CN1263152A

CN1263152A - 点状产气单胞菌脯氨酰内肽酶及其制法和用途

Info

Publication number: CN1263152A
Application number: CN 99102383
Authority: CN
Inventors: 陈常庆; 李民; 沈国祥; 史济平
Original assignee: Shanghai Institutes for Biological Sciences SIBS of CAS
Current assignee: Zhongke Wubaihao Bioengineering Co., Ltd., Shanghai
Priority date: 1999-02-12
Filing date: 1999-02-12
Publication date: 2000-08-16
Anticipated expiration: 2019-02-12
Also published as: CN1137261C

Abstract

本发明公开了一种新的脯氨酰内肽酶[EC3.4.21.26]，该酶是点状产气单胞菌点状亚种(Aeromonas punctata subsp.punctata)的脯氨酰内肽酶。具体地,本发明公开了该脯氨酰内肽酶的氨基酸序列和DNA编码序列,用于表达该脯氨酰内肽酶的表达载体和工程菌,以及该脯氨酰内肽酶的制备方法和用途。

Description

点状产气单胞菌脯氨酰内肽酶及其制法和用途

本发明涉及基因工程和酶学领域。更具体地，本发明涉及一种新的脯氨酰内肽酶[EC 3.4.21.26]，该脯氨酰内肽酶的氨基酸序列和DNA编码序列，用于表达该脯氨酰内肽酶的表达载体和工程菌，以及该脯氨酰内肽酶的制备方法和用途。

脯氨酰内肽酶(Prolyl endopeptidase简称PEP)[EC 3.4.21.26]是一种能特异性水解小分子量多肽中脯氨酸羧基端肽键的丝氨酸蛋白酶(Wilk S.LifeScience，1983，33(22)：2149)。

众所周知，在组成天然蛋白质或多肽的20种α-氨基酸中，脯氨酸(Pro)是唯一具有亚氨结构的氨基酸，其环状结构影响了与其他氨基酸形成肽键时的空间构象，同时使蛋白质中含Pro的肽键或其邻近的其他肽键对广泛专一性的蛋白酶不敏感。自然界在进化过程中产生了一些专门针对多肽中Pro残基的蛋白酶，而且这些蛋白酶甚至对Pro在多肽中的位置和成键的构型都有很强的专一性，这类酶称作脯氨酸专一性肽酶，也就是脯氨酰内肽酶(PEP)。脯氨酰内肽酶可以作为一种分子生物学的工具酶，用于蛋白质序列测定、肽谱分析、特异位点的酶切、肽段的修饰和加工等。

研究表明，PEP广泛分布于哺乳动物的各种组织，同时也存在于少数几种真菌、细菌甚至古细菌中，但其含量很低，分离纯化困难，限制了对其生理功能和性质的研究。因此国外已经从脑膜炎脓毒黄杆菌(Chevallier S，Goeltz P，Thibault P etal.J Biochem，1992，267(12)：8192)、嗜水气单胞菌(Kanatani A，Yoshimoto T，Kitazona Aet al.J Biochem，1993，113：790)、耐热古细菌(Robinson K A，Bartley D A，Robb F T etal.Gene，1995，152：123)、人淋巴细胞(Shirasawa Y，Osawa T，Hirashima A.JBiochem，1994，115：724)和猪脑cDNA库(Rennex D，Hemmings B A，Hofsteenge J etal.Biochemistry，1991，30：2195)中克隆了PEP基因，进行了基因工程研究。

然而，迄今为止还没有有关点状产气单胞菌脯氨酰内肽酶的报道。

本发明的目的是提供一种新的脯氨酰内肽酶，它是点状产气单胞菌的脯氨酰内肽酶。

本发明的另一目的是提供一种编码该新型脯氨酰内肽酶的DNA序列。

本发明的再一目的是提供生产该新型脯氨酰内肽酶的方法和用途。

在本发明的第一方面，提供了一种分离的脯氨酰内肽酶，该酶是点状产气单胞菌点状亚种(Aeromonas punctata subsp.punctata)的脯氨酰内肽酶。较佳地，该酶包括SEQ ID No.2所示的氨基酸序列。

在本发明的第二方面，提供了一种分离的DNA序列，该DNA序列编码具有SEQ ID No.2所示的氨基酸序列的多肽。较佳地，该DNA序列包括SEQ ID No.1中第1-2073位所示的核苷酸序列。

在本发明的第三方面，提供了一种表达载体，它含有上述的编码本发明新型脯氨酰内肽酶的DNA序列。此外，还提供所述的表达载体转化的宿主细胞。较佳地，该宿主细胞是原核细胞，更佳地是大肠杆菌。

在本发明的第四方面，提供了一种产生脯氨酰内肽酶的方法，该方法包括：

(a)将编码状点产气单胞菌点状亚种(Aeromonas punctata subsp.punctata)的脯氨酰内肽酶的核苷酸序列可操作地连于表达调控序列，形成点产气单胞菌点状亚种的脯氨酰内肽酶表达载体，所述的核苷酸序列编码具有SEQ ID No.2所示的氨基酸序列的多肽；

(b)将步骤(a)中的表达载体转入宿主细胞，形成脯氨酰内肽酶的重组细胞；

(c)在适合表达该脯氨酰内肽酶多肽的条件下，培养步骤(b)中的重组细胞；

(d)分离出具有点产气单胞菌点状亚种的脯氨酰内肽酶活性的多肽。

在本发明的一个具体实施方案中，本发明的分离的多核苷酸全长为3.4kb，其中开放阅读框的详细序列见SEQ ID NO.1，即开放读框位于1-2073位核苷酸。

图1，pAPEP01重组质粒的构建。

图2，pAPEP11重组质粒的构建。

图3，3.5kb HincII/EcoR I活性片段的限制性图谱。

图4，PEP基因的核苷酸序列。

图5，PEP基因编码的氨基酸序列。

图6，六种来源的PEP氨基酸序列比较，^*表示非常保守的氨基酸，·表示比较表示的氨基酸。APEP，产气单胞菌点状亚种来源的PEP；AHPEP，噬水气假单胞菌PEP；FPEP，脑膜炎脓毒黄杆菌PEP；PPEP，猪脑PEP；HPEP，人淋巴细胞PEP；PFPEP，狂怒火球菌PEP。

图7，重组质粒pGEM-PEP的构建。

图8，HPLC凝胶过滤法测定PEP分子量的电泳图。

图9，PEP等电点的测定。

图10，pH对PEP活性影响的曲线图。

图11，温度对PEP活性影响的曲线图。

图12，PEP酶的温度稳定性曲线图。

图13，PEP的pH稳定性曲线图。

图14，重组质粒pBL-PEP的构建图。

在本发明中，“分离的”、“纯化的”或“基本纯的”DNA是指，该DNA或片段已从天然状态下位于其两侧的序列中分离出来，还指该DNA或片段已经与天然状态下伴随核酸的组份分开，而且已经与在细胞中伴随其的蛋白质分开。

在本发明中，术语“点状产气单胞菌脯氨酰内肽酶(或多肽)编码序列”指编码具有点状产气单胞菌脯氨酰内肽酶活性的多肽的核苷酸序列，如SEQ ID NO.1中1-2073位核苷酸序列及其简并序列。该简并序列是指，位于SEQ ID NO.1序列的编码框1-2073位核苷酸中，有一个或多个密码子被编码相同氨基酸的简并密码子所取代后而产生的序列。由于密码子的简并性，所以与SEQ ID NO.1中1-2073位核苷酸序列同源性低至约70％的简并序列也能编码出SEQ ID NO.2所述的序列。该术语还包括能在中度严紧条件下，较佳地在高度严紧条件下，与SEQ ID NO.1中从核苷酸1-2073位的核苷酸序列杂交的核苷酸序列。此外，该术语还包括与SEQID NO.1中从核苷酸1-2073位的核苷酸序列的同源性至少70％，较佳地至少80％，更佳地至少90％，最佳地至少95％的核苷酸序列。

该术语还包括能编码具有与点状产气单胞菌脯氨酰内肽酶相同功能的蛋白的、SEQ ID NO.N序列的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)：若干个(通常为1-90个，较佳地1-60个，更佳地1-20个，最佳地1-10个)核苷酸的缺失、插入和/或取代，以及在5’和/或3’端添加数个(通常为60个以内，较佳地为30个以内，更佳地为10个以内，最佳地为5个以内)核苷酸。

在本发明中，“基本纯的”蛋白质或多肽是指其至少占样品总物质的至少20％，较佳地至少50％，更佳地至少80％，最佳地至少90％(按干重或湿重计)。纯度可以用任何合适的方法进行测量，如用柱层析、PAGE或HPLC法测量多肽的纯度。基本纯的多肽基本上不含天然状态下的伴随其的组分。

在本发明中，术语“点状产气单胞菌脯氨酰内肽酶多肽”指具有点状产气单胞菌脯氨酰内肽酶活性的SEQ ID NO.2序列的多肽。该术语还包括具有与点状产气单胞菌脯氨酰内肽酶相同功能的、SEQ ID NO.2序列的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)：若干个(通常为1-50个，较佳地1-30个，更佳地1-20个，最佳地1-10个)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一个或数个(通常为20个以内，较佳地为10个以内，更佳地为5个以内)氨基酸。例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的功能。该术语还包括点状产气单胞菌脯氨酰内肽酶的活性片段和活性衍生物。

本发明还包括点状产气单胞菌脯氨酰内肽酶的多肽变异形式，这些变异形式包括：同源序列、保守性变异体、等位变异体、天然突变体、诱导突变体、在高或低的严紧度条件下能与点状产气单胞菌脯氨酰内肽酶DNA杂交的DNA所编码的蛋白、以及利用抗点状产气单胞菌脯氨酰内肽酶多肽的抗血清获得的多肽或蛋白。本发明还提供了其他多肽，如包含点状产气单胞菌脯氨酰内肽酶多肽或其片段的融合蛋白。除了几乎全长的多肽外，本发明还提供了点状产气单胞菌脯氨酰内肽酶多肽的可溶性片段。通常，该片段具有点状产气单胞菌脯氨酰内肽酶多肽序列的至少约10个连续氨基酸，通常至少约30个连续氨基酸，较佳地至少约50个连续氨基酸，更佳地至少约80个连续氨基酸，最佳地至少约100个连续氨基酸。

发明还提供点状产气单胞菌脯氨酰内肽酶或多肽的类似物。这些类似物与天然点状产气单胞菌脯氨酰内肽酶多肽的差别可以是氨基酸序列上的差异，也可以是不影响序列的修饰形式上的差异，或者兼而有之。这些多肽包括天然或诱导的遗传变异体。诱导变异体可以通过各种技术得到，如通过辐射或暴露于诱变剂而产生随机诱变，还可通过定点诱变法或其他已知分子生物学的技术。类似物还可以包括具有不同于天然L-氨基酸的残基(如D-氨基酸)的类似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如β、γ-氨基酸)的类似物。应理解，本发明的多肽并不限于上述例举的代表性的多肽。

修饰(通常不改变一级结构)形式包括：体内或体外的多肽的化学衍生形式如乙酰化或羧基化。修饰还包括糖基化，如那些在多肽的合成和加工中或进一步加工步骤中进行糖基化修饰而产生的多肽。这种修饰可以通过将多肽暴露于进行糖基化的酶(如哺乳动物的糖基化酶或去糖基化酶)而完成。修饰形式还包括具有磷酸化氨基酸残基(如磷酸酪氨酸、磷酸丝氨酸、磷酸苏氨酸)的序列。还包括被修饰从而提高了其抗蛋白水解性能或优化了溶解性能的多肽。

在本发明中，“点状产气单胞菌脯氨酰内肽酶保守性变异多肽”指与SEQ ID No.2的氨基酸序列相比，有至多10个，较佳地至多8个，更佳地至多5个，最佳地至多3个氨基酸被性质相似或相近的氨基酸所替换而形成多肽。这些保守性变异多肽最好根据表A进行氨基酸替换而产生。

表A

最初的残基	代表性的取代	优选的取代
最初的残基	代表性的取代	优选的取代	Ala(A)	Val；Leu；Ile	Val
Arg(R)	Lys；Gln；Asn	Lys	Ala(A)	Val；Leu；Ile	Val
Arg(R)	Lys；Gln；Asn	Lys	Asn(N)	Gln；His；Lys；Arg	Gln
Asp(D)	Glu	Glu	Asn(N)	Gln；His；Lys；Arg	Gln
Asp(D)	Glu	Glu	Cys(C)	Ser	Ser
Gln(Q)	Asn	Asn	Cys(C)	Ser	Ser
Gln(Q)	Asn	Asn	Glu(E)	Asp	Asp
Gly(G)	Pro；Ala	Ala	Glu(E)	Asp	Asp

His(H)	Asn；Gln；Lys；Arg	Arg
His(H)	Asn；Gln；Lys；Arg	Arg	Ile(I)	Leu；Val；Met；Ala；Phe	Leu
Leu(L)	Ile；Val；Met；Ala；Phe	Ile	Ile(I)	Leu；Val；Met；Ala；Phe	Leu
Leu(L)	Ile；Val；Met；Ala；Phe	Ile	Lys(K)	Arg；Gln；Asn	Arg
Met(M)	Leu；Phe；Ile	Leu	Lys(K)	Arg；Gln；Asn	Arg
Met(M)	Leu；Phe；Ile	Leu	Phe(F)	Leu；Val；Ile；Ala；Tyr	Leu
Pro(P)	Ala	Ala	Phe(F)	Leu；Val；Ile；Ala；Tyr	Leu
Pro(P)	Ala	Ala	Ser(S)	Thr	Thr
Thr(T)	Ser	Ser	Ser(S)	Thr	Thr
Thr(T)	Ser	Ser	Trp(W)	Tyr；Phe	Tyr
Tyr(Y)	Trp；Phe；Thr；Ser	Phe	Trp(W)	Tyr；Phe	Tyr
Tyr(Y)	Trp；Phe；Thr；Ser	Phe	Val(V)	Ile；Leu；Met；Phe；Ala	Leu

本发明还包括点状产气单胞菌脯氨酰内肽酶多肽编码序列及其片段的反义序列。

本发明还包括一种可用作探针或引物的核苷酸分子，该分子通常具有点状产气单胞菌脯氨酰内肽酶核苷酸序列的8-100个，较佳地15-50个连续核苷酸。该探针可用于检测样品中是否存在编码点状产气单胞菌脯氨酰内肽酶的核酸分子。

本发明还包括检测点状产气单胞菌脯氨酰内肽酶核苷酸序列的方法，它包括用上述的探针与样品进行杂交，然后检测探针是否发生了结合。较佳地，该样品是PCR扩增后的产物，其中PCR扩增引物对应于点状产气单胞菌脯氨酰内肽酶多肽的编码序列，可位于该编码序列的两侧或中间。引物长度一般为20-50个核苷酸。

在本发明中，可选用本领域已知的各种载体，如市售的载体。比如，选用市售的载体，然后将编码本发明多肽的核苷酸序列可操作地连于表达调控序列，可以形成蛋白表达载体。

如本文所用，“可操作地连于”指这样一种状况，即线性DNA序列的某些部分能够影响同一线性DNA序列其他部分的活性。例如，如果信号肽DNA作为前体表达并参与多肽的分泌，那么信号肽(分泌前导序列)DNA就是可操作地连于多肽DNA；如果启动子控制序列的转录，那么它是可操作地连于编码序列；如果核糖体结合位点被置于能使其翻译的位置时，那么它是可操作地连于编码序列。一般，“可操作地连于”意味着相邻近，而对于分泌前导序列则意味着在阅读框中相邻。

在本发明中，术语“宿主细胞”包括原核细胞和真核细胞。常用的原核宿主细胞的例子包括大肠杆菌、枯草杆菌等。常用的真核宿主细胞包括酵母细胞，昆虫细胞、和哺乳动物细胞。较佳地，该宿主细胞是原核细胞，更佳地是大肠杆菌。

一旦表达了重组的本发明多肽之后，可用各种常规方法进行分离纯化。较佳地是通过如下步骤进行分离：超声破碎、硫酸铵沉淀和柱层析。其中，更佳地，柱层析是依次用Sephadex G-25、High Performance Q-Sepharose FF、PhenylSepharose 6FF柱进行。

另一方面，本发明还包括对点状产气单胞菌脯氨酰内肽酶DNA或是其片段编码的多肽具有特异性抗体，尤其是单克隆抗体。这里，“特异性”是指抗体能结合于点状产气单胞菌脯氨酰内肽酶基因产物或片段。较佳地，指那些能与点状产气单胞菌脯氨酰内肽酶基因产物或片段结合但不识别和结合于其它非相关抗原分子的抗体。本发明中抗体包括那些能够结合并抑制点状产气单胞菌脯氨酰内肽酶蛋白的分子，也包括那些并不影响点状产气单胞菌脯氨酰内肽酶蛋白功能的抗体。本发明还包括那些能与修饰或未经修饰形式的点状产气单胞菌脯氨酰内肽酶基因产物结合的抗体。

本发明不仅包括完整的单克隆或多克隆抗体，而且还包括具有免疫活性的抗体片段，如Fab′或(Fab)₂片段；抗体重链；抗体轻链；遗传工程改造的单链Fv分子(Ladner等人，美国专利No.4,946,778)；或嵌合抗体。

本发明的抗体可以通过本领域内技术人员已知的各种技术进行制备。例如，纯化的点状产气单胞菌脯氨酰内肽酶基因产物或者其具有抗原性的片段，可被施用于动物以诱导多克隆抗体的产生。与之相似的，表达点状产气单胞菌脯氨酰内肽酶或其具有抗原性的片段的细胞可用来免疫动物来生产抗体。本发明的抗体也可以是单克隆抗体。此类单克隆抗体可以利用杂交瘤技术来制备(见Kohler等人，Nature256；495，1975；Kohler等人，Eur.J.Immuno1.6：511，1976；Kohler等人，Eur.J.Immuno1.6：292，1976；Hammerling等人，In Monoclonal Antibodies and T Cell Hybridomas，Elsevier，N.Y.，1981)。本发明的抗体包括能阻断点状产气单胞菌脯氨酰内肽酶功能的抗体以及不影响点状产气单胞菌脯氨酰内肽酶功能的抗体。本发明的各类抗体可以利用点状产气单胞菌脯氨酰内肽酶基因产物的片段或功能区，通过免疫技术获得。这些片段或功能区可以利用重组方法制备或利用多肽合成仪合成。与点状产气单胞菌脯氨酰内肽酶基因产物的未修饰形式结合的抗体可以用原核细胞(例如E.Coli)中生产的基因产物来免疫动物而产生；与翻译后修饰形式结合的抗体(如糖基化或磷酸化的蛋白或多肽)，可以用真核细胞(例如酵母或昆虫细胞)中产生的基因产物来免疫动物而获得。

如上获得这些抗体可以作为本发明新型脯氨酰内肽酶的抑制剂。

本发明的点状产气单胞菌脯氨酰内肽酶核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。

对于PCR扩增法，可根据本发明所公开的有关核苷酸序列，尤其是开放阅读框序列来设计引物，并用市售的点状产气单胞菌菌株(如点状产气单胞菌点状亚种(Aeromonas punctata subsp.punctata))作为模板，扩增而得有关序列。

一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。

此外，还可用人工合成的方法来合成有关序列，尤其是片段长度较短时。通常，通过先合成多个小片段，然后再进行连接可获得序列很长的片段。

在本发明的一个实施例中，选用的原始菌是具有脯氨酰内肽酶(Prolylendopeptidase，简称为“PEP”)活性的点状产气单胞菌点状亚种(Aeromonas punctatasubsp.punctata)。将其染色体DNA用EcoR I部分酶切后回收8～16Kb的DNA片断，与EcoR I消化载体pUC19连接后转化E.coli DH5α，用该酶的专一性底物苄氧羰基甘氨酰脯氨酰-β萘酚(Benzyloxycarbonyl-Gly-Pro-β-naphthylamide)从中筛选到一株阳性克隆，其重组质粒上的12Kb EcoR I片断经亚克隆后获得3.5KbEcoRI/Hinc II的活性片断。构建该片断的限制性内切酶谱并进行核苷酸序列的测定，获得PEP基因长度为2073bp的完整开放阅读框架，其氨基酸一级结构与已克隆的PEP具有很高的同源性。随后构建了一株组成型高效表达PEP的基因工程菌BL21/pGEM-PEP。经DNA序列分析证实了表达质粒构建的正确性。工程菌BL21/pGEM-PEP于1998年11月9日保藏在中国，武汉市的中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏号为CCTCC M98016。

BL21/pGEM-PEP在YH培养基中PEP的表达量占菌体总蛋白的30％左右，活力是野生菌的112倍，表达产物主要为可溶性的胞内蛋白，仅有少量的产物分泌到胞外。非还原SDS-PAGE显示为单体，电喷雾质谱测定其分子量为76464.61Da，与基因序列预测的分子量一致。摇瓶培养后纯化得到了纯度为99％的重组脯氨酰内肽酶(PEP)，比活力为67.6U/mg。测定了N端10个氨基酸序列，与DNA序列推测的一致。该酶的等电点为pI＝6.05，比活力为67.6U/mg，对Z-Gly-Pro-βNA底物的酶解常数Km为0.0311mM。酶的最适温度为32℃、最适pH值为8.4，该蛋白酶的热稳定性实验表明在4-32℃比较稳定、pH值的稳定性表明pH值在6-10比较稳定；一些蛋白酶抑制剂和金属离子的抑制作用结果表明，PEP酶不受PMSF、TLCK、TPCK、胰蛋白酶抑制剂、胃蛋白酶抑制剂、EDTA、连四硫酸钠等和大多数离子的抑制，但明显受SDS、Zn²⁺的抑制。催产素9肽和降钙素32肽的酶切实验表明该酶能特异性地水解脯氨酸羧基端肽键，但效率明显比Z-Gly-Pro-βNA要低。

工程菌株E.coli BL21/pGEM-PEP可以组成型表达重组的点状产气单胞菌脯氨酰内肽酶，但培养条件极大地影响着酶的表达量和活性，为了获得该酶的高效表达，对工程菌的发酵条件进行了优化。

通常，本发明的转化的宿主细胞的培养条件为：胰化蛋白胨10-20g/L；酵母提取物5-10g/L；KH₂PO₄ 1-4g/L；K₂HPO₄ 2-6g/L；Na₂HPO₄·12H₂O5-10g/L；(NH₄)₂SO₄ 0.5-2g/L；NH₄Cl 0.1-0.5g/L；MgSO₄·7H₂O 0.5-1g/L。摇床转速为100-400rpm，培养温度为28-38℃，培养基pH为6.5-7.2，培养时间为12-24h。例如，可选用如下具体培养条件：胰化蛋白胨15g/L；酵母提取物7.5g/L；KH₂PO₄2g/L；K₂HPO₄ 4g/L；Na₂HPO₄·12H₂O 7g/L；(NH₄)₂SO₄ 1/2g/L；NH₄Cl 0.2g/L；MgSO₄·7H₂O 1g/L。摇床转速为250rpm，培养温度为32℃，培养基pH为7.0，培养时间为16h。

本发明新型脯氨酰内肽酶具有以下等方面的应用：

(1)作为分子生物学的试剂酶

(2)潜在的医药应用

Walter等人1971年首次在人体子宫组织的匀浆中发现PEP(Walter R，ShlankH，Glass J D et al.Science，1971，173：827)。PEP在生物体内能有效降解含有脯氨酸的生物活性肽，如神经降压素、促甲状腺激素释放素、P物质和抗利尿激素等(Walter R，Simmons W H，Yoshimoto T.Mol Biochem，1980，30(2)：111)。因此体内PEP活性的异常变化可能会导致与这些活性肽相关的生理功能的异常，甚至疾病的发生，如临床上发现精神分裂症患者血浆(Maes M，De Meester I，Scharp S et al.ActaPsychiatr Scand，1996，93：1)、吗啡戒断症患者下丘脑(Juhana J，Pekka R，Raimok eta1.Pharmacol & Toxical，1996，78：129)和Alzheimer′s Disease患者脑组织中(AoyagiT，Wasa T，Nagai M et al.Ecperientia，1990，46：94)的PEP活性均发生异常。一些PEP的专一性抑制剂(如JTP-4891)显示在莨菪胺引起的小鼠记忆障碍模型中有改善记忆的良好药理作用(Toide K，Iwamoto Y，Fujiwara T et al.J Pharmacol Exp Ther1995，274(3)：1370-1378；Shinoda M，Matsuo A，Toide K.Eur J Pharmacol 1996，305(1-3)：31-38；Yoshimoto T，Kado K，Matsubara F et al.J Pharmacbiodyn 1987，10：730-735)，并在人体药理实验中也获得了理想的结果(Umemura K，Kondo K，Ikeda Y et al.Br JClin Pharmacol 1997，43(6)：613-618)。因此PEP及其专一性抑制剂的进一步研究有可能开发出治疗老年性记忆障碍、老年痴呆症、抑郁症、精神分裂症等疾病的药物。

(3)应用于多肽工业

PEP除了具有潜在的医药应用外，还可利用其特异性的Pro酶切位点，利用大肠杆菌串联表达活性多肽，设计多肽的Pro连接位点，大量制备活性多肽；另外，利用该酶的逆过程可以催化合成活性多肽。Kokubo用PEP催化催产素前体和黄体生成素释放激素(LHRH)前体合成催产素和LHRH，收率分别达55％和67％，并且没有副产物产生；因此，PEP在多肽基因工程生产和肽类激素工业生产中有重大意义。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，比如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York：ColdSpring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例

材料

(1)菌株和质粒：

点状产气单胞菌点状亚种(Aeromonas punctata subsp.punctata)购自中国科学院水生生物研究所，

宿主菌E.coli DH5α、E.coli BL21(DE3)(hsdS gal(λcIts857 indl Sam7 nin5lacUV5-T7))，质粒pBluescript SK(+)、pUC 19、pGEM-3zf，购自普洛麦格(Promega)公司。

(2)酶和试剂：

分子克隆工具酶和试剂、细菌基因组、质粒抽提试剂盒为普洛麦格(Promega)公司产品；

PMSF、TLCK、TPCK、胃蛋白酶抑制剂(pepstatin)、大豆胰蛋白酶抑制剂(soybean trypsin inhibitor)、连四硫酸钠(sodium tetrathionate)、显色剂Fast GarnetGBC Salt、催产素9肽、鲑鱼降钙素32肽购自Sigma公司；

PEP特异性底物苄氧基羰基-Gly-Pro-β-萘基酰胺(Benzyloxycarbonyl-Gly-Pro-β-naphthylamide，简称为“Z-Gly-Pro-βNA”)按常规方法合成；

纯化蛋白用树脂Sephadex G-25、Phenyl Sepharose 6FF、High Q-Sepharose FF为Pharmacia公司产品；

Protein-Pak DEAE 15HR AP-1(10mm×100mm)为Waters公司产品。

(3)培养基：

LB培养基，配方见参考文献Sambrook J，Fristsh E F，Maniatis T. Molecular Cloning：A Laboratory Mannul.2nd ed.NY：Cold Spring Harbor LaboratoryPress，1989。

YH培养基含有：蛋白胨15g/L，酵母粉7.5g/L，葡萄糖1g/L，KH₂PO₄ 2g/L，K₂HPO₄ 4g/L，Na₂HPO₄12H₂O 7g/L，(NH₄)₂SO₄ 1.2g/L，NH₄Cl 0.2g/L，培养基pH为7.0。

方法

分子生物学操作方法

PEP酶活性的测定方法：取稀释的酶液10μl或超声破碎的发酵液10μl加入到预热到32℃，0.400ml 20mM的一定pH值的缓冲液中，保温1min后立刻加入10μl 5mM的Z-Gly-Pro-βNA溶液，立即混匀计时，反应5min，加入250μl 1mg/ml的Fast Garnet GBC Salt溶液显色20min，于550nm处测定光吸收值，相对活力以光密度表示。

质粒提取、内切酶酶切、DNA片断的回收、连接和转化大肠杆菌：操作方法参见Sambrook J，Fristsh E F，Maniatis T.Molecular Cloning：A Laboratory Mannul.2nded.NY：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989，pp.16-340。

重组蛋白表达量的测定：参照Sambrook J，Fristsh E F，Maniatis T.MolecularCloning：A Laboratory Mannul.2nd ed.NY：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989，方法进行。

实施例1 PEP基因的克隆

染色体文库的构建和阳性克隆的筛选

用普洛麦格试剂盒Wizard^Genomic DNA(Promega)，抽提点状产气单胞菌点状亚种(Aeromonas punctata subsp.punctata)的细菌染色体DNA。提取的染色体DNA用EcoR I部分酶切消化后用0.7％琼脂糖凝胶电泳回收8～16Kb的DNA片断，与EcoR I消化的pUC19载体连接后转化大肠杆菌E.coli DH5α，转化子涂布于含有Amp、IPTG和X-Gal的LB平板上培养16小时(图1)。根据蓝白显色挑取白色的转化子，接种于96孔酶标板的各个孔内(每孔含LB180μl)，37℃培养16～18小时后取50μl菌液转移至另一96孔板，加入50μl 5mmol/L的Z-Gly-Pro-βNA溶液，37℃反应16～18小时后加入50μl 1mg/ml的显色剂，呈现红色的是阳性菌株。

PEP基因的克隆重组质粒的鉴定：从所构建的染色体文库中，用酶活性筛选法筛选了约2000个白色的重组子，其中一株呈现较强红色反应，其PEP活性与PEP野生点状产气单胞菌的活性相当。该菌株的命名为pAPEP01的重组质粒中含有约12Kb的EcoRI插入片断(见图1)。

PEP基因的亚克隆和重组质粒的鉴定：对来自pAPEP01的12Kb EcoR I片断用Hinc II酶切后回收获得4.0Kb、3.5Kb和2.0Kb三个片断。它们分别与HincII酶切和Hinc II/EcoR I双酶切的质粒pUC19进行连接，转化感受态E.coliDH5α(图2)。结果，在3.5Kb片断的连接转化子中，筛选得到16株PEP活性显著提高(约10倍)的阳性株，取其中四株进行重组质粒的酶切鉴定，发现pUC19的多克隆位点上均有一个约3.5Kb的Hinc II/EcoR I插入片断，将此重组质粒命名为pAPEP11(见图2)。

实施例2

点状产气单胞菌PEP基因的限制酶图谱的构建和PEP基因核苷酸序列的测定：

对实施例1中获得的质粒pAPEP11，用单酶切和双酶切相结合的方法构建了PstI、SmaI、XhoI、Hind III和KpnI在Hinc II/EcoR I片断上的酶谱(见图3)。

根据物理图谱，构建了一系列相互重叠的重组质粒，用核苷酸自动测序仪进行测序。在所测定的2.6Kb核苷酸序列中，经同源性比较发现存在PEP基因的完整开放阅读框架(ORF)，PEP ORF的长度为2073bp。核苷酸序列和编码的氨基酸序列分别为SEQ ID No.1和SEQ ID No.2，此外还示于图4和5。

实施例3点状产气单胞菌PEP的同源性比较

采用PC/GENE软件，将PEP氨基酸一级结构与其它来源PEP的已报道氨基酸序列进行同源性比较(图6)。

如图所示，本发明的点状产气单胞菌与已克隆的A.hydrophlia，F.meningosepticum、P.furiosus、猪脑和人淋巴细胞PEP的氨基酸同源性分别为92.3％、53.2％、20.5％、33.5％和33.2％，在组成催化三联体的Ser⁵³⁸、Asp⁶²²和His⁶⁵⁷附近具有高度保守的氨基酸序列，活性中心Ser附近也具有Gly-X-Ser-X-Gly这一PEP家族的保守结构。因此证实了分离得到的是一种新来源的PEP基因。

实施例4工程菌BL21/pGEM-PEP的构建

如图7所示，质粒pAPEP11经Hinc II和EcoR I酶切，回收3.5kb左右的DNA片断，连接到经酶切的pGEM-3zf上，构建成重组质粒pGEM-PEP(见图7)，

将重组质粒重新转化到大肠杆菌E.coli BL21中，构建了工程菌BL21/pGEM-PEP，它能高效表达重组的PEP。该工程菌BL21/pGEM-PEP于1998年11月9日保藏在中国，武汉市的中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏号为CCTCC M98016。

在YH培养基上进行发酵，结果在YH发酵液上清和胞内都检测到了PEP活性，活力是野生菌的112倍。SDS-PAGE电泳显示，PEP主要存在于胞内，分泌在胞外的PEP小于5％，胞内的PEP占菌体总蛋白的30％左右，而破菌后离心的沉淀中不含有PEP，说明PEP是以可溶状态存在的，没有形成包涵体。

实施例5点状产气单胞菌脯氨酰内肽酶的制备

工程菌的发酵

工程菌的发酵在NBS BioFio 3000型5L自控罐中进行。发酵菌种需要重组质粒新鲜转化的菌株，从平皿中挑取单菌落接入YH试管中32℃培养至对数期作为一级种子，再以2％接种量接入到含100ml YH培养基的500ml摇瓶中，32℃，260rpm培养6h，作为二级种子，以备上罐。摇瓶培养过程中不调节pH值。按NBS BioFlo 3000型发酵罐工作体积的5％接入二级种子，32℃培养20hrs，培养过程中通过补加25％的氨水控制pH在7.0左右，自动调节转速和通入纯氧使溶解氧维持在50％左右。并补加料液。重组蛋白的分离纯化

菌体破碎：发酵结束后5000rpm离心25min收集菌体，用PBS按10∶1悬浮湿菌体，冰浴中用Sonics & Materials超声仪间断超声20次，每次60s破碎菌体，15,000rpm离心15min，上清中加入硫酸铵至20％饱和度，同样离心上清中在加入硫酸铵至65％饱和度，离心的沉淀用20mM Tris-HCl(pH 8.0)缓冲液溶解后进行柱分离。

柱层析分离：样品溶解后用Sephadex G-25(Φ2.5×30cm)脱盐，收集样品后上High Q-Sepharose FF(Φ2×25cm)，用0-0.5M NaCl线性梯度洗脱，对应SDS-PAGE电泳收集PEP活性峰；收集的样品再用65％硫酸铵沉淀，用20mM Tris-HCl(pH 8.0)缓冲液溶解后用Phenyl Sepharose 6FF(Φ2×10cm)纯化，用1.5-0M(NH4)2SO4线性梯度洗脱，洗脱峰走SDS-PAGE电泳，收集PEP，用Protein-Pak DEAE 15HRAP-1(10mm×100mm)HPLC纯化，收集PEP峰，即可得到产物纯品。

实施例6点状产气单胞菌脯氨酰内肽酶的性质

对于实施例5中获得的纯化PEP，如下进行鉴定和性质研究。

(a)重组PEP比活力的测定

PEP的专一性底物Z-G-P-βNA经PEP酶解后释放的β-NA与染料Fast GBC形成在550nm有吸收的偶氮类化合物，A₅₅₀可代表酶的相对活力，对应标准曲线可计算PEP的比活力。活力的计算公式为：比活力(U/mg)＝(479.52A₅₅₀+1.0677)/C，其中C代表酶的浓度(μg/ml)。

最终测定结果，PEP的比活力为67.6U/mg。

(b)PEP的N端测序

PEP的N端测序委托中国科学院上海生物化学研究所测定，质谱委托中国科学院上海有机化学研究所测定。测定均采用本领域常规方法进行。

结果，PEP的N端氨基酸序列分析结果为：M-S-G-K-A-R-L-H-Y-P，与DNA推测的氨基酸序列一致(图5)。

(c)PEP纯度的鉴定

HPLC分析采用Waters Millennium 2010系统C-8反相柱，乙氰0.1％TFA梯度，280nm检测。

结果，实施例5中分离纯化的点状产气单胞菌脯氨酰内肽酶的纯度约为99％。

(d)PEP酶切位点特异性的验证

将催产素9肽和降钙素32肽溶解在20mM Tris-Cl(pH 8.5)缓冲液中，稀释至1mg/ml，按照底物∶酶＝50∶1的量加入PEP酶，32℃酶切10hrs。用C18反相柱(Watersμ-Bond pak 5μ100A 4.6×250mm)在Waters Millennium 2010系统上分析酶切肽谱，使用乙氰梯度(含0.1％TFA)，210nm检测。

分别取酶切催产素4h的样品检测，结果为完全酶切，切点为Pro位点。

分别酶切降钙素32肽5h和10h后取样检测，结果如下：出现了9肽和23肽酶切的两个小肽的峰，经质谱鉴定正确。可见PEP专一性地酶切该位点：

(e)点状产气单胞菌脯氨酰内肽酶的分子量

用凝胶电泳法和分子排阻HPLC来测定重组PEP的分子量。

根据SDS-PAGE电泳迁移率与分子量对数值成反比的关系测得样品的分子量为76kDa。HPLC测定PEP分子量时，缓冲液洗脱的体积与分子量对数值成反比，计算公式为Y＝301522e^-0.1176X其中Y代表分子量(Dal)，X代表洗脱体积(ml)，PEP的洗脱体积为11.7ml，则分子量为76kDa(图8)，电喷雾质谱测定PEP的分子量为76464.61Da。

(f)点状产气单胞菌脯氨酰内肽酶等电点的测定

采用Bio-Rad公司的微型聚丙烯酰胺等电聚焦仪(Mini IEF Cell 111)测定，电泳方法按Bio-Rad资料。两性电解质的pH范围为3-10。上样2μl，电泳结束后考马斯亮兰染色，对应标准pH蛋白分析等电点。

结果，点状产气单胞菌脯氨酰内肽酶的等电点pI＝6.05(理论计算值为5.64)，见图9。

(g)点状产气单胞菌脯氨酰内肽酶的最适温度和pH值

以Z-Gly-Pro-βNA为底物，pH范围在8-9之间活性较高，最适pH为pH＝8.4左右，在pH 9.5时活性还有50％左右，因此PEP酶在碱性条件下活力较好(图10)。

最适温度测定为30-32℃，在0℃保持了25％左右的活力，在10℃有51％的活力，可见在低温下PEP保持了较高的酶活性(图11)。

(h)点状产气单胞菌脯氨酰内肽酶的热稳定性

测定在20、32、37、50℃不同温度下保温5h的酶液，尚剩的酶活力的情况。结果表明PEP在小于32℃的稳定性较好，在50℃ 1h后活力仅剩36.7％，同时表明此纯酶的耐热性不好(图12)。在4℃的冰箱中放置48h活力没有变化。

(i)点状产气单胞菌脯氨酰内肽酶的pH值稳定性

将酶液与不同的缓冲液在26℃保温2h后，按标准酶活测定法测其活力，以在最适反应pH下保温测得的酶活力为100％。结果表明该酶在pH 6-10范围内比较稳定(图13)。

(j)点状产气单胞菌脯氨酰内肽酶的Km值测定

PEP酶的浓度在1×10^-9mol/L，底物浓度在10^-4-10^-5M范围内，超过8×10^-4M，有明显的底物抑制作用。反应时间在5min以内最好。根据Michaelis和Menten推导的米氏方程：v＝V[S]/(Km+[S])，变换得到：[S]/v＝[S]/v+Km/V，按Hanes-Woolf作图法得到Km值，为0.0311mM。

(h)点状产气单胞菌脯氨酰内肽酶的抑制性

用一系列蛋白酶的抑制剂如下进行抑制性测试：将点状产气单胞菌脯氨酰内肽酶与各抑制剂的20mM Tris-HCl缓冲液(pH 8.4)，在32℃温育5分钟，然后如上测定剩余酶活。结果示于表1和2所示。

表1表明PEP酶不受PMSF、TLCK、TPCK、胰蛋白酶抑制剂、胃蛋白酶抑制剂、连四硫酸钠等的抑制，当PMSF浓度高达1mM，已经超过底物浓度的20倍，残留活性还有32.6％。

表1

抑制剂	浓度	剩余活力
抑制剂	浓度	剩余活力	无	0	100％
TPCK	0.1mM	91.6	无	0	100％
TPCK	0.1mM	91.6	TPCK	0.3mM	52.9
TLCK	0.2mM	88.8	TPCK	0.3mM	52.9
TLCK	0.2mM	88.8	TLCK	1mM	52.7
大豆胰蛋白酶抑制剂	0.1mM	99.5	TLCK	1mM	52.7
大豆胰蛋白酶抑制剂	0.1mM	99.5	PMSF	0.1mM	91.3
PMSF	0.5mM	61.8	PMSF	0.1mM	91.3

PMSF	1mM	32.6
PMSF	1mM	32.6	胃蛋白酶抑制剂	0.2mM	60.0
连四硫酸钠	0.2mM	73.5	胃蛋白酶抑制剂	0.2mM	60.0

表2表明，PEP对金属离子和其它化学物质的抑制作用表明不受EDTA和大多数离子的抑制，但明显受SDS、Zn²⁺的抑制。

表2

试剂	浓度(mM)	剩余活性(％)
试剂	浓度(mM)	剩余活性(％)	无	0	100
Mg²⁺	0.2m	100	无	0	100
Mg²⁺	0.2m	100	Zn²⁺	0.2	5.4
Zn²⁺	0.1	8.9	Zn²⁺	0.2	5.4
Zn²⁺	0.1	8.9	Zn²⁺	0.05	18.7
Zn²⁺	0.02	24.1	Zn²⁺	0.05	18.7
Zn²⁺	0.02	24.1	Zn²⁺	0.01	34.5
Fe²⁺	0.2	95.5	Zn²⁺	0.01	34.5
Fe²⁺	0.2	95.5	Cu²⁺	0.2	61.0
Mn²⁺	0.2	78	Cu²⁺	0.2	61.0
Mn²⁺	0.2	78	Ca²⁺	0.2	98
Co²⁺	0.2	79.9	Ca²⁺	0.2	98
Co²⁺	0.2	79.9	EDTA	0.2	109
SDS	0.1％	13.4	EDTA	0.2	109
SDS	0.1％	13.4	SDS	0.05％	23.4

Zn2+明显抑制PEP酶的活性。另外，PEP酶活性不随盐离子浓度(20mM-500mM)的改变而变化。

实施例7重组工程菌BL21/pGEM-PEP的高密度高表达发酵

5L实验室规模的培养采用优化的补料分批发酵工艺，流加含碳源较少的料液，控制流加速度，控制发酵液中的溶解氧，控制工程菌的比生长速率使PEP酶的表达达到最大，发酵20hrs最终菌体密度达60OD₆₀₀，相当于干菌体22.5g/L，获得干菌体98.5g，酶表达量为28％，每升发酵液中含PEP酶3.15g。

接着，对PEP酶进行分离纯化。

PEP表达的产物为可溶性蛋白，占菌体总蛋白的28％左右，因此用硫酸铵分级沉淀即可去除部分杂蛋白，又能去掉大量的核酸类和其它非蛋白类杂质。从不同饱和度硫酸铵的优化可以看出，PEP主要存在于20-65％的饱和度中，该步骤蛋白的回收率为36.2％。

Sephadex G-25上样最大体积可到树脂体积的1/10，总之，比透析脱盐快速、彻底，避免了因脱盐时间长造成酶的失活和自身降解现象。

接下来用High Q-Sepharose FF快速捕捉目标蛋白，并达到较高的分离效果，使酶的纯度达到85％以上。

Phenyl Sepharose 6FF可进一步精细纯化，并避免了硫酸铵沉淀后要脱盐的麻烦，可大大节约时间。并将PEP的纯度纯化达到了96％，完全可以满足作为分子生物学工具酶的要求。若要达到更高纯度的酶制剂，可以用半制备的阴离子型HPLC纯化，一次纯化只需30min，可得到近1mg的纯品。

整个纯化过程的蛋白回收率为10.2％左右，活性回收率在27.3％左右，结果见表3。

表3

程序	蛋白质(mg)	总活力(U)	比活力(U/mg)	产率(％)	纯化倍数
程序	蛋白质(mg)	总活力(U)	比活力(U/mg)	产率(％)	纯化倍数	无细胞的裂解液	10,428	230,000	22.1	100	1.0
硫酸铵沉淀	3,151	122,000	38.9	36.2	1.2	无细胞的裂解液	10,428	230,000	22.1	100	1.0
硫酸铵沉淀	3,151	122,000	38.9	36.2	1.2	高效Qsepharose FF	1,482	90,000	60.8	19.0	3.0
Phenylsepharose 6FF	860	56,000	65.5	10.2	3.42	高效Qsepharose FF	1,482	90,000	60.8	19.0	3.0

纯化后的PEP经SDS-PAGE和HPLC鉴定，其纯度达到99％左右。

本发明首次大规模和高效率地纯化了重组PEP。此前日本的Akio Kanatani曾在J.Biochem.1993年第113期上报道了Aeromonas hydrophila来源的脯氨酸末端肽酶的纯化，10L发酵液中仅纯化得到了16mg的PEP。因此，本发明的上述发酵和纯化工艺简单快速，效率高，各步骤间衔接合理，树脂尽量采用高流速的FF型和高效的High Performance型，过程中避免采用耗时步骤，完成一次制备过程仅需3天，这对于易失活、易降解的蛋白酶极为有利。

实施例8抗体的制备

以实施例5中获得的纯化的脯氨酰内肽酶为免疫原，按标准方法制备单克隆抗体。结果发现，制得的抗体可特异性地与点状产气单胞菌脯氨酰内肽酶结合，并作为其抑制剂。

实施例9表达质粒pBL-PEP的构建和表达

按实施例4相同的方法，构建另一表达质粒pBL-PEP，不同点仅在于：用

质粒pBL代替pGEM-3zf，酶切时用BamHI/EcoRI代替HincII/EcoRI。构建的重组质粒pBL-PEP的结构图示于图14。

将重组质粒pBL-PEP转化到大肠杆菌E.coli BL21中，构建了工程菌BL21/pBL-PEP，它能高效表达重组的PEP。在LB培养基中(蛋白胨10克/升，酵母粉5克/升，氯化钠10克/升，pH 7.0)，30℃培养至对数生长期(OD＝0.4左右)，迅速转入42℃，温度诱导4小时。检测发现可高表达PEP，表达量为30％。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等阶形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

序列表

(1)一般信息：

(i)申请人：中国科学院上海生物工程研究中心

(ii)发明名称：点状产气单胞菌脯氨酰内肽酶及其制法和用途

(iii)序列数目：2

(2)SEQ ID NO.1的信息：

(i)序列特征：

(A)长度：2073 bp

(B)类型：核酸

(C)链性：单链

(D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：DNA

(xi)序列描述：SEQ ID NO.1：ATGTCAGGGA AAGCGCGCCT TCACTACCCC GTCACCCGCC AGGGAGCCCA GGTGGATCAC 60TACTTCGGCC AGGCCGTGGC CGACCCCTAT CGCTGGGTGG AGGATGATCG CAGCCCCGAG 120ACCGAGGCCT GGGTCAAGGC CCAGAATGCC GTGACCCAGG ACTATCTGGC ACAGATCCCG 180TATCGCGCTG CCATCAAGGA GAAGCTGGCC GCCTCCTGGA ACTACGCCAA GGAGGGGGCG 240CCGTTTCGGG AGGGGCGCTA CCACTACTTC TTCAAGAACG ACGGCCTGCA GAACCAGAAC 300GTGCTGTGGC GCCAGAAGGA GGGCAAACCG GCGGAGGTGT TCCTAGATCC CAATACCCTC 360AGCCCCGACG GCACCACGGC GCTGGATCAG CTGAGCTTCT CCCGCGATGG CCGCATCCTG 420GCCTACTCGC TGTCGCTGGC GGGTAGCGAC TGGCGCGAGA TCCACCTGAT GGACGTGGAG 480AGCAAGCAGC CGCTGGAGAC CCCTCTCAAG GACGTGAAAT TCAGCGGCAT CAGCTGGCTC 540GGCAACGAGG GCTTCTTCTA CTCGAGCTAC GACAAGCCCG ATGGCAGCGA GCTGTCGGCC 600AGGACTGATC AGCACAAGGT CTATTTCCAC CGGCTCGGCA CGGCGCAGGA GGATGACCGG 660CTGGTGTTCG GCGCCATCCC GGCCCAGCAC CACCGCTACG TGGGGGCGAC CGTCACCGAA 720GATGACCGCT TCCTGCTCAT CTCGGCGGCG AACTCCACCT CCGGCAACCG CCTCTATGTG 780AAGGATCTGA GCCAGGAGAA CGCGCCGCTG CTGACGGTGC AGGGGGATCT GGACGCGGAC 840GTGAGCCTGG TGGACAACAA GGGCAGCACC CTATACCTGC TGACCAACCG GGACGCCCCC 900AACCGCCGGC TGGTGACGGT GGATGCCGCC AACCCGGGGC CGGCCCACTG GCGCGACCTT 960ATCCCCGAGC GTCACAGGGT GCTGACGGTG CACAGCGGCA GCGGTTATCT GTTCGCCGAG 1020TACATGGTGG ATGCCACCGC CCCGGTCGAG CAGTTCGACT ACGAGGGCAA GCGGGTGCGC 1080GAGGTGGCGC TGCCCGGCCT TGGCAGCGTC AGCGGCTTCA ACGGCAAGCA CGACGACCCC 1140GCCCTCTACT TCGGCTTCGA GAACTATGCC CAGCCGCCCA CTCTCTATCG GTTCGAGCCA 1200AAGAGCGGCG CCATCAGCCT CTATTCCGCC TCGGCGGCGC CGTTCAAGCC GGAGGATTAC 1260GTCTCCGAGC AGCGCTTCTA CCAGAGCAAG GACGGCACCC GGGTGCCGCT CATCATCAGC 1320TACCGCAAGG GGCTGAAACT CGATGGCAGC AACCCGACCA TCCTCTACGG CTATGGCGGT 1380TTTGACGTGA GCCTTACCCC GAGCTTCAGC GTATCGGTGG CCAACTGGCT GGATCTGGGG 1440GGCGTCTATG CGGTGGCCAA CCTGCGTGGG GGCGGCGAGT ACGGCCAGGC CTGGCACCTG 1500GCGGGCACCC AGCAGAACAA ACAGAACGTG TTCGACGACT TCATCGCGGC GGCCGAGTAC 1560CTCAAGGCCG AGGGCTACAC CCGCACCGAT CGGCTGGCGA TCCGCGGTGG CTCCAACGGC 1620GGTCTGCTGG TGGGGGCCGT GATGACCCAG CGGCCGGATC TGATGCGGGT CGCCCTGCCA 1680GCGGTGGGGG TGCTCGACAT GCTGCGCTAC CACACCTTCA CCGCCGGGGC GGGCTGGGCC 1740TATGACTACG GCACCAGTGC CGACAGCGAG GCGATGTTCG ACTACCTGAA GGGCTACTCG 1800CCGCTGCACA ACGTCCGACC CGGGGTCAGC TACCCCTCGA CTATGGTGAC CACGGCGGAT 1860CACGACGATC GGGTGGTACC GGCTCACTCC TTCAAGTTTG CCGCCACCCT GCAGGCCGAC 1920AATGCGGGCC CCCATCCCCA GCTCATCCGC ATCGAGACCA ATGCCGGGCA CGGGGCGGGT 1980ACGCCGGTGG CGAAGCTGAT TGAGCAGAGT GCGGACATCT ATGCCTTCAC CCTGTACGAG 2040ATGGGCTACC GGGAGCTGCC GCGTCAGCCT TGA 2073

(2)SEQ ID NO.2的信息：

(i)序列特征：

(A)长度：690个氨基酸

(B)类型：氨基酸

(D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：多肽

(xi)序列描述：SEQ ID NO.2：Met Ser Gly Lys Ala Arg Leu His Tyr Pro Val Thr Arg Gln Gly 15Ala Gln Val Asp His Tyr Phe Gly Gln Ala Val Ala Asp Pro Tyr 30Arg Trp Val Glu Asp Asp Arg Ser Pro Glu Thr Glu Ala Trp Val 45Lys Ala Gln Asn Ala Val Thr Gln Asp Tyr Leu Ala Gln Ile Pro 60Tyr Arg Ala Ala Ile Lys Glu Lys Leu Ala Ala Ser Trp Asn Tyr 75Ala Lys Glu Gly Ala Pro Phe Arg Glu Gly Arg Tyr His Tyr Phe 90Phe Lys Asn Asp Gly Leu Gln Asn Gln Asn Val Leu Tyr Arg Gln 105Lys Glu Gly Lys Pro Ala Glu Val Phe Leu Asp Pro Asn Thr Leu 120Ser Pro Asp Gly Thr Thr Ala Leu Asp Gln Leu Ser Phe Ser Arg 135Asp Gly Arg Ile Leu Ala Tyr Ser Leu Ser Leu Ala Gly Ser Asp 150Trp Arg Glu Ile His Leu Met Asp Val Glu Ser Lys Gln Pro Leu 165Glu Thr Pro Leu Lys Asp Val Lys Phe Ser Gly Ile Ser Trp Leu 180Gly Asn Glu Gly Phe Phe Tyr Ser Ser Tyr Asp Lys Pro Asp Gly 195Ser Asp Leu Ser Ala Arg Thr Asp Gln His Lys Val Tyr Phe His 210Arg Leu Gly Thr Ala Gln Glu Asp Asp Arg Leu Val Phe Gly Ala 225Ile Pro Ala Gln His His Arg Tyr Val Gly Ala Thr Val Thr Glu 240Asp Asp Arg Phe Leu Leu Ile Ser Ala Ala Asn Ser Thr Ser Gly 255Asn Arg Leu Tyr Val Lys Asp Leu Ser Gln Glu Asn Ala Pro Leu 270Leu Thr Val Gln Gly Asp Leu Asp Ala Asp Val Ser Leu Val Asp 285Asn Lys Gly Ser Thr Leu Tyr Leu Leu Thr Asn Arg Asp Ala Pro 300Asn Arg Arg Leu Val Thr Val Asp Ala Ala Asn Pro Gly Pro Ala 315His Trp Arg Asp Leu Ile Pro Glu Arg His Arg Val Leu Thr Val 330His Ser Gly Ser Gly Tyr Leu Phe Ala Glu Tyr Met Val Asp Ala 345Thr Ala Pro Val Glu Gln Phe Asp Tyr Glu Gly Lys Arg Val Arg 360Glu Val Ala Leu Pro Gly Leu Gly Ser Val Ser Gly Phe Asn Gly 375Lys His Asp Asp Pro Ala Leu Lys Phe Gly Phe Glu Asn Tyr Ala 390Gln Pro Pro Thr Leu Tyr Arg Phe Glu Pro Lys Ser Gly Ala Ile 405Ser Leu Tyr Ser Ala Ser Ala Ala Pro Phe Lys Pro Glu Asp Tyr 420Val Ser Glu Gln Arg Phe Tyr Gln Ser Lys Asp Gly Thr Arg Val 435Pro Leu Ile Ile Ser Tyr Arg Lys Gly Leu Asp Lys Asp Gly Ser 450Asn Pro Thr Ile Leu Tyr Gly Tyr Gly Gly Phe Asp Val Ser Leu 465Thr Pro Ser Phe Ser Val Ser Val Ala Asn Trp Leu Asp Leu Gly 480Gly Val Tyr Ala Val Ala Asn Leu Arg Gly Gly Gly Glu Tyr Gly 495Gln Ala Trp His Leu Ala Gly Thr Gln Gln Asn Lys Gln Asn Val 510Phe Asp Asp Phe Ile Ala Ala Ala Glu Tyr Leu Lys Ala Glu Gly 525Tyr Thr Arg Thr Asp Arg Leu Ala Ile Arg Gly Gly Ser Asn Gly 540Gly Leu Leu Val Gly Ala Val Met Thr Gln Arg Pro Asp Leu Met 555Arg Val Ala Leu Pro Ala Val Gly Val Leu Asp Met Leu Arg Tyr 570His Tyr Phe Thr Ala Gly Ala Gly Trp Ala Tyr Asp Tyr Gly Thr 585Ser Ala Asp Ser Glu Ala Met Phe Asp Tyr Leu Lys Gly Tyr Ser 600Pro Leu His Met Val Arg Pro Gly Val Ser Tyr Pro Ser Thr Met 615Val Thr Thr Ala Asp His Asp Asp Arg Val Val Pro Ala His Ser 630Phe Lys Phe Ala Ala Thr Leu Gln Ala Asp Asn Ala Gly Pro His 645Pro Gln Leu Ile Arg Ile Glu Thr Asn Ala Gly His Gly Ala Gly 660Thr Pro Val Ala Lys Leu Ile Glu Gln Ser Ala Asp ILe Tyr Ala 675Phe Thr Leu Tyr Glu Met Gly Tyr Arg Glu Leu Pro Arg Gln Pro 690

Claims

1.一种分离的脯氨酰内肽酶，其特征在于，该酶是点状产气单胞菌点状亚种(Aeromonas punctata subsp.punctata)的脯氨酰内肽酶。

2.如权利要求1所述脯氨酰内肽酶，其特征在于，它包括SEQ ID No.2所示的氨基酸序列。

3.一种分离的DNA序列，其特征在于，该DNA序列编码具有SEQ ID No.2所示的氨基酸序列的多肽。

4.如权利要求3所述的DNA序列，其特征在于，该DNA序列包括SEQ ID No.1中第1-2073位所示的核苷酸序列。

5.一种表达载体，其特征在于，它含有权利要求3所述DNA序列。

6.一种宿主细胞，其特征在于，它被权利要求5所述的表达载体所转化。

7.如权利要求6所述的宿主细胞，其特征在于，它是大肠杆菌BL21/pGEM-PEP，CCTCC M98016。

8.一种产生脯氨酰内肽酶的方法，其特征在于，该方法包括：

9.如权利要求8所述的方法，其特征在于，在步骤(c)中，培养条件为：胰化蛋白胨10-20g/L；酵母提取物5-10g/L；KH₂PO₄ 1-4g/L；K₂HPO₄ 2-6g/L；Na₂HPO₄·12H₂O5-10g/L；(NH₄)₂SO₄ 0.5-2g/L；NH₄Cl 0.1-0.5g/L；MgSO₄·7H₂O0.5-1g/L。摇床转速为100-400rpm，培养温度为28-38℃，培养基pH为6.5-7.2，培养时间为12-24h。

10.如权利要求8所述的方法，其特征在于，在步骤(d)中，还包括以下步骤：超声破碎、硫酸铵沉淀，然后依次用Sephadex G-25、High Performance Q-SepharoseFF、Phenyl Sepharose 6FF柱进行柱层析。