WO2020067552A1 - タンパク質成形体及びその製造方法、成形用原液及びその製造方法、並びにタンパク質成形体用着色剤 - Google Patents

タンパク質成形体及びその製造方法、成形用原液及びその製造方法、並びにタンパク質成形体用着色剤 Download PDF

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WO2020067552A1
WO2020067552A1 PCT/JP2019/038433 JP2019038433W WO2020067552A1 WO 2020067552 A1 WO2020067552 A1 WO 2020067552A1 JP 2019038433 W JP2019038433 W JP 2019038433W WO 2020067552 A1 WO2020067552 A1 WO 2020067552A1
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protein
amino acid
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sequence
fibroin
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PCT/JP2019/038433
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原田　諭
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Ｓｐｉｂｅｒ株式会社
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08K—Use of inorganic or non-macromolecular organic substances as compounding ingredients
    • C08K5/00—Use of organic ingredients
    • C08K5/16—Nitrogen-containing compounds
    • C08K5/34—Heterocyclic compounds having nitrogen in the ring
    • C08K5/3467—Heterocyclic compounds having nitrogen in the ring having more than two nitrogen atoms in the ring
    • C08K5/3477—Six-membered rings
    • C08K5/3495—Six-membered rings condensed with carbocyclic rings
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08L—COMPOSITIONS OF MACROMOLECULAR COMPOUNDS
    • C08L89/00—Compositions of proteins; Compositions of derivatives thereof
    • D—TEXTILES; PAPER
    • D01—NATURAL OR MAN-MADE THREADS OR FIBRES; SPINNING
    • D01F—CHEMICAL FEATURES IN THE MANUFACTURE OF ARTIFICIAL FILAMENTS, THREADS, FIBRES, BRISTLES OR RIBBONS; APPARATUS SPECIALLY ADAPTED FOR THE MANUFACTURE OF CARBON FILAMENTS
    • D01F4/00—Monocomponent artificial filaments or the like of proteins; Manufacture thereof
    • D01F4/02—Monocomponent artificial filaments or the like of proteins; Manufacture thereof from fibroin

Definitions

  • Patent Document 1 discloses a protein fiber which is colored with a primary dye such as an acid dye, a basic dye, or a fluorescent dye as a primary dye.
  • the soaked dye here is a dye added to the dope solution to produce protein fibers by spinning.
  • the degree of coloring by a dye such as a primary dye varies depending on the type of the protein and the solvent in which the protein material is dissolved. Therefore, for example, a small amount of the pigment may not be able to sufficiently color a molded article such as a protein fiber. Therefore, it is desirable to select as many dyes as possible.
  • One aspect of the present invention provides a protein molded article colored with a dye different from the conventional one.
  • one aspect of the present invention relates to a protein molded product containing a protein, a purine base compound having a purine ring, and / or a degradation product thereof.
  • a stock solution for forming an original protein molded product comprising a protein and a purine base compound having a purine ring.
  • the stock solution is prepared, for example, by preparing a raw material powder containing a protein, a purine base compound having a purine ring, and a protein-containing liquid containing a solvent, and dissolving the protein in the protein-containing liquid in the solvent.
  • a method including: An original protein molded article can be produced by a method including forming a colored protein molded article by molding using the molding stock solution.
  • the purine base compound may be contained in the raw material powder.
  • the raw material powder may be a host expressing a protein or a crushed product thereof, or a powder containing the protein and a purine base compound.
  • the present invention it is possible to provide a protein molded article colored with a dye different from the conventional one.
  • the dye may be a primary dye.
  • a protein molded product contains a protein, a purine base compound having a purine ring, and / or a degradation product thereof.
  • the protein molded article may be a native protein molded article.
  • the term “dyeing” means that the molded article itself formed by various molding methods from the undiluted solution for molding is colored, including the inside thereof, and the surface of the formed molded article is later added. It is different from the colored molding obtained by dyeing.
  • the original protein molded article according to the present embodiment is colored by the purine base compound having a purine ring and / or a decomposition product thereof acting as an original pigment.
  • a protein molded product that can be visually confirmed to be colored compared to a molded product obtained from an undiluted coloring solution (here, a purine base compound) that does not contain a purifying base compound is regarded as a native protein molded product. Can be.
  • a protein molded product is a molded product formed mainly by proteins.
  • the ratio of the protein in the molded article may be, for example, 80% by mass or more, or 90% by mass or more based on the mass of the molded article. Details of the protein will be described later.
  • a purine base compound is a compound having one or more purine rings.
  • the purine ring may be an adenine ring, a guanine ring, a hivoxanthin ring, a xanthine ring, a theobromine ring, a caffeine ring, a uric acid ring, an isoguanine ring, or a combination thereof.
  • the purine base compound may have a purine ring and a pyrimidine ring.
  • the purine base compound may be deoxyribonucleic acid (DNA) or a compound derived from DNA.
  • the purine base compound derived from DNA may be a compound having an adenine ring or a guanine ring as a purine ring.
  • Purine base compounds may be nucleosides or nucleotides. Examples of purine base compounds derived from DNA include deoxyadenosine monophosphate and sodium 2'-deoxyguanosine 5'-mono
  • the decomposed product of the purine base compound may be, for example, an imidazole compound having an imidazole ring and a substituent derived from the 6-membered ring portion of the purine ring.
  • the total content of the purine base compound and the decomposition product thereof may be 0.1% by mass or more and 10% by mass or less, or 8% by mass or less, or 0.2% by mass or more and 10% by mass or less. Or 8% by mass or less, 0.3% by mass or more and 10% by mass or less, or 8% by mass or less, and 0.4% by mass or more and 10% by mass or less, or 8% by mass % Or less, 0.5% to 10% by mass or 8% by mass, or 1.0% to 10% by mass or 8% by mass or less. You may.
  • the content of the purine base compound may be within these numerical ranges.
  • the protein molded body may further include a solvent.
  • This solvent is usually the solvent contained in the stock solution for molding used to obtain the molded body.
  • the solvent may contain an acid compound such as formic acid (particularly, an organic acid compound).
  • the content of the solvent in the protein molded body may be, for example, 0.0001 to 1% by mass based on the mass of the protein.
  • An impregnated protein molded article is produced, for example, by a method including forming a colored protein molded article by molding using a stock solution containing a protein, a purine base compound, and a solvent in which these are dissolved. be able to.
  • a sufficiently colored unadhered protein molded product can be obtained.
  • At least a part of the purine base compound can be decomposed due to a reaction with a solvent and / or an influence of heat history or the like in a process of forming the original protein molded product.
  • the concentration of the protein in the stock solution for molding may be, for example, 5 to 50% by mass based on the mass of the stock solution for molding.
  • the amount of the purine base compound may be 0.1% by mass or more and 10% by mass or less, or 8% by mass or less, or 0.2% by mass or more and 10% by mass or less, based on the mass of the protein. It may be 8% by mass or less, 0.3% by mass or more and 10% by mass or less, or 8% by mass or less, and 0.4% by mass or more and 10% by mass or less, or 8% by mass or less. May be 0.5% by mass or more and 10% by mass or less, or 8% by mass or less, and may be 1.0% by mass or more and 10% by mass or less, or 8% by mass or less. Good.
  • An undiluted solution for molding is prepared by, for example, a method comprising preparing a protein-containing solution containing a raw material powder containing a protein, a purine base compound, and a solvent, and dissolving the protein in the protein-containing solution in a solvent.
  • the purine base compound may be contained in the raw material powder, or may be dissolved or dispersed in a solvent separately from the raw material powder.
  • the raw material powder may be, for example, a powder containing a host expressing a protein or a pulverized product thereof, or a powder containing a protein and a purine base compound.
  • the method for obtaining the stock solution for molding may further include heating the solvent.
  • the protein-containing liquid may be heated, for example, to disperse or dissolve the purine base compound in the solvent, to dissolve the protein in the solvent, or to remove insolubles as described below. .
  • the raw material powder containing the host in which the protein has been expressed or a pulverized product thereof may be a powder recovered from a culture medium containing the protein produced and accumulated by culturing the host.
  • the ground material of the host may be mixed with a solvent, or the host may be ground in a protein-containing liquid. Before or after dissolving the protein in the solvent, insoluble components including contaminants generated by crushing the host or the like are removed. When removing the insoluble content, the protein-containing liquid may be heated. The heating temperature for removing insolubles is, for example, 20 to 70 ° C.
  • the powder containing the protein and the purine base compound may be a powder containing the protein collected and purified from a culture medium containing the protein produced and accumulated by culturing the host.
  • the protein can be recovered and purified from the culture medium in a usual manner.
  • a purine base compound derived from the host may remain in the powder containing the purified protein.
  • the host When the protein is expressed in a dissolved state in the host, after completion of the culture, the host is recovered by centrifugation, suspended in an aqueous buffer, and sonicated in a suspension, a French press, a Mantongaulin homogenizer. And crushing the host using a dynomill or the like to obtain a cell-free extract, and isolating and purifying the protein from the supernatant obtained by centrifuging the cell-free extract, A powder containing the extracted protein can be obtained.
  • the host recovered by the same method as described above is crushed to obtain a crushed product, and the protein insoluble is recovered by centrifugation or the like. And solubilizing the insoluble protein with a protein denaturant to obtain a protein-containing solution, and isolating and purifying the protein from the solution to obtain a powder containing the purified protein. Obtainable.
  • the method for isolating and purifying the protein from the solution can be the same as the method for isolating and purifying the protein from the supernatant.
  • the protein can be recovered from the culture supernatant. That is, a culture supernatant is obtained by treating the culture by a technique such as centrifugation, and the protein can be isolated and purified from the culture supernatant by the same method as described above.
  • the purine base compound used as the primary dye may be added to the protein-containing solution before dissolving the protein in the solvent, or may be added to the protein-containing solution after dissolving the protein in the solvent.
  • the raw material powder may contain a purine base compound derived from the host.
  • the purine base compound may be dissolved in the solvent.
  • the protein-containing solution may be heated to dissolve the purine base compound in the solvent. The heating temperature for dissolving the purine base compound is, for example, 20 to 70 ° C.
  • the protein in the protein-containing solution is dissolved in the solvent, for example, by heating the protein-containing solution.
  • the heating temperature for protein dissolution may be, for example, 20-70 ° C, or 25-40 ° C.
  • the raw material powder is a powder containing a host or a crushed product thereof
  • the protein is extracted from the host or the crushed product by heating the protein-containing liquid, whereby the protein is dissolved in the solvent.
  • an acid compound for example, an organic acid compound
  • a colored protein molded article tends to be more easily formed. This is considered to be due to a chemical reaction between the acid compound and the purine base compound.
  • organic acid compounds that can be used as a solvent include formic acid, acetic acid, citric acid, and oxalic acid.
  • the protein-containing liquid may contain a solvent other than the acid compound.
  • the solvent may be an aqueous solution of an acid compound.
  • the ratio of the acid compound to the total amount of the solvent may be, for example, 50 to 100% by mass, 70 to 100% by mass, or 90 to 100% by mass.
  • the shape of the protein molded product or the original protein molded product is not particularly limited, but may be a fiber or a film.
  • the protein fiber or the soaked protein fiber as the molded protein or the soaked protein can be produced by a spinning method using a dope solution as a dope solution.
  • a spinning method for example, an ordinary method such as wet spinning, dry spinning, dry-wet spinning or melt spinning can be used.
  • the spinning method may be wet spinning or dry-wet spinning.
  • the dope solution 6 (stock solution for molding) stored in the storage tank 7 of the spinning device 10 is pushed out of the base 9 by the gear pump 8.
  • the method of extruding the dope solution is not limited to this.
  • the dope solution filled in a cylinder may be extruded from a nozzle using a syringe pump.
  • the extruded dope liquid 6 is introduced into the coagulation liquid 11 of the coagulation liquid tank 20 via the air gap 19.
  • the protein is coagulated, and protein fibers, which are fibrous coagulations, are formed.
  • the protein fibers are introduced into the hot water 12 in the drawing bath 21 and drawn there.
  • the stretching ratio is determined by the speed ratio between the supply nip roller 13 and the take-off nip roller 14.
  • the drawn protein fiber is introduced into the yarn path 22 of the drying device 4 and dried while passing through the yarn path 22.
  • the dried protein fiber 36 is wound up, and the wound body 5 of protein fiber is obtained.
  • the spinning device 10 has yarn guides 18a, 18b, 18c, 18d, 18e, 18f, and 18g provided on the movement path of the protein fiber 36.
  • the coagulation liquid 11 may be any solvent that can remove the solvent from the dope liquid, and examples thereof include lower alcohols having 1 to 5 carbon atoms such as methanol, ethanol and 2-propanol, and acetone.
  • the coagulating liquid 11 may include water.
  • the temperature of the coagulating liquid 11 may be 0 to 30 ° C.
  • the protein fiber is drawn by, for example, pre-drawing in the coagulating liquid bath 20, wet-drawing in the drawing bath 21, dry-dry drawing, or a combination thereof.
  • the protein fiber that has not been drawn or that has been predrawn in the coagulation liquid tank 20 is drawn in the hot water 12 in the drawing bath 21.
  • the temperature of the hot water 12 may be, for example, 50 to 90 ° C, or 75 to 85 ° C.
  • An organic solvent or the like may be added to the warm water 12.
  • wet heat stretching may be performed during steam heating.
  • the stretching ratio in the wet heat stretching may be, for example, 1 to 10 times, or 2 to 8 times.
  • Dry heat drawing can be performed using an electric tube furnace, a dry heat plate or the like.
  • the temperature of the dry heat stretching may be, for example, 140 to 270 ° C, or 160 to 230 ° C.
  • the stretching ratio in the dry heat stretching may be, for example, 0.5 to 8 times, or 1 to 4 times.
  • the final draw ratio is more than 1 time, 2 times or more, 3 times or more, 4 times or more, 5 times or more, 6 times or more, 7 times or more, 8 times or more of the undrawn yarn (or pre-drawn yarn). Or more, or 9 times or more, and may be 40 times or less, 30 times or less, 20 times or less, 15 times or less, 14 times or less, 13 times or less, 12 times or less, 11 times or less, or 10 times or less. You may.
  • a protein film or a protein film as a protein molded product or a protein-adhered product is, for example, using a stock solution for doping as a dope solution, casting it on the surface of the substrate, and drying the formed coating film. And / or removing the solvent.
  • the viscosity of the dope solution for producing the protein film or the native protein film may be 15 to 80 cP (centipoise), or 20 to 70 cP.
  • the concentration of the protein may be 3 to 50% by mass, 3.5 to 35% by mass, or 4.2 to 15.8% by mass based on 100% by mass of the total amount of the dope solution.
  • the substrate may be a resin substrate, a glass substrate, a metal substrate, or the like.
  • the substrate may be a resin substrate from the viewpoint that the formed film can be easily peeled off.
  • the resin substrate may be, for example, a polyethylene terephthalate (PET) film, a fluororesin film such as polytetrafluoroethylene, a polypropylene (PP) film, or a release film in which a silicone compound is immobilized on the surface of these films.
  • PET polyethylene terephthalate
  • PP polypropylene
  • the base material is stable against HFIP, DMSO solvent, etc., and from the viewpoint that the dope solution can be cast-formed stably and the formed film can be easily peeled, the silicone compound is immobilized on the PET film or the PET film surface. It may be a peeled release film.
  • An example of cast molding is to cast a dope solution on a substrate surface and adjust the thickness of a coating film to a predetermined thickness using a film thickness controlling means such as an applicator, a knife coater, and a bar coater. And The predetermined thickness is set so that the thickness of the coating film after drying and / or desolvation is, for example, 1 to 1000 ⁇ m.
  • Drying and desolvation of the coating film can be performed by a dry method or a wet method.
  • the dry method include vacuum drying, hot air drying, and air drying.
  • the wet method a method in which the coating film is immersed in a desolvation liquid can be given.
  • the solvent removal liquid include water, alcohol liquids such as lower alcohols having 1 to 5 carbon atoms such as methanol, ethanol, and 2-propanol, and mixed liquids of water and alcohol.
  • the temperature of the desolvation solution may be 0 to 90 ° C.
  • the formed protein film may be monoaxially or biaxially stretched in water.
  • the biaxial stretching may be sequential stretching or simultaneous biaxial stretching. Two-stage or more multi-stage stretching may be performed.
  • the stretching ratio may be 1.01 to 6 times or 1.05 to 4 times in both the vertical and horizontal directions. Within this range, a balance between stress and strain can be easily obtained.
  • the underwater stretching can be performed, for example, at a water temperature of 20 to 90 ° C.
  • the stretched protein film may be heat-set by a dry heat treatment at 50 to 200 ° C. for 5 to 600 seconds. By this heat setting, a protein film having excellent dimensional stability at normal temperature can be obtained.
  • a uniaxially stretched film becomes a uniaxially oriented film
  • a biaxially stretched film becomes a biaxially oriented film.
  • the protein forming the protein molded product or the native protein molded product may be a structural protein.
  • the structural protein may be a spider silk protein or a silk protein.
  • Spiders belonging to the genus (Gasteracantha), spiders belonging to the genus Ordgarius, such as the spider spider, Mamaytai spider and the spider spider spider Spiders belonging to the genus Argiope (Argiope spp.), Such as Negumo and Argiope spiders, spiders belonging to the genus Arachnura (Arachnura), such as the arachnid spider, spiders belonging to the genus Acusilas, such as spiders and spider spiders belonging to the genus Acusilas, such as spiders Spiders belonging to the genus Cytophora, spiders belonging to the genus Cygophora, such as the spiders belonging to the genus (Potys), spiders belonging to the genus (Potys), spiders belonging to the genus (Polys), spiders belonging to the genus Cyclos sp.
  • Arachnura such as the arachnid spider
  • Spiders belonging to the genus Leucauge such as spiders belonging to the genus Arachnid, spiders spiders and spiders belonging to the genus Leucauge, spiders belonging to the genus Nephila, spiders belonging to the genus Nephila, and the like spiders belonging to the genus Nephila.
  • Spiders belonging to the genus Dyschiriognatha such as spiders belonging to the genus Menosira
  • spiders belonging to the genus Dyschiriognatha such as the spiders belonging to the genus Latrodectus, including the spiders belonging to the genus Latrodectus, such as the spiders, the black widow spider, the red widow spider, the brown spider spider
  • Examples include spiders belonging to the family Tetragnathidae, such as spiders belonging to the genus (Euprosthenops).
  • the spider silk protein may be a dragline protein, such as MaSp (MaSp1 and MaSp2), ADF (ADF3 and ADF4), MiSp (MiSp1 and MiSp2).
  • spider silk proteins include fibroin-3 (adf-3) [derived from Araneus diadematus] (GenBank Accession No. AAC47010 (amino acid sequence), U47855 (base sequence)), fibroin-4 (adf-4) [Araneus diademmatus] (GenBank accession number AAC47011 (amino acid sequence), U47856 (base sequence)), dragline ⁇ silk ⁇ protein ⁇ spidroin ⁇ 1 [derived from Nephila ⁇ clavipes] (GenBank accession number AAC04504 (amino acid sequence, base sequence 20a) ampullate ⁇ spidroin ⁇ 1 [Latrodictus Hesperus] (GenBank accession number ABR68856 (amino acid sequence), EF595246 (base sequence)), dragline ⁇ silk ⁇ protein ⁇ spidroin ⁇ 2 [from Nephila ⁇ clavata] (GenBank accession number AAL32472
  • fibroin in which sequence information is registered in NCBI GenBank.
  • sequence information is registered in NCBI GenBank.
  • spidroin, ampullate, fibroin, "silk and polypeptide", or “silk and protein” is described as a keyword in DEFINITION from among sequences including INV as DIVISION in the sequence information registered in NCBI @ GenBank. It can be confirmed by extracting a character string of a specific product from a sequence or CDS, and extracting a sequence in which a specific character string is described in TISSUE @ TYPE from SOURCE.
  • Fibroin may be modified fibroin.
  • the modified fibroin may be a fibroin having an amino acid sequence obtained by partially modifying the amino acid sequence of natural fibroin, or a fibroin artificially designed and synthesized independently of natural fibroin.
  • the modified fibroin may have, for example, an amino acid sequence of a cloned natural fibroin in which one or more amino acid residues are substituted, deleted, inserted and / or added. Substitution, deletion, insertion and / or addition of amino acid residues can be performed by methods well known to those skilled in the art, such as partial specific mutagenesis. Specifically, Nucleic Acid Res. 10, 6487 (1982) and Methods ⁇ in ⁇ Enzymology, 100, 448 (1983).
  • RE REP in Formulas 1 and 2 represents an amino acid sequence composed of 2 to 200 amino acid residues.
  • REP may be an amino acid sequence composed of 10 to 200 amino acid residues.
  • a plurality of REPs present in fibroin have the same or different amino acid sequences.
  • the modified fibroin is a modified fibroin derived from a large spinal canal thread protein produced in a large ampullate of a spider (hereinafter referred to as "first modified fibroin"), a domain sequence having a reduced content of glycine residues.
  • second modified fibroin (Hereinafter referred to as “second modified fibroin”), (A) a modified fibroin having a domain sequence with a reduced content of the n motif (hereinafter referred to as “third modified fibroin”), a glycine residue , And (A) a modified fibroin having a reduced content of the n motif (hereinafter referred to as a “fourth modified fibroin”), a modified fibroin having a domain sequence locally including a region having a large hydrophobicity index ( Hereinafter referred to as “fifth modified fibroin”) or a domain sequence having a reduced glutamine residue content.
  • Modified fibroin may be a (hereinafter referred to as the "sixth modified fibroin of"). The classification here is for convenience and one type of modified fibroin may fall into these two or more classifications.
  • the first modified fibroin is a C-terminal sequence which is an amino acid sequence represented by any one of SEQ ID NOs: 1, 2, and 3 or an amino acid sequence having 90% or more homology with the domain sequence represented by Formula 1. May be provided.
  • the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 is the same as the amino acid sequence consisting of 50 amino acids at the C-terminal of the amino acid sequence of ADF3 (GI: 1263287, NCBI).
  • the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 is identical to the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 by removing 20 residues from the C-terminal.
  • the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 3 is shown in SEQ ID NO: 1. It is the same as the amino acid sequence obtained by removing 29 residues from the C-terminal of the amino acid sequence.
  • the first modified fibroin include an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4 (recombinant ⁇ spider ⁇ silk ⁇ protein ⁇ ADF3KaiLargeNRSH1) or an amino acid sequence having 90% or more sequence identity with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4, Modified fibroin can be mentioned.
  • the sequence identity here may be 95% or more.
  • the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4 is obtained by adding the amino acid sequence of ADF3 to the N-terminal by adding an amino acid sequence (SEQ ID NO: 5) comprising an initiation codon, a His10 tag, and an HRV3C protease (Human ⁇ rhinovirus @ 3C protease) recognition site.
  • the ⁇ 13th repeat region was approximately doubled and mutated so that translation ended at the 1154th amino acid residue.
  • the amino acid sequence at the C-terminus of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4 is the same as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 3.
  • an amino acid sequence consisting of XGX is extracted from all REPs included in the sequence excluding the sequence from the (A) n motif located at the most C-terminal side to the C-terminal among the domain sequences represented by Formula 1. I do.
  • the total number of amino acid residues constituting XGX is z.
  • z is calculated by subtracting the overlap.
  • 663 kinds of natural fibroins (415 kinds of spider-derived natural fibroins) are extracted from fibroins whose amino acid sequence information is registered in NCBI GenBank.
  • those containing the domain sequence represented by Formula 1 and having a content of 6% or less of the amino acid sequence consisting of GGX in the fibroin were determined to have z / w calculated by the above-mentioned calculation method. Calculated. The result is shown in FIG.
  • the horizontal axis in FIG. 3 indicates z / w (%), and the vertical axis indicates frequency.
  • the z / w in native fibroin is up to 50.86%.
  • z / w may be 50.9% or more, 56.1% or more, 58.7% or more, 70% or more, 80% or more.
  • the upper limit of z / w is not particularly limited, but may be, for example, 95% or less.
  • Another amino acid residue that replaces the glycine residue includes valine (V) residue, leucine (L) residue, isoleucine (I) residue, methionine (M) residue, proline (P) residue, phenylalanine ( F) hydrophobic amino acid residues such as residues and tryptophan (W) residues, or glutamine (Q) residues, asparagine (N) residues, serine (S) residues, lysine (K) residues and glutamic acid It may be a hydrophilic amino acid residue such as (E) residue, and may be valine (V) residue, leucine (L) residue, isoleucine (I) residue, phenylalanine (F) residue or glutamine (Q). It may be a residue or a glutamine (Q) residue.
  • the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 6 (Met-PRT380), SEQ ID NO: 7 (Met-PRT410), SEQ ID NO: 8 (Met-PRT525) or SEQ ID NO: 9 (Met-PRT799)
  • a modified fibroin comprising an amino acid sequence having 90% or more sequence identity with these.
  • the sequence identity here may be 95% or more.
  • the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 6 is obtained by replacing all GGX in the REP of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 10 (Met-PRT313) corresponding to natural fibroin with GQX.
  • the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 7 is obtained by deleting every two (A) n motifs from the N-terminal side to the C-terminal side from the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 6, and further before the C-terminal sequence. In which one [(A) n motif-REP] was inserted.
  • the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 8 has two alanine residues inserted at the C-terminal side of each (A) n motif of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 7, and further has a partial glutamine (Q) residue. It has been replaced with a serine (S) residue, and some amino acids on the C-terminal side have been deleted so that the molecular weight becomes almost the same as that of SEQ ID NO: 7.
  • the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 9 has a region of 20 domain sequences present in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 7 (however, several amino acid residues on the C-terminal side of the region are substituted). Is repeated four times with a predetermined hinge sequence and His tag sequence added to the C-terminal.
  • the value of z / w in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 10 (corresponding to natural fibroin) is 46.8%.
  • the values of z / w in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 6, the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 7, the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 8, and the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 9 are 58.7%, respectively. 70.1%, 66.1% and 70.0%.
  • the x / y values of the amino acid sequences represented by SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, and SEQ ID NO: 9 at the giza ratio of 1: 1.8 to 11.3 are 15.0%, 15.0%, 93.4%, 92.7% and 89.8%. Details of the knurl ratio will be described later.
  • the second modified fibroin may include a tag sequence added to the N-terminus, C-terminus, or both.
  • the modified fibroin can be isolated, immobilized, detected, visualized, and the like.
  • GST glutathione-S-transferase
  • MBP maltose binding protein
  • ⁇ An“ epitope tag ” utilizing an antigen-antibody reaction can also be used.
  • a peptide (epitope) showing antigenicity as a tag sequence an antibody against the epitope can be bound.
  • the epitope tag include an HA (peptide sequence of hemagglutinin of influenza virus) tag, myc tag, and FLAG tag.
  • the tag sequence may be capable of being cleaved by a specific protease.
  • protease treatment By subjecting the protein adsorbed via the tag sequence to protease treatment, the modified fibroin from which the tag sequence has been separated can also be recovered.
  • the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 12 (PRT380), SEQ ID NO: 13 (PRT410), SEQ ID NO: 14 (PRT525), or SEQ ID NO: 15 (PRT799), or these amino acid sequences
  • Modified fibroin containing an amino acid sequence having 90% or more sequence identity can be mentioned.
  • the sequence identity here may be 95% or more.
  • the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 16 (PRT313), SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, or SEQ ID NO: 15 is SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, or SEQ ID NO: 9, respectively.
  • An amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 11 (including a His tag sequence and a hinge sequence) is added to the N-terminal of the amino acid sequence shown.
  • the second modified fibroin may include a secretion signal for releasing a protein produced in the recombinant protein production system to the outside of the host.
  • the sequence of the secretion signal can be appropriately set according to the type of the host.
  • the third modified fibroin has a domain sequence with reduced content of the (A) n motif compared to native fibroin.
  • the domain sequence of the third modified fibroin may have an amino acid sequence corresponding to the deletion of at least one or more (A) n motifs as compared to the native fibroin.
  • the third modified fibroin may have a domain sequence corresponding to 10-40% deletion of the (A) n motif from native fibroin.
  • the third modification fibroin, compared to native fibroin, C-terminal, side headed 1 to 3 (A) n motif every one (A) n motif from the N-terminal side is equivalent to that deleted It may have a domain sequence.
  • the third modified fibroin has two consecutive deletions of the (A) n motif and one deletion of the (A) n motif from the N-terminal side to the C-terminal side as compared to the natural fibroin. It may have a domain sequence corresponding to the sequence repeated.
  • the third modified fibroin may have a domain sequence corresponding to the deletion of the (A) n motif every third from the N-terminal side to the C-terminal side as compared to the natural fibroin. .
  • the third modified fibroin may include a domain sequence represented by Formula 1.
  • x / y is It may be 20% or more, 30% or more, 40% or more, or 50% or more.
  • the ratio of the number of alanine residues to the total number of amino acid residues in the n motif may be 83% or more, 86% or more, 90% or more, 95% or more, or 100%.
  • FIG. 2 shows a domain sequence obtained by removing the N-terminal sequence and the C-terminal sequence from the modified fibroin. From the N-terminal side (left side), the domain sequence in FIG. 2 is (A) n motif-first REP (50 amino acid residues)-(A) n motif-second REP (100 amino acid residues)-( A) n motif-third REP (10 amino acid residues)-(A) n motif-fourth REP (20 amino acid residues)-(A) n motif-fifth REP (30 amino acid residues)- (A) It has a sequence called an n motif.
  • FIG. 2 shows pattern 1 (comparison of the first REP and the second REP, and comparison of the third REP with the fourth REP), pattern 2 (comparison of the first REP with the second REP, and Pattern 4 (comparison of the second REP with the third REP, and comparison of the fourth REP with the fifth REP), pattern 4 (the comparison of the fourth REP with the fifth REP), and pattern 4 (the first REP with the fifth REP). Second REP comparison). There are other selection methods.
  • the number of amino acid residues of each REP in two selected adjacent [(A) n motif-REP] units is compared.
  • x / y may be 50% or more, 60% or more, 65% or more, 70% or more, 75% or more, or 80% or more.
  • the upper limit of x / y is not particularly limited, and may be, for example, 100% or less.
  • the indentation ratio may be 1: 1.9 to 11.3, and x / y may be 89.6% or more.
  • the knurl ratio may be 1: 1.8 to 3.4, and x / y may be 77.1% or more.
  • the knurl ratio may be 1: 1.9 to 8.4, and x / y may be 75.9% or more.
  • the knurl ratio may be 1: 1.9 to 4.1, and x / y may be 64.2% or more.
  • x / y is 46.4% or more, 50% or more, and 55 % Or more, 60% or more, 70% or more, or 80% or more.
  • the upper limit of x / y is not particularly limited, and may be 100% or less.
  • X / y was calculated by the above-described calculation method for the amino acid sequence of natural fibroin composed of the domain sequence represented by Formula 1 among 663 types of fibroins whose amino acid sequence information is registered in ⁇ NCBI ⁇ GenBank.
  • FIG. 4 shows the results when the knurl ratio is 1: 1.9 to 4.1.
  • the horizontal axis in FIG. 4 indicates x / y (%), and the vertical axis indicates frequency.
  • x / y in native fibroin is up to 64.14%.
  • the third modified fibroin is obtained, for example, by deleting one or more of the sequence encoding the (A) n motif from the cloned natural fibroin gene sequence so that x / y is 64.2% or more.
  • Obtainable for example, based on the amino acid sequence of natural fibroin, an amino acid sequence corresponding to the deletion of one or more (A) n motifs is designed so that x / y is 64.2% or more, and the designed amino acid sequence is
  • a third fibroin can also be obtained by chemically synthesizing the encoding nucleic acid.
  • the amino acid sequence corresponding to the substitution, deletion, insertion and / or addition of one or more amino acid residues Modifications may be made.
  • the amino acid represented by SEQ ID NO: 17 (Met-PRT399), SEQ ID NO: 7 (Met-PRT410), SEQ ID NO: 8 (Met-PRT525), or SEQ ID NO: 9 (Met-PRT799)
  • Modified fibroin comprising a sequence or an amino acid sequence having 90% or more sequence identity with these amino acid sequences can be mentioned.
  • the sequence identity here may be 95% or more.
  • the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 17 differs from the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 10 (Met-PRT313) corresponding to natural fibroin by adding (A) n motifs every two positions from the N-terminal side to the C-terminal side.
  • the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 10 (corresponding to natural fibroin) has an x / y value of 15.0% at a giza ratio of 1: 1.8 to 11.3.
  • the value of x / y in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 17 and the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 7 is 93.4%.
  • the value of x / y in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 8 is 92.7%.
  • the value of x / y in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 9 is 89.8%.
  • the values of z / w in the amino acid sequences represented by SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, and SEQ ID NO: 9 are 46.8%, 56.2%, 70.1%, 66. 1% and 70.0%.
  • the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 18 (PRT399), SEQ ID NO: 13 (PRT410), SEQ ID NO: 14 (PRT525), or SEQ ID NO: 15 (PRT799), or these amino acid sequences
  • Modified fibroin containing an amino acid sequence having 90% or more sequence identity can be mentioned.
  • the audience identity here may be 95% or more.
  • the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, or SEQ ID NO: 15 is obtained by adding SEQ ID NO: 11 to the N-terminal of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, or SEQ ID NO: 9, respectively. (Including a His tag sequence and a hinge sequence).
  • the third modified fibroin may include a secretion signal for releasing a protein produced in the recombinant protein production system to the outside of the host.
  • the sequence of the secretion signal can be appropriately set according to the type of the host.
  • the fourth modified fibroin has a domain sequence with a reduced content of glycine residues in addition to a reduced content of the (A) n motif compared to native fibroin.
  • the domain sequence of the fourth modified fibroin differs from the native fibroin in that at least one or more (A) n motifs have been deleted, and at least one or more glycine residues in It has an amino acid sequence equivalent to being replaced with an amino acid residue.
  • the modified fibroin may include an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 15 (PRT799) or an amino acid sequence having 90% or more sequence identity with these amino acid sequences.
  • the sequence identity here may be 95% or more.
  • the fifth modified fibroin may have one or more amino acid residues in the REP replaced by amino acid residues having a higher hydrophobicity index and / or one or more hydrophobic residues in the REP as compared to the native fibroin. It may have a domain sequence locally including a region having a large hydrophobicity index, corresponding to the insertion of an amino acid residue having a large sex index.
  • the region having a locally large hydrophobicity index may be composed of two to four consecutive amino acid residues having a large hydrophobicity index.
  • hydrophobicity index of amino acid residues
  • a publicly known index Kyte J, & Doolittle R (1982) "A simple method for display, the hydropathic charactor of aa protein, J.Pol.Mol. 105-132).
  • HI hydropathic index
  • the amino acid residue having a large hydrophobicity index is an amino acid residue selected from isoleucine (I), valine (V), leucine (L), phenylalanine (F), cysteine (C), methionine (M), and alanine (A). Or an amino acid residue selected from valine (V), leucine (L) and isoleucine (I).
  • the fifth modified fibroin may have one or more amino acid residues in the REP replaced by amino acid residues having a higher hydrophobicity index and / or one or more hydrophobic residues in the REP as compared to the native fibroin.
  • the modification corresponding to the insertion of an amino acid residue having a large sex index it has been modified by substitution, deletion, insertion and / or addition of one or more amino acid residues as compared to natural fibroin. You may.
  • the fifth modified fibroin is obtained by, for example, converting one or more hydrophilic amino acid residues (for example, amino acid residues having a negative hydrophobicity index) in a REP from a cloned natural fibroin gene sequence to hydrophobic amino acid residues ( For example, it can be obtained by substituting an amino acid residue having a positive hydrophobicity index) and / or inserting one or more hydrophobic amino acid residues into REP.
  • hydrophilic amino acid residues for example, amino acid residues having a negative hydrophobicity index
  • a fifth modified fibroin can also be obtained by designing an amino acid sequence to be synthesized and chemically synthesizing a nucleic acid encoding the designed amino acid sequence.
  • the fifth modified fibroin may include a domain sequence represented by Formula 1.
  • sequence A In the sequence obtained by removing the sequence from the (A) n motif located at the most C-terminal side of the domain sequence to the C-terminal from the domain sequence (hereinafter sometimes referred to as “sequence A”), it is continuous in the REP. Assuming that the total number of amino acid residues in a region where the average value of the hydrophobicity index of four amino acid residues is 2.6 or more is p, and the total number of amino acid residues is q, p / q is 6.2. % Or more.
  • the average value of the hydrophobicity index of four consecutive amino acid residues is calculated for all REPs included in sequence A.
  • the average value of the hydrophobicity index is determined by dividing the total sum of HI of each amino acid residue contained in four consecutive amino acid residues by 4 (the number of amino acid residues).
  • the average value of the hydrophobicity index is determined for all four consecutive amino acid residues.
  • a region where the average value of the hydrophobicity index of four consecutive amino acid residues is 2.6 or more is specified. Even when a certain amino acid residue corresponds to a plurality of “consecutive four amino acid residues having an average value of the hydrophobicity index of 2.6 or more”, it is included as one amino acid residue in the region. become.
  • the total number of amino acid residues contained in the region is p.
  • the total number of amino acid residues contained in sequence A is q.
  • the fifth modified fibroin is obtained by, for example, changing the amino acid sequence of a cloned natural fibroin to one or more hydrophilic amino acid residues in REP (for example, when the hydrophobicity index is negative, so as to satisfy the above-mentioned p / q conditions).
  • a hydrophobic amino acid residue eg, an amino acid residue having a positive hydrophobicity index
  • / or one or more hydrophobic amino acid residues are inserted into the REP.
  • it can be obtained by locally modifying the amino acid sequence to include a region having a large hydrophobicity index.
  • the fifth modified fibroin can also be obtained by designing an amino acid sequence satisfying the above p / q condition from the amino acid sequence of natural fibroin and chemically synthesizing a nucleic acid encoding the designed amino acid sequence.
  • One or more amino acid residues in the REP have been replaced by amino acid residues with a higher hydrophobicity index compared to native fibroin, and / or one or more amino acid residues in the REP with a higher hydrophobicity index
  • the modification corresponding to the substitution, deletion, insertion and / or addition of one or more amino acid residues may be further performed.
  • an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 19 (Met-PRT665), SEQ ID NO: 20 (Met-PRT665) or SEQ ID NO: 21 (Met-PRT666), or a combination of these amino acid sequences with 90% Modified fibroin containing an amino acid sequence having the above sequence identity can be mentioned.
  • the sequence identity here may be 95% or more.
  • the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 19 consists of three amino acid residues every other REP, except for the domain sequence of the terminal at the C-terminal side, with respect to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 7 (Met-PRT410).
  • amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 20 is obtained by inserting one amino acid sequence (VLI) consisting of three amino acid residues every other REP into the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 8 (Met-PRT525). is there.
  • amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 21 is obtained by inserting two amino acid sequences (VLI) each consisting of three amino acid residues every other REP into the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 8.
  • amino acid sequence having 90% or more sequence identity with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, or SEQ ID NO: 21, p / q may be 6.2% or more.
  • the fifth modified fibroin may include the above-described tag sequence added to the N-terminus, C-terminus, or both.
  • the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 22 (PRT720), SEQ ID NO: 23 (PRT665) or SEQ ID NO: 24 (PRT666), or a sequence identity of 90% or more with these amino acid sequences Modified fibroin containing an amino acid sequence having the same.
  • the sequence identity here may be 95% or more.
  • the amino acid sequences represented by SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23 and SEQ ID NO: 24 correspond to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 11 (His tag) at the N-terminal of the amino acid sequences represented by SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20 and SEQ ID NO: 21, respectively. Sequences and hinge sequences).
  • the fifth modified fibroin may include a secretion signal for releasing a protein produced in the recombinant protein production system to the outside of the host.
  • the sequence of the secretion signal can be appropriately set according to the type of the host.
  • the sixth modified fibroin has an amino acid sequence in which the content of glutamine residues is reduced as compared to natural fibroin.
  • REP of the sixth modified fibroin may include at least one motif selected from a GGX motif and a GPGXX motif.
  • the content of the GPGXX motif may be 1% or more, 5% or more, or 10% or more.
  • the upper limit of the GPGXX motif content is not particularly limited, and may be 50% or less, or 30% or less.
  • the “GPGXX motif content” is a value calculated by the following method.
  • Formula 1 [(A) n motif-REP] m or Formula 2: [(A) n motif-REP] m- (A) located at the C-terminal side of the domain sequence represented by the n motif (A)
  • the total number of the GPGXX motifs was tripled (ie, the total number of G and P in the GPGXX motif).
  • s the total number of amino acid residues in all REPs excluding the n motif is t, and the GPGXX motif content is calculated as s / t.
  • the target of “the sequence excluding the sequence from the (A) n motif located at the most C-terminal side of the domain sequence to the C-terminal of the domain sequence” is “ "(A) Sequence from n motif to C-terminal located at the terminal side” (sequence corresponding to REP) may include a sequence having low correlation with a sequence characteristic of fibroin. This is because when the domain sequence is short, the calculation result of the GPGXX motif content is affected, and this influence is eliminated.
  • the “GPGXX motif” is located at the C-terminus of the REP, even if “XX” is, for example, “AA”, it is treated as a “GPGXX motif”.
  • FIG. 6 is a schematic diagram showing the domain sequence of the modified fibroin.
  • the method of calculating the content rate of the GPGXX motif will be specifically described with reference to FIG.
  • the domain sequence of the modified fibroin (“[(A) n motif-REP] m- (A) n motif” type) shown in FIG. 6, all REPs are located at the most C-terminal side.
  • all REPs are “sequences in which the sequence from the (A) n motif located at the most C-terminal side to the C-terminal of the domain sequence is excluded from the domain sequence” (the sequence shown as “region A” in FIG. 6). ),
  • the sixth modified fibroin may have a glutamine residue content of 9% or less, 7% or less, 4% or less, or 0%.
  • the “glutamine residue content” is a value calculated by the following method.
  • Formula 1 [(A) n motif-REP] m or Formula 2: [(A) n motif-REP] m- (A) located at the C-terminal side of the domain sequence represented by the n motif (A)
  • u the total number of glutamine residues contained in all REPs
  • (A) n motif The glutamine residue content is calculated as u / t, where t is the total number of amino acid residues of all REPs except for.
  • the sixth modified fibroin has a domain sequence corresponding to the deletion or replacement of one or more glutamine residues in the REP or to another amino acid residue as compared to the natural fibroin. Is also good.
  • the “other amino acid residue” may be an amino acid residue having a larger hydrophobicity index than a glutamine residue.
  • the hydrophobicity index of amino acid residues is as shown in Table 1.
  • the amino acid residue having a large hydrophobicity index is selected from isoleucine (I), valine (V), leucine (L), phenylalanine (F), cysteine (C), methionine (M), and alanine (A)
  • “REP hydrophobicity” is a value calculated by the following method.
  • Formula 1 [(A) n motif-REP] m or Formula 2: [(A) n motif-REP] m- (A) located at the C-terminal side of the domain sequence represented by the n motif (A)
  • the sum of the hydrophobicity index of each amino acid residue of all REPs is represented by v, A)
  • the hydrophobicity of REP is calculated as v / t, where t is the total number of amino acid residues of all REPs excluding the n motif.
  • the sixth modified fibroin may have one or more glutamine residues in the REP deleted and / or one or more glutamine residues in the REP compared to the native fibroin.
  • it may have an amino acid sequence in which the modification corresponding to the substitution, deletion, insertion and / or addition of one or more amino acid residues is further performed.
  • the sixth modified fibroin may be, for example, deleting one or more glutamine residues in the REP from the cloned native fibroin gene sequence and / or replacing one or more glutamine residues in the REP with other amino acids. It can be obtained by substituting the residue.
  • the sixth modified fibroin can be obtained by chemically synthesizing a nucleic acid encoding the designed amino acid sequence.
  • SEQ ID NO: 25 (Met-PRT888), SEQ ID NO: 26 (Met-PRT965), SEQ ID NO: 27 (Met-PRT889), SEQ ID NO: 28 (Met-PRT916), SEQ ID NO: 29 ( Met-PRT918), the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 30 (Met-PRT699), SEQ ID NO: 31 (Met-PRT698) or SEQ ID NO: 32 (Met-PRT966), or a sequence identity of 90% or more with these amino acid sequences.
  • the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 25 is obtained by substituting VL for all QQ in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 7 (Met-PRT410).
  • the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 26 is obtained by substituting all QQs in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 7 with TS, and substituting the remaining Q with A.
  • the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 27 is obtained by substituting all QQs in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 7 with VL, and substituting the remaining Q with I.
  • the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 28 is obtained by substituting all QQ in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 7 with VI and substituting the remaining Q with L.
  • the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 29 is obtained by substituting all QQs in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 7 with VF and substituting the remaining Q with I.
  • the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 30 is obtained by replacing all QQs in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 8 (Met-PRT525) with VL.
  • the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 31 is obtained by substituting all QQs in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 8 with VL and substituting the remaining Q with I.
  • the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 32 is obtained by replacing all QQs in a sequence obtained by repeating twice the domain of the 20 domain sequences present in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 7 (Met-PRT410) with VF, In addition, the remaining Q is replaced with I.
  • the amino acid sequences represented by SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 31, and SEQ ID NO: 32 all have a glutamine residue content of 9% or less. (Table 2).
  • the glutamine residue content may be 9% or less.
  • the content of the GPGXX motif in the modified fibroin may be 10% or more.
  • the sixth modified fibroin may include the above-described tag sequence added to the N-terminus, C-terminus, or both. As a result, the modified fibroin can be isolated, immobilized, detected, visualized, and the like.
  • modified fibroin containing a tag sequence SEQ ID NO: 33 (PRT888), SEQ ID NO: 34 (PRT965), SEQ ID NO: 35 (PRT889), SEQ ID NO: 36 (PRT916), SEQ ID NO: 37 (PRT918), SEQ ID NO: 38 (PRT699), a modified fibroin comprising an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 39 (PRT698) or SEQ ID NO: 40 (PRT966), or a modified fibroin comprising an amino acid sequence having 90% or more sequence identity with these amino acid sequences.
  • sequence identity may be 95% or more.
  • amino acid sequences represented by SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 39 or SEQ ID NO: 40 correspond to SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, respectively.
  • the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 11 (including the His tag sequence and the hinge sequence) was added to the N-terminal of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 31 or SEQ ID NO: 32 Things.
  • the glutamine residue content may be 9% or less.
  • the modified fibroin may have a GPGXX motif content of 10% or more.
  • the modified fibroin has two or more of the characteristics of the first modified fibroin, the second modified fibroin, the third modified fibroin, the fourth modified fibroin, the fifth modified fibroin, and the sixth modified fibroin. It may be a modified fibroin having characteristics.
  • Modified fibroin is expressed, for example, by expressing the nucleic acid by a host transformed with an expression vector having a nucleic acid sequence encoding the modified fibroin and one or more regulatory sequences operably linked to the nucleic acid sequence.
  • a host any of prokaryotes and eukaryotes such as yeast, filamentous fungi, insect cells, animal cells, and plant cells can be suitably used.
  • SEQ ID NO: 15 A modified fibroin having an amino acid sequence represented by (hereinafter, also referred to as “PRT799”) was designed.
  • the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 15 is obtained by substituting, inserting and deleting amino acid residues with respect to the amino acid sequence of fibroin derived from Nephila clavipes for the purpose of improving productivity, and the N-terminal thereof.
  • the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 11 (tag sequence and hinge sequence).
  • a modified spider silk fibroin having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 40 (hereinafter, also referred to as “PRT966”) was designed.
  • a nucleic acid encoding PRT799 or PRT966 was synthesized. An NdeI site was added to the 5 'end of the nucleic acid, and an EcoRI site was added downstream of the stop codon of the nucleic acid. The nucleic acid was cloned into a cloning vector (pUC118). Thereafter, the nucleic acid encoding PRT799 or PRT966 was cut out by treatment with NdeI and EcoRI with restriction enzymes. The excised nucleic acid was recombined into a protein expression vector pET-22b (+) to obtain an expression vector.
  • a feed solution (455 g / 1 L of glucose, 120 g / 1 L of Yeast Extract) was added at a rate of 1 mL / min.
  • the temperature of the culture solution was maintained at 37 ° C., and the culture was continued for 20 hours while the pH was constantly controlled at 6.9.
  • the dissolved oxygen concentration in the culture was maintained at 20% of the dissolved oxygen saturation concentration.
  • 1 M isopropyl- ⁇ -thiogalactopyranoside (IPTG) was added to the culture solution to a final concentration of 1 mM to induce the expression of the target protein.
  • IPTG isopropyl- ⁇ -thiogalactopyranoside
  • the precipitate after washing was suspended in 8 M guanidine buffer (8 M guanidine hydrochloride, 10 mM sodium dihydrogen phosphate, 20 mM NaCl, 1 mM Tris-HCl, pH 7.0) to a concentration of 100 mg / mL. .
  • the precipitate was dissolved by stirring the suspension at 60 ° C. for 30 minutes with a stirrer. After dissolution, dialysis was performed with water using a dialysis tube (cellulose tube 36/32 manufactured by Sanko Junyaku Co., Ltd.).
  • the white aggregated protein obtained after dialysis was recovered by centrifugation. Lyophilized powder of the modified spider silk fibroin "PRT799" or "PRT966” was obtained by removing water from the collected aggregated protein using a freeze dryer.
  • Dyeing dye The following materials were prepared as dyeing dyes.
  • Purine base compounds DNA: DNA derived from fish sperm
  • DAMP deoxyadenosine monophosphate (abcam, purity:> 98%)
  • DGMP 2′-deoxyguanosine 5′-sodium monophosphate hydrate (SIGMA, purity: ⁇ 99% (HPLC)
  • Pyrimidine base compounds DTMP: thymidine 5′-disodium monophosphate hydrate (sigma, purity; ⁇ 99%)
  • DCMP 2'-deoxycytidine 5'-monophosphate hydrate (Tokyo Kasei, purity:> 98.0% (HPLC))
  • the amount of the modified spider silk fibroin was 26% by mass based on the mass of the suspension.
  • dAMP as a primary dye was dissolved, respectively.
  • the amount of dAMP was 1% by mass based on the total mass of the modified spider silk fibroin and dAMP in the dope solution.
  • the suspension was infiltrated with a shaker to dissolve the modified spider silk fibroin over 3 hours to obtain a formic acid solution containing the modified spider silk fibroin and dAMP.
  • the obtained formic acid solution was heated at 70 ° C. for 1 hour.
  • the formic acid solution after the heat treatment was colored dark brown.

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Abstract

タンパク質と、プリン環を有するプリン塩基化合物及び／又はその分解物と、を含有する、タンパク質成形体が開示される。プリン塩基化合物が、ＤＮＡ、又はＤＮＡに由来する化合物であってもよい。

Description

タンパク質成形体及びその製造方法、成形用原液及びその製造方法、並びにタンパク質成形体用着色剤
　本発明は、タンパク質成形体及びその製造方法、成形用原液及びその製造方法、並びにタンパク質成形体用着色剤に関する。
　特許文献１は、原着色素として酸性染料、塩基性染料、蛍光染料等の原着色素で着色されたタンパク質繊維を開示している。ここでの原着色素は、タンパク質繊維を紡糸によって製造するためドープ液に添加される色素である。
特許第５４０７００６号公報
　原着色素等の色素による着色の程度は、タンパク質、及びタンパク質材料を溶解する溶媒の種類によって変化する。そのため、例えば、少量の原着色素では、タンパク質繊維等の成形体を十分に着色できないことがある。したがって、色素の選択肢は出来るだけ多いことが望ましい。本発明の一側面は、従来とは異なる色素によって着色されたタンパク質成形体を提供する。
　本発明者が鋭意検討した結果、タンパク質成形体を得るための成形用原液に、プリン環を有するプリン塩基化合物を添加することにより、少量のプリン塩基化合物であっても十分に着色されたタンパク質成形体が得られることを見出した。本発明は係る知見に基づいて完成されたものである。
　すなわち、本発明の一側面は、タンパク質と、プリン環を有するプリン塩基化合物及び／又はその分解物と、を含有する、タンパク質成形体に関する。
　本発明の別の一側面は、タンパク質と、プリン環を有するプリン塩基化合物とを含有する、原着タンパク質成形体を得るための成形用原液に関する。この成形用原液は、例えば、タンパク質を含む原料粉体、プリン環を有するプリン塩基化合物、及び溶媒を含むタンパク質含有液を準備することと、前記タンパク質含有液中の前記タンパク質を前記溶媒に溶解させることと、を含む方法によって得ることができる。この成形用原液を用いた成形により、着色したタンパク質成形体を形成することを含む方法によって、原着タンパク質成形体を製造することができる。プリン塩基化合物は、原料粉体中に含まれていてもよい。原料粉体が、タンパク質が発現した宿主若しくはその粉砕物、又は、前記タンパク質及びプリン塩基化合物を含む粉体であってもよい。
　本発明の更に別の一側面は、プリン環を有するプリン塩基化合物を含む、タンパク質成形体用着色剤に関する。この着色剤は、例えば上記方法によって成形用原液、及び原着タンパク質成形体を製造するために用いることができる。
　本発明によれば、従来とは異なる色素によって着色されたタンパク質成形体を提供することができる。色素は原着色素であってもよい。
タンパク質繊維を製造するための紡糸装置の一例を示す模式図である。 改変フィブロインのドメイン配列の一例を示す模式図である。 天然フィブロインのｚ／ｗ（％）の値の分布を示す図である。 天然フィブロインのｘ／ｙ（％）の値の分布を示す図である。 改変フィブロインのドメイン配列の一例を示す模式図である。 改変フィブロインのドメイン配列の一例を示す模式図である。
　以下、本発明の実施形態について詳細に説明する。ただし、本発明は以下の実施形態に限定されるものではない。
　一実施形態に係るタンパク質成形体は、タンパク質と、プリン環を有するプリン塩基化合物及び／又はその分解物と、を含有する。タンパク質成形体は、原着タンパク質成形体であってもよい。ここで、「原着」とは、成形用原液から各種の成形方法によって形成された成形体自体が、その内部も含めて着色されることを意味し、形成された成形体の表面を後から染色して得られる着色成形体とは異なる。本実施形態に係る原着タンパク質成形体は、プリン環を有するプリン塩基化合物及び／又はその分解物が原着色素として作用することによって、着色されている。原着色素（ここではプリン塩基化合物）を含まない成形用原液から得られた成形体と比較して、着色していることが目視で確認できるタンパク質成形体は、原着タンパク質成形体とみなすことができる。
　タンパク質成形体は、主としてタンパク質によって形成された成形体である。成形体におけるタンパク質の割合は、例えば、成形体の質量を基準として、８０質量％以上、又は９０質量％以上であってもよい。タンパク質の詳細は後述される。
　プリン塩基化合物は、１個以上のプリン環を有する化合物である。プリン環は、アデニン環、グアニン環、ヒボキサンチン環、キサンチン環、テオブロミン環、カフェイン環、尿酸環、イソグアニン環、又はこれらの組み合わせであってもよい。プリン塩基化合物が、プリン環及びピリミジン環を有していてもよい。プリン塩基化合物は、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、又はＤＮＡに由来する化合物であってもよい。ＤＮＡに由来するプリン塩基化合物は、プリン環としてアデニン環又はグアニン環を有する化合物であってもよい。プリン塩基化合物は、ヌクレオシド又はヌクレオチドであってもよい。ＤＮＡに由来するプリン塩基化合物の例としては、デオキシアデノシン一リン酸、及び２’－デオキシグアノシン５’－一リン酸ナトリウムが挙げられる。
　プリン塩基化合物の分解物は、例えば、イミダゾール環とプリン環の６員環部分に由来する置換基とを有するイミダゾール化合物であり得る。プリン環の６員環部分に由来する置換基は、典型的には、イミダゾール環の４位及び５位に結合する。置換基の例としては、カルボキサミド基（－Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ２）、ホルムアミノ基（－ＮＨＣＨＯ）、及びアミノ基（－ＮＨ２）が挙げられる。
　タンパク質成形体におけるプリン塩基化合物及びその分解物の合計の含有量が、タンパク質の質量に対して０．１質量％以上であってもよい。プリン塩基化合物及びその分解物の合計の含有量が０．１質量％以上であると、タンパク質成形体が特に着色され易い。同様の観点から、プリン塩基化合物及びその分解物の合計の含有量が０．２質量％以上、０．３質量％以上、０．４質量％以上、０．５質量％以上、又は１．０質量％以上であってもよい。プリン塩基化合物及びその分解物の合計の含有量の上限は、特に制限されないが、１０質量％以下、又は８質量％以下であってもよい。すなわち、プリン塩基化合物及びその分解物の合計の含有量が、０．１質量％以上で１０質量％以下、又は８質量％以下であってもよく、０．２質量％以上で１０質量％以下、又は８質量％以下であってもよく、０．３質量％以上で１０質量％以下、又は８質量％以下であってもよく、０．４質量％以上で１０質量％以下、又は８質量％以下であってもよく、０．５質量％以上で１０質量％以下、又は８質量％以下であってもよく、１．０質量％以上で１０質量％以下、又は８質量％以下であってもよい。プリン塩基化合物の含有量がこれら数値範囲内にあってもよい。
　タンパク質成形体は、溶媒を更に含み得る。この溶媒は、通常、成形体を得るために用いられた成形用原液に含まれていた溶媒である。この溶媒は、例えばギ酸等の酸化合物（特に、有機酸化合物）を含んでいてもよい。タンパク質成形体における溶媒の含有量は、例えば、タンパク質の質量に対して０．０００１～１質量％であってもよい。
　原着タンパク質成形体は、例えば、タンパク質、プリン塩基化合物及びこれらを溶解している溶媒を含有する成形用原液を用いた成形により、着色したタンパク質成形体を形成することを含む方法によって、製造することができる。プリン塩基化合物を含有する成形用原液を用いることにより、十分に着色した原着タンパク質成形体を得ることができる。プリン塩基化合物の少なくとも一部が、原着タンパク質成形体が形成される過程で、溶媒との反応及び／又は熱履歴等の影響で分解し得る。
　成形用原液におけるタンパク質の濃度は、例えば、成形用原液の質量を基準として、５～５０質量％であってもよい。プリン塩基化合物の量は、タンパク質の質量に対して、０．１質量％以上で１０質量％以下、又は８質量％以下であってもよく、０．２質量％以上で１０質量％以下、又は８質量％以下であってもよく、０．３質量％以上で１０質量％以下、又は８質量％以下であってもよく、０．４質量％以上で１０質量％以下、又は８質量％以下であってもよく、０．５質量％以上で１０質量％以下、又は８質量％以下であってもよく、１．０質量％以上で１０質量％以下、又は８質量％以下であってもよい。
　成形用原液は、例えば、タンパク質を含む原料粉体、プリン塩基化合物、及び溶媒を含有するタンパク質含有液を準備することと、タンパク質含有液中のタンパク質を溶媒に溶解させることと、を含む方法により、得ることができる。プリン塩基化合物は、原料粉体に含まれていてもよいし、原料粉体とは別に溶媒中に溶解又は分散していていもよい。原料粉体が、例えば、タンパク質が発現した宿主若しくはその粉砕物を含む粉体であっても、タンパク質及びプリン塩基化合物を含む粉体であってもよい。成形用原液を得る方法が、溶媒を加熱することを更に含んでもよい。タンパク質含有液は、例えば、プリン塩基化合物を溶媒に分散又は溶解させるため、タンパク質を溶媒に溶解させるため、又は後述のように不溶分を除去するためのうち少なくともいずれかの目的で、加熱され得る。
　タンパク質が発現した宿主若しくはその粉砕物を含む原料粉体は、宿主の培養により生成及び蓄積されたタンパク質を含む培養培地から回収された粉体であってもよい。宿主の粉砕物を溶媒と混合してもよいし、宿主をタンパク質含有液中で粉砕してもよい。タンパク質を溶媒に溶解させる前又は後に、宿主の粉砕等によって生じた夾雑物を含む不溶分が除去される。不溶分の除去の際、タンパク質含有液を加熱してもよい。不溶分の除去のための加熱温度は、例えば２０～７０℃である。
　タンパク質及びプリン塩基化合物を含む粉体は、宿主の培養により生成及び蓄積されたタンパク質を含む培養培地から回収及び精製されたタンパク質を含む粉体であってもよい。タンパク質は、通常の方法で培養培地から回収及び精製することができる。精製されたタンパク質を含む粉体中に、宿主に由来するプリン塩基化合物が残存していてもよい。
　タンパク質が宿主内に溶解状態で発現した場合、培養終了後、宿主を遠心分離により回収し、水系緩衝液に懸濁させることと、懸濁液中で超音波破砕機、フレンチプレス、マントンガウリンホモゲナイザー及びダイノミル等により宿主を破砕して、無細胞抽出液を得ることと、無細胞抽出液を遠心分離することにより得られる上清から、タンパク質を単離精製することと、を含む方法により、精製されたタンパク質を含む粉体を得ることができる。上清からタンパク質を単離精製する方法として、例えば溶媒抽出法、硫安等による塩析法、脱塩法、有機溶媒による沈殿法、ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）－セファロース、ＤＩＡＩＯＮ　ＨＰＡ－７５（三菱化成社製）等のレジンを用いた陰イオン交換クロマトグラフィー法、Ｓ－Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ　ＦＦ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）等のレジンを用いた陽イオン交換クロマトグラフィー法、ブチルセファロース、フェニルセファロース等のレジンを用いた疎水性クロマトグラフィー法、分子篩を用いたゲルろ過法、アフィニティークロマトグラフィー法、クロマトフォーカシング法、電気泳動法、又はこれらの組み合わせを採用することができる。
　発現したタンパク質が宿主の細胞内に不溶体を形成している場合、上記と同様の方法で回収された宿主を破砕して粉砕物を得ることと、遠心分離等によってタンパク質の不溶体を回収することと、タンパク質の不溶体をタンパク質変性剤で可溶化してタンパク質を含む溶液を得ることと、該溶液からタンパク質を単離精製することとを含む方法により、精製されたタンパク質を含む粉体を得ることができる。溶液からのタンパク質を単離精製する方法は、上清からタンパク質を単離精製する場合と同様の方法であることができる。
　発現したタンパク質が細胞外に分泌された場合、培養上清からタンパク質を回収することができる。すなわち、培養物を遠心分離等の手法により処理することにより培養上清を取得し、その培養上清から、上記と同様の方法によりタンパク質を単離精製することができる。
　原着色素として用いられるプリン塩基化合物は、タンパク質を溶媒に溶解させる前にタンパク質含有液に加えられてもよいし、タンパク質を溶媒に溶解させた後でタンパク質含有液に加えられてもよい。原料粉体が、宿主に由来するプリン塩基化合物を含んでいてもよい。プリン塩基化合物が溶媒中に溶解していてもよい。プリン塩基化合物を溶媒に溶解させるために、タンパク質含有液を加熱してもよい。プリン塩基化合物の溶解のための加熱温度は、例えば２０～７０℃である。
　タンパク質含有液中のタンパク質は、例えば、タンパク質含有液を加熱することにより、溶媒に溶解される。タンパク質の溶解のための加熱温度は、例えば２０～７０℃、又は２５～４０℃であってもよい。原料粉体が宿主若しくはその粉砕物を含む粉体である場合、タンパク質含有液を加熱することによって、タンパク質が宿主又はその粉砕物から抽出され、それによりタンパク質が溶媒に溶解する。
　タンパク質含有液を調製するための溶媒としては、例えば酸化合物（特に、有機酸化合物）を用いることができる。酸化合物とプリン塩基化合物との組み合わせにより、着色されたタンパク質成形体がより一層容易に形成される傾向がある。これは、酸化合物とプリン塩基化合物の化学反応に因るものと考えられる。溶媒として用いられ得る有機酸化合物の例としては、ギ酸、酢酸、クエン酸、及びシュウ酸が挙げられる。タンパク質含有液は、酸化合物以外の溶媒を含んでいてもよい。溶媒が酸化合物の水溶液であってもよい。溶媒の全量に対する酸化合物の割合は、例えば５０～１００質量％、７０～１００質量％、又は９０～１００質量％であってもよい。
　タンパク質成形体又は原着タンパク質成形体の形状は、特に制限されないが、繊維又はフィルムであってもよい。
　タンパク質成形体又は原着タンパク質成形体としてのタンパク質繊維又は原着タンパク質繊維は、成形用原液をドープ液として用いた紡糸方法によって、製造することができる。紡糸方法としては、例えば、湿式紡糸、乾式紡糸、乾湿式紡糸又は溶融紡糸等の通常の方法を利用できる。紡糸方法が、湿式紡糸又は乾湿式紡糸であってもよい。
　図１は、タンパク質繊維又は原着タンパク質維を製造するための紡糸装置の一例を示す模式図である。図１に示す紡糸装置は、乾湿式紡糸用の紡糸装置の一例であり、押出し装置１と、未延伸糸製造装置２と、湿熱延伸装置３と、乾燥装置４とを有している。
　紡糸装置１０の貯槽７に貯蔵されたドープ液６（成形用原液）が、ギアポンプ８により口金９から押し出される。ドープ液を押し出す方法はこれに限られず、例えば、シリンダーに充填されたドープ液を、シリンジポンプを用いてノズルから押し出してもよい。押し出されたドープ液６は、エアギャップ１９を経て、凝固液槽２０の凝固液１１内に導入される。凝固液１１内で溶媒が除去されることにより、タンパク質が凝固し、繊維状の凝固体であるタンパク質繊維が形成される。タンパク質繊維は、延伸浴槽２１内の温水１２中に導入され、そこで延伸される。延伸倍率は供給ニップローラ１３と引き取りニップローラ１４との速度比によって決まる。延伸されたタンパク質繊維は、乾燥装置４の糸道２２内に導入され、糸道２２を通過しながら乾燥される。乾燥されたタンパク質繊維３６が巻き取られて、タンパク質繊維の巻糸体５が得られる。紡糸装置１０は、タンパク質繊維３６の移動経路上に設けられた糸ガイド１８ａ、１８ｂ、１８ｃ、１８ｄ、１８ｅ、１８ｆ及び１８ｇを有している。
　凝固液１１は、ドープ液から脱溶媒できる溶媒であればよく、その例としては、メタノール、エタノール及び２－プロパノール等の炭素数１～５の低級アルコール、並びにアセトンを挙げることができる。凝固液１１は、水を含んでいてもよい。凝固液１１の温度は、０～３０℃であってもよい。
　口金９として、直径０．１～０．６ｍｍのノズルを有するシリンジポンプを使用してもよい。その場合、押出し速度は１ホール当たり、０．２～６．０ｍｌ／時間、又は１．４～４．０ｍｌ／時間であってもよい。タンパク質繊維が凝固液１１中を通過する距離は、脱溶媒が十分に行える長さであればよく、例えば、２００～５００ｍｍである。未延伸のタンパク質繊維の引き取り速度は、１～２０ｍ／分、又は１～３ｍ／分であってもよい。凝固液１１中でのタンパク質繊維の滞留時間は、０．０１～３分、又は０．０５～０．１５分であってもよい。凝固液１１中でタンパク質繊維を延伸してもよい。凝固液１１中での延伸は、前延伸ということがある。多段の凝固液槽２０が設けられてもよい。
　タンパク質繊維維は、例えば、凝固液槽２０内での前延伸、延伸浴槽２１内での湿熱延伸、乾熱延伸又はこれらの組み合わせにより、延伸される。
　湿熱延伸では、未延伸、又は凝固液槽２０内で前延伸されたタンパク質繊維が延伸浴槽２１内の温水１２中で延伸される。温水１２の温度は、例えば、５０～９０℃、又は７５～８５℃であってもよい。温水１２に有機溶剤等を加えられてもよい。温水に代えて、スチーム加熱中で湿熱延伸を行ってもよい。湿熱延伸の延伸倍率は、例えば、１～１０倍、又は２～８倍であってもよい。
　乾熱延伸は、電気管状炉、乾熱板等を使用して行うことができる。乾熱延伸の温度は、例えば、１４０～２７０℃、又は１６０～２３０℃であってもよい。乾熱延伸における延伸倍率は、例えば、０．５～８倍、又は１～４倍であってもよい。
　最終的な延伸倍率は、未延伸糸（又は前延伸糸）に対して、１倍超、２倍以上、３倍以上、４倍以上、５倍以上、６倍以上、７倍以上、８倍以上、又は９倍以上であってもよく、４０倍以下、３０倍以下、２０倍以下、１５倍以下、１４倍以下、１３倍以下、１２倍以下、１１倍以下、又は１０倍以下であってもよい。
　タンパク質成形体又は原着タンパク質成形体としてのタンパク質フィルム又は原着タンパク質フィルムは、例えば、成形用原液をドープ溶液として用い、これを基材表面にキャスト成形することと、形成された塗膜を乾燥する、及び／又は脱溶媒することとを含む方法により得ることができる。
　タンパク質フィルム又は原着タンパク質フィルムを製造するためのドープ溶液の粘度は１５～８０ｃＰ（センチポアズ）、又は２０～７０ｃＰであってもよい。タンパク質の濃度は、ドープ溶液全量を１００質量％として、３～５０質量％、３．５～３５質量％、又は４．２～１５．８質量％であってもよい。
　基材は、樹脂基板、ガラス基板、金属基板等であってよい。基材は、形成されたフィルムを容易に剥離できる観点から、樹脂基板であってもよい。樹脂基板は、例えば、ポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）フィルム、ポリテトラフルオロエチレン等のフッ素樹脂フィルム、ポリプロピレン（ＰＰ）フィルム、又はこれらのフィルム表面にシリコーン化合物を固定化させた剥離フィルムであってよい。基材は、ＨＦＩＰ、ＤＭＳＯ溶媒等に対して安定であり、ドープ溶液を安定してキャスト成形でき、成形後のフィルムを容易に剥離できる観点から、ＰＥＴフィルム又はＰＥＴフィルム表面にシリコーン化合物を固定化させた剥離フィルムであってもよい。
　キャスト成形の一例は、ドープ液を基材表面に流延することと、塗膜の厚さをアプリケーター、ナイフコーター、バーコーター等の膜厚制御手段を使用して所定の厚さに調整することとを含む。所定の厚さは、塗膜の乾燥及び／又は脱溶媒後の厚さが、例えば１～１０００μｍとなる範囲で設定される。
　塗膜の乾燥及び脱溶媒は、乾式又は湿式で行うことができる。乾式で行う方法の例としては、真空乾燥、熱風乾燥、風乾を挙げることができる。湿式で行う方法の例としては、塗膜を脱溶媒液に浸漬する方法を挙げることができる。脱溶媒液の例として、水、メタノール、エタノール、２－プロパノール等の炭素数１～５の低級アルコール等のアルコール液、水とアルコールとの混合液を挙げることができる。脱溶媒液の温度は０～９０℃であってもよい。
　乾燥及び／又は脱溶媒後、形成されたタンパク質フィルムを、水中で１軸延伸又は２軸延伸してもよい。２軸延伸は、逐次延伸でも同時２軸延伸でもよい。２段以上の多段延伸をしてもよい。延伸倍率は、縦、横ともに、１．０１～６倍、又は１．０５～４倍であってもよい。この範囲であると応力－歪のバランスがとりやすい。水中延伸は、例えば２０～９０℃の水温で行うことができる。延伸後のタンパク質フィルムを、５０～２００℃で５～６００秒間の乾熱処理により、熱固定してもよい。この熱固定により、常温における寸法安定性に優れたタンパク質フィルムが得られる。通常、１軸延伸したフィルムは、１軸配向フィルムとなり、２軸延伸したフィルムは２軸配向フィルムとなる。
　タンパク質成形体又は原着タンパク質成形体を形成するタンパク質は、構造タンパク質であってもよい。構造タンパク質は、クモ糸タンパク質、又は絹タンパク質であってもよい。
　構造タンパク質であるクモ糸タンパク質の代表例は、フィブロインである。フィブロインは、人為的に製造された人造フィブロインであってもよい。人造フィブロインのドメイン配列は、天然フィブロインのアミノ酸配列と同一でも異なっていてもよい。
　フィブロインは、クモ類が産生するスパイダーシルクタンパク質であってもよい。スパイダーシルクタンパク質を産生するクモとしては、例えば、オニグモ、ニワオニグモ、アカオニグモ、アオオニグモ及びマメオニグモ等のオニグモ属（Ａｒａｎｅｕｓ属）に属するクモ、ヤマシロオニグモ、イエオニグモ、ドヨウオニグモ及びサツマノミダマシ等のヒメオニグモ属（Ｎｅｏｓｃｏｎａ属）に属するクモ、コオニグモモドキ等のコオニグモモドキ属（Ｐｒｏｎｕｓ属）に属するクモ、トリノフンダマシ及びオオトリノフンダマシ等のトリノフンダマシ属（Ｃｙｒｔａｒａｃｈｎｅ属）に属するクモ、トゲグモ及びチブサトゲグモ等のトゲグモ属（Ｇａｓｔｅｒａｃａｎｔｈａ属）に属するクモ、マメイタイセキグモ及びムツトゲイセキグモ等のイセキグモ属（Ｏｒｄｇａｒｉｕｓ属）に属するクモ、コガネグモ、コガタコガネグモ及びナガコガネグモ等のコガネグモ属（Ａｒｇｉｏｐｅ属）に属するクモ、キジロオヒキグモ等のオヒキグモ属（Ａｒａｃｈｎｕｒａ属）に属するクモ、ハツリグモ等のハツリグモ属（Ａｃｕｓｉｌａｓ属）に属するクモ、スズミグモ、キヌアミグモ及びハラビロスズミグモ等のスズミグモ属（Ｃｙｔｏｐｈｏｒａ属）に属するクモ、ゲホウグモ等のゲホウグモ属（Ｐｏｌｔｙｓ属）に属するクモ、ゴミグモ、ヨツデゴミグモ、マルゴミグモ及びカラスゴミグモ等のゴミグモ属（Ｃｙｃｌｏｓａ属）に属するクモ、ヤマトカナエグモ等のカナエグモ属（Ｃｈｏｒｉｚｏｐｅｓ属）に属するクモ、並びに、アシナガグモ、ヤサガタアシナガグモ、ハラビロアシダカグモ及びウロコアシナガグモ等のアシナガグモ属（Ｔｅｔｒａｇｎａｔｈａ属）に属するクモ、オオシロカネグモ、チュウガタシロカネグモ及びコシロカネグモ等のシロカネグモ属（Ｌｅｕｃａｕｇｅ属）に属するクモ、ジョロウグモ及びオオジョロウグモ等のジョロウグモ属（Ｎｅｐｈｉｌａ属）に属するクモ、キンヨウグモ等のアズミグモ属（Ｍｅｎｏｓｉｒａ属）に属するクモ、ヒメアシナガグモ等のヒメアシナガグモ属（Ｄｙｓｃｈｉｒｉｏｇｎａｔｈａ属）に属するクモ、クロゴケグモ、セアカゴケグモ、ハイイロゴケグモ及びジュウサンボシゴケグモ等のゴケグモ属（Ｌａｔｒｏｄｅｃｔｕｓ属）に属するクモ、及びユープロステノプス属（Ｅｕｐｒｏｓｔｈｅｎｏｐｓ属）に属するクモ等のアシナガグモ科（Ｔｅｔｒａｇｎａｔｈｉｄａｅ科）に属するクモが挙げられる。スパイダーシルクタンパク質は、ＭａＳｐ（ＭａＳｐ１及びＭａＳｐ２）、ＡＤＦ（ＡＤＦ３及びＡＤＦ４）等の牽引糸タンパク質、ＭｉＳｐ（ＭｉＳｐ１及びＭｉＳｐ２）であってもよい。
　スパイダーシルクタンパク質の具体例としては、ｆｉｂｒｏｉｎ－３（ａｄｆ－３）［Ａｒａｎｅｕｓ　ｄｉａｄｅｍａｔｕｓ由来］（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＡＣ４７０１０（アミノ酸配列）、Ｕ４７８５５（塩基配列））、ｆｉｂｒｏｉｎ－４（ａｄｆ－４）［Ａｒａｎｅｕｓ　ｄｉａｄｅｍａｔｕｓ由来］（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＡＣ４７０１１（アミノ酸配列）、Ｕ４７８５６（塩基配列））、ｄｒａｇｌｉｎｅ　ｓｉｌｋ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｓｐｉｄｒｏｉｎ　１［Ｎｅｐｈｉｌａ　ｃｌａｖｉｐｅｓ由来］（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＡＣ０４５０４（アミノ酸配列）、Ｕ３７５２０（塩基配列））、ｍａｊｏｒ　ａｍｐｕｌｌａｔｅ　ｓｐｉｄｒｏｉｎ　１［Ｌａｔｒｏｄｅｃｔｕｓ　ｈｅｓｐｅｒｕｓ由来］（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＢＲ６８８５６（アミノ酸配列）、ＥＦ５９５２４６（塩基配列））、ｄｒａｇｌｉｎｅ　ｓｉｌｋ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｓｐｉｄｒｏｉｎ　２［Ｎｅｐｈｉｌａ　ｃｌａｖａｔａ由来］（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＡＬ３２４７２（アミノ酸配列）、ＡＦ４４１２４５（塩基配列））、ｍａｊｏｒ　ａｍｐｕｌｌａｔｅ　ｓｐｉｄｒｏｉｎ　１［Ｅｕｐｒｏｓｔｈｅｎｏｐｓ　ａｕｓｔｒａｌｉｓ由来］（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＣＡＪ００４２８（アミノ酸配列）、ＡＪ９７３１５５（塩基配列））、及びｍａｊｏｒ　ａｍｐｕｌｌａｔｅ　ｓｐｉｄｒｏｉｎ　２［Ｅｕｐｒｏｓｔｈｅｎｏｐｓ　ａｕｓｔｒａｌｉｓ］（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＣＡＭ３２２４９．１（アミノ酸配列）、ＡＭ４９０１６９（塩基配列））、ｍｉｎｏｒ　ａｍｐｕｌｌａｔｅ　ｓｉｌｋ　ｐｒｏｔｅｉｎ　１［Ｎｅｐｈｉｌａ　ｃｌａｖｉｐｅｓ］（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＡＣ１４５８９．１（アミノ酸配列））、ｍｉｎｏｒ　ａｍｐｕｌｌａｔｅ　ｓｉｌｋ　ｐｒｏｔｅｉｎ　２［Ｎｅｐｈｉｌａ　ｃｌａｖｉｐｅｓ］（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＡＣ１４５９１．１（アミノ酸配列））、及び、ｍｉｎｏｒ　ａｍｐｕｌｌａｔｅ　ｓｐｉｄｒｏｉｎ－ｌｉｋｅ　ｐｒｏｔｅｉｎ［Ｎｅｐｈｉｌｅｎｇｙｓ　ｃｒｕｅｎｔａｔａ］（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＢＲ３７２７８．１（アミノ酸配列）が挙げられる。
　天然フィブロインのその他の具体例としては、ＮＣＢＩ　ＧｅｎＢａｎｋに配列情報が登録されているフィブロインを挙げることができる。例えば、ＮＣＢＩ　ＧｅｎＢａｎｋに登録されている配列情報のうちＤＩＶＩＳＩＯＮとしてＩＮＶを含む配列の中から、ＤＥＦＩＮＩＴＩＯＮにｓｐｉｄｒｏｉｎ、ａｍｐｕｌｌａｔｅ、ｆｉｂｒｏｉｎ、「ｓｉｌｋ及びｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ」、又は「ｓｉｌｋ及びｐｒｏｔｅｉｎ」がキーワードとして記載されている配列、ＣＤＳから特定のｐｒｏｄｕｃｔの文字列、ＳＯＵＲＣＥからＴＩＳＳＵＥ　ＴＹＰＥに特定の文字列の記載された配列を抽出することにより確認することができる。
　フィブロインが、改変フィブロインであってもよい。改変フィブロインは、天然フィブロインのアミノ酸配列の一部を改変したアミノ酸配列を有するフィブロインであっても、天然フィブロインに依らず人工的に設計及び合成されたフィブロインであってもよい。改変フィブロインは、例えば、クローニングした天然フィブロインのアミノ酸配列を、１又は複数のアミノ酸残基を置換、欠失、挿入及び／又は付加すること改変したアミノ酸配列を有していてもよい。アミノ酸残基の置換、欠失、挿入及び／又は付加は、部分特異的突然変異誘発法等の当業者に周知の方法により行うことができる。具体的には、Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄ　Ｒｅｓ．１０，６４８７（１９８２）、Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１００，４４８（１９８３）等の文献に記載されている方法に準じて行うことができる。
　改変フィブロインは、式１：［（Ａ）ｎモチーフ－ＲＥＰ］ｍ、又は式２：［（Ａ）ｎモチーフ－ＲＥＰ］ｍ－（Ａ）ｎモチーフで表されるドメイン配列を含むフィブロインであってもよい。ｍは２～３００、又は１０～３００の整数を示す。改変フィブロインは、ドメイン配列のＮ末端側に付加されたＮ末端配列、ドメイン配列のＣ末端側に付加されたＣ末端配列、又はこれらの両方を更に含んでいてもよい。Ｎ末端配列及びＣ末端配列は、特に限定されないが、典型的には、フィブロインに特徴的なアミノ酸モチーフの反復を有さない領域であり、１００残基程度のアミノ酸からなる。
　本明細書において「ドメイン配列」は、フィブロイン特有の結晶領域（典型的には、アミノ酸配列の（Ａ）ｎモチーフに相当する。）と非晶領域（典型的には、アミノ酸配列のＲＥＰに相当する。）を生じるアミノ酸配列を意味する。
　式１及び２中の（Ａ）ｎモチーフは、主としてアラニン残基から構成されるアミノ酸配列である。（Ａ）ｎモチーフのアミノ酸残基数は、２～２７、２～２０、４～２７、４～２０、８～２０、１０～２０、４～１６、８～１６、又は１０～１６であってよい。フィブロイン中に複数存在する（Ａ）ｎモチーフは、互いに同一又は異なるアミノ酸配列を有する。（Ａ）ｎモチーフ中の全アミノ酸残基数に対するアラニン残基数の割合は、４０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、８３％以上、８５％以上、８６％以上、９０％以上、９５％以上、又は１００％であってもよい。ドメイン配列を構成するｍ個の（Ａ）ｎモチーフのうち７個以上が、アラニン残基のみで構成されてもよい。
　式１及び２中のＲＥＰは、２～２００アミノ酸残基から構成されるアミノ酸配列を示す。ＲＥＰは、１０～２００アミノ酸残基から構成されるアミノ酸配列であってもよい。フィブロイン中に複数存在するＲＥＰは、互いに同一又は異なるアミノ酸配列を有する。
　改変フィブロインは、クモの大瓶状腺で産生される大吐糸管しおり糸タンパク質に由来する改変フィブロイン（以下「第１の改変フィブロイン」という。）、グリシン残基の含有量が低減されたドメイン配列を有する改変フィブロイン（以下「第２の改変フィブロイン」という。）、（Ａ）ｎモチーフの含有量が低減されたドメイン配列を有する改変フィブロイン（以下「第３の改変フィブロイン」という）、グリシン残基の含有量、及び（Ａ）ｎモチーフの含有量が低減された改変フィブロイン（以下「第４の改変フィブロイン」という。）、局所的に疎水性指標の大きい領域を含むドメイン配列を有する改変フィブロイン（以下「第５の改変フィブロイン」という。）、又は、グルタミン残基の含有量が低減されたドメイン配列を有する改変フィブロイン（以下「第６の改変フィブロイン」）であってもよい。ここでの分類は便宜的なものであり、１種の改変フィブロインがこれらの２以上の分類に該当し得る。
　第１の改変フィブロインは、式１で表されるドメイン配列を含んでいてもよい。第１の改変フィブロインにおける（Ａ）ｎモチーフのアミノ酸残基数は、３～２０、４～２０、８～２０、１０～２０、４～１６、８～１６、又は１０～１６であってもよい。第１の改変フィブロインにおけるＲＥＰを構成するアミノ酸残基の数は、１０～２００、１０～１５０、２０～１００、又は２０～７５であってもよい。式１で表されるドメイン配列において、グリシン残基、セリン残基及びアラニン残基の合計残基数が、アミノ酸残基数全体に対して、４０％以上、６０％以上、又は７０％以上であってもよい。
　第１の改変フィブロインは、式１で表されるドメイン配列と、配列番号１、２又は３のいずれかに示されるアミノ酸配列又はこれらと９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列であるＣ末端配列とを有していてもよい。配列番号１に示されるアミノ酸配列は、ＡＤＦ３（ＧＩ：１２６３２８７、ＮＣＢＩ）のアミノ酸配列のＣ末端の５０残基のアミノ酸からなるアミノ酸配列と同一である。配列番号２に示されるアミノ酸配列は、配列番号１に示されるアミノ酸配列のＣ末端から２０残基取り除いたアミノ酸配列と同一である、配列番号３に示されるアミノ酸配列は、配列番号１に示されるアミノ酸配列のＣ末端から２９残基取り除いたアミノ酸配列と同一である。
　第１の改変フィブロインの具体例として、配列番号４（ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ　ｓｐｉｄｅｒ　ｓｉｌｋ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ＡＤＦ３ＫａｉＬａｒｇｅＮＲＳＨ１）で示されるアミノ酸配列、又は配列番号４で示されるアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、改変フィブロインを挙げることができる。ここでの配列同一性は、９５％以上であってもよい。配列番号４で示されるアミノ酸配列は、ＡＤＦ３のアミノ酸配列を、Ｎ末端に開始コドン、Ｈｉｓ１０タグ及びＨＲＶ３Ｃプロテアーゼ（Ｈｕｍａｎ　ｒｈｉｎｏｖｉｒｕｓ　３Ｃプロテアーゼ）認識サイトからなるアミノ酸配列（配列番号５）を付加し、第１～１３番目の反復領域をおよそ２倍に増やし、翻訳が第１１５４番目アミノ酸残基で終止するように変異させたものである。配列番号４で示されるアミノ酸配列のＣ末端のアミノ酸配列は、配列番号３で示されるアミノ酸配列と同一である。
　第２の改変フィブロインは、天然フィブロインと比較してグリシン残基の含有量が低減されたドメイン配列を有する。第２の改変フィブロインは、天然フィブロインにおいて少なくともＲＥＰ中の１又は複数のグリシン残基が別のアミノ酸残基に置換されたものに相当するアミノ酸配列を有していてもよい。例えば、ＲＥＰ中のＧＧＸ及びＧＰＧＸＸ（Ｇはグリシン残基、Ｐはプロリン残基、Ｘはグリシン以外のアミノ酸残基を示す。）から選ばれる少なくとも一つのモチーフ配列において、１つのグリシン残基が別のアミノ酸残基に置換されていてもよい。第２の改変フィブロインにおいて、グリシン残基が別のアミノ酸残基に置換されたモチーフ配列の割合が、全モチーフ配列に対して、１０％以上であってもよい。
　第２の改変フィブロインが式１で表されるドメイン配列を含んでもよい。式１のドメイン配列のうち、最もＣ末端側に位置する（Ａ）ｎモチーフからＣ末端までの配列を除いた配列中において、全ＲＥＰに含まれるＸＧＸ（Ｘはグリシン以外のアミノ酸残基を示す。）からなるアミノ酸配列の総アミノ酸残基数をｚとし、総アミノ酸残基数をｗとしたときに、ｚ／ｗが３０％以上、４０％以上、５０％以上又は５０．９％以上であってもよい。（Ａ）ｎモチーフ中の全アミノ酸残基数に対するアラニン残基数は８３％以上、８６％以上、９０％以上、９５％以上、又は１００％であってもよい。
　第２の改変フィブロインにおいて、ＧＧＸモチーフの１つのグリシン残基を別のアミノ酸残基に置換することにより、ＸＧＸからなるアミノ酸配列の含有割合が高められていてもよい。第２の改変フィブロインのドメイン配列におけるＧＧＸからなるアミノ酸配列の含有割合が、３０％以下、２０％以下、１０％以下、６％以下、４％以下、又は２％以下であってもよい。ドメイン配列中のＧＧＸからなるアミノ酸配列の含有割合は、ｚ／ｗの算出方法と同様の方法で算出することができる。
　ｚ／ｗの算出方法を更に詳細に説明する。まず、式１で表されるドメイン配列のうち、最もＣ末端側に位置する（Ａ）ｎモチーフからＣ末端までの配列を除いた配列に含まれる全てのＲＥＰから、ＸＧＸからなるアミノ酸配列を抽出する。ＸＧＸを構成するアミノ酸残基の総数がｚである。例えば、ＸＧＸからなるアミノ酸配列が重複なく５０個抽出された場合、ｚは５０×３＝１５０である。例えばＸＧＸＧＸからなるアミノ酸配列のように、２つのＸＧＸに含まれるＸが存在する場合、重複分を控除してｚを計算する。したがって、ＸＧＸＧＸにおけるアミノ酸残基の数は５としてｚに算入される。ｗは、式１で表されるドメイン配列のうち、最もＣ末端側に位置する（Ａ）ｎモチーフからＣ末端までの配列を除いた配列に含まれる総アミノ酸残基数である。例えば、図２に示したドメイン配列の場合、ｗは４＋５０＋４＋１００＋４＋１０＋４＋２０＋４＋３０＝２３０である。ここで、最もＣ末端側に位置する（Ａ）ｎモチーフは除かれている。
　ここで、ＮＣＢＩ　ＧｅｎＢａｎｋにアミノ酸配列情報が登録されているフィブロインから、６６３種類の天然フィブロイン（このうち、クモ類由来の天然フィブロインは４１５種類）が抽出される。抽出されたフィブロインのうち、式１で表されるドメイン配列を含み、フィブロイン中のＧＧＸからなるアミノ酸配列の含有割合が６％以下であるもののアミノ酸配列について、上述の算出方法により、ｚ／ｗを算出した。その結果を図３に示す。図３の横軸はｚ／ｗ（％）を示し、縦軸は頻度を示す。図３に示されるように、天然フィブロインにおけるｚ／ｗは、最大で５０．８６％である。
　第２の改変フィブロインにおいて、ｚ／ｗは、５０．９％以上、５６．１％以上、５８．７％以上、７０％以上、８０％以上であってもよい。ｚ／ｗの上限に特に制限はないが、例えば、９５％以下であってもよい。
　第２の改変フィブロインは、例えば、クローニングした天然フィブロインの遺伝子配列から、グリシン残基をコードする塩基配列の少なくとも一部を置換して別のアミノ酸残基をコードするように改変することにより得ることができる。このとき、改変するグリシン残基として、ＧＧＸモチーフ及びＧＰＧＸＸモチーフにおける１つのグリシン残基を選択してもよいし、ｚ／ｗが５０．９％以上になるように塩基配列を置換してもよい。天然フィブロインのアミノ酸配列からＲＥＰ中のグリシン残基を別のアミノ酸残基に置換したことに相当する改変に加え、更に１又は複数のアミノ酸残基を置換、欠失、挿入及び／又は付加したことに相当するアミノ酸配列の改変を行ってもよい。
　グリシン残基を置換する別のアミノ酸残基は、バリン（Ｖ）残基、ロイシン（Ｌ）残基、イソロイシン（Ｉ）残基、メチオニン（Ｍ）残基、プロリン（Ｐ）残基、フェニルアラニン（Ｆ）残基及びトリプトファン（Ｗ）残基等の疎水性アミノ酸残基、又は、グルタミン（Ｑ）残基、アスパラギン（Ｎ）残基、セリン（Ｓ）残基、リシン（Ｋ）残基及びグルタミン酸（Ｅ）残基等の親水性アミノ酸残基であってもよく、バリン（Ｖ）残基、ロイシン（Ｌ）残基、イソロイシン（Ｉ）残基、フェニルアラニン（Ｆ）残基又はグルタミン（Ｑ）残基であってもよく、グルタミン（Ｑ）残基であってもよい。
　第２の改変フィブロインの具体例として、配列番号６（Ｍｅｔ－ＰＲＴ３８０）、配列番号７（Ｍｅｔ－ＰＲＴ４１０）、配列番号８（Ｍｅｔ－ＰＲＴ５２５）若しくは配列番号９（Ｍｅｔ－ＰＲＴ７９９）で示されるアミノ酸配列、又はこれらと９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、改変フィブロインを挙げることができる。ここでの配列同一性は９５％以上であってもよい。配列番号６で示されるアミノ酸配列は、天然フィブロインに相当する配列番号１０（Ｍｅｔ－ＰＲＴ３１３）で示されるアミノ酸配列のＲＥＰ中の全てのＧＧＸをＧＱＸに置換したものである。配列番号７で示されるアミノ酸配列は、配列番号６で示されるアミノ酸配列から、Ｎ末端側からＣ末端側に向かって２つおきに（Ａ）ｎモチーフを欠失させ、更にＣ末端配列の手前に［（Ａ）ｎモチーフ－ＲＥＰ］を１つ挿入したものである。配列番号８で示されるアミノ酸配列は、配列番号７で示されるアミノ酸配列の各（Ａ）ｎモチーフのＣ末端側に２つのアラニン残基を挿入し、更に一部のグルタミン（Ｑ）残基をセリン（Ｓ）残基に置換し、配列番号７の分子量とほぼ同じとなるようにＣ末端側の一部のアミノ酸を欠失させたものである。配列番号９で示されるアミノ酸配列は、配列番号７で示されるアミノ酸配列中に存在する２０個のドメイン配列の領域（但し、当該領域のＣ末端側の数アミノ酸残基が置換されている。）を４回繰り返した配列のＣ末端に所定のヒンジ配列とＨｉｓタグ配列が付加されたものである。
　配列番号１０で示されるアミノ酸配列（天然フィブロインに相当）におけるｚ／ｗの値は、４６．８％である。配列番号６で示されるアミノ酸配列、配列番号７で示されるアミノ酸配列、配列番号８で示されるアミノ酸配列、及び配列番号９で示されるアミノ酸配列におけるｚ／ｗの値は、それぞれ５８．７％、７０．１％、６６．１％及び７０．０％である。配列番号１０、配列番号６、配列番号７、配列番号８及び配列番号９で示されるアミノ酸配列のギザ比率１：１．８～１１．３におけるｘ／ｙの値は、それぞれ１５．０％、１５．０％、９３．４％、９２．７％及び８９．８％である。ギザ比率の詳細は後述される。
　配列番号６、配列番号７、配列番号８又は配列番号９で示されるアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列において、ＲＥＰ中に含まれるＸＧＸ（但し、Ｘはグリシン以外のアミノ酸残基を示す。）からなるアミノ酸配列の総アミノ酸残基数をｚとし、上記ドメイン配列中のＲＥＰの総アミノ酸残基数をｗとしたときに、ｚ／ｗが５０．９％以上であってもよい。
　第２の改変フィブロインは、Ｎ末端、Ｃ末端又はこれらの両方に付加されたタグ配列を含んでいてもよい。これにより、改変フィブロインの単離、固定化、検出及び可視化等が可能となる。
　タグ配列として、例えば、他の分子との特異的親和性（結合性、アフィニティ）を利用したアフィニティタグを挙げることができる。アフィニティタグの具体例として、ヒスチジンタグ（Ｈｉｓタグ）を挙げることができる。Ｈｉｓタグは、ヒスチジン残基が４から１０個程度並んだ短いペプチドで、ニッケル等の金属イオンと特異的に結合する性質があるため、金属キレートクロマトグラフィー（ｃｈｅｌａｔｉｎｇ　ｍｅｔａｌ　ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）による改変フィブロインの単離に利用することができる。タグ配列の具体例として、例えば、配列番号１１で示されるアミノ酸配列（Ｈｉｓタグ配列及びヒンジ配列を含むアミノ酸配列）が挙げられる。
　グルタチオンに特異的に結合するグルタチオン－Ｓ－トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、マルトースに特異的に結合するマルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）等のタグ配列を利用することもできる。
　抗原抗体反応を利用した「エピトープタグ」を利用することもできる。抗原性を示すペプチド（エピトープ）をタグ配列として付加することにより、当該エピトープに対する抗体を結合させることができる。エピトープタグとして、ＨＡ（インフルエンザウイルスのヘマグルチニンのペプチド配列）タグ、ｍｙｃタグ、ＦＬＡＧタグ等を挙げることができる。エピトープタグを利用することにより、高い特異性で容易に改変フィブロインを精製することができる。
　タグ配列は、特定のプロテアーゼで切り離すことが可能であってもよい。当該タグ配列を介して吸着したタンパク質をプロテアーゼ処理することにより、タグ配列を切り離した改変フィブロインを回収することもできる。
　タグ配列を含む改変フィブロインの具体例として、配列番号１２（ＰＲＴ３８０）、配列番号１３（ＰＲＴ４１０）、配列番号１４（ＰＲＴ５２５）、若しくは配列番号１５（ＰＲＴ７９９）で示されるアミノ酸配列、又はこれらアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、改変フィブロインを挙げることができる。ここでの配列同一性は９５％以上であってもよい。配列番号１６（ＰＲＴ３１３）、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４又は配列番号１５で示されるアミノ酸配列は、それぞれ配列番号１０、配列番号６、配列番号７、配列番号８又は配列番号９で示されるアミノ酸配列のＮ末端に配列番号１１で示されるアミノ酸配列（Ｈｉｓタグ配列及びヒンジ配列を含む）を付加したものである。
　配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４又は配列番号１５で示されるアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列において、ＲＥＰ中に含まれるＸＧＸ（但し、Ｘはグリシン以外のアミノ酸残基を示す。）からなるアミノ酸配列の総アミノ酸残基数をｚとし、上記ドメイン配列中のＲＥＰの総アミノ酸残基数をｗとしたときに、ｚ／ｗが５０．９％以上であってもよい。
　第２の改変フィブロインは、組換えタンパク質生産系において生産されたタンパク質を宿主の外部に放出するための分泌シグナルを含んでいてもよい。分泌シグナルの配列は、宿主の種類に応じて適宜設定することができる。
　第３の改変フィブロインは、天然フィブロインと比較して、（Ａ）ｎモチーフの含有量が低減されたドメイン配列を有する。第３の改変フィブロインのドメイン配列は、天然フィブロインと比較して、少なくとも１又は複数の（Ａ）ｎモチーフが欠失したことに相当するアミノ酸配列を有していてもよい。第３の改変フィブロインが、天然フィブロインから（Ａ）ｎモチーフを１０～４０％欠失させたことに相当するドメイン配列を有していてもよい。第３の改変フィブロインが、天然フィブロインと比較して、Ｎ末端側からＣ末端側に向かって１～３つの（Ａ）ｎモチーフ毎に１つの（Ａ）ｎモチーフが欠失したことに相当するドメイン配列を有していてもよい。第３の改変フィブロインが、天然フィブロインと比較して、Ｎ末端側からＣ末端側に向かって２つ連続した（Ａ）ｎモチーフの欠失、及び１つの（Ａ）ｎモチーフの欠失がこの順に繰り返されたことに相当するドメイン配列を有していてもよい。第３の改変フィブロインが、天然フィブロインと比較して、Ｎ末端側からＣ末端側に向かって２つおきに（Ａ）ｎモチーフが欠失したことに相当するドメイン配列を有していてもよい。
　第３の改変フィブロインは、式１で表されるドメイン配列を含んでいてもよい。式１で表されるドメイン配列において隣合う２つの［（Ａ）ｎモチーフ－ＲＥＰ］ユニットの組み合わせであって、アミノ酸残基数が少ない方のＲＥＰのアミノ酸残基数に対する他方のＲＥＰのアミノ酸残基数の比が１．８～１１．３である組み合わせに含まれるアミノ酸残基の合計が、最大でｘであり、ドメイン配列の総アミノ酸残基数がｙであるときに、ｘ／ｙが２０％以上、３０％以上、４０％以上又は５０％以上であってもよい。（Ａ）ｎモチーフ中の全アミノ酸残基数に対するアラニン残基数の割合は８３％以上、８６％以上、９０％以上、９５％以上、又は１００％であってもよい。
　ｘ／ｙの算出方法を図２を参照しながら更に詳細に説明する。図２は、改変フィブロインからＮ末端配列及びＣ末端配列を除いたドメイン配列を示す。図２のドメイン配列は、Ｎ末端側（左側）から、（Ａ）ｎモチーフ－第１のＲＥＰ（５０アミノ酸残基）－（Ａ）ｎモチーフ－第２のＲＥＰ（１００アミノ酸残基）－（Ａ）ｎモチーフ－第３のＲＥＰ（１０アミノ酸残基）－（Ａ）ｎモチーフ－第４のＲＥＰ（２０アミノ酸残基）－（Ａ）ｎモチーフ－第５のＲＥＰ（３０アミノ酸残基）－（Ａ）ｎモチーフという配列を有する。
　隣合う２つの［（Ａ）ｎモチーフ－ＲＥＰ］ユニットを、重複がないように、Ｎ末端側からＣ末端側に向かって、順次選択する。このとき、選択されない［（Ａ）ｎモチーフ－ＲＥＰ］ユニットが存在してもよい。図２には、パターン１（第１のＲＥＰと第２のＲＥＰの比較、及び第３のＲＥＰと第４のＲＥＰの比較）、パターン２（第１のＲＥＰと第２のＲＥＰの比較、及び第４のＲＥＰと第５のＲＥＰの比較）、パターン３（第２のＲＥＰと第３のＲＥＰの比較、及び第４のＲＥＰと第５のＲＥＰの比較）、パターン４（第１のＲＥＰと第２のＲＥＰの比較）を示した。これ以外にも選択方法は存在する。
　次に各パターンについて、選択した隣合う２つの［（Ａ）ｎモチーフ－ＲＥＰ］ユニット中の各ＲＥＰのアミノ酸残基数を比較する。比較は、よりアミノ酸残基数の少ない方を１としたときの、他方のアミノ酸残基数の比を求めることによって行う。例えば、第１のＲＥＰ（５０アミノ酸残基）と第２のＲＥＰ（１００アミノ酸残基）の比較の場合、よりアミノ酸残基数の少ない第１のＲＥＰを１としたとき、第２のＲＥＰのアミノ酸残基数の比は、１００／５０＝２である。同様に、第４のＲＥＰ（２０アミノ酸残基）と第５のＲＥＰ（３０アミノ酸残基）の比較の場合、よりアミノ酸残基数の少ない第４のＲＥＰを１としたとき、第５のＲＥＰのアミノ酸残基数の比は、３０／２０＝１．５である。
　図２中、よりアミノ酸残基数の少ない方を１としたときに、他方のアミノ酸残基数の比が１．８～１１．３となる［（Ａ）ｎモチーフ－ＲＥＰ］ユニットの組を実線で示した。本明細書中、この比をギザ比率と呼ぶ。よりアミノ酸残基数の少ない方を１としたときに、他方のアミノ酸残基数の比が１．８未満又は１１．３超となる［（Ａ）ｎモチーフ－ＲＥＰ］ユニットの組は破線で示した。
　各パターンにおいて、実線で示した隣合う２つの［（Ａ）ｎモチーフ－ＲＥＰ］ユニットの全てのアミノ酸残基数を足し合わせる。このとき、ＲＥＰだけでなく（Ａ）ｎモチーフのアミノ酸残基数も算入される。足し合わせた合計値が最大となるパターンの合計値（合計値の最大値）がｘとする。図２に示した例では、パターン１の合計値が最大である。
　第３の改変フィブロインにおいて、ｘ／ｙは、５０％以上、６０％以上、６５％以上、７０％以上、７５％以上、又は８０％以上であってもよい。ｘ／ｙの上限に特に制限はなく、例えば、１００％以下であってよい。ギザ比率が１：１．９～１１．３で、ｘ／ｙが８９．６％以上であってもよい。ギザ比率が１：１．８～３．４で、ｘ／ｙが７７．１％以上であってもよい。ギザ比率が１：１．９～８．４で、ｘ／ｙが７５．９％以上であってもよい。ギザ比率が１：１．９～４．１で、ｘ／ｙが６４．２％以上であってもよい。
　第３の改変フィブロインのドメイン配列中に複数存在する（Ａ）ｎモチーフのうち７個以上がアラニン残基のみで構成される場合、ｘ／ｙは、４６．４％以上、５０％以上、５５％以上、６０％以上、７０％以上、又は８０％以上でってもよい。ｘ／ｙの上限に特に制限はなく、１００％以下であってもよい。
　ＮＣＢＩ　ＧｅｎＢａｎｋにアミノ酸配列情報が登録されている６６３種類のフィブロインのうち、式１で表されるドメイン配列で構成される天然フィブロインのアミノ酸配列に関して、上述の算出方法によりｘ／ｙを算出した。ギザ比率が１：１．９～４．１の場合の結果を図４に示す。図４の横軸はｘ／ｙ（％）を示し、縦軸は頻度を示す。図４に示されるように、天然フィブロインにおけるｘ／ｙは、最大で６４．１４％である。
　第３の改変フィブロインは、例えば、クローニングした天然フィブロインの遺伝子配列から、ｘ／ｙが６４．２％以上になるように（Ａ）ｎモチーフをコードする配列の１又は複数を欠失させることにより得ることができる。例えば、天然フィブロインのアミノ酸配列から、ｘ／ｙが６４．２％以上になるように１又は複数の（Ａ）ｎモチーフが欠失したことに相当するアミノ酸配列を設計し、設計したアミノ酸配列をコードする核酸を化学合成することにより、第３のフィブロインを得ることもできる。天然フィブロインのアミノ酸配列から（Ａ）ｎモチーフが欠失したことに相当する改変に加え、更に１又は複数のアミノ酸残基を置換、欠失、挿入及び／又は付加したことに相当するアミノ酸配列の改変を行ってもよい。
　第３の改変フィブロインの具体例として、配列番号１７（Ｍｅｔ－ＰＲＴ３９９）、配列番号７（Ｍｅｔ－ＰＲＴ４１０）、配列番号８（Ｍｅｔ－ＰＲＴ５２５）、若しくは配列番号９（Ｍｅｔ－ＰＲＴ７９９）で示されるアミノ酸配列、又はこれらアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、改変フィブロインを挙げることができる。ここでの配列同一性は９５％以上であってもよい。配列番号１７で示されるアミノ酸配列は、天然フィブロインに相当する配列番号１０（Ｍｅｔ－ＰＲＴ３１３）で示されるアミノ酸配列から、Ｎ末端側からＣ末端側に向かって２つおきに（Ａ）ｎモチーフを欠失させ、更にＣ末端配列の手前に［（Ａ）ｎモチーフ－ＲＥＰ］を１つ挿入したものである。配列番号７、配列番号８又は配列番号９で示されるアミノ酸配列は、第２の改変フィブロインで説明したとおりである。
　配列番号１０で示されるアミノ酸配列（天然フィブロインに相当）のギザ比率１：１．８～１１．３におけるｘ／ｙの値は１５．０％である。配列番号１７で示されるアミノ酸配列、及び配列番号７で示されるアミノ酸配列におけるｘ／ｙの値は、いずれも９３．４％である。配列番号８で示されるアミノ酸配列におけるｘ／ｙの値は、９２．７％である。配列番号９で示されるアミノ酸配列におけるｘ／ｙの値は、８９．８％である。配列番号１０、配列番号１７、配列番号７、配列番号８及び配列番号９で示されるアミノ酸配列におけるｚ／ｗの値は、それぞれ４６．８％、５６．２％、７０．１％、６６．１％及び７０．０％である。
　配列番号１７、配列番号７、配列番号８又は配列番号９で示されるアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有するドメイン配列において、隣合う２つの［（Ａ）ｎモチーフ－ＲＥＰ］ユニットの組み合わせであって、アミノ酸残基数が少ない方のＲＥＰのアミノ酸残基数に対する他方のＲＥＰのアミノ酸残基数の比（ギザ比率）が１．８～１１．３である組み合わせにおけるアミノ酸残基数の合計が最大でｘであり、ドメイン配列の総アミノ酸残基数がｙであるときに、ｘ／ｙが６４．２％以上であってもよい。
　第３の改変フィブロインが、Ｎ末端、Ｃ末端又はこれらの両方に付加された上述のタグ配列を含んでいてもよい。
　タグ配列を含む改変フィブロインの具体例として、配列番号１８（ＰＲＴ３９９）、配列番号１３（ＰＲＴ４１０）、配列番号１４（ＰＲＴ５２５）、若しくは配列番号１５（ＰＲＴ７９９）で示されるアミノ酸配列、又はこれらアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、改変フィブロインを挙げることができる。ここでの拝謁同一性は９５％以上であってもよい。配列番号１８、配列番号１３、配列番号１４又は配列番号１５で示されるアミノ酸配列は、それぞれ配列番号１７、配列番号７、配列番号８又は配列番号９で示されるアミノ酸配列のＮ末端に配列番号１１で示されるアミノ酸配列（Ｈｉｓタグ配列及びヒンジ配列を含む）を付加したものである。
　配列番号１８、配列番号１３、配列番号１４又は配列番号１５で示されるアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有するドメイン配列において、隣合う２つの［（Ａ）ｎモチーフ－ＲＥＰ］ユニットの組み合わせであって、アミノ酸残基数が少ない方のＲＥＰのアミノ酸残基数に対する他方のＲＥＰのアミノ酸残基数の比が１．８～１１．３である組み合わせにおけるアミノ酸残基数の合計が最大でｘであり、ドメイン配列の総アミノ酸残基数がｙであるときに、ｘ／ｙが６４．２％以上であってもよい。
　第３の改変フィブロインは、組換えタンパク質生産系において生産されたタンパク質を宿主の外部に放出するための分泌シグナルを含んでいてもよい。分泌シグナルの配列は、宿主の種類に応じて適宜設定することができる。
　第４の改変フィブロインは、天然フィブロインと比較して、（Ａ）ｎモチーフの含有量が低減されたことに加え、グリシン残基の含有量が低減されたドメイン配列を有する。第４の改変フィブロインのドメイン配列は、天然フィブロインと比較して、少なくとも１又は複数の（Ａ）ｎモチーフが欠失したことに加え、更に少なくともＲＥＰ中の１又は複数のグリシン残基が別のアミノ酸残基に置換されたことに相当するアミノ酸配列を有する。
　第４の改変フィブロインの具体例として、配列番号７（Ｍｅｔ－ＰＲＴ４１０）、配列番号８（Ｍｅｔ－ＰＲＴ５２５）、配列番号９（Ｍｅｔ－ＰＲＴ７９９）、配列番号１３（ＰＲＴ４１０）、配列番号１４（ＰＲＴ５２５）若しくは配列番号１５（ＰＲＴ７９９）で示されるアミノ酸配列、又はこれらアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、改変フィブロインを挙げることができる。ここでの配列同一性は９５％以上であってもよい。
　第５の改変フィブロインは、天然フィブロインと比較して、ＲＥＰ中の１又は複数のアミノ酸残基が疎水性指標の大きいアミノ酸残基に置換されたこと、及び／又はＲＥＰ中に１又は複数の疎水性指標の大きいアミノ酸残基が挿入されたことに相当する、局所的に疎水性指標の大きい領域を含むドメイン配列を有していてもよい。局所的に疎水性指標の大きい領域は、連続する２～４個の疎水性指標の大きいアミノ酸残基で構成されていてもよい。
　アミノ酸残基の疎水性指標については、公知の指標（Ｈｙｄｒｏｐａｔｈｙ　ｉｎｄｅｘ：Ｋｙｔｅ　Ｊ，＆Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ　Ｒ（１９８２）“Ａ　ｓｉｍｐｌｅ　ｍｅｔｈｏｄ　ｆｏｒ　ｄｉｓｐｌａｙｉｎｇ　ｔｈｅ　ｈｙｄｒｏｐａｔｈｉｃ　ｃｈａｒａｃｔｅｒ　ｏｆ　ａ　ｐｒｏｔｅｉｎ”，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１５７，ｐｐ．１０５－１３２）を使用する。具体的には、各アミノ酸の疎水性指標（ハイドロパシー・インデックス、以下「ＨＩ」とも記す。）は、下記表１に示すとおりである。
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　疎水性指標の大きいアミノ酸残基は、イソロイシン（Ｉ）、バリン（Ｖ）、ロイシン（Ｌ）、フェニルアラニン（Ｆ）、システイン（Ｃ）、メチオニン（Ｍ）及びアラニン（Ａ）から選ばれるアミノ酸残基、又は、バリン（Ｖ）、ロイシン（Ｌ）及びイソロイシン（Ｉ）から選ばれるアミノ酸残基であってもよい。
　第５の改変フィブロインは、天然フィブロインと比較して、ＲＥＰ中の１又は複数のアミノ酸残基が疎水性指標の大きいアミノ酸残基に置換されたこと、及び／又はＲＥＰ中に１又は複数の疎水性指標の大きいアミノ酸残基が挿入されたことに相当する改変に加え、天然フィブロインと比較して、１又は複数のアミノ酸残基を置換、欠失、挿入及び／又は付加したことにより改変されていてもよい。
　第５の改変フィブロインは、例えば、クローニングした天然フィブロインの遺伝子配列からＲＥＰ中の１又は複数の親水性アミノ酸残基（例えば、疎水性指標がマイナスであるアミノ酸残基）を疎水性アミノ酸残基（例えば、疎水性指標がプラスであるアミノ酸残基）に置換すること、及び／又はＲＥＰ中に１又は複数の疎水性アミノ酸残基を挿入することにより得ることができる。天然フィブロインのアミノ酸配列からＲＥＰ中の１又は複数の親水性アミノ酸残基を疎水性アミノ酸残基に置換したこと、及び／又はＲＥＰ中に１又は複数の疎水性アミノ酸残基を挿入したことに相当するアミノ酸配列を設計し、設計したアミノ酸配列をコードする核酸を化学合成することにより、第５の改変フィブロインを得ることもできる。
　第５の改変フィブロインは、式１で表されるドメイン配列を含んでもよい。ドメイン配列のうち最もＣ末端側に位置する（Ａ）ｎモチーフからＣ末端までの配列を上記ドメイン配列から除いた配列（以下、「配列Ａ」ということがある。）において、ＲＥＰ中で連続する４アミノ酸残基の疎水性指標の平均値が２．６以上となる領域に含まれるアミノ酸残基の総数をｐとし、アミノ酸残基の総数をｑとしたときに、ｐ／ｑが６．２％以上であってもよい。
　ｐ／ｑの計算においては、配列Ａに含まれる全てのＲＥＰにおいて、連続する４アミノ酸残基の疎水性指標の平均値を算出する。疎水性指標の平均値は、連続する４アミノ酸残基に含まれる各アミノ酸残基のＨＩの総和を４（アミノ酸残基数）で除して求める。疎水性指標の平均値は、全ての連続する４アミノ酸残基について求める。次いで、連続する４アミノ酸残基の疎水性指標の平均値が２．６以上となる領域を特定する。あるアミノ酸残基が、複数の「疎水性指標の平均値が２．６以上となる連続する４アミノ酸残基」に該当する場合であっても、領域中には１アミノ酸残基として含まれることになる。当該領域に含まれるアミノ酸残基の総数がｐである。配列Ａに含まれるアミノ酸残基の総数がｑである。
　例えば、「疎水性指標の平均値が２．６以上となる連続する４アミノ酸残基」が２０カ所重複なく抽出された場合、連続する４アミノ酸残基の疎水性指標の平均値が２．６以上となる領域には、連続する４アミノ酸残基が重複なく２０含まれることになり、ｐは２０×４＝８０である。例えば、２つの「疎水性指標の平均値が２．６以上となる連続する４アミノ酸残基」が１アミノ酸残基だけ重複して存在する場合、連続する４アミノ酸残基の疎水性指標の平均値が２．６以上となる領域には、７アミノ酸残基含まれることになる（ｐ＝２×４－１＝７。「－１」は重複分の控除である。）。例えば、図５に示したドメイン配列の場合、「疎水性指標の平均値が２．６以上となる連続する４アミノ酸残基」が重複せずに７つ存在するため、ｐは７×４＝２８となる。また、ｑは４＋５０＋４＋４０＋４＋１０＋４＋２０＋４＋３０＝１７０である。ここで、Ｃ末端側の最後に存在する（Ａ）ｎモチーフは算入されない。次に、ｐをｑで除すことによって、ｐ／ｑ（％）を算出することができる。図５の場合２８／１７０＝１６．４７％となる。
　第５の改変フィブロインにおいて、ｐ／ｑは、６．２％以上、７％以、１０％以上、２０％以上で、又は３０％以上であってもよい。ｐ／ｑの上限は、特に制限されないが、例えば、４５％以下であってもよい。
　第５の改変フィブロインは、例えば、クローニングした天然フィブロインのアミノ酸配列を、上記のｐ／ｑの条件を満たすように、ＲＥＰ中の１又は複数の親水性アミノ酸残基（例えば、疎水性指標がマイナスであるアミノ酸残基）を疎水性アミノ酸残基（例えば、疎水性指標がプラスであるアミノ酸残基）に置換すること、及び／又はＲＥＰ中に１又は複数の疎水性アミノ酸残基を挿入することにより、局所的に疎水性指標の大きい領域を含むアミノ酸配列に改変することにより得ることができる。天然フィブロインのアミノ酸配列から上記のｐ／ｑの条件を満たすアミノ酸配列を設計し、設計したアミノ酸配列をコードする核酸を化学合成することにより第５の改変フィブロインを得ることもできる。天然フィブロインと比較して、ＲＥＰ中の１又は複数のアミノ酸残基が疎水性指標の大きいアミノ酸残基に置換されたこと、及び／又はＲＥＰ中に１又は複数の疎水性指標の大きいアミノ酸残基が挿入されたことに相当する改変に加え、更に１又は複数のアミノ酸残基を置換、欠失、挿入及び／又は付加したことに相当する改変を行ってもよい。
　第５の改変フィブロインのより具体例として、配列番号１９（Ｍｅｔ－ＰＲＴ７２０）、配列番号２０（Ｍｅｔ－ＰＲＴ６６５）若しくは配列番号２１（Ｍｅｔ－ＰＲＴ６６６）で示されるアミノ酸配列、又はこれらアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、改変フィブロインを挙げることができる。ここでの配列同一性は９５％以上であってもよい。配列番号１９で示されるアミノ酸配列は、配列番号７（Ｍｅｔ－ＰＲＴ４１０）で示されるアミノ酸配列に対し、Ｃ末端側の端末のドメイン配列を除いて、ＲＥＰ一つ置きにそれぞれ３アミノ酸残基からなるアミノ酸配列（ＶＬＩ）を２カ所挿入し、更に一部のグルタミン（Ｑ）残基をセリン（Ｓ）残基に置換し、かつＣ末端側の一部のアミノ酸を欠失させたものである。配列番号２０で示されるアミノ酸配列は、配列番号８（Ｍｅｔ－ＰＲＴ５２５）で示されるアミノ酸配列に対し、ＲＥＰ一つ置きにそれぞれ３アミノ酸残基からなるアミノ酸配列（ＶＬＩ）を１カ所挿入したものである。配列番号２１で示されるアミノ酸配列は、配列番号８で示されるアミノ酸配列に対し、ＲＥＰ一つ置きにそれぞれ３アミノ酸残基からなるアミノ酸配列（ＶＬＩ）を２カ所挿入したものである。
　配列番号１９、配列番号２０又は配列番号２１で示されるアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列において、ｐ／ｑが６．２％以上であってもよい。
　第５の改変フィブロインは、Ｎ末端、Ｃ末端又はこれらの両方に付加された上述のタグ配列を含んでいてもよい。
　タグ配列を含む改変フィブロインの具体例として、配列番号２２（ＰＲＴ７２０）、配列番号２３（ＰＲＴ６６５）若しくは配列番号２４（ＰＲＴ６６６）で示されるアミノ酸配列、又はこれらアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、改変フィブロインを挙げることができる。ここでの配列同一性は９５％以上であってもよい。配列番号２２、配列番号２３及び配列番号２４で示されるアミノ酸配列は、それぞれ配列番号１９、配列番号２０及び配列番号２１で示されるアミノ酸配列のＮ末端に配列番号１１で示されるアミノ酸配列（Ｈｉｓタグ配列及びヒンジ配列を含む）を付加したものである。
　配列番号２２、配列番号２３又は配列番号２４で示されるアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列において、ｐ／ｑが６．２％以上であってもよい。
　第５の改変フィブロインは、組換えタンパク質生産系において生産されたタンパク質を宿主の外部に放出するための分泌シグナルを含んでいてもよい。分泌シグナルの配列は、宿主の種類に応じて適宜設定することができる。
　第６の改変フィブロインは、天然フィブロインと比較して、グルタミン残基の含有量が低減されたアミノ酸配列を有する。
　第６の改変フィブロインのＲＥＰは、ＧＧＸモチーフ及びＧＰＧＸＸモチーフから選ばれる少なくとも一つのモチーフが含んでいてもよい。
　第６の改変フィブロインのＲＥＰがＧＰＧＸＸモチーフを含む場合、ＧＰＧＸＸモチーフ含有率は、１％以、５％以上、又は１０％以上であってもよい。ＧＰＧＸＸモチーフ含有率の上限に特に制限はなく、５０％以下であってよく、３０％以下であってもよい。
　本明細書において、「ＧＰＧＸＸモチーフ含有率」は、以下の方法により算出される値である。
　式１：［（Ａ）ｎモチーフ－ＲＥＰ］ｍ、又は式２：［（Ａ）ｎモチーフ－ＲＥＰ］ｍ－（Ａ）ｎモチーフで表されるドメイン配列のうち、最もＣ末端側に位置する（Ａ）ｎモチーフからＣ末端までの配列を除いた配列に含まれる全てのＲＥＰにおいて、ＧＰＧＸＸモチーフの個数の総数を３倍した数（即ち、ＧＰＧＸＸモチーフ中のＧ及びＰの総数に相当）をｓとし、（Ａ）ｎモチーフを除く全ＲＥＰのアミノ酸残基の総数をｔとしたときに、ＧＰＧＸＸモチーフ含有率はｓ／ｔとして算出される。
　ＧＰＧＸＸモチーフ含有率の算出において、「ドメイン配列のうち、最もＣ末端側に位置する（Ａ）ｎモチーフからドメイン配列のＣ末端までの配列を除いた配列」を対象としているのは、「最もＣ末端側に位置する（Ａ）ｎモチーフからＣ末端までの配列」（ＲＥＰに相当する配列）には、フィブロインに特徴的な配列と相関性の低い配列が含まれることがあり、ｍが小さい場合（つまり、ドメイン配列が短い場合）、ＧＰＧＸＸモチーフ含有率の算出結果に影響するので、この影響を排除するためである。ＲＥＰのＣ末端に「ＧＰＧＸＸモチーフ」が位置する場合、「ＸＸ」が例えば「ＡＡ」の場合であっても、「ＧＰＧＸＸモチーフ」として扱う。
　図６は、改変フィブロインのドメイン配列を示す模式図である。図６を参照しながらＧＰＧＸＸモチーフ含有率の算出方法を具体的に説明する。まず、図６に示した改変フィブロインのドメイン配列（「［（Ａ）ｎモチーフ－ＲＥＰ］ｍ－（Ａ）ｎモチーフ」タイプである。）では、全てのＲＥＰが「最もＣ末端側に位置する（Ａ）ｎモチーフからＣ末端までの配列をドメイン配列から除いた配列」（図６中、「領域Ａ」で示した配列。）に含まれているため、ｓを算出するためのＧＰＧＸＸモチーフの個数は７であり、ｓは７×３＝２１となる。同様に、全てのＲＥＰが「最もＣ末端側に位置する（Ａ）ｎモチーフからドメイン配列のＣ末端までの配列をドメイン配列から除いた配列」（図６中、「領域Ａ」で示した配列。）に含まれているため、当該配列から更に（Ａ）ｎモチーフを除いた全ＲＥＰのアミノ酸残基の総数ｔは５０＋４０＋１０＋２０＋３０＝１５０である。次に、ｓをｔで除すことによって、ｓ／ｔ（％）を算出することができ、図６の改変フィブロインの場合２１／１５０＝１４．０％となる。
　第６の改変フィブロインのグルタミン残基含有率が９％以下、７％以下、４％以下、又は０％であってもよい。
　本明細書において、「グルタミン残基含有率」は、以下の方法により算出される値である。
　式１：［（Ａ）ｎモチーフ－ＲＥＰ］ｍ、又は式２：［（Ａ）ｎモチーフ－ＲＥＰ］ｍ－（Ａ）ｎモチーフで表されるドメイン配列のうち、最もＣ末端側に位置する（Ａ）ｎモチーフからＣ末端までの配列を除いた配列（図６の「領域Ａ」に相当する配列）において、全てのＲＥＰに含まれるグルタミン残基の総数をｕとし、（Ａ）ｎモチーフを除いた全てのＲＥＰのアミノ酸残基の総数をｔとしたときに、グルタミン残基含有率はｕ／ｔとして算出される。
　第６の改変フィブロインは、天然フィブロインと比較して、ＲＥＰ中の１又は複数のグルタミン残基を欠失したこと、又は他のアミノ酸残基に置換したことに相当するドメイン配列を有していてもよい。
　「他のアミノ酸残基」は、グルタミン残基よりも疎水性指標の大きいアミノ酸残基であってもよい。アミノ酸残基の疎水性指標は表１に示すとおりである。疎水性指標の大きいアミノ酸残基が、イソロイシン（Ｉ）、バリン（Ｖ）、ロイシン（Ｌ）、フェニルアラニン（Ｆ）、システイン（Ｃ）、メチオニン（Ｍ）及びアラニン（Ａ）から選ばれるアミノ酸残基、又は、イソロイシン（Ｉ）、バリン（Ｖ）、ロイシン（Ｌ）及びフェニルアラニン（Ｆ）から選ばれるアミノ酸残基であってもよい。
　第６の改変フィブロインにおけるＲＥＰの疎水性度が、－０．８以上、－０．７以上、０以上で、０．３以上、又は０．４以上であってもよい。ＲＥＰの疎水性度の上限に特に制限はなく、１．０以下、又は０．７以下であってもよい。
　本明細書において、「ＲＥＰの疎水性度」は、以下の方法により算出される値である。
　式１：［（Ａ）ｎモチーフ－ＲＥＰ］ｍ、又は式２：［（Ａ）ｎモチーフ－ＲＥＰ］ｍ－（Ａ）ｎモチーフで表されるドメイン配列のうち、最もＣ末端側に位置する（Ａ）ｎモチーフからＣ末端までの配列を除いた配列（図６の「領域Ａ」に相当する配列。）において、全てのＲＥＰの各アミノ酸残基の疎水性指標の総和をｖとし、（Ａ）ｎモチーフを除いた全てのＲＥＰのアミノ酸残基の総数をｔとしたときに、ＲＥＰの疎水性度はｖ／ｔとして算出される。
　第６の改変フィブロインは、天然フィブロインと比較して、ＲＥＰ中の１又は複数のグルタミン残基を欠失したこと、及び／又はＲＥＰ中の１又は複数のグルタミン残基を他のアミノ酸残基に置換したことに相当する改変に加え、更に１又は複数のアミノ酸残基を置換、欠失、挿入及び／又は付加したことに相当する改変が行われたアミノ酸配列を有していてもよい。
　第６の改変フィブロインは、例えば、クローニングした天然フィブロインの遺伝子配列からＲＥＰ中の１又は複数のグルタミン残基を欠失させること、及び／又はＲＥＰ中の１又は複数のグルタミン残基を他のアミノ酸残基に置換することにより得ることができる。天然フィブロインのアミノ酸配列からＲＥＰ中の１又は複数のグルタミン残基を欠失したこと、及び／又はＲＥＰ中の１又は複数のグルタミン残基を他のアミノ酸残基に置換したことに相当するアミノ酸配列を設計し、設計したアミノ酸配列をコードする核酸を化学合成することにより第６の改変フィブロインを得ることもできる。
　第６の改変フィブロインの具体例として、配列番号２５（Ｍｅｔ－ＰＲＴ８８８）、配列番号２６（Ｍｅｔ－ＰＲＴ９６５）、配列番号２７（Ｍｅｔ－ＰＲＴ８８９）、配列番号２８（Ｍｅｔ－ＰＲＴ９１６）、配列番号２９（Ｍｅｔ－ＰＲＴ９１８）、配列番号３０（Ｍｅｔ－ＰＲＴ６９９）、配列番号３１（Ｍｅｔ－ＰＲＴ６９８）若しくは配列番号３２（Ｍｅｔ－ＰＲＴ９６６）で示されるアミノ酸配列、又はこれらアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む改変フィブロインを挙げることができる。ここでの配列同一性は９５％以上であってもよい。配列番号２５で示されるアミノ酸配列は、配列番号７で示されるアミノ酸配列（Ｍｅｔ－ＰＲＴ４１０）中のＱＱを全てＶＬに置換したものである。配列番号２６で示されるアミノ酸配列は、配列番号７で示されるアミノ酸配列中のＱＱを全てＴＳに置換し、かつ残りのＱをＡに置換したものである。配列番号２７で示されるアミノ酸配列は、配列番号７で示されるアミノ酸配列中のＱＱを全てＶＬに置換し、かつ残りのＱをＩに置換したものである。配列番号２８で示されるアミノ酸配列は、配列番号７で示されるアミノ酸配列中のＱＱを全てＶＩに置換し、かつ残りのＱをＬに置換したものである。配列番号２９で示されるアミノ酸配列は、配列番号７で示されるアミノ酸配列中のＱＱを全てＶＦに置換し、かつ残りのＱをＩに置換したものである。配列番号３０で示されるアミノ酸配列は、配列番号８で示されるアミノ酸配列（Ｍｅｔ－ＰＲＴ５２５）中のＱＱを全てＶＬに置換したものである。配列番号３１で示されるアミノ酸配列は、配列番号８で示されるアミノ酸配列中のＱＱを全てＶＬに置換し、かつ残りのＱをＩに置換したものである。配列番号３２で示されるアミノ酸配列は、配列番号７で示されるアミノ酸配列（Ｍｅｔ－ＰＲＴ４１０）中に存在する２０個のドメイン配列の領域を２回繰り返した配列中のＱＱを全てＶＦに置換し、かつ残りのＱをＩに置換したものである。配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１及び配列番号３２で示されるアミノ酸配列は、いずれもグルタミン残基含有率は９％以下である（表２）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１若しくは配列番号３２で示されるアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む改変フィブロインにおいて、グルタミン残基含有率が９％以下であってもよい。同改変フィブロインにおけるＧＰＧＸＸモチーフ含有率が１０％以上であってもよい。
　第６の改変フィブロインは、Ｎ末端、Ｃ末端又はこれらの両方に付加された上述のタグ配列を含んでいてもよい。これにより、改変フィブロインの単離、固定化、検出及び可視化等が可能となる。
　タグ配列を含む改変フィブロインのより具体例として、配列番号３３（ＰＲＴ８８８）、配列番号３４（ＰＲＴ９６５）、配列番号３５（ＰＲＴ８８９）、配列番号３６（ＰＲＴ９１６）、配列番号３７（ＰＲＴ９１８）、配列番号３８（ＰＲＴ６９９）、配列番号３９（ＰＲＴ６９８）若しくは配列番号４０（ＰＲＴ９６６）で示されるアミノ酸配列を含む改変フィブロイン、又はこれらアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む改変フィブロインを挙げることができる。ここでも配列同一性は９５％以上であってもよい。配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９又は配列番号４０で示されるアミノ酸配列は、それぞれ配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１又は配列番号３２で示されるアミノ酸配列のＮ末端に配列番号１１で示されるアミノ酸配列（Ｈｉｓタグ配列及びヒンジ配列を含む）を付加したものである。Ｎ末端にタグ配列を付加しただけであるため、グルタミン残基含有率に変化はなく、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９又は配列番号４０で示されるアミノ酸配列において、グルタミン残基含有率は９％以下である（表３）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
　配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９又は配列番号４０で示されるアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む改変フィブロインにおいて、グルタミン残基含有率が９％以下であってもよい。同改変フィブロインにおいて、ＧＰＧＸＸモチーフ含有率が１０％以上であってもよい。
　第６の改変フィブロインは、組換えタンパク質生産系において生産されたタンパク質を宿主の外部に放出するための分泌シグナルを含んでいてもよい。分泌シグナルの配列は、宿主の種類に応じて適宜設定することができる。
　改変フィブロインは、第１の改変フィブロイン、第２の改変フィブロイン、第３の改変フィブロイン、第４の改変フィブロイン、第５の改変フィブロイン、及び第６の改変フィブロインが有する特徴のうち、２つ以上の特徴を併せ持つ改変フィブロインであってもよい。
　改変フィブロインは、例えば、改変フィブロインをコードする核酸配列と、当該核酸配列に作動可能に連結された１又は複数の調節配列とを有する発現ベクターで形質転換された宿主により、当該核酸を発現させることにより生産することができる。宿主として、原核生物、並びに酵母、糸状真菌、昆虫細胞、動物細胞及び植物細胞等の真核生物のいずれも好適に用いることができる。
　以下、実施例を挙げて本発明についてさらに具体的に説明する。ただし、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
１．改変クモ糸フィブロインの製造
（１）プラスミド発現株の作製
　ネフィラ・クラビペス（Ｎｅｐｈｉｌａ　ｃｌａｖｉｐｅｓ）由来のフィブロイン（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：Ｐ４６８０４．１、ＧＩ：１１７４４１５）の塩基配列及びアミノ酸配列に基づき、配列番号１５で示されるアミノ酸配列を有する改変フィブロイン（以下、「ＰＲＴ７９９」ともいう。）を設計した。配列番号１５で示されるアミノ酸配列は、ネフィラ・クラビペス由来のフィブロインのアミノ酸配列に対して、生産性の向上を目的としてアミノ酸残基の置換、挿入及び欠失を施したアミノ酸配列と、そのＮ末端に付加された配列番号１１で示されるアミノ酸配列（タグ配列及びヒンジ配列）とを有する。また、配列番号４０で示されるアミノ酸配列を有する改変クモ糸フィブロイン（以下「ＰＲＴ９６６」ともいう。）も設計した。
　ＰＲＴ７９９又はＰＲＴ９６６をコードする核酸を合成した。この核酸の５’末端にＮｄｅＩサイトを付加し、この核酸の終止コドン下流にＥｃｏＲＩサイトを付加した。核酸をクローニングベクター（ｐＵＣ１１８）にクローニングした。その後、ＰＲＴ７９９又はＰＲＴ９６６をコードする核酸をＮｄｅＩ及びＥｃｏＲＩで制限酵素処理して切り出した。切り出された核酸をタンパク質発現ベクターｐＥＴ－２２ｂ（＋）に組換えて発現ベクターを得た。
（２）タンパク質の発現
　得られたｐＥＴ２２ｂ（＋）発現ベクターにより、大腸菌ＢＬＲ（ＤＥ３）を形質転換した。形質転換された大腸菌を、アンピシリンを含む２ｍＬのＬＢ培地で１５時間培養した。次いで、培養液を、アンピシリンを含む１００ｍＬの表４に示されるシード培養用培地に、ＯＤ６００が０．００５となるように添加した。培養液の温度を３０℃に保ち、ＯＤ６００が５になるまで、約１５時間かけてフラスコ培養を行い、シード培養液を得た。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
　得られたシード培養液を、５００ｍＬの表５に示される生産培地を添加したジャーファーメンターに、ＯＤ６００が０．０５となるように添加した。培養液の温度を３７℃に保ち、ｐＨ６．９で一定に制御して培養を行った。培養液中の溶存酸素濃度を、溶存酸素飽和濃度の２０％に維持した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
　生産培地中のグルコースが完全に消費された直後に、フィード液（グルコース４５５ｇ／１Ｌ、Ｙｅａｓｔ　Ｅｘｔｒａｃｔ　１２０ｇ／１Ｌ）を１ｍＬ／分の速度で添加した。添加後、培養液温度を３７℃に保ち、ｐＨ６．９で一定に制御して培養を２０時間継続した。培養液中の溶存酸素濃度を、溶存酸素飽和濃度の２０％に維持した。
　その後、培養液に対して、１Ｍのイソプロピル－β－チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を、終濃度１ｍＭになるよう添加し、目的のタンパク質を発現誘導した。ＩＰＴＧを添加してから２０時間経過した時点で、培養液を遠心分離し、菌体を回収した。ＩＰＴＧ添加前とＩＰＴＧ添加後の培養液から調製した菌体を用いてＳＤＳ－ＰＡＧＥを行い、ＩＰＴＧ添加に依存した目的とするクモ糸フィブロインサイズのバンドの出現により、目的とするクモ糸フィブロインの発現を確認した。
（３）タンパク質の精製
　回収した菌体を２０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．４）で洗浄した。洗浄後の菌体を約１ｍＭのＰＭＳＦを含む２０ｍＭＴｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．４）に懸濁させ、高圧ホモジナイザー（ＧＥＡ　Ｎｉｒｏ　Ｓｏａｖｉ社製）で細胞を破砕した。破砕した細胞を遠心分離し、沈殿物を得た。得られた沈殿物を、高純度になるまで２０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．４）で洗浄した。洗浄後の沈殿物を１００ｍｇ／ｍＬの濃度になるように８Ｍ　グアニジン緩衝液（８Ｍグアニジン塩酸塩、１０ｍＭリン酸二水素ナトリウム、２０ｍＭ　ＮａＣｌ、１ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ７．０）中に懸濁させた。懸濁液を６０℃で３０分間、スターラーで撹拌することにより、沈殿物を溶解させた。溶解後、透析チューブ（三光純薬株式会社製のセルロースチューブ３６／３２）を用いて水で透析を行った。透析後に得られた白色の凝集タンパク質を遠心分離により回収た。回収した凝集タンパク質から凍結乾燥機で水分を除くことにより、改変クモ糸フィブロイン「ＰＲＴ７９９」又は「ＰＲＴ９６６」の凍結乾燥粉末を得た。
２．改変クモ糸フィブロイン繊維の作製
（１）原着色素
　原着色素として、以下の材料を準備した。
プリン塩基化合物：
・ＤＮＡ：魚類精子由来のＤＮＡ
・ｄＡＭＰ：デオキシアデノシン一リン酸(abcam，純度：＞９８％）
・ｄＧＭＰ：２’－デオキシグアノシン５’－一リン酸ナトリウム水和物（SIGMA、純度：≧９９％（ＨＰＬＣ））
ピリミジン塩基化合物：
・ｄＴＭＰ：チミジン５’－一リン酸二ナトリウム水和物（sigma、純度；≧９９％）
・ｄＣＭＰ：２’－デオキシシチジン５’－一りん酸水和物（東京化成、純度：＞９８．０％（ＨＰＬＣ））
（２）ギ酸溶液の調製
　ギ酸（株式会社朝日化学工業所）に、各原着色素を添加して、原着色素のギ酸溶液を調整した。原着色素の濃度がギ酸溶液の全質量に対して１質量％又は５質量％である２種の溶液を調製した。得られたギ酸溶液から、ゴミ及び泡を取り除いた。
（３）ギ酸溶液の呈色試験
試験１
　ＤＮＡ、ｄＡＭＰ、ｄＴＭＰ、又はｄＣＭＰのギ酸溶液を、ターボサーモシェイカー（バイオメディカルサイエンス株式会社、BSR-TMS-200）を用いて、室温で２０００ｒｐｍで撹拌した。撹拌後の呈色の有無を目視で確認した。下記表６に示される呈色程度は、以下の基準で判定された結果である。
＋＋：濃い呈色
＋：薄い呈色
－：呈色無し
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000006
試験２
　ＤＮＡ、ｄＧＭＰ、又はｄＣＭＰのギ酸溶液を、ターボサーモシェイカー（バイオメディカルサイエンス株式会社、BSR-TMS-200）を用いて、室温で２０００ｒｐｍで撹拌した。撹拌後の各ギ酸溶液を、７０℃で１時間、加熱処理した。その後の呈色の有無を目視で確認した。試験１と同様の基準で呈色程度を評価した。結果を表７に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000007
試験３
　改変クモ糸フィブロイン「ＰＲＴ７９９」又は「ＰＲＴ９６６」の凍結乾燥粉末をギ酸中に懸濁させた。改変クモ糸フィブロインの量は、懸濁液の質量を基準として２６質量％とした。「ＰＲＴ７９９」又は「ＰＲＴ９６６」の懸濁液に、それぞれ原着色素としてのｄＡＭＰを溶解させた。ｄＡＭＰの量は、ドープ液中の改変クモ糸フィブロイン及びｄＡＭＰの合計質量に対し、１質量％とした。その後、シェーカーを用いて懸濁液を浸透することにより、改変クモ糸フィブロインを３時間かけて溶解させて、改変クモ糸フィブロイン及びｄＡＭＰを含むギ酸溶液を得た。得られたギ酸溶液を、７０℃で１時間、加熱処理した。加熱処理後のギ酸溶液は濃い茶色に呈色していた。
　試験１、２及び３から、プリン塩基化合物と酸化合物との組み合わせによる呈色が確認された。したがって、これらの組み合わせを含む成形用原液を用いることにより、原着タンパク質成形体を得ることができると考えられる。
（４）ドープ液の調整
　改変クモ糸フィブロイン「ＰＲＴ７９９」の凍結乾燥粉末をギ酸中に懸濁させた。改変クモ糸フィブロインの量は、懸濁液の質量を基準として２６質量％とした。この懸濁液に、原着色素としてのＤＮＡを溶解させた。ＤＮＡの量は、ドープ液中の改変クモ糸フィブロインの質量に対し、１質量％又は５質量％とした。その後、シェーカーを用いて懸濁液を浸透することにより、改変クモ糸フィブロインを３時間かけて溶解させて、ドープ液を得た。ドープ液中のゴミ及び泡を取り除いた。ドープ液の粘度は、６０℃において５０００ｃＰであった。改変クモ糸フィブロインを「ＰＲＴ７９９」から「ＰＲＴ９６６」に変更したこと以外はと同様にして、原着色素としてのＤＮＡと、改変クモ糸フィブロイン「ＰＲＴ９６６」とを含むドープ液を調製した。
（５）紡糸
　改変クモ糸フィブロイン及び原着色素を含むドープ液を、メタノールを含む凝固浴中に吐出することにより、紡糸した。紡糸により形成された繊維を延伸及び乾燥して、改変クモ糸フィブロイン繊維のフィラメントを得た。得られたフィラメントをボビンに巻き取った。比較のため、原着色素を含まないドープ液を用いて、同様に改変クモ糸フィブロイン（「ＰＲＴ７９９」又は「ＰＲＴ９６６」）の繊維を作製した。原着色素を含まないドープ液を用いて得た繊維が透明であったのに対して、原着色素としてＤＮＡを含むドープ液を用いて得た繊維は、灰色に呈色していた。
凝固浴温度：５～１０℃
延伸倍率：４．５２倍
乾燥温度：８０℃
　１…押出し装置、２…未延伸糸製造装置、３…湿熱延伸装置、４…乾燥装置、６…ドープ液、１０…紡糸装置、２０…凝固液槽、２１…延伸浴槽、３６…タンパク質繊維（又は原着タンパク質繊維）。

Claims (18)

  1. 　タンパク質と、プリン環を有するプリン塩基化合物及び／又はその分解物と、を含有する、タンパク質成形体。
  2. 　前記プリン塩基化合物が、ＤＮＡ、又はＤＮＡに由来する化合物である、請求項１に記載のタンパク質成形体。
  3. 　前記プリン塩基化合物の含有量及びその分解物の合計の含有量が、前記タンパク質の質量に対し、０．５質量％以上である、請求項１又は２に記載のタンパク質成形体。
  4. 　溶媒を更に含有する、請求項１～３のいずれか一項に記載のタンパク質成形体。
  5. 　前記溶媒が酸化合物を含む、請求項４に記載のタンパク質成形体。
  6. 　当該タンパク質成形体が繊維又はフィルムである、請求項１～５のいずれか一項に記載のタンパク質成形体。
  7. 　前記タンパク質が構造タンパク質である、請求項１～６のいずれか一項に記載のタンパク質成形体。
  8. 　前記構造タンパク質がクモ糸タンパク質を含む、請求項７に記載のタンパク質成形体。
  9. 　当該タンパク質成形体が、原着タンパク質成形体である、請求項１～８のいずれか一項に記載のタンパク質成形体。
  10. 　タンパク質と、プリン環を有するプリン塩基化合物と、を含有する、原着タンパク質成形体を得るための成形用原液。
  11. 　前記プリン塩基化合物が、ＤＮＡ、又はＤＮＡに由来する化合物である、請求項１０に記載の成形用原液。
  12. 　前記タンパク質がクモ糸タンパク質を含む構造タンパク質である、請求項１０又は１１に記載の成形用原液。
  13. 　原着タンパク質成形体を得るための成形用原液を製造する方法であって、
    　タンパク質を含む原料粉体、プリン環を有するプリン塩基化合物、及び溶媒を含有し、前記プリン塩基化合物が前記原料粉体中に含まれていてもよい、タンパク質含有液を準備することと、
    　前記タンパク質含有液中の前記タンパク質を前記溶媒に溶解させることと、を含み、
    　前記原料粉体が、前記タンパク質が発現した宿主若しくはその粉砕物である、又は、前記タンパク質及び前記プリン塩基化合物を含む粉体である、
    方法。
  14. 　前記溶媒が酸化合物を含む、請求項１３に記載の方法。
  15. 　前記タンパク質含有液を加熱することを更に含む、請求項１３又は１４に記載の方法。
  16. 　前記タンパク質がクモ糸タンパク質を含む構造タンパク質である、請求項１３～１５のいずれか一項に記載の方法。
  17. 　請求項１０～１２のいずれか一項に記載の成形用原液を用いた成形により、原着タンパク質成形体を形成することを含む、原着タンパク質成形体を製造する方法。
  18. 　プリン環を有するプリン塩基化合物を含む、タンパク質成形体用着色剤。
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112175061A (zh) * 2020-10-13 2021-01-05 广州今盛美精细化工有限公司 一种化妆品蚕丝蛋白提取设备

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS4832631B1 (ja) * 1970-09-09 1973-10-08
US20100031452A1 (en) * 2008-07-07 2010-02-11 Universite Catholique De Louvain Azo dyes
WO2014002605A1 (ja) * 2012-06-28 2014-01-03 スパイバー株式会社 原着タンパク質繊維及びその製造方法

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS4832631A (ja) * 1971-08-27 1973-05-01

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS4832631B1 (ja) * 1970-09-09 1973-10-08
US20100031452A1 (en) * 2008-07-07 2010-02-11 Universite Catholique De Louvain Azo dyes
WO2014002605A1 (ja) * 2012-06-28 2014-01-03 スパイバー株式会社 原着タンパク質繊維及びその製造方法

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
MOUNIR, A. I. SALEM ET AL.: "Synthesis of pharmacological dyes and their application on synthetic fabrics", COLORATION TECHNOLOGY, vol. 131, 2015, pages 288 - 297 *

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112175061A (zh) * 2020-10-13 2021-01-05 广州今盛美精细化工有限公司 一种化妆品蚕丝蛋白提取设备
CN112175061B (zh) * 2020-10-13 2021-06-25 广州今盛美精细化工有限公司 一种化妆品蚕丝蛋白提取设备

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