58到7-60)。但是还是优选使用GCG Bestfit程序。
尽管最终的同源性％可以根据同一性来估算，但排列过程本身并不是根据全或无的一对对的比较。而是通常使用依据比例确定的相似性评分矩阵，其根据化学相似性或进化距离为每对比较进行评分。通常所使用的这种矩阵的例子有BLOSUM62矩阵-即程序中BLAST组合所使用的预设矩阵。在GCG Wisconsin程序中一般既可以使用公用预设值，也可以使用自定义符号对照表(在假定提供了该项功能的情况下，进一步的详细说明请看见使用手册)。对于GCG软件包来说，优选使用公用预设值，或者在使用其它软件的情况下，优选使用预设矩阵，如BLOSUM62。
一旦软件产生了最优化排列，则可以进一步计算出同源性％，优选是序列同一性％。软件计算上述数值的工作优选是整个序列比较的一部分，并生成一系列的数字化结果。
在一个高度优选地实施方式中，AFP多肽与一种信号序列相连接，该信号序列负责引导III型AFP蛋白从宿主细胞分泌出来。合适的信号序列包括啤酒酵母(S.cerevisiae)转化酶信号序列和啤酒酵母(S.cerevisiae)α-配对因子的前导序列。
可以将AFP与一种异源序列相融合，形成融合蛋白，以有利于提取和纯化。融合蛋白伴侣的实例包括谷胱甘肽-S-转移酶(GST)、六组氨酸、GAL4(DNA结合和/或转录活化区)和β-半乳糖苷酶。在融合蛋白伴侣和所需蛋白序列之间可以包含蛋白水解切割位点，以利于融合蛋白序列的切割。优选融合蛋白不阻遏AFP的RI活性。但是如果生产出的AFPs用于食品制造时，则优选避免使用融合伴侣。
AFP编码核酸和表达载体
本发明的方法包含在糖基化缺陷型的真菌宿主中表达III型AFPs。实施过程如下：将编码III型AFP的核酸序列以及用于引导III型AFP在宿主细胞中表达的序列，优选为表达载体转导到真菌宿主中。这样，首先将编码III型AFP的核酸序列整合到可复制的重组核酸载体中，该载体应当适于转导真菌宿主细胞。编码III型AFP的核酸序列可以是，如cDNA序列、基因组DNA序列、杂合的DNA序列、或合成、半合成的DNA序列。优选使用cDNA，而不是基因组DNA。
将编码III型AFP的核酸序列与调控序列操作性连接，该调控序列能够调控编码序列在宿主细胞中的表达，即载体是一种表达载体。术语“操作性连接”的意思是指所述成分的相互关系处于能够使它们以预定的作用方式发挥作用的状态下。将调控序列“操作性连接”到编码序列，是指以在与调控序列相容的条件下表达出编码序列的方式连接。
调控序列包括如下的序列，如启动子、和任选的转录增强元件。优选地，启动子是强启动子，如啤酒酵母(S.cerevisiae)的GAPDH启动子或GAL7启动子。启动子可以是构成型的，如GAPDH启动子，也可以是诱导型的，如GAL7启动子。
使用标准技术，如热激或电穿孔技术，将核酸载体转化到合适的真菌宿主细胞中，以表达III型AFP。过程包含：在适于上述表达载体表达编码III型AFP序列的条件下，培养表达载体转化的宿主细胞，并可选择的，回收表达出的蛋白。
WO 97/02343中记载了在啤酒酵母(S.cerevisiae)中表达III型HPLC-12多肽的方法，本发明与之不同之处在于，本发明使用的宿主细胞是下面所描述的糖基化缺陷型。
如果III型AFP没有与信号序列相连接，则可以使用标准技术，如裂解细胞并从细胞裂解液中纯化重组蛋白，来从宿主细胞中回收上述蛋白。如果使用了信号序列，则可以从培养物上清液中回收所述蛋白。
糖基化能力降低的真菌宿主细胞
通过抑制或消除宿主细胞中与糖基化途径相关的基因产物如酶的活性的方法，来达到降低AFP糖基化程度的目的。优选地，所述糖基化是O-糖基化，该过程是将糖部分侧链连接到蛋白表面的丝氨酸和/或苏氨酸残基上。
在一个优选实施方式中，降低糖基化程度是通过如下方法达到的，即筛选缺乏一种或多种蛋白糖基化相关酶活性的表达生物体菌株。优选地，所述酶是一种有关将糖残基直接连接到蛋白底物氨基酸侧链上的酶。更优选地，是一种有关将甘露糖残基连接到蛋白底物丝氨酸或苏氨酸残基的羟基上(O-糖基化)的酶。因为在给定真菌菌株中有几种酶在起作用，因此需要筛选缺乏特异性影响III型HPLC-12糖基化过程的酶活性的菌株。
与某种感兴趣的酶对应的基因发生一个或多个突变，导致宿主菌株成为缺乏该酶活性的缺陷型。突变可发生在编码序列，如影响多肽活性、构象和/或稳定性的插入、缺失或替换。突变也可发生在调控序列，如启动子和/或5′UTR，导致基因产物表达量降低。此外，另外一种与该酶相互作用的基因产物发生了突变，也可能影响该酶的活性。
典型的，合适的表达菌株选自糖基化缺陷型突变菌株，已经鉴定出了这样的菌株，并在这些菌株中进行了表达。例如，在啤酒酵母中表达时，至少已经鉴定出了四种基因，其编码的蛋白涉及将甘露糖残基转移到蛋白丝氨酸或苏氨酸残基的过程，所述基因的名称分别为pmt1、pmt2、pmt3和pmt4。本发明人对如下的突变株进行了研究，其中突变株已经破坏了已知的一种或几种上述基因的活性。从而发明人能够判断出是pmt1还是pmt2的破坏能够有效降低所分泌的III型HPLC-12的糖基化的程度。同时发现突变还能影响分泌蛋白的产量，并且发现对于本发明目的来说，最优选地应当破坏的基因是pmt1，因为破坏pmt1基因，所产生的未糖基化的、具有活性的III型HPLC-12蛋白的产量最高。相比之下，破坏pmt4基因对糖基化程度或蛋白产量没有明显的影响。
相应的，本发明提供了一种制备具有增强了的特异AFP活性的III型HPLC-12或其功能等同物的方法(与亲代菌株所产生的蛋白相比较)，该方法是在缺乏一种或多种由pmt1和pmt2基因或其同源基因编码的酶活性的真菌宿主菌株中表达编码所述蛋白的核酸序列。优选地，被破坏的基因是pmt1。
在本文中，术语“同源”是指这样的基因，其编码的基因产物与pmt1或pmt2所编码的基因产物具有相同的功能。
在一个优选实施方式中，真菌宿主细胞是一种pmt1基因和/或pmt2基因已被破坏的啤酒酵母细胞(Saccharomyces cerevisiae)。
由选定的表达菌株生产出的III型HPLC-12，其糖基化程度可以通过对上述分子量增大的修饰蛋白灵敏的方法来很方便地测定出来。例如，通过SDS-PAGE电泳就能很明显地观察到所连接的多糖的量。另外在实施本发明方法时，还可以进一步制备抗体，特别是针对HPLC-12的抗体，进行Western杂交，检测AFP(包括糖基化和未糖基化的)的特异性条带，背景是其它蛋白形成的很弱的条带。例如这样可以鉴定出能够有效抑制HPLC-12糖基化的菌株，而不需要从分泌物进入的培养基中纯化HPLC-12的步骤。可以使用常规的方法制备合适的单克隆或多克隆抗体。可选择的，还可以使用反相HPLC检测III型HPLC-12糖基化和未糖基化的水平。此外，还可以使用HPLC系统结合质谱分析来研究特定的糖型(glycoforms)。
本发明人使用上述方法，如SDS凝胶电泳、Western杂交、HPLC分析和结合质谱分析的HPLC，来鉴定优选地用于生产III型HPLC-12的啤酒酵母菌株。还可以使用上述方法进行进一步的研究，筛选出该物种的其它突变菌株或筛选出其它物种的突变菌株，目的是筛选更加有效的表达宿主。可选择的，对含有至少部分纯化III型HPLC-12蛋白的制备物进行重结晶抑制特性分析，以发现在怎样的条件下或哪种菌株能够产生大量的活性蛋白。
在判断表达产物是否能用作抗冻蛋白时，鉴别其是否存在糖基化是一个关键的衡量标准，因此本发明人提供了分析是否存在糖基化的方法，本发明人还提供了一种用于鉴定适于生产大量活性III型HPLC-12蛋白的真菌菌株的一般方法。
在啤酒酵母中，已鉴定出多种其它基因，它们的表达产物是涉及糖基化更晚步骤的酶，而且在一些情况下，这些酶还涉及O-位点和N-位点连接的糖基化过程(Strahl-Bolsinger等(Biochimica etBiophysica Acta 1426(1999)297-307))。另外还原则上研究了上述基因被破坏的突变株，以衡量这种突变是否有利于生产III型HPLC-12或其功能等同物。
上述方法可以很容易地扩展到其它物种的筛选。现有技术中已经记载了多种糖基化缺陷型突变株，另外也可以采用上述方法很容易地鉴定出其它突变株。例如，WO 94/04687记载了来自另外一种酵母，乳克鲁维氏酵母(Kluyveromyces lactis)的pmt1同源序列的克隆。根据酵母(Saccharomyces)基因的序列信息设计引物，利用PCR可以很容易地得到上述克隆。作者还进一步描述了允许构建突变株的乳克鲁维氏酵母(Kluyveromyces lactis)基因的序列特征。上述技术方案同样可以直接适用于其它真菌。本发明人发现在酵母中由pmt1和pmt2基因编码的酶对III型HPLC-12的糖基化过程影响最大，在上述发现的启示下，在其它物种中应当同样存在适于作为破坏靶的与上述酶同源的蛋白。如果要想获得合适的候选糖基化突变株，或需要构建其它真菌物种的糖基化突变株，则同样可以使用作者所列举的用于酵母的筛选方案，以鉴定出能够获得最高产量的活性III型HPLC-12的菌株。
在其中一个实施方式中，筛选合适的糖基化缺陷型宿主细胞的方法如下：将一组宿主细胞诱变，获得一组突变的宿主细胞，然后按照上述筛选细胞的方法筛选出具有蛋白糖基化缺陷，特别是具有III型AFP糖基化缺陷的细胞组。可以使用标准技术来实施细胞诱变过程，如使用破坏DNA的化学品或UV/X射线辐射进行随机诱变，或使用某一真菌物种已知pmt基因的定向引物靶向其它物种的同源序列来进行定点诱变。
用于表达的物种可以是任何合适的真菌物种，包括酵母，如但不限于酵母属(Saccharomyces)、克鲁维氏酵母属(Kluyveromyces)、毕赤氏酵母属(Pichia)、汉逊氏酵母属(Hansenula)、假丝酵母属(Candida)、裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)等，和丝状物种，如但不限于曲霉属(Aspergillus)、木霉属(Trichoderma)、毛霉属(Mucor)、链孢霉属(Neuroapora)、镰孢属(Fusarium)等。优选地，所选择的物种是酵母，更加优选地，是酵母属，如啤酒酵母。已经表明上述属的许多种类在表达异源基因时都会发生不正常的糖基化。
然而，在一个可选择的实施方式中，所使用的真菌物种宿主菌株在自然条件下不进行显著的O-糖基化过程。因此，术语“糖基化缺陷型”在本发明中的含义不仅限于那些由于基因诱变而降低蛋白糖基化程度的宿主细胞。虽然如此，优选地糖基化缺陷型宿主细胞是那些包含一个或多个涉及蛋白糖基化的基因发生突变的宿主细胞。
AFP组合物
实施本发明的方法，可以获得具有较高活性的III型AFPs制备产物，其包含较高比例的未糖基化AFP。
因此，本发明提供了一种组合物，其所包含的重量占III型AFP总重量的至少约50％的未糖基化III型AFP的获得方法是在糖基化缺陷型的真菌宿主细胞中表达编码III型AFP的核酸序列。优选地，所述组合物所包含的未糖基化III型AFP的重量占总III型AFP重量的至少约60％、65％、70％或80％。
相应的，本发明的组合物还包含糖基化III型AFP的重量占总III型AFP重量的比例小于约50％，更优选小于约40％、35％、30％或20％。换言之，本发明的组合物所包含的未糖基化III型AFP和糖基化III型AFP的重量比为从1∶1到100∶1，更优选地，从1.5∶1到100∶1，最优选地，从2∶1、3∶1或4∶1到100∶1。因为是在真菌宿主中表达III型AFP，而不是在原核宿主中表达，因此一般会存在至少痕量的糖基化III型AFP，在原核宿主细胞中表达III型AFP则不会存在上述情况。
在一个优选实施方式中，本发明的组合物包含重量比为50％到99％的不具有O-糖基化的III型AFP。
另外，优选组合物中III型AFP(不管糖基化类型)占蛋白总含量的至少30％，更优选为至少40％、50％或60％。当将AFP用于化妆品或药物用途时，优选AFP组合物中III型AFP(不管糖基化类型)占蛋白总含量的至少90％，更优选为至少95％、98％或99％。
本发明将结合如下的实施例对本发明作进一步的描述，这些实施例仅是用于描述本发明而不是限定本发明。实施例参考如下的附图：
附图说明
附图1a图示实施例中所用到的rDNA整合序列组件。该序列组件包含如下序列：
1-126 NTS1-啤酒酵母rDNA的非转录间隔区
127-2186啤酒酵母染色体IX DNA
114-348部分orf1＝假定蛋白
485-916 RNAse P亚基
1165-1959与葡萄糖苷酶、外唾液酸酶、粘蛋白的弱相似性。
2103-2165可疑的orf
2165-2096硫a.a.代谢的转录激活剂
2397-2197 III型HPLC12抗冻蛋白
2457-2398 ISS-啤酒酵母SUC2 I(转化酶)信号序列。
2775-2486 Pga17-啤酒酵母GAL7启动子(合成的)
4009-2801 LEU2d-啤酒酵母LEU2d
4100-4413 2u-啤酒酵母2u质粒片段(非功能的)
4420-5460 NTS2-啤酒酵母rDNA非转录间隔区
55461-5581 5S-啤酒酵母rDNA 5S RNA
5582-6238 NTS1-啤酒酵母rDNA非转录间隔区
附图1b图示质粒pUR3993。
附图2表示HPLC层析结果。
实施例
实施例1：测定由啤酒酵母产生的糖基化和未糖基化形式的III型AFP HPLC-12在抑制重结晶方面的活性。
从发酵培养液中制备浓缩的糖基化和未糖基化III型AFP组分。
用吸管将包含III型AFP HPLC-12的发酵培养液(15ml)分别转移到锥形试管中，并加入10ml冷冻的乙醇，混合5秒钟。
如果pH低于6.0，则用1M的NaOH校正pH值。然后将试管置于冰浴中至少20分钟或置于冰箱中过夜，然后在5℃、3000rpm下离心5分钟。然后将上清液轻轻倒入另外一个锥形试管中。向沉淀中加入浓度为40％、pH为6.0的乙醇，然后置于冰浴中至少20分钟或置于冰箱中过夜，然后如上所述进行离心，从而使沉淀得到洗涤。最后，用超纯水将沉淀洗入预先称重的烧瓶中，通过冻干进行冷冻干燥。
将上述过程中得到的上清液轻轻倒入预先称重的离心瓶中，并在约4000rpm下至少再次离心20分钟。将上清液转移到另外的圆底烧瓶中进行旋转蒸发。进行旋转蒸发是为了去除上清液中的乙醇，因而水浴的温度不能超过35℃。在去除乙醇之后，将含水上清液转移到预先称重的烧瓶中，进行冷冻干燥，去除水分。
表1显示了所得到的冷冻干燥产物中，未糖基化III型AFP和糖基化III型AFP的含量。
表1：III型AFP在乙醇处理的沉淀和上清液分别进行冷冻干燥后 的产物中的分布情况。
  材料   未糖基化的AFP占蛋白总量的百分比   糖基化的AFP占蛋白总量的百分比
  乙醇处理的上清液冷冻干燥后的产物   0.4   41
  乙醇处理的沉淀冷冻干燥后的产物   39.5   19
在乙醇处理的沉淀中包含一定量的未糖基化产物的同时，上清液中所富含的糖基化产物(占蛋白总量的41％)比其所含的非糖基化成分(占蛋白总量的0.4％)要多的多。
重结晶抑制(RI)试验
用糖基化HPLC 12的重结晶抑制活性来代表糖基化和未糖基化III型AFP的活性。制备含有0.0004％蛋白、浓度为30％的蔗糖溶液样品，并进行RI试验(设置3个重复)。同时对两个对照样品进行测定，对照样品分别为：浓度为30％的蔗糖溶液(即不包含AFP)，和浓度为0.0004％的未糖基化HPLC 12。表2显示了在-6℃下进行重结晶1小时后，所形成的冰晶平均尺寸变化的试验结果。
                 表2：RI抑制结果
  测试溶液   冰晶增大结果(微米)
  蔗糖溶液对照样品   13.0±0.5
  未糖基化的III型AFP HPLC 12   0.7±0.5
  糖基化的III型AFP HPLC 12   13.4±0.5
上述结果表明未糖基化的III型AFP HPLC-12具备活性，因为它与对照蔗糖溶液相比，显著降低了冰晶的增大量。而糖基化的HPLC-12则显示出与蔗糖溶液相同的冰晶增大量。因此，糖基化的III型AFPHPLC-12不能影响重结晶，即其不具备活性。
实施例2：蛋白甘露糖基转移酶(pmt)缺陷型突变株的制备
以啤酒酵母VWK18gal1(MATa、leu2、gal1：URA3、ura3)来构建pmt缺陷型突变株，其中使用了cre/lox基因破坏系统，Guldener等已经描述过该系统(Nucleic Acids Res 24(13)：2519-24，1996)。使用loxP-Kan-loxP序列组件进行PCR，得到短的侧翼同源序列的DNA片段。利用诊断性PCR验证序列组件的整合是否正确，之后利用cre重组酶的表达去除Kan基因。利用诊断性PCR验证是否正确地去除了序列组件，如果去除正确，则得到带有剩余的一个loxP位点的缺失基因。
构建如下的缺失：
pmt1(201，2350)：：loxP
pmt2(50，2229)：：loxP
pmt4(09，2289)：：loxP
实施例3：构建用编码III型AFP HPLC-12的基因转化的酵母突变菌株
为了构建能够有效表达、并且能够调控表达AFP的菌株，用来自pUR3993质粒的ISP表达序列组件的多个拷贝转化啤酒酵母VWK18gal1宿主菌株的pmt突变株，按照Lopes等所描述的，将整合位点设定在rDNA基因座(Gene 1989 Jul 15；79(2)：199-206)。用HpaI消化完整质粒，切除其中的rDNA整合序列组件，然后使用醋酸锂转化方法(Gietz R.D.和Woods R.A Methods Enzymol 2002；350：87-96)将大约6283bp的片段转导到宿主菌株。
详细的r DNA整合序列组件和pUR3993质粒的结构分别显示在附图1(a)和(b)中。选择能够在不含亮氨酸的基础培养基上生长的转化子，并从中筛选那些在含有葡萄糖作为碳源和半乳糖作为诱导剂的培养基上生长，并产生AFP的转化子。
实施例4：测定发酵样品中AFP III HPLC-12的含量
使用反相HPLC对样品成分进行分离，所使用的柱子是C18柱，并利用UV检测技术，参考纯化标准在214nm下测定III型AFP HPLC-12的含量。
仪器：
AKTA Explorer XT 10
分析天平
各种玻璃器皿
各种移液管(最低限度是b级)
试剂：
超纯水         Milipore水系统
乙腈           HPLC级，远紫外
三氟乙酸(TFA)  HPLC级
异丙醇         HPLC级
制备洗脱液：
洗脱液A：0.05％的TFA超纯水溶液
将1ml的TFA稀释到2升的超纯水中，混合。
洗脱液B的制备：0.05％的TFA乙腈溶液
将0.5ml的TFA稀释到1升的乙腈中。
量取/称取三份一定体积或重量的测试材料，分别置于50ml的容量瓶中，并用洗脱液A定容。在进行分析前，使用后面的特定AKTA条件对样品进行过滤。以纯化的未糖基化III型AFP作为量化标准。具有代表性的发酵样品的层析结果显示在附图2中。
用于分析III型AFP的HPLC条件如下：
  注入类型注入环注入体积针头洗涤液数据处理柱子流动相线性梯度流速 ：：：：：：：：：：   部分填充100μl50μl20％的IPACompaq deskpro计算机Windows NTUNICORN V3.21软件UNICORN/A-900软件Vydac蛋白/肽C18 218TP54完全0.05％TFA的超纯水溶液B1，0.05％TFA的乙腈溶液T0→T5：完全100％T5→T35：完全100％→完全42％，58％B1T36→T40：完全42％，58％B→100％B1T40→T41.5：100％B1→完全100％T41.5→T44：完全100％1.0ml/分钟
AKTA Explorer 10XT层析系统适于与A900自动上样仪和三波长UV检测器合用。在量化时使用214nm下的信号信息。其它波长，如254和280nm下的信号仅用于指纹鉴定。
实施例5：pmt对实验室规模的发酵容器中生产的III型AFP HPLC-12的影响。
将每一个pmt突变株进行发酵，以检测pmt缺失为AFP产物带来的影响，比较的对象是不含任何pmt缺失的亲代菌株。发酵过程如下所述。
接种制备
将1.4ml的菌株甘油储备液接种到包含50ml培养液的摇瓶中，培养液的组成为：6.7g/l的YNB(酵母营养培养液)w/o氨基酸(Difco)和5g/l的葡萄糖·laq(Avebe)，在30℃、120rpm下培养48小时。随后将接种液转移到包含500ml培养液的摇瓶中，培养液的组成为：10g/l酵母提取物(Difco)、20g/l的Bacto Pepton(Difco)和20g/l的葡萄糖·laq，之后在30℃、120rpm下培养24小时。
补料分批发酵
每批培养液为5.5L，其组成为：22g/kg的葡萄糖·laq、10g/kg的酵母提取物KatG(Ohly)、2.1g/kg的KH2PO4、0.6g/kg的MgSO4·7H2O、0.4g/kg的Struktol J673(Schill和Seilacher)、10g/kg的Egli微量金属(100x溶液，含有5.5g/l CaCl2·2H2O、3.73g/lFeSO4·7H2O、1.4g/l MnSO4·1H2O、1.35g/l ZnSO4·7H2O、0.4g/lCuSO4·5H2O、0.45g/l CoCl2·6H2O、0.25g/l NaMoO4·2H2O、0.4g/lH3BO3、0.25g/l KI、30g/l NaEDTA)、1g/kg Egli维生素(1000x溶液，含有5g/l维生素B1、47g/l肌醇、1.2g/l维生素B6、23g/l泛酸、0.05g/l生物素)。4L的补充培养液包含440g/kg葡萄糖·laq、3g/l半乳糖(Duchefa)、25g/kg酵母提取物、12g/kg KH2PO4、2.5g/kgMgSO4·7H2O、0.8g/kg Struktol J673、20g/kg Egli微量金属、2g/kgEgli维生素。
在标准的生物反应器中进行补料分批发酵，反应器的工作体积是10升。用Ingold DO2电极(Mettler-Toledo)测定培养液中溶解的氧(DO2)，通过自动校正，使6叶轮Rushton推进器的速度控制在最大1000rpm内。使用Ingold Impro 3100凝胶电极(Mettler-Toledo)测定pH，并用3M的磷酸(Baker)和12.5％v/v的氨水(Merck)进行调节。使用PT100电极测定温度，并通过冷却套和冷却和加热指针来调控温度。
将500ml生长良好的接种物转移到分批培养液中，从而开始分批发酵阶段。温度保持在30℃，气流保持在2 l/分钟。DO2控制在30％以上，pH控制在5.0。当废气中的乙醇含量降低到300ppm以下时，开始补料阶段。在补料阶段，使温度降低到21℃，气流定为6 l/分钟。根据指数曲线确定补料比率，使生长速度保持在0.06 l/小时。维持上述指数式补料，直到发酵容器中的DO2水平降低到15％以下，随后将补料比率维持线性。
表3：使用反相HPLC测定的糖基化和来糖基化III型AFP HPLC- 12的产量
  测试微生物   AFP总量，以亲代菌株生产能力作为标准  未糖基化的AFP占总量的百分比   未糖基化AFP生产增加倍数
  亲代菌株   1.0  23％   1
  Pmt1突变株   0.79  67％   2.3
  Pmt2突变株   0.61  71％   1.9
  Pmt4突变株   0.93  23％   0.93
表3显示了使用反相HPLC检测到的经过60小时的发酵后，总AFP的产量，以及pmt缺失对未糖基化AFP生产能力的影响。
表3中的数据表明，与亲代菌种相比，pmt1缺失和pmt2缺失均能够提高所生产的未糖基化AFP的百分比。尽管pmt1和pmt2突变株的总AFP产量有所降低，但是未糖基化AFP的产量却是升高了，这是因为降低了糖基化活性，在pmt1和pmt2突变株中，未糖基化AFP的产量分别提高了2.3倍和1.9倍。相比之下，很明显pmt4缺失对提高未糖基化产物的百分比没有作用，但其AFP的总产量却有所下降。比较亲代菌株和pmt1突变株的SDS凝胶蛋白图谱，结果表明原先的非缺陷型菌株包含糖基化和未糖基化的AFP，而pmt1突变株产生的主要是未糖基化的AFP(数据未显示)。摇瓶筛选试验也得到了上述类似的结果。
这从而提供了一种相对快速的用于鉴定具有降低的AFP蛋白糖基化能力的菌株的筛选方法。
实施例6：转化突变菌株所分泌的III型AFP HPLC-12糖基化方式的分析
使用HPLC-MS对pmt1突变株的III型AFP型和原先的非缺陷型菌株的糖型进行了比较研究。使用它们各自的最大丰度的质子化分子离子的选择离子检测(SIM)质谱应答，比较了与AFP主要糖型相对应的糖基化水平和AFP相对丰度。测定步骤采用了正电喷射离子化质谱仪。分离步骤使用了如下描述的反相HPLC柱，洗脱是梯度洗脱。
仪器和试剂：
1050 HPLC组件(Hewlett Packard)
Quattro I质谱仪(VG，现在的Micromass)
PRP1柱4.6×250mm(Hamilton)
超纯水-Millipore-Q水系统
乙腈 梯度  HPLC级
HPLC流动相的制备
A：1％乙酸水溶液
B：1％乙酸的80％aq.乙腈溶液
样品制备
将样品以1∶50的比例稀释在水中(即将1g样品溶解到50ml水中)，在进行分析前经过过滤(0.45μm或更小孔径的注射式过滤器)。
装备条件
  HPLC系统
  UV检测器注入体积柱子流动相流速整个分析过程   214nm20μl(部分填充注入环)Phenomenex Jupiter C18 孔径 300埃，150×2.1 id mm温度维持在30℃A：1％乙酸的水溶液B：1％乙酸的80％aq.乙腈溶液1ml/分钟
  时间   74分钟
  梯度   分钟0105557626474   ％B1010651001001010
在层析分离之后，采用1/5的断裂速度，使得以200μl/分钟的速度传递到质谱仪上。
QuattroI质谱仪
  匹配安装说明文件(tune pagesettings file)   毛细管视锥(cone)HV透镜信号源阻断温度去溶剂化温度增效器去溶剂化气体流速雾化器气体流速   3.2V规划作为本方法的一部分0.6V150C150C650V300l/小时25l/小时
  MS方法   收集20到60分钟之间的数据
  扫描：m/z 100到2000(扫描时间：5秒钟，内扫描滞留：0.1秒)
  SIR函数1(III型AFP片段示踪)284.4m/z视锥电压70V(III型AFP C-末端最后3个氨基酸带有标记物)，和163.01m/z(氧鎓离子，糖肽的标记物)(广度为1Da，停留时间0.08秒，内通道滞留时间0.02秒)
  SIR函数2(AFP糖型的六种电荷状态下的离子)1308、1335、1362、1389、1416、1443、1470和1497m/z，视锥电压20V(广度1Da，停留时间0.08秒，内通道滞留时间0.02秒)。
表4显示pmt1菌株生产未糖基化III型AFP的产量从23％升高到67％，同时尽管降低了糖基化产物的水平，其中糖基化产物的糖基化形式与来自非缺陷型亲代菌株的糖基化产物类似。
                        表4
  占III型AFP HPLC-12总量的百分比％
  亲代   Pmt1突变株
  糖基化类型
  未糖基化的   25   67
  +5甘露糖   4.5   2.2
  +6甘露糖   10.5   4
  +7甘露糖   11   5.5
  +8甘露糖   13   5.8
  +9甘露糖   12.5   5
  +10甘露糖   9   3.2
  +11甘露糖   8   4
  +12甘露糖   6.5   3.3
上文中所有提到的出版物在本申请中引作参考。对本发明所记载的方法和体系作出的任何修改和变化，对本领域技术人员来说均是显而易见的，均包括在本发明所要求保护的范围内。尽管本发明结合特定的优选实施例进行了描述，但应当理解本发明所要求保护的范围不局限于这些特定的实施例。事实上，对本发明所记载的实施方式作出的各种对分子生物学或相关领域的技术人员来说是显而易见的修改，均理应包含在本发明权利要求书所要求保护的范围内。
序列表
<210>1
<211>66
<212>PRT
<213>Macrozoarces americanus
<400>1
Asn Gln Ala Ser Val Val Ala Asn Gln Leu Ile Pro Ile Asn Thr Ala
1               5                   10                  15
Leu Thr Leu Val Met Met Arg Ser Glu Val Val Thr pro Val Gly Ile
            20                  25                  30
Pro Ala Glu Asp Ile Pro Arg Leu Val Ser Met Gln Val Asn Arg Ala
        35                  40                  45
Val Pro Leu Gly Thr Thr Leu Met Pro Asp Met Val Lys Gly Tyr Pro
    50                  55                  60
Pro Ala
65
(在Swiss-Prot蛋白数据库，通过登记号P19614鉴定出III型HPLC-12抗冻蛋白)

Claims (11)

1.一种生产III型抗冻蛋白(AFP)的方法，该方法包含在蛋白糖基化缺陷的真菌宿主细胞中表达编码AFP的核酸序列。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述真菌宿主细胞蛋白糖基化缺陷是通过使一个或多个编码蛋白糖基化相关酶的基因发生突变而形成的。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中真菌细胞是O-糖基化缺陷的。
4.根据上述任一权利要求所述的方法，其中真菌细胞是一种或多种蛋白甘露糖基转移酶活性缺陷的。
5.根据上述任一权利要求所述的方法，其中真菌细胞是酵母。
6.根据权利要求5所述的方法，其中所述酵母是pmt1缺陷型突变菌株。
7.根据权利要求5或6所述的方法，其中所述酵母是pmt2缺陷型突变菌株。
8.根据权利要求5-7任一权利要求所述的方法，其中所述酵母是啤酒酵母(Saccaromyces cerevisiae)。
9.根据上述任一权利要求所述的方法，其中所述III型AFP是III型HPLC-12。
10.一种包含重组III型抗冻蛋白(AFP)的组合物，其中大约50％到99％的AFP是未糖基化的。
11.根据权利要求10所述的组合物，其中III型AFP是III型HPLC-12。
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