CN1149281C - 活化细胞周期蛋白依赖性激酶的激酶及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及具有下列共同特征的蛋白激酶家族：它们缺乏保守序列GxGx(Y/F)GxV，它们具有一种非细胞周期蛋白依赖性CAK活性，该家族的蛋白激酶的抑制剂可用做杀真菌剂。

Description

活化细胞周期蛋白依赖性激酶的激酶及其应用

本发明涉及一种新的来自白色念珠菌(Candida albicans)的活化细胞周期蛋白依赖性蛋白激酶的激酶和它的应用。

细胞周期蛋白依赖性蛋白激酶(Cdk)是真核生物的细胞分裂周期调节因子，在细胞周期的G1/S期转变和G2/M期转变水平都是必需的。酿酒酵母(Saccharomyces cerevisae)的CDC28和栗酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)的CDC2是被确认的第一批Cdk。

Cdk的活化需要一个细胞周期蛋白分子的附着和Cdk的磷酸化，磷酸化位置是在被称做“T环”区的保守苏氨酸残基。

现已证明这种磷酸化作用是由一种被称做“Cdk活化激酶(CAK)”的激酶来完成的，在脊椎动物中，它以一种异质三联体的形式存在，包括一个催化亚基，称为Cdk7；一个细胞周期蛋白类型的亚单位，称为细胞周期蛋白H和因子MAT-1[参见综述，SOLOMON，生化科学趋势(TrendsBiochem.Sci)，19，496-500(1994)]。Cdk7-细胞周期蛋白H复合物另外还是TFIIH复合物的一个成分，该复合物在由RNA聚合酶II引起的基因基础转录中是必需的，并且参与该聚合酶的大亚单位羧基末端区(CTD)的重复序列的磷酸化作用。

在栗酒裂殖酵母的裂体生殖中，一种类似Cdk7-细胞周期蛋白H的、包含称做Crk1的催化亚单位和称做Mcs2的调节细胞周期蛋白的复合物被识别。现已证明Crk1基因对细胞生存能力是不可缺少的，并且已经在体外观察到Crk1-Mcs2复合物是与CAK活性和CTD-激酶活性有关的。[BUCK等，EMBO J.，14(24)，6173-83(1995)；DAMAGNEZ等，EMBO J.，14(24)，6164-72(1995)]。

在刚发芽的酿酒酵母中，一种包含有分别在其序列水平与激酶Cdk1和crk1及与调节蛋白细胞周期蛋白H和Mcs2相关的一种激酶(Kin28)和一种细胞周期蛋白(Ccll)的复合物也已被识别。复合物Kin28-Ccll形成复合物TFIIH的一部分，并有CTD-激酶活性，但是不涉及CAK活性。

最近，发明者已经在酿酒酵母中鉴定出一种具有CAK活性的激酶，这种激酶被叫做CIV1(体内CAK)，对应的基因被叫做CIV1(THURET等，细胞(Cell)，86(4)，1996)。这些结果已经被其他研究组确认[KALDIS等，细胞(Cell)，86(4)，553-564(1996)；ESPINOZA等，科学(Science)，273(5282)，1714-1717 1996)]。酿酒酵母CAK都是与丝氨酸-苏氨酸激酶家族有关的，特别是与蛋白激酶CDC2和CDC28有关，它与先前在其他的机体中鉴定的CAK的不同在于缺乏甘氨酸丰富的保守基序GxGx(Y/F)GxV，该基序在大多数蛋白激酶中都存在，即一个5～29氨基酸的插入序列，位于在Cdk家族中保守的二级结构成分之间；不同之处还有其CAK活性并不需要其整合到酶复合物中。

CIV1的CAK活性对细胞的分裂和存活不可缺少，发明者已经在进行研究：是否在致病性酵母中存在与CIV1同源的基因，编码具有CAK活性的蛋白激酶。的确，在这种情况下，得到调节这种活性的方法，特别是得到抑制剂，从工业或治疗学的观点上看都将是非常有意义的，主要是对杀真菌剂的生产尤为重要。

为了这个目标，发明者首先使用来自酿酒酵母CIV1基因的各个不同区域的探针着手对致病性酵母白色念珠菌的DNA文库进行了筛选。但任何一个被使用的探针都没能探测到白色念珠菌基因组中有同源序列的存在。

不过发明者已经研究了是否白色念珠菌可能拥有酿酒酵母CAK的功能类似物，方法是通过检查白色念珠菌里是否有一个或多个在酿酒酵母中有能力使CIV1基因的热敏感突变体恢复CAK功能的基因。这样他们成功地鉴定出一个白色念珠菌基因，它自身能在突变体中补充恢复有缺陷的CAK功能。

这个被叫做CaCIV1的基因序列已经被确定下来；它在所附的序列表中以SEQ ID No：1被列出；它的翻译产物叫做CaCIV1，在SEQ ID No：2下列出。

图1表示的是CaCIV1的氨基酸序列(单字母代码)与酿酒酵母CAK的氨基酸序列(叫做ScCIV1)的比较，以及与酿酒酵母激酶CDC28(叫做ScCDC28)的氨基酸序列的比较。在ScCIV1和CaCIV1中保守的残基用黑体字母表示。

对图1注释的图例说明：

k＝在大部分的蛋白激酶中保守的残基；

·＝在Cdk家族中经常出现的残基；

o＝总是在Cdk家族中出现的残基；

+＝在Cdk家族和ScCIV1中出现的残基；

二级结构：a＝α螺旋；b＝β片层。

CaCIV1在所有的氨基酸序列中仅仅与酿酒酵母的CAK即ScCAV1具有28％的同一性。

不过，在ScCIV1和CaCIV1之间的相似性得以定义一个激酶家族—下文称为CIV1，包括具有下列特征的蛋白质：

-它们缺乏基序GxGx(Y/F)GxV，其中G表示甘氨酸，x表示任一氨基酸，Y/F表示酪氨酸或苯丙氨酸之一，V表示缬氨酸；

-它们拥有非细胞周期蛋白依赖性的CAK活性。

本发明包含属于如上面定义的CIV1家族的蛋白激酶，但除酿酒酵母CAK ScCIV1之外。

根据本发明的一个优选实施方案，所说的蛋白激酶可以从一种子囊菌中获得，有利地是从半子囊菌，优选是从白色念珠菌中得到。

本发明的蛋白激酶是例如在所附的序列表中以SEQ ID No：2列出的蛋白激酶。

本发明的主题也包括编码一种本发明蛋白激酶的核酸序列。

一种本发明的核酸序列是例如在所附序列表中以SEQ ID NO：1列出的序列。

本发明的主题也包括至少18bp的核酸片段，它同源或互补于一个编码本发明的CAK特异的多肽序列的核酸序列。

这些片段可以被特别用做杂交探针和/或扩增引物，用于在白色念珠菌中分离和/或克隆编码本发明的CAK的核酸序列。

本发明也包括至少15bp的核酸片段，优选是至少18bp的片段，它同源或互补于一个编码在本发明的CAK CaCIV1蛋白激酶家族和酿酒酵母的CAK ScCAV1间保守的多肽序列的核酸序列。

这些片段特别可以用做杂交探针和/或扩增引物，以用于在除酿酒酵母和白色念珠菌以外的机体中检测编码与CAK CaCIV1和ScCIV1相关激酶的序列的存在，以及分离或克隆被识别的基因。本发明也包含以这种方式获得的核酸序列，和被这些序列所编码的CAK CaCIV1和ScCIV1家族的蛋白激酶。

本发明的主题也包括将至少一个本发明的核酸序列插入到一个合适的载体而构成的任何重组载体，特别是任何表达载体。本领域技术人员可以很容易选择出一个合适的载体，他可以在众多的现有载体中，根据选择用于扩增和/或表达本发明核酸的宿主细胞来选择。

本发明也包括用本发明的核酸序列转化的原核或真核细胞。这些转化细胞可以被特别用于表达一种本发明的激酶，例如为了从细胞培养基中将其纯化，例如使用类似于发明人先前对酿酒酵母CIV1叙述过的技术(THURET等，1996，上述引用的出版物)，或通过适当的细胞生存能力实验来检测它的活性。

本发明对激酶ScCIV1和CaCIV1功能同源性的证明使人们可以设计该激酶家族的许多应用。

特别地，由于该激酶家族看来的非细胞周期蛋白依赖性CAK活性是细胞分裂和存活所必需的，抑制这种活性的物质可以用做杀真菌剂，作为药物或在工业水平使用。

例如，为了筛选如对白色念珠菌有活性的杀真菌物质，在每种想确定其杀真菌性质的产物存在下，测定CaCIV1-或其CIV1家族中非细胞周期蛋白依赖性CAK的功能性类似物—的激酶活性，并选择对这种活性具有抑制作用的产物。

这种筛选可以在待测的潜在活化剂或抑制剂存在下，通过测定CIV1家族CAK的激酶活性来完成。例如，激酶活性可以在体外被测定，或者直接在合适的反应混合物中，检测一种多肽或一种底物蛋白如CDC28或Cdk2，或蛋白MBP(髓磷脂碱性蛋白)的磷酸化作用，或者间接检测和/或测定底物蛋白的活性，而后者依赖于磷酸化作用。

激酶活性也可以通过细胞生存能力试验在体内测定，例如CaCIV1的激酶活性可以在不表达CAK ScCIV1但用CaCIV1基因转化的酿酒酵母突变体细胞中有利地测定。

本发明也包括一种如上述因其对CIV1家族非细胞周期蛋白依赖性CAK的抑制活性而被选择的产物在生产杀真菌剂中的应用。

本发明在下面的进一步描述中会更清楚地得以理解，其中实施例描述了CaCIV1 CAK活性的检测和相应基因的克隆。

                         实施例

酿酒酵母株CMY975(基因型CIV1-2 ura3 leu2 trpl lys2 ade2 adeS)携带CIV1基因的一个热敏感性突变，并且因此生长于24℃而不是37℃。

这株酵母的培养物按醋酸锂法[SCHIESTL和GIETZ，当前遗传学(Current Genetics)，16，339-346，(1989)]用克隆到载体YEp24 BamHI位点(多拷贝-URA3)[Botstein等，基因(Gene)8，17-24，(1979)]的白色念珠菌Sau3基因组片段文库转化。

CMY975细胞被接种在含有无尿嘧啶的合成培养基的平皿中，37℃培养。

获得了此条件下生长的10个CMY975菌落。从这些菌落中回收这些含有白色念珠菌插入序列的YEp24质粒，在大肠杆菌中扩增。

确定这些质粒中每一个的酶切图谱，得以观察到所有插入序列来自白色念珠菌基因组的同一区域。对该区域的测序可以确认编码一个339个氨基酸的蛋白激酶的同一开放读码框架，这显示这10个分别获得的插入序列相应于一个相同的白色念珠菌基因，这个基因被称为CaCIV1。

CaCIV1的序列在所附序列表中在SEQ ID NO：1下给出，蛋白CaCIV1的序列在SEQ ID NO：2下给出。CaCIV1蛋白序列与在数据库中的序列进行的比较显示：这种蛋白与酿酒酵母的CAK ScCIV1的氨基酸同一性仅为28％，与酿酒酵母的Cdk ScCDC28和白色念珠菌的CaCDC28的氨基酸同一性为24％。

将一段含有CaCIV1基因的3kb BamHI-ClaI基因组片段亚克隆到着丝粒质粒TRP1 pRS414[SIKORSKI和HIETER，遗传学(Genetics)，122，19-27(1989)]中。这个质粒被用于转化酿酒酵母突变体，其中ScCIV1序列被从基因组中删除，而在复制型质粒中含有ScCIV1基因，它也携带选择性基因URA3(CMY11G株基因组ura3 leu2 trpl lys2 civl LEU2/pJG43(URA3-ScCIVI))。pRS414-CaCIV1质粒转化的细胞经过反向选择后并且缺失了pJG43质粒(URA3-ScCIV1)是能够生长的，这证实CaCIV1基因可以功能性代替必需的ScCIV1基因。因而，CaCIV1编码一种ScCIV1的功能性同系物，并且足以恢复CAK活性。

                             序列表

<110>FAYE，Gerard

    VALAY，Jean Gabrie1

    MANN，Carl

    CEA

    INSTITUT CURIE

    CNRS

<120>活化细胞周期蛋白依赖性激酶的激酶及其应用

<130>MJPrm263/33

<140>

<141>

<150>FR 9710287

<151>1997-08-12

<170>PatentIn Vers.2.0

<210>1

<211>1020

<212>DNA

<213>白色念珠菌

<220>

<221>CDS

<222>(1)..(1020)

<400>1

atg aag ttg tca gat tat tat ata gac aag gaa tta att tac aat agt        48

Met Lys Leu Ser Asp Tyr Tyr Ile Asp Lys Glu Leu Ile Tyr Asn Ser

  1               5                  10                  15

gcc att tct gat ata tat acg gct att gat aag ttt aat aac tta cca        96

Ala Ile Ser Asp Ile Tyr Thr Ala Ile Asp Lys Phe Asn Asn Leu Pro

             20                  25                  30

gta tgt ctt aaa ata gtt gat gaa gat ttc agt ctt cca cca cat tca       144

Val Cys Leu Lys Ile Val Asp Glu Asp Phe Ser Leu Pro Pro His Ser

         35                  40                  45

atc cat cga gaa gtt ctt ata ctt aaa act ttg aaa cca cat cca aac       192

Ile His Arg Glu Val Leu Ile Leu Lys Thr Leu Lys Pro His Pro Asn

     50                  55                  60

ata att gaa tat ttt aat gat ctt aaa att tgt gac gat att ata tta       240

Ile Ile Glu Tyr Phe Asn Asp Leu Lys Ile Cys Asp Asp Ile Ile Leu

 65                  70                  75                  80

gtc acc aaa ttg tat cgt tat gat ttg agt caa ttg att gaa att aca       288

Val Thr Lys Leu Tyr Arg Tyr Asp Leu Ser Gln Leu Ile Glu Ile Thr

                 85                  90                  95

aaa tat tgt aaa cga aca aca cga ttt att tat ggt att aat ggt aat       336

Lys Tyr Cys Lys Arg Thr Thr Arg Phe Ile Tyr Gly Ile Asn Gly Asn

            100                 105                 110

ctt gtt agt aat caa tat aca ctt gct aat gaa att gaa gaa aaa gat       384

Leu Val Ser Asn Gln Tyr Thr Leu Ala Asn Glu Ile Glu Glu Lys Asp

        115                 120                 125

atc aaa tta tgg tta aaa tca atg agt tca gga ctt gaa ttt att cat       432

Ile Lys Leu Trp Leu Lys Ser Met Ser Ser Gly Leu Glu Phe Ile His

    130                 135                 140

tca caa ggg ata att cat cgt gat ata aaa ccc agt aat att ttc ttt       480

Ser Gln Gly Ile Ile His Arg Asp Ile Lys Pro Ser Asn Ile Phe Phe

145                 150                 155                 160

gcc cgg gat gat ata aca caa ccg att att gga gat ttt gat att tgt       528

Ala Arg Asp Asp Ile Thr Gln Pro Ile Ile Gly Asp Phe Asp Ile Cys

                165                 170                 175

tat gat tta aaa ctg cca cct aaa gat gaa ccc cct atg gcg aaa tat       576

Tyr Asp Leu Lys Leu Pro Pro Lys Asp Glu Pro Pro Met Ala Lys Tyr

            180                 185                 190

att gat gta tct aca ggt att tat aaa gca cca gaa ttg att ctt ggt       624

Ile Asp Val Ser Thr Gly Ile Tyr Lys Ala Pro Glu Leu Ile Leu Gly

        195                 200                 205

ata act aat tat gaa tat gaa att gat att tgg tca ttg ggt ata att       672

Ile Thr Asn Tyr Glu Tyr Glu Ile Asp Ile Trp Ser Leu Gly Ile Ile

    210                 215                 220

ttg act ggt tta tat tca gaa aat ttt caa agt gtt tta gtc aaa gat       720

Leu Thr Gly Leu Tyr Ser Glu Asn Phe Gln Ser Val Leu Val Lys Asp

225                 230                 235                 240

gat aaa gaa ttg act aat gat tct cat gtt agt gat tta tat tta tta       768

Asp Lys Glu Leu Thr Asn Asp Ser His Val Ser Asp Leu Tyr Leu Leu

                245                 250                 255

aat caa ata ttt gaa aat ttc ggt aca ccc aat tta act gat ttt gaa       816

Asn Gln Ile Phe Glu Asn Phe Gly Thr Pro Asn Leu Thr Asp Phe Glu

            260                 265                 270

gat gaa tta ttt tgt gat gaa tat aat aat gaa aac ttg cat ttt aaa       864

Asp Glu Leu Phe Cys Asp Glu Tyr Asn Asn Glu Asn Leu His Phe Lys

        275                 280                 285

aaa ttc aat tta caa aaa tat cct aga aaa gat tgg gat att att tta       912

Lys Phe Asn Leu Gln Lys Tyr Pro Arg Lys Asp Trp Asp Ile Ile Leu

    290                 295                 300

cct cga tgc aat gat gat ttc atg aaa gaa att ttt acc aag atg att       960

Pro Arg Cys Asn Asp Asp Phe Met Lys Glu Ile Phe Thr Lys Met Ile

305                 310                 315                 320

aga tat gat cga agt aaa aga ata act tct aaa gaa atc tta caa tta      1008

Arg Tyr Asp Arg Ser Lys Arg Ile Thr Ser Lys Glu Ile Leu Gln Leu

                325                 330                 335

atg tta gat tga                                                      1020

Met Leu Asp

            340

<210>2

<211>339

<212>蛋白

<213>白色念珠菌

<400>2

Met Lys Leu Ser Asp Tyr Tyr Ile Asp Lys Glu Leu Ile Tyr Asn Ser

  1               5                  10                  15

Ala Ile Ser Asp Ile Tyr Thr Ala Ile Asp Lys Phe Asn Asn Leu Pro

             20                  25                  30

Val Cys Leu Lys Ile Val Asp Glu Asp Phe Ser Leu Pro Pro His Ser

         35                  40                  45

Ile His Arg Glu Val Leu Ile Leu Lys Thr Leu Lys Pro His Pro Asn

     50                  55                  60

Ile Ile Glu Tyr Phe Asn Asp Leu Lys Ile Cys Asp Asp Ile Ile Leu

 65                  70                  75                  80

Val Thr Lys Leu Tyr Arg Tyr Asp Leu Ser Gln Leu Ile Glu Ile Thr

                 85                  90                  95

Lys Tyr Cys Lys Arg Thr Thr Arg Phe Ile Tyr Gly Ile Asn Gly Asn

            100                 105                 110

Leu Val Ser Asn Gln Tyr Thr Leu Ala Asn Glu Ile Glu Glu Lys Asp

    115                 120                 125

Ile Lys Leu Trp Leu Lys Ser Met Ser Ser Gly Leu Glu Phe Ile His

    130                 135                 140

Ser Gln Gly Ile Ile His Arg Asp Ile Lys Pro Ser Asn Ile Phe Phe

145                 150                 155                 160

Ala Arg Asp Asp Ile Thr Gln Pro Ile Ile Gly Asp Phe Asp Ile Cys

                165                 170                 175

Tyr Asp Leu Lys Leu Pro Pro Lys Asp Glu Pro Pro Met Ala Lys Tyr

            180                 185                 190

Ile Asp Val Ser Thr Gly Ile Tyr Lys Ala Pro Glu Leu Ile Leu Gly

        195                 200                 205

Ile Thr Asn Tyr Glu Tyr Glu Ile Asp Ile Trp Ser Leu Gly Ile Ile

    210                 215                 220

Leu Thr Gly Leu Tyr Ser Glu Asn Phe Gln Ser Val Leu Val Lys Asp

225                 230                 235                 240

Asp Lys Glu Leu Thr Asn Asp Ser His Val Ser Asp Leu Tyr Leu Leu

                245                 250                 255

Asn Gln Ile Phe Glu Asn Phe Gly Thr Pro Asn Leu Thr Asp Phe Glu

            260                 265                 270

Asp Glu Leu Phe Cys Asp Glu Tyr Asn Asn Glu Asn Leu His Phe Lys

        275                 280                 285

Lys Phe Asn Leu Gln Lys Tyr Pro Arg Lys Asp Trp Asp Ile Ile Leu

    290                 295                 300

Pro Arg Cys Asn Asp Asp Phe Met Lys Glu Ile Phe Thr Lys Met Ile

305                 310                 315                 320

Arg Tyr Asp Arg Ser Lys Arg Ile Thr Ser Lys Glu Ile Leu Gln Leu

                325                 330                 335

Met Leu Asp

Claims (7)

1.一种白色念珠菌(Cadida albicans)CIV1家族的蛋白激酶，其特征在于：

-它缺乏基序GxGx(Y/F)GxV，其中G表示甘氨酸，x表示任一氨基酸，Y/F表示酪氨酸或苯丙氨酸，V表示缬氨酸；

-它具有非细胞周期蛋白依赖性的CAK活性。

2.根据权利要求1的蛋白激酶，其特征是它能够从白色念珠菌中获得。

3.根据权利要求1或2的蛋白激酶，其特征是它相应于所附序列表中SEQID NO：2下给出的序列。

4.编码权利要求1的蛋白激酶的核酸。

5.将权利要求4的核酸插入到合适的载体中所构建的重组载体。

6.筛选杀真菌产品的方法，其特征是它包含如下步骤，其中在每种想确定其杀真菌性质的产品存在下，测定权利要求1所定义的CIV1家族的非细胞周期蛋白依赖性CAK的激酶活性，并选择对该活性具有抑制作用的产品。

7.一种产生杀真菌剂的方法，包括：

-按权利要求6的方法鉴别杀真菌产品；

-将所述杀真菌产品配制成杀真菌剂。