CN109553673B - 一种生物蛋白积木及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及电子信息技术和生物医学技术领域。本发明提供了一种生物蛋白积木制备方法，所述制备方法包括以下步骤：（1）对生物蛋白薄膜进行第一灰度光刻，构建所述生物蛋白积木的底部；（2）对经过步骤（1）处理后的生物蛋白薄膜进行第二灰度光刻，构建所述生物蛋白积木的顶部；（3）将经过步骤（2）处理的生物蛋白薄膜进行显影，获得所述生物蛋白积木。本发明的生物蛋白积木制备方法以生物蛋白为材料，并且制备过程无需光敏剂，制备的生物蛋白积木生物相容性好、力学性能优异、易功能化、绿色环保、可控降解等优点。
Description
技术领域
本发明涉及电子信息技术和生物医学技术领域，特别设计一种生物蛋白积木及其制备方法。
背景技术
生物结构的精确定位以及功能化生物纳米结构的可控组装，是生物传感、组织工程、再生医学等领域的重要部分。目前运用较为普遍的加工方法主要包括：电子束光刻、离子束光刻、纳米压印、喷墨打印、软光刻、蘸笔纳米光刻、激光加工等。按照加工的方向可以大致分为“自下而上”的加工方法和“自上而下”的加工方法。“自下而上”的加工方法包括以DNA剪纸术为代表的自组装加工方法。“自上而下”的加工方法包括了大部分基于光刻的加工技术。
目前这些加工方法只局限于加工二维或2.5维(即灰度光刻)的结构，并且加工得到的结构的形貌和功能都受限。如何协调现有的以集成电路(integrated circuit，IC)为导向的纳米加工技术与生物系统之间的不匹配是研发人员的根本挑战。
由于大部分的生物分子都很脆弱，并且只能在液体环境中发挥功效，因而在运用传统的加工技术来集成生物材料时会面临很多问题。近些年来，通过在生物蛋白中添加光敏剂，运用紫外光刻和双光子聚合加工技术成功的制备基于生物蛋白的2D和3D的人工微纳结构；光敏剂具有毒性，不但限制了加工后的微纳结构的应用，也破坏了生物蛋白的生物相容性，并且污染环境。
发明内容
鉴于以上所述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种生物蛋白积木及其制备方法，以生物蛋白为材料，并且制备过程无需光敏剂，制备的生物蛋白积木具有生物相容性好、力学性能优异、易功能化、绿色环保、可控降解等优点；其制备方法采用了不同的加工方式，实现“从上而下”和“从下而上”的复合式加工，可以制备一系列形貌和功能可控的生物蛋白积木，突破了传统纳米加工技术难以直接制备小尺寸、高精度、真三维生物蛋白纳米器件的技术瓶颈；该制备方法为功能可分层的、多维度、跨尺度的复杂三维生物蛋白纳米积木的复合纳米光刻的工艺和方法，可以用于开发无毒副物质残留的“绿色”三维生物蛋白微纳器件，并可进一步发展其在生物医疗相关领域的应用，具有较好的应用开发前景。
第一方面，本发明提供了一种生物蛋白积木制备方法，所述制备方法包括以下步骤：(1)对生物蛋白薄膜进行第一灰度光刻，构建所述生物蛋白积木的底部；(2)对经过步骤(1)处理后的生物蛋白薄膜进行第二灰度光刻，构建所述生物蛋白积木的顶部；(3)将经过步骤(2)处理的生物蛋白薄膜进行显影，获得所述生物蛋白积木。
第一灰度光刻采用“自下而上”的加工方式对生物蛋白的底部进行加工，以构建生物蛋白积木的底部。第二灰度光刻采用“自上而下”的加工方式对生物蛋白的顶部进行加工，以构建生物蛋白积木的顶部。第一灰度光刻和第二灰度光刻只是空间和加工次序的区分，均可包含多次灰度光刻以及多种光刻方法。
在本发明的一个实施例中，所述步骤(1)包括：采用电子束光刻技术进行所述第一灰度光刻。
在本发明的一个实施例中，所述步骤(2)包括：采用离子束光刻技术、紫外光刻技术、喷墨打印技术中的一种或多种进行所述第二灰度光刻。
在本发明的一个实施例中，所述生物蛋白薄膜中的生物蛋白的功能经基因调控获得。
生物蛋白的功能经基因调控获得，具体是指通过改变编码基因来调控生物蛋白的功能。在本发明的一个实施例中，在所述步骤(1)之前，所述生物蛋白积木制备方法还包括：将生物蛋白溶液涂覆于基底，干燥，形成所述生物蛋白薄膜。
在本发明的一个实施例中，在所述将生物蛋白溶液涂覆于基底之前，所述生物蛋白积木制备方法还包括：对所述生物蛋白溶液中的生物蛋白进行功能化处理；其中，所述功能化处理方式选自化学修饰、掺杂、溶液混合的一种或多种。
在本发明的一个实施例中，配置生物蛋白溶液的溶剂以及显影时用到的显影液的电阻率不小于18MΩ·cm。
在本发明的一个实施例中，所述生物蛋白溶液为生物蛋白水溶液；其中，所述生物蛋白水溶液中生物蛋白的浓度为1μg/L～1g/ml。
在本发明的一个实施例中，所述将生物蛋白溶液涂覆于基底的步骤包括：将0.1～1000μL所述生物蛋白溶液滴涂于所述基底；或者，将0.1～1000μL所述生物蛋白溶液旋涂于所述基底；其中，所述旋涂的转速为1～10000r/min，旋涂时间为1s～1h。
在本发明的一个实施例中，所述干燥步骤包括如下步骤：室温干燥，15～35℃，0.1h～48h；烘箱加热，70～130℃，0.1～300min。
在本发明的一个实施例中，所述生物蛋白薄膜的厚度为1nm～100μm。
在本发明的一个实施例中，所述生物蛋白薄膜包括至少两层薄膜；其中，每层薄膜的厚度为1nm～10μm。
在本发明的一个实施例中，所述生物蛋白薄膜包括至少两层薄膜；其中，相邻的两层薄膜分别由采用不同的溶剂的生物蛋白溶液制备而成。
在本发明的一个实施例中，所述显影步骤包括如下步骤：显影1s～10h；其中，显影液的电阻率不小于18MΩ·cm；25℃常压下进行干燥，干燥时间为1s～100h。
在本发明的一个实施例中，所述生物蛋白薄膜为天然生物蛋白或重组生物蛋白组成的生物薄膜。
在本发明的一个实施例中，所述天然生物蛋白选自蚕丝蛋白、蛛丝蛋白、胶原蛋白、鹿角蛋白中的一种或多种。
第二方面，本发明还提供了一种由第一方面所述的生物蛋白积木制备方法制备而成的生物蛋白积木。
第三方面，本发明还提供了一种采用如第二方面所述的生物蛋白积木组装的蛋白。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
生物蛋白积木以生物蛋白为材料，并且制备过程无需光敏剂，生物相容性好、力学性能优异、易功能化、绿色环保、可控降解等优点；其制备方法采用了不同的加工方式，实现“从上而下”和“从下而上”的复合式加工，可以制备一系列形貌和功能可控的生物蛋白积木，突破了传统纳米加工技术难以直接制备小尺寸、高精度、真三维生物蛋白纳米器件的技术瓶颈；该制备方法为功能可分层的、多维度、跨尺度的复杂三维生物蛋白纳米积木的复合纳米光刻的工艺和方法，可以用于开发无毒副物质残留的“绿色”三维生物蛋白微纳器件，并可进一步发展其在生物医疗相关领域的应用，具有较好的应用开发前景。
附图说明
图1为本发明实施例提供的生物蛋白积木制备方法的流程示意图。
图2为对比例1中得到的2维和2.5维生物蛋白积木的扫描电镜照片。
图3为实施例2得到的3维生物蛋白结构的扫描电镜照片。
图4为实施例3中生物蛋白积木保持良好的生物相容性验证实验流程图。
图5为实施例4中功能化的生物蛋白积木生物相容性验证实验流程图。
图6为实施例5中的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳图。
图7为实施例7中不同生物蛋白材料进行离子束光刻后形貌的扫描电镜照片。
具体实施方式
在进一步描述本发明具体实施方式之前，应理解，本发明的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案；还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围；在本发明说明书和权利要求书中，除非文中另外明确指出，单数形式“一个”、“一”和“这个”包括复数形式。
当实施例给出数值范围时，应理解，除非本发明另有说明，每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用。除非另外定义，本发明中使用的所有技术和科学术语与本技术领域技术人员通常理解的意义相同。除实施例中使用的具体方法、设备、材料外，根据本技术领域的技术人员对现有技术的掌握及本发明的记载，还可以使用与本发明实施例中所述的方法、设备、材料相似或等同的现有技术的任何方法、设备和材料来实现本发明。
除非另外说明，本发明中所公开的实验方法、检测方法、制备方法均采用本技术领域常规的分子生物学、生物化学、染色质结构和分析、分析化学、细胞培养、重组DNA技术及相关领域的常规技术。这些技术在现有文献中已有完善说明，具体可参见Sambrook等MOLECULAR CLONING：A LABORATORY MANUAL，Second edition，Cold Spring HarborLaboratory Press，1989and Third edition，2001；Ausubel等，CURRENT PROTOCOLS INMOLECULAR BIOLOGY，John Wiley&Sons，New York，1987and periodic updates；theseries METHODS IN ENZYMOLOGY，Academic Press，San Diego；Wolffe，CHROMATINSTRUCTURE AND FUNCTION，Third edition，Academic Press，San Diego，1998；METHODS INENZYMOLOGY，Vol.304，Chromatin(P.M.Wassarman and A.P.Wolffe，eds.)，AcademicPress，San Diego，1999；和METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY，Vol.119，ChromatinProtocols(P.B.Becker，ed.)Humana Press，Totowa，1999等。
本发明实施例提供了一种生物蛋白积木制备方法，所述制备方法包括以下步骤：(1)对生物蛋白薄膜进行第一灰度光刻，构建所述生物蛋白积木的底部；(2)对经过步骤(1)处理后的生物蛋白薄膜进行第二灰度光刻，构建所述生物蛋白积木的顶部；(3)将经过步骤(2)处理的生物蛋白薄膜进行显影，获得所述生物蛋白积木。
第一灰度光刻采用“自下而上”的加工方式对生物蛋白的底部进行加工，以构建生物蛋白积木的底部。第二灰度光刻采用“自上而下”的加工方式对生物蛋白的顶部进行加工，以构建生物蛋白积木的顶部。
在一个示例中，所述步骤(1)包括：采用电子束光刻技术进行所述第一灰度光刻。电子很小，能穿透生物蛋白薄膜，遇到基底后会反弹，因而可以“自下而上”地对生物蛋白的底部进行加工。更具体的，电子束曝光的加速电压为0.1～200kV，束流为0.1～1000pA，曝光剂量为0.1～107μC/cm2。
在一个示例中，所述步骤(2)包括：采用离子束光刻技术、紫外光刻技术、喷墨打印技术中的一种或多种进行所述第二灰度光刻。离子很大，无法穿透生物蛋白薄膜膜，因而离子束光刻技术可以“自上而下”地对生物蛋白的顶部进行加工。更具体的，聚焦离子束的加速电压为1～200kV,束流为1～10000pA,曝光剂量为0.1～108μC/cm2；紫外光刻的曝光剂量为0.1～10000mJ/cm2，曝光时间为0.1～1000s；喷墨打印控制电压为0.1～40V，墨滴黏度1～50cps，墨滴体积为1～100μL，墨滴温度10～100℃。
在一个示例中，所述生物蛋白薄膜中的生物蛋白的功能经基因调控获得。在该示例中，生物蛋白具体为通过基因工程改造过的生物蛋白。更具体地，可以对编码生物蛋白的基因进行改造，以使改造后的基因能够编码具有预设功能的生物蛋白，然后将改造后的基因导入宿主，然后培养，经过蛋白提取步骤获得生物蛋白，进而利用获得的生物蛋白制备生物蛋白薄膜。
在一个示例中，在所述步骤(1)之前，所述生物蛋白积木制备方法还包括：将生物蛋白溶液涂覆于基底，干燥，形成所述生物蛋白薄膜。
在一个示例中，在所述将生物蛋白溶液涂覆于基底之前，所述生物蛋白积木制备方法还包括：对所述生物蛋白溶液中的生物蛋白进行功能化处理；其中，所述功能化处理方式选自化学修饰、掺杂、溶液混合的一种或多种。在该示例中，将生物蛋白溶液溶剂，制备了生物蛋白溶液后，可以利用化学修饰、掺杂、溶液混合等方式对生物蛋白进行功能化处理。
在一个示例中，所述生物蛋白溶液的溶剂的电阻率不小于18MΩ·cm。在一个例子中，溶剂具体为超纯水。
在一个示例中，所述生物蛋白溶液为生物蛋白水溶液；其中，所述生物蛋白水溶液中生物蛋白的浓度为1μg/L～1g/ml。
在一个示例中，所述将生物蛋白溶液涂覆于基底的步骤包括：将0.1～1000μL所述生物蛋白溶液滴涂于所述基底；或者，将0.1～1000μL所述生物蛋白溶液旋涂于所述基底；其中，所述旋涂的转速为1～10000r/min，旋涂时间为1s～1h。
在一个示例中，所述干燥步骤包括如下步骤：室温干燥，15～35℃，0.1h～48h；烘箱加热，70～130℃，0.1～300min。
在一个示例中，所述生物蛋白薄膜的厚度为1nm～100μm。
在一个示例中，所述生物蛋白薄膜包括至少两层薄膜；其中，每层薄膜的厚度为1nm～10μm。
在一个示例中，所述生物蛋白薄膜包括至少两层薄膜；其中，相邻的两层薄膜分别由采用不同的溶剂的生物蛋白溶液制备而成。
在一个示例中，所述显影步骤包括如下步骤：显影1s～10h；其中，显影液的电阻率不小于18MΩ·cm；25℃常压下进行干燥，干燥时间为1s～100h。
在一个示例中，所述生物蛋白薄膜为天然生物蛋白或重组生物蛋白组成的生物薄膜。
在一个示例中，所述天然生物蛋白选自蚕丝蛋白、蛛丝蛋白、胶原蛋白、鹿角蛋白中的一种或多种。所述蚕丝蛋白、蛛丝蛋白、胶原蛋白、鹿角蛋白可以为对天然或重组蚕丝蛋白、蛛丝蛋白、胶原蛋白、鹿角蛋白进行剪碎、去胶、溶解、透析等一系列步骤提取出来的蛋白。
在一个示例中，所述天然生物蛋白或重组生物蛋白的分子量为1KDa～1000KDa。
在一个示例中，所述天然生物蛋白或重组生物蛋白的形态为溶液或者固体粉末。
本发明实施例提供的生物蛋白积木制备方法无需往生物蛋白中添加光敏剂；采用了不同的加工方式，实现“从上而下”和“从下而上”的复合式加工，可以制备一系列形貌和功能可控的生物蛋白积木，突破了传统纳米加工技术难以直接制备小尺寸、高精度、真三维生物蛋白纳米器件的技术瓶颈；该制备方法为功能可分层的、多维度、跨尺度的复杂三维生物蛋白纳米积木的复合纳米光刻的工艺和方法，可以用于开发无毒副物质残留的“绿色”三维生物蛋白微纳器件，并可进一步发展其在生物医疗相关领域的应用，具有较好的应用开发前景。
本发明的实施例提供了一种由上文所述的生物蛋白积木制备方法制备而成的生物蛋白积木。
需要说明的是，在本发明实施例中，生物蛋白积木是指类似于乐高积木，可以相互拼接，用于组装具有特定三维结构的生物蛋白元件。
制备得到的生物蛋白积木保留了生物蛋白的功能。
本发明实施例提供的生物蛋白积木以生物蛋白为材料，并且制备过程无需光敏剂，生物相容性好、力学性能优异、易功能化、绿色环保、可控降解等优点。
本发明实施例提供的蛋白积木还具有广泛的用途，在电子信息技术和生物医学领域都具有极其重要的意义。举例而言，可以通过掺入荧光分子的周期纳米光栅，实现荧光增强，也可以用于组装生物蛋白微纳结构、功能化的微纳元器件、人体植入式可降解微芯片、生物光电传感等。
本发明实施例还提供了一种上述所述的生物蛋白积木组装的蛋白。
下文以具体实施例对本发明提供的生物蛋白积木及其制备方法进行举例说明。
实施例1
自然提取天然蚕丝蛋白，具体为对天然蚕茧进行剪碎、去胶、溶解、透析等一系列步骤，获得天然蚕丝蛋白。
将天然蚕丝蛋白分成多份。
对每份天然蚕丝蛋白进行特定的功能化处理，以为多份天然蚕丝蛋白赋予不同的生物功能。功能化的处理方式为化学修饰、掺杂、溶液混合等。
将经过功能化处理后的蚕丝蛋白的水溶液涂覆于基底上，干燥并固化形成生物蛋白薄膜。
将具有不同生物功能的蚕丝蛋白按需一层一层涂于基底上，干燥并固化，形成多层次多功能生物蛋白复合薄膜。
对生物蛋白薄膜进行“自下而上”的加工，进行灰度光刻，完成蛋白积木底部的构建。具体可以采用电子束光刻技术。
对生物蛋白薄膜进行“自上而下的”加工，进行灰度光刻，完成蛋白积木顶部的构建。具体可以采用离子束光刻技术，紫外光刻技术，喷墨打印技术等技术。
将曝光后生物蛋白薄膜置于水中显影并干燥；
获得三维多功能生物蛋白积木。
对比例1
制备生物蛋白水溶液。具体地，将基因重组蜘蛛丝蛋白溶解于水中。在一个例子中，所述基因重组蜘蛛丝蛋白的分子量为75KDa，为固体粉末，水为超纯水，电阻率为18.25MΩ·cm。
制备生物蛋白薄膜。具体地，将基因重组蜘蛛丝蛋白水溶液涂覆于基底上，干燥并固化形成基因重组蜘蛛丝蛋白薄膜。在一个例子中，基因重组蜘蛛丝蛋白水溶液的浓度为40mg/mL，涂覆方式采用旋涂，所用基因重组蜘蛛丝蛋白水溶液体积为40μL，转速为2000r/min，旋涂时间为60s，室温干燥，25℃，24h，烘箱加热固化，60℃，60min。
灰度光刻。具体地，运用“自下而上”的加工方式加工生物蛋白薄膜的底部部分，以构建生物蛋白积木的底部。在一个例子中，所述“自下而上”的加工方法为电子束光刻技术，电子束的加速电压为30kV，束流为1pA，曝光剂量为10～10000μC/cm2。
显影。具体地，将曝光后的步骤S3得到的样品置于水中显影并干燥。在一个例子中，所述显影液为超纯水，电阻率为18.25MΩ·cm，显影时间为300s，干燥方式为25℃常压下干燥，时间1h。
经过上述步骤，可以得到具有2维和2.5维结构的生物蛋白积木，具体如图2所示。
实施例2
在实施例2中，结合图1对本发明提供的生物蛋白积木制备方法进行具体说明。
步骤S1、制备生物蛋白水溶液。具体地，将基因重组蜘蛛丝蛋白溶解于水中。在一个例子中，所述基因重组蜘蛛丝蛋白的分子量为75KDa，为固体粉末，水为超纯水，电阻率为18.25MΩ·cm。
在步骤S1之后，功能化处理所述生物蛋白水溶液。在一个例子中，在基因重组蜘蛛丝蛋白溶液中掺杂罗丹明B，使其具有荧光特性。
步骤S2、制备生物蛋白薄膜。具体地，将进行了功能化处理的基因重组蜘蛛丝蛋白水溶液涂覆于基底上，干燥并固化形成基因重组蜘蛛丝蛋白薄膜。在一个例子中，基因重组蜘蛛丝蛋白水溶液的浓度为60mg/mL，涂覆方式采用旋涂，所用基因重组蜘蛛丝蛋白体积为40μL，转速为2000r/min，旋涂时间为60s，室温干燥，25℃，24h，烘箱加热固化，60℃，60min。
步骤S3、第一灰度光刻。第一灰度光刻具体为运用“自下而上”的加工方式加工生物蛋白薄膜的底部部分，以构建生物蛋白积木的底部。在一个例子中，所述“自下而上”的加工方法为电子束光刻技术，电子束的加速电压为30kV，束流为1pA，曝光剂量为10～10000μC/cm2。
步骤S4、第二灰度光刻。第二灰度光刻具体为运用“自上而下”的加工方式加工第一灰度光刻后的样品的顶部部分，以构建生物蛋白积木的顶部。在一个例子中，所述“自上而下”的加工方法为离子束光刻技术，离子束的加速电压为30kV，束流为1pA，曝光剂量为10～10000μC/cm2。
执行步骤S5、显影。具体地，将曝光后的步骤S3得到的样品进行曝光后，置于水中显影并干燥。在一个例子中，所述显影液为超纯水，电阻率为18.25MΩ·cm，显影时间为300s，干燥方式为25℃常压下干燥，时间1h。
经过上述步骤，可以得到具有3维结构的生物蛋白积木，具体可以如图3所示。
实施例3
重组蛛丝蛋白具有很好的生物相容性，可以保存生物分子辣根过氧化物酶(Horseradish Peroxidase，HRP)的活性，活性HRP可以与四甲基联苯胺(Tetramethylbenzidine，TMB)发生显色反应。
为验证经过制备成生物蛋白积木后的重组蛛丝蛋白的相容性，进行流程如图4所示的实验。
往重组蛛丝蛋白溶液中加入HRP，得到重组蛛丝蛋白和HRP的混合溶液，将其涂覆于两个基底上，干燥并固化形成基因重组蜘蛛丝蛋白和HRP薄膜。
对两个基底上的薄膜分别进行正胶灰度光刻和负胶灰度光刻。具体地，具体为运用“自下而上”的加工方式加工生物蛋白薄膜的底部部分，以构建生物蛋白积木的底部。所述“自下而上”的加工方法为电子束光刻技术，电子束的加速电压为30kV，束流为1pA，曝光剂量为10～10000μC/cm2。然后在运用“自上而下”的加工方式加工顶部部分，以构建生物蛋白积木的顶部。所述“自上而下”的加工方法为离子束光刻技术，离子束的加速电压为30kV，束流为1pA，曝光剂量为10～10000μC/cm2。
显影。具体地，将曝光后的灰度光刻得到的样品置于水中显影并干燥。所述显影液为超纯水，电阻率为18.25MΩ·cm，显影时间为300s，干燥方式为25℃常压下干燥，时间1h。
经过上述步骤，得到正胶形式的基因重组蜘蛛丝蛋白和HRP积木以及负胶形式的基因重组蜘蛛丝蛋白和HRP积木，分别滴加BMP。如图4所示，产生了明显的显示反应(颜色加深)。表明基因重组蛛丝蛋白经过本发明提供的生物蛋白积木制备方法加工成蛋白积木后仍保留了较好的生物相容性。
实施例4
在本实施了中进行流程如图5所示的实验。
具体地，制备四份重组蛛丝蛋白溶液，其中，一份加入胶原蛋白，另一份加入杀肿瘤药物替莫唑胺(Temozolomide，TMZ)，另外两份用作对照。
生物蛋白积木的制备过程参照实施例2。
利用重组蛛丝蛋白和胶原蛋白制备的蛋白积木以及对照蛋白积木培养细胞，从图中可以看出，经过一段时间的培养，相比对照蛋白积木，重组蛛丝蛋白和胶原蛋白制备的蛋白积木培养的细胞数量显著增多，说明通过本发明实施例提供的生物积木蛋白制备方法得到的蛋白积木后仍保留了较好的生物相容性。
往重组蛛丝蛋白和TMZ制备的蛋白积木以及对照蛋白积木滴加肿瘤细胞，从图中可以看出，经过一段时间的培养，相比对照蛋白积木，重组蛛丝蛋白和TMZ制备的蛋白积木培养的细胞数量显著减少，说明通过本发明实施例提供的生物积木蛋白制备方法得到的蛋白积木后仍保留了较好的生物相容性。
实施例5
本发明实施例采用了SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳比较了蛛丝蛋白(MasSp1)、提取时间为30分钟的蚕丝蛋白(30mins silk)、提取时间为90分钟的蚕丝蛋白(90mins silk)、提取时间为120分钟的蚕丝蛋白(120mins silk)以及高温高压条件下提取的蚕丝蛋白(HTPsilk)的分子量。结果如图6所示，其中，泳道30、90、120、HTP以及MasSp1分别为30minssilk、90mins silk、120mins silk、HTP silk和蛛丝蛋白泳道。图6显示，对于不同提取时间的蚕丝蛋白，其分子量是比较宽的分布。对于重组蜘蛛丝蛋白(MaSp1)，其分子量分布很窄，说明其分子量更为均一。
实施例6
本发明实施例比较了重组蛛丝蛋白(Spider silk)、提取时间为30分钟的蚕丝蛋白(30mins silk)、高温高压条件下提取的蚕丝蛋白(HTP silk)以及PMMA的抗刻蚀比，具体方式为测量不同材料的薄膜与硅片经过深反应离子刻蚀仪作用后刻蚀的深度。得到的薄膜的刻蚀深度与硅片的刻蚀深度的比值即为抗刻蚀比。结果如表1所示。
表1
重组蛛丝蛋白、30mins silk、60mins silk、120mins silk、HTP silk的抗刻蚀比明显高于常规的光刻胶PMMA。相比之下，重组蜘蛛丝蛋白具有更高的抗刻蚀比。
实施例7
在本实施例中，采用实施例2提到的生物蛋白积木制备方法，分别以蛛丝蛋白(MasSp1)、提取时间为30分钟的蚕丝蛋白(30mins silk)、提取时间为120分钟的蚕丝蛋白(120mins silk)以及高温高压条件下提取的蚕丝蛋白(HTP silk)为材料制备了生物蛋白，结果如图7所示，说明由于分子量更均一，在特定能量下分子链聚合会形成形貌更光滑的结构。而如果分子量是一个很宽的范围，在能量作用下，有的链能聚合，有的就不能聚合，因而生成的结构也不规整、光滑。
综上所述，本发明有效克服了现有技术中的种种缺点而具高度产业利用价值。
上述实施例仅例示性说明本发明的原理及其功效，而非用于限制本发明。任何熟悉此技术的人士皆可在不违背本发明的精神及范畴下，对上述实施例进行修饰或改变。因此，举凡所属技术领域中具有通常知识者在未脱离本发明所揭示的精神与技术思想下所完成的一切等效修饰或改变，仍应由本发明的权利要求所涵盖。
Claims (14)
1.一种生物蛋白积木制备方法，其特征在于，所述制备方法包括以下步骤：
(1)对生物蛋白薄膜进行第一灰度光刻，构建所述生物蛋白积木的底部；其中，所述生物蛋白薄膜为分子量均一的基因重组蜘蛛丝蛋白组成的生物薄膜，所述基因重组蜘蛛丝蛋白的分子量为1KDa～75KDa，采用电子束光刻技术进行所述第一灰度光刻；
(2)对经过步骤(1)处理后的生物蛋白薄膜进行第二灰度光刻，构建所述生物蛋白积木的顶部；其中，采用离子束光刻技术、紫外光刻技术、喷墨打印技术中的一种或多种进行所述第二灰度光刻；
(3)将经过步骤(2)处理的生物蛋白薄膜进行显影，获得所述生物蛋白积木。
2.根据权利要求1所述的生物蛋白积木制备方法，其特征在于，所述生物蛋白薄膜中的生物蛋白的功能经基因调控获得。
3.根据权利要求1所述的生物蛋白积木制备方法，其特征在于，在所述步骤(1)之前，所述生物蛋白积木制备方法还包括：
将生物蛋白溶液涂覆于基底，干燥，形成所述生物蛋白薄膜。
4.根据权利要求3所述的生物蛋白积木制备方法，其特征在于，在所述将生物蛋白溶液涂覆于基底之前，所述生物蛋白积木制备方法还包括：
对所述生物蛋白溶液中的生物蛋白进行功能化处理；其中，所述功能化处理方式选自化学修饰、掺杂、溶液混合的一种或多种。
5.根据权利要求3所述的蛋白积木制备方法，其特征在于，配置生物蛋白溶液的溶剂以及显影时用到的显影液的电阻率不小于18MΩ·cm。
6.根据权利要求3所述的蛋白积木制备方法，其特征在于，所述生物蛋白溶液为生物蛋白水溶液；
其中，所述生物蛋白水溶液中生物蛋白的浓度为1μg/L～1g/ml。
7.根据权利要求6所述的生物蛋白积木制备方法，其特征在于，所述将生物蛋白溶液涂覆于基底的步骤包括：
将0.1～1000μL所述生物蛋白溶液滴涂于所述基底；或者，将0.1～1000μL所述生物蛋白溶液旋涂于所述基底；其中，所述旋涂的转速为1～10000r/min，旋涂时间为1s～1h。
8.根据权利要求3所述的生物蛋白积木制备方法，其特征在于，所述干燥步骤包括如下步骤：
室温干燥，15～35℃，0.1h～48h；
烘箱加热，70～130℃，0.1～300min。
9.根据权利要求1所述的生物蛋白积木制备方法，其特征在于，所述生物蛋白薄膜的厚度为1nm～100μm。
10.根据权利要求1所述的生物蛋白积木制备方法，其特征在于，所述生物蛋白薄膜包括至少两层薄膜；其中，每层薄膜的厚度为1nm～10μm。
11.根据权利要求1所述的生物蛋白积木制备方法，其特征在于，所述生物蛋白薄膜包括至少两层薄膜；其中，相邻的两层薄膜分别由采用不同的溶剂的生物蛋白溶液制备而成。
12.根据权利要求1所述的生物蛋白积木制备方法，其特征在于，所述显影步骤包括如下步骤：
显影1s～10h；其中，显影液的电阻率不小于18MΩ·cm；
25℃常压下进行干燥，干燥时间为1s～100h。
13.一种由权利要求1-12任一项所述的生物蛋白积木制备方法制备而成的生物蛋白积木。
14.一种权利要求13生物蛋白积木组装的蛋白。
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| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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| GR01 | Patent grant | ||
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