SK1922000A3 - Kinase activating dependent cyclin protein kinases, and their uses - Google Patents

Description

Oblasť tecniky

Tento vynález sa týka novej cyklinovo závislej proteínovej kinázy aktivujúcej kinázu z Candida albicans a jej použitia.

Doterajší stav techniky

Cyklinovo závislé proteínové kinázy (Cdk) sú regulátory cyklu delenia buniek v eukaryotách, ktoré sú základné v úrovniach Gl/S prechodu a G2/M prechodu bunkového cyklu. CDS28 zo Saccharomyces cerevisiae a CDC2 zo Schizosaccharomyces pombe boli prvými Cdk, ktoré sa identifikovali.

Aktivácia CDK vyžaduje pripojenie molekuly cyklínu a fosforyláciu Cdk na zachovanom treonínovom zvyšku umiestnenom v oblasti nazývanej: T slučka.

Ukázalo sa, že táto fosforylácia sa uskutočňuje kinázou nazývanou Cdk-aktivujúca kináza (CAK), ktorá u stavovcov existuje vo forme heterotriméru obsahujúceho katalyzátorovú podjednôtku nazývanú Cdk7, podjednotku cyklinového typu, nazývanú cyklín H, a faktor MAT-1 (kvôli prehladu, Solomon, Trends Biochem. Sci. 19, 496-500 (1994)). Komplex Cdk7 cyklín H je navyše zložkou komplexu TFIIH, ktorý je potrebný na bazálnu transkripciu génov pomocou RNA polymerázy II a je zahrnutý vo fosforylácii opakujúcich sa sekvencii karboxykoncovej oblasti (CTD) velkej podjednotky tejto polymerázy.

Pri delení kvasiniek Schizosaccharomyces pombe sa identifikoval komplex podobný komplexu Cdk7 - cyklín H, ktorý obsahuje katalyzátorovú podjednotku nazývanú Crkl a regulačný cyklín nazývaný Mcs2. Ukázalo sa, že Crkl gén bol podstatný pre bunkovú životaschopnosť a pozorovalo sa in vitro, že komplex Crkl-Mcs2 bol spojený s CAK aktivitou a s CTD kinázovou aktivitou (Buck a kol. EMBO J., 14(24),6173-83 (1995); Damagnez a kol. EMBO J., 14(24),6164-72 (1995)).

Pri pučaní kvasiniek Saccharomyces cerevisiae sa tiež identifikoval komplex obsahujúci kinázu (Kin28) a cyklin (Ccll), príslušne vztiahnuté, na úrovni ich sekvencie, ku kinázam Cdk7 a crkl a k regulačným proteinom cyklinu H a Mcs2. Komplex Kin28-Ccll tvorí časť komplexu TFIIH a má CTD kinázovú aktivitu, ale nie je zahrnutý v CAK aktivite.

Nedávno vynálezcovia identifikovali kinázu zodpovednú za CAK aktivitu v Saccharomyces cerevisiae. Táto kináza sa nazvala CIV1 (CAK in vivo) a zodpovedajúci gén sa nazval CIV1 (Thuret a kol., Celí, 86(4), 1996). Tieto výsledky sa potvrdili inými tímami (Kaldis a kol., Celí, 86(4), 553-564 (1996); Espinoza a kol., Science, 273(5282), 1714-1717 (1996)). Saccharomyces cerevisiae CAK je úplne vzťahovaná k serin-treonín-kinázovej rodine a najmä k proteínovým kinázam CDC2 a CDC28 a od predtým identifikovaných CAK v iných organizmoch sa líši absenciou glycinovo bohatého zachovaného motívu GxGx(Y/F)GxV, ktorý je prítomný vo väčšine proteínových kinázach, prítomnosťou inzertov 5 až 29 aminokyselín, ktoré sú umiestnené medzi zložkami sekundárnej štruktúry, ktoré sú zachované v Cdk rodine, a skutočnosťou, že jej CAK aktivita nevyžaduje jej zavedenie do enzýmového komplexu.

CAK aktivita CIV1 je základná pri delení buniek a prežití, a vynálezcovia sa podujali zistiť, či v patogénnych kvasinkách sú gény homologické s CIV1, ktoré kódujú proteínové kinázy majúce CAK aktivitu. Naozaj v tomto prípade získanie prostriedku regulácie tejto aktivity a najmä inhibitorov je velmi významné z hľadiska priemyselného ako aj z terapeutického hľadiska, hlavne na výrobu fungicídov.

Podstata vynálezu

S týmto cielom sa vynálezcovia podujali najskôr uskutočniť skríning DNA knižníc z potogénnych kvasiniek Candida albicans s použitím sond odvodených z rôznych oblastí génu CIV1 zo Saccharomyces cerevisiae. Ale žiadna použitá sonda neumožnila detegovať prítomnosť homológnych sekvencii v genóme Candida albicans.

Ale vynálezcovia testovali možnosť, či Candida albicans má funkčný analóg CAK Saccharomyces cerevisiae skúšaním či v Candida albicans je jeden alebo viacero génov schopných obnoviť v Saccharomyces cerevisiae CAK funkciu v teplocitlivom mutante CIV1 génu. Boli tiež úspešní v identifikovaní génu Candida albicans schopného komplementácie do jeho vlastnej deficientnej CAK funkcie v mutante.

Určila sa sekvencia tohto génu nazývaná CaCIVl; je uvádzaná vo zozname sekvencií v dodatku pod číslom SEKV. ID. ČÍS. 1; sekvencia jeho translačného produktu, nazvaná CaCIVl, je uvádzaná pod číslom SEKV. ID. ČÍS. 2.

Obrázok 1 predstavuje porovnanie aminokyselinovej sekvencie (1 - písmenový kód) CaCIVl s tou, ktorá je u

Saccharomyces cerevisiae CAK (nazývaná ScCIVl) a s tou, ktorá je u Saccharomyces cerevisiae kinázy CDC28 (nazývaná ScCDC28). Zvyšky zachované v ScCIVl a CaCIVl sú v hrubých písmenách.

Legenda k poznámkam obrázku 1:

k - zvyšok zachovaný vo väčšine proteínových kinázach, • = zvyšok často prítomný v Cdkv rodine, o = zvyšok vždy prítomný v Cdk rodine, + = zvyšok prítomný v Cdk rodine a v ScCIVl, sekundárne štruktúry: a = a helix, b = β list.

CaCIVl iba vykazuje na úrovni celej aminokyselinovej sekvencie 28 % identitu s CAK Saccharomyces cerevisiae,

ScCIVl.

Avšak podobnosti pozorované medzi ScCIVl a CaCIVl umožňujú definovať rodinu kinázy, tu nazývanú CIV1, zoskupujúcu spolu proteíny s nasledujúcimi charakteristikami:

neobsahujú motív GxGx(Y/F)GxV, v ktorom G predstavuje glycín, x predstavuje aminokyselinu, Y/F predstavuje buď tyrozin alebo fenylalanín, V predstavuje valin;

majú necyklinovo závislú CAK aktivitu.

Tento vynález opisuje proteínové kinázy patriace do rodiny CIV1 ako je definované vyššie, s výnimkou Saccharomyces cerevisiae CAK ScCIVl.

Podlá uprednostňovaného uskutočnenia predloženého vynálezu sa táto proteínová kináza dá získať z askomycét, výhodne z hemiaskomycét a výhodne z Candida albicans.

Podlá vynálezu je proteínová kináza napríklad prítomná v zozname sekvencií v dodatku pod číslom SEKV. ID. ČÍS. 2.

Predmetom predloženého vynálezu je tiež sekvencia nukleovej kyseliny kódujúca proteínovú kinázu podlá vynálezu.

Sekvencia nukleovej kyseliny podlá vynálezu pozostáva napríklad zo sekvencie SEKV. ID. ČÍS. 1 v zozname sekvencií v dodatku.

Predmetom tohto vynálezu sú tiež fragmenty nukleovej kyseliny najmenej 18 bp, homológne alebo komplementárne k sekvencií nukleovej kyseliny kódujúcej peptidovú sekvenciu špecifickú pre CAK podlá vynálezu.

Tieto fragmenty sa môžu najmä použiť ako hybridizačné sondy a/alebo amplifikačné priméry na izoláciu a/alebo klonovanie s použitím Candida albicans, sekvencie nukleovej kyseliny kódujúcej CAK podľa vynálezu.

Tento vynález tiež opisuje fragmenty nukleovej kyseliny aspoň 15 bp, výhodne aspoň 18 bp, homológne alebo komplementárne k sekvencií nukleovej kyseliny kódujúcej peptidovú sekvenciu zachovanú v rodine proteínovej kinázy definovanej pomocou CAK CaCIVl podľa vynálezu a Saccharomyces cerevisiae CAK ScCIVl.

Tieto fragmenty sa môžu najmä použiť ako hybridizačné sondy a/alebo amplifikačné priméry na detekciu, v organizme inom ako Saccharomyces cerevisiae a Candida albicans, sekvencií kódujúcich kinázy, ktoré sú vztiahnuté k CAK CaCIVl a ScCIVl a na izoláciu a/alebo klonovanie génov takto identifikovaných. Vynález tiež opisuje sekvencie nukleovej kyseliny získané týmto spôsobom a proteínové kinázy z CAK CaCIVl a ScCIVl rodiny, ktoré sú kódované týmito sekvenciami.

Predmetom predloženého vynálezu je tiež hocijaký rekombinantný vektor a najmä hocijaký expresný vektor, ktorý je výsledkom inzercie najmenej jednej sekvencie nukleovej kyseliny podlá vynálezu do vhodného vektora. Výber vhodného vektora sa môže ľahko uskutočniť odborníkmi z množstva dostupných vektorov v závislosti na vybratej na multiplifikáciu a/alebo kyseliny podľa vynálezu.

hostiteľskej bunke expresiu nukleovej

Vynález tiež zahŕňa prokaryotické alebo eukaryotické bunky transformované so sekvenciou nukleovej kyseliny podľa vynálezu. Tieto transformované bunky sa môžu použiť najmä na expresiu kinázy podlá vynálezu, napríklad bunkových kultúr, napríklad ktoré boli skôr opísané cerevisiae CIV1 (Thuret a citovaná) alebo alternatívne testom bunkovej životaschopnosti.

s použitím vynálezcami kol., 1996, na detekciu jej aktivity vhodným na jej čistenie z podobných techník, pre Saccharomyces publikácia vyššie

Demonštrácia, uskutočnená vynálezcami, funkčnej homológie kináz ScCIVl a CaCIVl umožňuje pozorovať početné aplikácie tejto kinázovej rodiny.

Najmä pretože sa zistilo, že necyklínovo závislá CAK aktivita tejto kinázovej rodiny je významná pri bunkovom delení a prežití, môžu sa látky, ktoré inhibujú túto aktivitu, použiť ako fungicídy, buď ako liečivá alebo na priemyselnej úrovni.

Napríklad pri výbere fungicidnych látok ako sú látky aktívne na Candida albicans, sa kinázová aktivita CaCIVl alebo jedného z jej funkčných homológov pozostávajúcich z necyklínovo závislej CAk CIV1 rodiny, meria v prítomnosti každého produktu, pre ktorý je želané stanoviť fungicidne vlastnosti a vyberú sa produkty majúce inhibičný účinok na túto aktivitu.

Taký výber sa môže uskutočniť meraním kinázovej aktivity

CAK z CIV1 rodiny v prítomnosti potenciálnych aktivátorov alebo inhibítorov, ktoré sa majú testovať. Kinázová aktivita sa môže napríklad merať in vitro buď priamo detekciou fosforylácie peptidu alebo substrátového proteínu, napr. CDC28 alebo Cdk2 alebo proteínu MBP (základný myelinový proteín), vo vhodnej reakčnej zmesi, alebo nepriamo detekciou a/alebo meraním aktivity substrátového proteínu, keď tento závisí na fosforylácii.

Kinázová aktivita sa tiež môže merať in vivo, testom bunkovej životaschopnosti; napríklad sa môže výhodne kinázová aktivita merať v bunkách mutantu Saccharomyces cerevisiae neexpresujúceho CAK ScCIVl, ktoré sú transformované s CaCIVl génom.

Vynález tiež zahŕňa použitie produktu vybraného ako je uvedené vyššie kvôli svojím inhibičným vlastnostiam necyklínovo závislej CAK CIV1 rodiny na výrobu fungicídu.

Tento vynález sa jasnejšie pochopí pomocou nasledujúceho dodatočného opisu, ktorý sa odvoláva na príklad ilustrujúci detekciu CAK aktivity CaCIVl a klonovania zodpovedajúceho génu.

Príklad uskutočnenia vynálezu

Kmeň Saccharomyces cerevisiae CMY975 (genotyp CIV1-2 ura3 leu2 trpí lys2 ade2 ade3) nesie teplo-citlivú mutáciu CIV1 génu a preto rastie pri 24 °C, ale nie pri 37 °C.

Kultúra tohto kmeňa sa transformovala metódou octanu lítneho (Schiestl a Gietz, Current Genetics, 16, 339-346, (1989)) s knižnicou Candida albicans Sau3A genómových fragmentov klonovaných do BamHI miesta vektora YEp24 (multikópia-URA3) (Botstein a kol., Gene 8, 17-24, (1979)).

Bunky CMY975 sa poukladali na misky s obsahom syntetického média bez uracilu a kultivovali pri 37 °C.

Získalo sa 10 kolónii CMY975 rastúcich pri týchto podmienkach. Tieto plazmidy YEp24 obsahujúce Candida albicans inzerty sa získali z každej z týchto kolónií a amplifikovali v Escherichia coli.

Stanovila sa reštrikčná mapa každého z týchto plazmidov, čo umožnilo spozorovať, že všetky inzerty pochádzajú z tej istej oblasti genómu Candida albicans. Sekvencovanie tejto oblasti umožňuje identifikovať kódujúci proteínovú kinázu 339 10 inzertov získaných oddelene génu Candida albicans. Tento gén sa nazval CaCIVl.

ten istý otvorený čítací rámec aminokyselín, ktorý zodpovedá j ednému a ukazuje, že tomu istému

Sekvencia z CaCIVl uvedená pod číslom SEKV. uvedená pod číslom SEKV.

sekvenciami proteín má

Saccharomyces s Cdk

CaCDC28 Candida albicans.

je v zozname sekvencií ID. ČÍS. :

ID. ČÍS.

proteínu CaCIVl odhalilo, že 1 aminokyselín aminokyselín cerevisiae a so tento s CAK identických a od proteínu . 2. Porovnanie dostupnými v iba 28 % cerevisiae ScCDC28 v dodatku CaCIVl je sekvencie databázach identických a 24 %

Saccharomyces

BamHI-Clal genómový fragment 3 kb obsahujúci gén CaCIVl sa subklonoval do centromérneho plazmidu TRPÍ pRS414 (Sikorski a Hieter, Genetics, 122, 19-27 (1989)). Tento plazmid sa použil na transformáciu mutantu Saccharomyces cerevisiae, v ktorom je sekvencia ScCIVl vymazaná z genómu a obsahuje ScCIVl gén na replikačný plazmid tiež nesúci selektovatelný gén URA3 (kmeň CMY116 genómu ura3 leu2 trpí lys2 civl LEU2/pJG43 (URA3ScCIVl)) . Bunky transformované s plazmidom pR414-CaCTVl sú životaschopné po protiselekcii a stratili plazmid pJG43 (URA3ScCIVl), čo potvrdzuje, že gén CaCIVl môže plniť funkciu základného génu ScCIVl. Preto CaCIVl kóduje funkčný homológ z ScCIVl a je dostatočný na obnovenie CAK aktivity.

Claims (7)

1. PATENTOVÉ NÁROKY

   1. Proteínová kináza patriaca do rodiny nazývanej CIV1, vyznačujúca sa tým, že je charakterizovaná nasledujúcimi charakteristikami:

   neobsahuje motív GxGx(Y/F)GxV, v ktorom G predstavuje glycín, x predstavuje aminokyselinu, Y/F predstavuje buď tyrozin alebo fenylalanín, V predstavuje valín;

   má necyklínovo závislú CAK aktivitu;

   s výnimkou Saccharomyces cerevisiae CAK ScCIVl.
2. 2. Proteínová kináza podía nároku 1, vyznačujúca sa tým, že je možné ju získať z Candida albicans.
3. 3. Proteínová kináza podía nároku 1 alebo 2, vyznačujúca sa tým, že korešponduje so sekvenciou uvedenou v zozname sekvencií v dodatku pod číslom SEKV. ID. ČÍS. 2.
4. 4. Nukleová kyselina, vyznačujúca sa tým, že kóduje proteínovú kinázu podía niektorého z nárokov 1 až 3.
5. 5. Rekombinantný vektor, vyznačujúci sa tým, že vyplýva z inzercie nukleovej kyseliny podía nároku 4 do vhodného vektora.
6. 6. Spôsob výberu fungicídnych produktov, vyznačujúci sa tým, že obsahuje krok, v ktorom sa kinázová aktivita necyklínovo závislej CAK z rodiny CIV1, definovaná v nároku 1, meria v prítomnosti každého z produktov, pre ktoré je želané stanoviť fungicídne vlastnosti, pričom sa vyberú produkty majúce inhibičný účinok na túto aktivitu.
7. 7. Použitie produktu vybraného spôsobom podía nároku 6 na výrobu fungicidu.