CZ2000491A3 - Proteinkináza - Google Patents

Description

Oblast techniky '

Vynález se týká proteinkinázy, kodové nukleové kyseliny, rekombinantního vektoru a způsobu sériových zkoušek fungicidů.

Dosavadní stav techniky

Proteinkinázy (Cdk), závislé na cyklinu jsou regulátory buněčného dělení u eukaryotických organismů. Tyto látky jsou nezbytné jak na úrovni G1/S, tak na úrovni G2/M přechodných stádií buněčného cyklu. Prvními identifikovanými enzymy tohoto typu byly enzym CDC28 ze Saccharomyces cerevisiae a CDC2 ze Schizosaccharomyces pombe.

Aktivace uvedených enzymů vyžaduje spojení s molekulou cyklinu a fosforylaci této látky na konzervovaném threoninovém zbytku, který se nachází v oblasti, označované jako smyčka T.

Bylo prokázáno, že tato fosforylace se uskuteční působením kinázy, označované jako Cdk-aktivační kináza, CAK, která existuje u obratlovců ve formě heterotrimeru a je tvořena katalytickou podjednotkou, označovanou Cdk7, pod jednotkou cyklinového typu, označovanou jako cyklin H a faktorem MAT-1, popis těchto složek je možno nalézt v souhrnném článku Solomon, Trends Biochem Sci. 19, 496-500 (1994). Komplex Cdk7-cyklin H je mimo to složkou komplexu TFIIH, který je nezbytný pro základní transkripci genů působením RNA polymerázy II a účastní se fosforylace opakujících se sekvencí karboxyterminální oblasti (CTD) velké podjednotky této polymerázy.

V případě kvasinky Schizosaccharomyces pombe byl identifikován komplex, který je podobný komplexu Cdk7-cyklin H a je tvořen katalytickou podjednotkou, označovanou Crkl a řídícím cyklinem, označovaným Mcs2. Bylo prokázáno, že gen Crkl je nezbytný pro životaschopnost buněk a in vitro bylo pozorováno, že komplex Crk1-Mcs2 je spojen s účinností CAK a s účinností CTD• · • · · · · . . ♦· ·* *·· · · · « * * · * • * ··· * · ·» * · ” * · O ··· ··«, *·* *·

........ : ·..··..· kinázy podle publikace Buck a další, EMBO J., 14 (24) 6173-83 (1995), Damagnez a další, EMBO J., 14 (24), 6164-72, (1995).

V případě kvasinek Saccharomyces cerevisiae byl také identifikován komplex, tvořený kinázou Kin28 a cyklinem Cell, tento komplex je příbuzný svou sekvencí kinázám Cdk7 a Crkl a řídícímu syklinu H a Mcs2. Komplex Kin28-Ccl1 tvoří část komplexu TFIIH a má účinnost CTD-kinázy, avšak neúčastní se účinnosti CAK.

V poslední době byla identifikována v Saccharomyces cerevisiae kináze, která se účastní účinnosti CAK. Tato kináza byla označena CIV1 (CAK in vivo) a odpovídající gen byl označen CIV1 podle Thuret a další, Cell, 86 (4), 1996. Tyto výsledky byly potvrzeny také jinými pracovními skupinami a popsány v publikacích Kaldis a další, Cell, 86 (4), 553-564 (1996), Espinoza a další, Science, 273 (5282), 17141717 (1996). CAK ze Saccharomyces cerevisiae je látka, příbuzná skupině serin-threoninkinázám a zejména proteinkinázám CDC2 a CDC28 a liší se od CAK, dříve identifikovaných u jiných organismů nepřítomností konzervované sekvence GxGx (Y/F) GxV, bohaté na glycin, která je přítomná ve většině proteinkináz a přítomností uložené sekvence 5 až 29 zbytků aminokyselin mezi složkami sekundární struktury, které jsou konzervování ve skupině látek typu Cdk a také skutečností, že účinnost CAK této látky nevyžaduje její zařazení do enzymatického komplexu.

Vzhledem k tomu, že účinnosti CAK proteinkinázy CIV1 je nezbytná pro buněčné dělení a přežívání, byly provedeny další zkoušky za účelem zjištění, zda existují u pathogenních kvasinek geny, homologní CIV1 a kódující proteinkinázy s účinností CAK. V tomto případě by totiž byly získány prostředky k řízení této účinnosti a zvláště inhibitory, které by mohly mít značný význam na základě možnosti průmyslového i léčebného použití, zvláště při získávání nových fungicidních látek.

Z uvedeného důvodu byly nejprve vyšetřovány banky DNA z pathogenních kvasinek Candida albicans při použití sond, odvozených ·· ·· • · z různých oblastí genu CIV1 Saccharomyces cerevisiae. Avšak žádnou z použitých sond nebylo možno prokázat přítomnost homologní sekvence v genomu Candida albicans.

Proto bylo dále sledováno, zda Candida albicans má funkční analog CAK ze Saccharomyces cerevisiae. Bylo sledováno, zda Candida albicans obsahuje jeden nebo větší počet genů, schopných obnovit funkci CAK u Saccharomyces cerevisiae, a to u mutanty genu CIV1, citlivé na působení tepla. Tímto způsobem byl identifikován u Candida albicans gen, schopný doplnit chybějící funkci CAK u této mutanty.

Byla stanovena sekvence tohoto genu, který byl označen CaCIVI. Tento gen má sekvenci, která bude dále uvedena jako sekvence ID NO:1 a sekvence produktu translace, která byla označena CaCIVI je uvedena jako sekvence ID NO:2.

Přehled obrázků na výkresech

Na obr. 1 je uvedeno srovnání sekvence aminokyselin CaCIVI se sekvencí CAK Saccharomyces cerevisiae, která je označena ScCIVI a se sekvencí kinázy CDC28 z téhož kmene kvasinek, označené ScCDC28. Zbytky, které jsou konzervovány v ScCIVI a CaCIVI jsou uvedeny velkými písmeny.

Na obr. 1 znamená:

k = zbytky, konzervované ve většině proteinkináz, • = zbytky, často se vyskytující ve skupině Cdk, o = zbytky, vždy přítomné ve skupině Cdk a + = zbytky, přítomné ve skupině Cdk i ve skupině ScCIVI, sekundárními strukturami jsou a = α helix, b = β-řetězec.

CaCIVI má na úrovni sekvence aminokyselin pouze 28 % zbytků, totožných s CAK Saccharomyces cerevisiae, ScCIVI.

Podobnosti, které byly pozorovány mezi ScCIVI a CaCIVI však dovolují definovat skupinu kináz, která bude dále označována CIV1, tato skupina látek spojuje bílkoviny s následujícími vlastnostmi:

« ·

- těmto látkám chybí sekvence GxGx (Y/F) GxV, kde G znamená zbytek glycinu, x znamená jakýkoliv zbytek aminokyseliny, Y/F znamená zbytek tyrosinu nebo fenylalaninu a V znamená zbytek valinu,

- všechny tyto látky mají účinnost CAK, která není závislá na cyklinu.

Podstata vynálezu

Podstatu vynálezu tvoří proteinkináza, náležející do skupiny CIV1, která

- neobsahuje sekvenci GxGx (Y/F) GxV, kde G znamená zbytek glycinu, x znamená zbytek jakékoliv aminokyseliny, Y/F znamená zbytek tyrosinu nebo fenylalaninu a V znamená zbytek valinu,

- má účinnost CAK, nezávislou na cyklinu, s výjimkou CAK Saccharomyces cerevisiae, ScCIVI.

Podle výhodného provedení vynálezu je možno tuto kinázu získat z ascomycet, s výhodou hemiascomycet a zvláště z kvasinky Candida albicans.

Proteinkináza podle vynálezu je vyjádřena např. sekvencí, která bude dále v příloze uváděna jako sekvence ID NO:2.

Součást podstaty vynálezu tvoří také kodová sekvence nukleové kyseliny pro proteinkinázu podle vynálezu.

Tato sekvence nukleové kyseliny je tvořena např. sekvencí ID NO:1, uvedenou v příloze.

Součást podstaty vynálezu tvoří také fragmenty nukleové kyseliny o velikost nejméně 18 bp, homologní se sekvencí nukleové kyseliny nebo komplementární k sekvenci kodové nukleové kyseliny pro sekvenci peptidu, specifického pro CAK podle vynálezu.

Tyto fragmenty je zvláště možno použít jako hybridizační sondy a/nebo amplifikační primery pro izolaci a/nebo klonování při použití Candida albicans, přičemž ke klonování se užije nukleová kyselina podle vynálezu.

·· ·· • t 9 9 • ·· * 9 9

5· 9 9 ···· ··

Vynález zahrnuje také fragmenty nukleové kyseliny o nejméně 15, s výhodou nejméně 18 bp, komplementární nebo homologní s nukleovou kyselinou, kódující sekvenci peptidů, konzervovanou ve skupině proteinkináz podle vynálezu a pro Saccharomyces cerevisiae CAKScCIVI.

Tyto fragmenty mohou být zvláště použity jako hybridizační sondy a/nebo jako amplifikační primery k průkazu existence sekvencí, které jsou kódem pro kinázy, příbuzné CAK CaCIVI a ScCIVI z Saccharomyces cerevisiae a Candida albicans a pro izolaci a/nebo klonování takto identifikovaných genů. Vynález také zahrnuje sekvence nukleových kyselin, získané tímto způsobem a proteinkinázy ze svrchu uvedené skupiny, pro něž jsou tyto sekvence kódovými sekvencemi.

Součást podstaty vynálezu tvoří také jakýkoliv rekombinantní vektor a zvláště vektor pro expresi, který vznikne uložením nejméně jedné sekvence nukleové kyseliny podle vynálezu do příslušného vektoru. Volbu příslušného vektoru snadno provede každý odborník, který je schopen vybrat z dostupných vektorů vhodný vektor na základě hostitelské buňky tak, aby mohlo dojít ke zmnožení a/nebo k expresi nukleové kyseliny podle vynálezu.

Součást podstaty vynálezu tvoří také prokaryotické nebo eukaryotické buňky, které byly transformovány nukleovou kyselinou podle vynálezu. Tyto transformované buňky je možno použít zvláště k expresi kinázy podle vynálezu, např. k jejímu čištění z buněčných kultur, např. při použití technik, podobných těm, které byly dříve popsány pro CIV1 ze Saccharomyces cerevisiae podle svrchu uvedené publikace Thuret a další, 1996 nebo je tohoto postupu možno použít ke zjištění účinnosti kinázy zkouškou životaschopnosti použitých buněk.

Průkazem funkční homologie kináz ScCVH a CaCIVI vzniká možnost různých aplikací této skupiny kináz.

• · • ·

Vzhledem k tomu, že účinnost této skupiny kináz, nezávislých na cyklinu je podstatná pro dělení a přežívání buněk, je možno použít látky, které inhibují tuto účinnost jako fungicidy, a to k léčebným účelům nebo pro průmyslové účely.

Aby bylo možno sériově vyhledávat fungicidní látky, např. takové, které jsou účinné proti Candida albicans, je možno měřit účinnost kinázy CaCIVI nebo funkčních homologů této kinázy v přítomnosti látek, u nichž mají být stanoveny fungicidní vlastnosti, načež je možno vybírat látky, které mají požadovaný inhibiční účinek.

Tyto zkoušky je možno uskutečnit měřením účinnosti kinázy ze skupiny CIV1 v přítomnosti potenciálních aktivátorů nebo inhibitorů. Účinnost kinázy je např. možno měřit in vitro tak, že se přímo sleduje fosforylace peptidů nebo bílkovinného substrátu, např. CDC28 nebo Cdk2 nebo bílkoviny MBP (základní bílkovina myelinu) v příslušné reakční směsi nebo je možno měřit tyto hodnoty nepřímo sledováním a/nebo měřením účinnosti bílkoviny v případě, že tato účinnost je závislá na fosforylaci bílkovin.

Účinnost kinázy je také možno měřit in vivo zkouškou na životaschopnost buněk. Např. je možno měřit účinnost kinázy CaCIVI na buňkách mutanty Saccharomyces cerevisiae, u níž nedochází k expresi CAK ScCIVI a které byly transformovány genem CaCIVI.

Vynález se rovněž týká použití svrchu uvedených kináz vzhledem k jejich inhibičním vlastnostem pro výrobu fungicídních látek.

Praktické provedení vynálezu bude osvětleno následujícím příkladem, který popisuje detekci účinnosti CAK v případě CaCIVI a klonování odpovídajícího genu.

Příklad provedení vynálezu

Kmen Saccharomyces cerevisiae CMY975 (genotyp CIV1-2 ura3 Ieu2 trpí Iys2 ade2 ade3) nese mutaci genu CIV1, citlivou na působení tepla a vzhledem k této skutečnosti je schopen růst při teplotě 24, avšak nikoliv při teplotě 37 °C.

• · · » ··· ·· ·· • · · · ··· ····

Kultura tohoto kmene byla transformována při použití octanu lithného podle publikace Schiestl a Gietz, Current Genetics, 16, 339346 (1989) bankou fragmentu genomu Candida albicans Sau3A, klonovanou v místě působení BamHI vektoru Yep24 (větší počet kopií URA3) podle publikace Botstein a další, Gene 8, 17-24, (1979).

Buňky CMY975 se naočkují na plotny, obsahující syntetické živné prostředí, prosté uracilu a pěstují se při 37 °C.

Bylo získáno 10 kolonií CMY975, které rostly za těchto podmínek. Z každé z těchto kolonií byly identifikovány plasmidy Yep24, obsahující uloženou sekvenci z Candida albicans a byly amplifikovány v Escherichia coli.

Byla znázorněna mapa působení restrikčních enzymů pro každý z těchto plasmidů a bylo možno pozorovat, že všechny uložené části pocházely z téže oblasti genomu Candida albicans. Analýzou sekvence této oblasti bylo možno identifikovat tentýž otevřený čtecí rámec, kódující proteinkinázu s obsahem 339 aminokyselin, což prokazuje, že všech 10 uložených sekvencí, získaných nezávisle odpovídá témuž genu Candida albicans. Tento gen byl označen CaCIVI.

Sekvence tohoto genu je dále uvedena v příloze jako sekvence ID NO:1 a odpovídající bílkovina je uvedena jako sekvence ID NO:2. Srovnání sekvence uvedené bílkoviny se sekvencemi, dostupnými v databazi, bylo prokázáno, že pouze 28 % zbytku aminokyselin v této bílkovině je totožných s CAK Saccharomyces cerevisiae ScCIVI a 24 % zbytku aminokyselin je totožných s Cdk ScCDC28 Saccharomyces cerevisiae a CaCDC28 Candida albicans.

Fragment genomu BamHl-Clal o velikosti 3 kb, obsahující gen CaCIVI byl subklonován v plasmidů TRP1 pRS414, který byl popsán v publikaci Sikorski a Hieter, Genetics, 122, 19-27 (1989). Tento plasmid byl užit k transformaci mutanty Saccharomyces cerevisiae, v níž byla z genomu vypuštěna sekvence ScCIVI a která obsahuje gen ScCIVI v replikativním plasmidů, který rovněž nese selekceschopný • · • · ···· · · · ···· ··· · ··· · ·· · _ ·· ··· ······· ·· ·

8..........

gen URA3 (kmen CMY116 s genomem ura 3 Ieu2 trpí Iys2 civí LEU2/pJG43, (URA3-ScCIV1)). Buňky, transformované plasmidem pRS414-CaCIV1 jsou životaschopné po provedené selekci a po ztrátě plasmidu pJG43 (URA3-ScCIV1), což potvrzuje, že gen CaCIVI může být funkční na místě genu ScCIVI. Tzn., že gen CaCIVI je funkčním homologem ScCIVI a dostačuje k obnovení účinnosti CAK.

Claims (7)

1. PATENTOVÉ NÁROKY

   Taft

   1. Proteinkináza ze skupiny CIV1, která

   - neobsahuje sekvenci GxGx (Y/F) GxV, kde G znamená zbytek glycinu, x znamená zbytek jakékoliv aminokyseliny, Y/F znamená zbytek tyrosinu nebo fenylalaninu a V znamená zbytek valinu,

   - má účinnost CAK nezávislou na cyklinu, s výjimkou CAK ScCIVI ze Saccharomyces cerevisiae.
2. 2. Proteinkináza podle nároku 1, získatelná z Candida albicans.
3. 3. Proteinkináza podle nároku 1 a 2, jejíž sekvence odpovídá sekvenci ID NO:2.
4. 4. Nukleová kyselina, kódující proteinkinázu podle některého z nároků 1 až 3.
5. 5. Rekombinantní vektor, vzniklý uložením nukleové kyseliny podle nároku 4 do příslušného vektoru.
6. 6. Způsob sériových zkoušek potenciálních fungicidních látek, vyznačujících se tím, že se měří účinnost kinázy, nezávislá na cyklinu v případě skupiny proteinkináz CIV1 podle nároku 1 v přítomnosti látek, jejichž fungicidní vlastnosti mají být prokázány a vybírají se látky s požadovaným účinkem.
7. 7. Použití sloučenin, identifikovaných způsobem podle nároku 6 pro výrobu fungicidů.