JPWO2017047504A1

JPWO2017047504A1 - モールド成形体及びモールド成形体の製造方法

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Publication number: JPWO2017047504A1
Application number: JP2017539870A
Authority: JP
Inventors: 潤一菅原; 香里関山; あゆみ安部; 潤一下方; 純一野場; 伸治平井
Original assignee: Spiber Inc
Current assignee: Spiber Inc
Priority date: 2015-09-18
Filing date: 2016-09-08
Publication date: 2018-07-05
Anticipated expiration: 2036-09-08
Also published as: WO2017047504A1; EP3351584B1; JP6830604B2; CN108137814B; CN108137814A; US10961285B2; EP3351584A1; US20190040109A1; EP3351584A4

Abstract

ポリペプチドを含む組成物のモールド成形体であって、前記ポリペプチドは、天然クモ糸タンパク質及び天然クモ糸タンパク質に由来するポリペプチドからなる群より選ばれる少なくとも１種である、モールド成形体を提供する。

Description

本発明は、モールド成形体及びモールド成形体の製造方法に関する。

軽量化、コストダウン、成形加工の容易化等を目的として、金属材料を有機材料で代替する試みがなされている。このような有機材料としては、樹脂の硬度の高いフェノール樹脂が用いられることが多く、曲げ弾性率や曲げ強度を更に上昇させるため、フェノール樹脂を含有するマトリックス樹脂に、フェノール樹脂繊維を添加する手法が知られている（例えば、特許文献１参照）。また、環境保全意識の高まりから、以前から脱石油材料であるバイオプラスチックが注目されているが、シルク粉末を樹脂化することで曲げ弾性率４．５ＧＰａの成形体を得られることが知られている（例えば、非特許文献１参照）。

特開２０１４−８０４９１号公報

平井伸治、月刊機能材料誌、２０１４年６月、「廃棄物由来動物タンパク質を用いた環境調和型シルクおよび羊毛樹脂」

しかしながら、特許文献１に開示されるような材料は、繊維を含有させて補強効果を発揮させるものであり、マトリックス樹脂自体で高強度を得ることは困難であった。また、生分解性材料により曲げ弾性率４．５ＧＰａを超える成形体を得ることはできなかった。

そこで、本発明の目的は、強化繊維等の添加材料を用いなくとも、優れた曲げ弾性率を発揮する生分解性の成形体及びその製造方法を提供することにある。

本発明は、ポリペプチドを含む組成物のモールド成形体であって、上記ポリペプチドは、天然クモ糸タンパク質及び天然クモ糸タンパク質に由来するポリペプチドからなる群より選ばれる少なくとも１種である、モールド成形体を提供する。

上記成形体は、生分解性を有しており、また天然クモ糸タンパク質及び／又は天然クモ糸タンパク質に由来するポリペプチドタンパク質を原料とすること、そして当該原料をモールド成形したものであることを特徴としており、これらの特徴に起因して、強化繊維等の添加材料を用いなくとも、非常に高い曲げ弾性率（例えば、４．５ＧＰａ超）を発揮する。更に、成形体に透明性を付与することも可能であることから、フェノール樹脂やポリエーテルエーテルケトン（ＰＥＥＫ）など、高強度でありながら透明性に欠ける樹脂に比較して、適用可能な用途が格段に増えるという利点がある。加えて、クモ糸タンパク質は種々の遺伝子改変が可能なことから、最終用途に合わせて性能の最適化を容易に図ることができる。なお、曲げ弾性率は、４．７ＧＰａ以上が好ましく、５．０ＧＰａ以上、更には５．２ＧＰａ以上がより好ましい。曲げ弾性率の上限について制限はないが、例えば、１５．０ＧＰａ以下とすることができる。曲げ弾性率は、１０．０ＧＰａ以下、更には７．０ＧＰａ以下とすることが可能である。

上記モールド成形体は、加熱加圧成形体として提供されてもよい。モールド成形体は、鋳型（モールド）で成形されたもの等を意味するが、加熱及び加圧を行うことにより、更に曲げ弾性率の優れた成形体となる。

上記モールド成形体は、天然クモ糸タンパク質及び天然クモ糸タンパク質に由来するポリペプチドからなる群より選ばれる少なくとも１種を含む組成物を、加熱及び加圧する工程を備える製造方法で製造可能である。

本発明によれば、強化繊維等の添加材料を用いなくとも、優れた曲げ弾性率を発揮する生分解性の成形体、及びその製造方法が提供される。

加圧成形機の模式断面図である。（ａ）は組成物導入前、（ｂ）は組成物導入直後、（ｃ）は組成物を加熱及び加圧している状態、の加圧成形機の模式断面図である。実施例１のモールド成形体の写真である。

以下、本発明の好適な実施形態について説明する。ただし、本発明は下記実施形態に何ら限定されるものではない。

実施形態に係るモールド成形体は、天然クモ糸タンパク質及び／又は天然クモ糸タンパク質に由来するポリペプチドを含む組成物からなるものである。モールド成形体は、鋳型（モールド）に上記組成物を導入し成形加工する等して得ることができ、成形加工の工程において、加熱及び／又は加圧することが可能である。組成物は、典型的には粉末状（凍結乾燥粉末等）又は繊維状（紡糸して得られる繊維等）の形状を有しており、モールド成形体は、そのような形状の天然クモ糸タンパク質及び／又は天然クモ糸タンパク質に由来するポリペプチドを含む組成物の融着体であり得る。

天然クモ糸タンパク質としては、例えば、大吐糸管しおり糸タンパク質、横糸タンパク質が挙げられる。

大吐糸管しおり糸タンパク質はクモの大瓶状線で産生されるものであり、強靭性に優れるという特徴を有する。大吐糸管しおり糸タンパク質としては、アメリカジョロウグモ（Ｎｅｐｈｉｌａｃｌａｖｉｐｅｓ）に由来する大瓶状線スピドロインＭａＳｐ１やＭａＳｐ２、ニワオニグモ（Ａｒａｎｅｕｓｄｉａｄｅｍａｔｕｓ）に由来するＡＤＦ３やＡＤＦ４などが挙げられる。

横糸タンパク質としては、クモの鞭毛状線（ｆｌａｇｅｌｌｉｆｏｒｍｇｌａｎｄ）で産生されるものであり、横糸タンパク質としては、例えばアメリカジョロウグモ（Ｎｅｐｈｉｌａｃｌａｖｉｐｅｓ）に由来する鞭毛状絹タンパク質（ｆｌａｇｅｌｌｉｆｏｒｍｓｉｌｋｐｒｏｔｅｉｎ）が含まれる。

天然クモ糸タンパク質に由来するポリペプチドとしては、組換えクモ糸タンパク質、例えば、天然型クモ糸タンパク質の変異体、類似体又は誘導体等が挙げられる。このようなポリペプチドとしては、大吐糸管しおり糸タンパク質の組換えクモ糸タンパク質が特に好適である。

モールド成形体は、天然クモ糸タンパク質及び／又は天然クモ糸タンパク質に由来するポリペプチド（以下、これらを併せて「クモ糸ポリペプチド」と総称する場合がある。）のみのモールド成形体であってもよいが、クモ糸ポリペプチドに添加成分（例えば、可塑剤、着色剤、層状ケイ酸塩や塩基性リン酸カルシウム等のフィラー、水分、合成樹脂等）を添加したもののモールド成形体であってもよい。可塑剤等の添加成分を用いる場合は、クモ糸ポリペプチドの合計量の５０質量％以下にすることが好ましい。また、他のタンパク質、例えば絹フィブロイン、大豆タンパク質、カゼイン、ケラチン、コラーゲン、乳清タンパク質や、ポリペプチドを得る過程で生じる夾雑物が含まれていてもよい。なお、モールド成形体は、上記の添加成分を含有させない場合であっても本発明の効果を奏する。

クモ糸ポリペプチドのモールド成形体は、透明性を有するものであることが好ましい。透明性は目視で判断可能であるが、光学透過率測定器を用い、例えば２２０〜８００ｎｍの波長範囲で０．１秒間の積算時間とした場合に、透過率が５０％以上であるものが好適である。

モールド成形体は、加圧成形機を用いて作製可能である。図１は、モールド成形体を製造するために用いることのできる加圧成形機の模式断面図である。図１に示す加圧成形機１０は、貫通孔が形成され加温可能な金型２と、金型２の貫通孔内で上下動が可能な上側ピン４及び下側ピン６とを備えるものであり、金型２に、上側ピン４又は下側ピン６を挿入して生じる空隙に、クモ糸ポリペプチドを含む組成物を導入して、金型２を加温しつつ、上側ピン４及び下側ピン６で組成物を圧縮することで、モールド成形体を得ることができる。

図２は、モールド成形体を得る工程図を示すものであり、（ａ）は組成物導入前、（ｂ）は組成物導入直後、（ｃ）は組成物を加熱及び加圧している状態の加圧成形機の模式断面図である。図２（ａ）に示すように、金型２の貫通孔に下側ピン６のみを挿入した状態で貫通孔内に組成物を導入し、図２（ｂ）に示すように、金型２の貫通孔に上側ピン４を挿入して下降させ、金型２の加熱を開始して、加熱加圧前の組成物８ａを貫通孔内で加熱加圧する。あらかじめ定めた加圧力に至るまで上側ピン４を下降させ、図２（ｃ）に示す状態で組成物が所定の温度に達するまで、加熱及び加圧を継続して、加熱加圧後の組成物８ｂを得る。その後、冷却器（例えばスポットクーラー）を用いて金型２の温度を下降させ、組成物８ｂが所定の温度になったところで、上側ピン４又は下側ピン６を金型２から抜き取り、内容物を取り出して、モールド成形体を得る。加圧に関しては、下側ピン６を固定した状態で上側ピン４を下降させて実施してもよいが、上側ピン４の下降と下側ピン６の上昇の両方を実施してもよい。

加熱は、８０〜３００℃で行うことが好ましく、１００〜１８０℃がより好ましく、１００〜１３０℃が更に好ましい。加圧は、５ｋＮ以上で行うことが好ましく、１０ｋＮ以上がより好ましく、２０ｋＮ以上が更に好ましい。また、所定の加熱加圧条件に達した後、その条件での処理を続ける時間（保温条件）は、０〜１００分が好ましく、１〜５０分がより好ましく５〜３０分が更に好ましい。

クモ糸ポリペプチドを含む組成物のモールド成形体は、天然クモ糸タンパク質に由来するポリペプチドを用いて作製することが好ましいことから、この製造方法について、以下詳述する。

クモ糸ポリペプチドを含む組成物のモールド成形体の原料となる、大吐糸管しおり糸タンパク質に由来するポリペプチドとしては、式１：ＲＥＰ１−ＲＥＰ２（１）で示されるアミノ酸配列の単位を２以上、好ましくは５以上、より好ましくは１０以上含むポリペプチドが挙げられる。或いは、大吐糸管しおり糸タンパク質に由来するポリペプチドは、式１：ＲＥＰ１−ＲＥＰ２（１）で示されるアミノ酸配列の単位を含み、かつＣ末端配列が配列番号１〜３のいずれかに示されるアミノ酸配列又は配列番号１〜３のいずれかに示されるアミノ酸配列と９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列であるポリペプチドであってもよい。なお、大吐糸管しおり糸タンパク質に由来するポリペプチドにおいて、式１：ＲＥＰ１−ＲＥＰ２（１）で示されるアミノ酸配列の単位は、同一であってもよく、異なっていてもよい。上記大吐糸管しおり糸タンパク質に由来するポリペプチドは、大腸菌等の微生物を宿主とした組み換えタンパク質生産を行う場合、生産性の観点から、分子量が５００ｋＤａ以下であることが好ましく、より好ましくは３００ｋＤａ以下であり、さらに好ましくは２００ｋＤａ以下である。

式１において、ＲＥＰ１は、ポリアラニンを意味している。ＲＥＰ１において、連続して並んでいるアラニンは、２残基以上であることが好ましく、より好ましくは３残基以上であり、さらに好ましくは４残基以上であり、特に好ましくは５残基以上である。また、ＲＥＰ１において、連続して並んでいるアラニンは、２０残基以下であることが好ましく、より好ましくは１６残基以下であり、さらに好ましくは１２残基以下であり、特に好ましくは１０残基以下である。式１において、ＲＥＰ２は、１０〜２００残基のアミノ酸からなるアミノ酸配列であり、アミノ酸配列中に含まれるグリシン、セリン、グルタミン及びアラニンの合計残基数がアミノ酸残基数全体に対して４０％以上、好ましくは６０％以上、より好ましくは７０％以上である。

大吐糸管しおり糸において、ＲＥＰ１は、繊維内で結晶βシートを形成する結晶領域に該当し、ＲＥＰ２は、繊維内でより柔軟性があり大部分が規則正しい構造を欠いている無定型領域に該当する。そして、［ＲＥＰ１−ＲＥＰ２］は、結晶領域と無定型領域からなる繰り返し領域（反復配列）に該当し、しおり糸タンパク質の特徴的配列である。

配列番号１に示されるアミノ酸配列は、ＡＤＦ３のアミノ酸配列（ＮＣＢＩアクセッション番号：ＡＡＣ４７０１０、ＧＩ：１２６３２８７）のＣ末端の５０残基のアミノ酸からなるアミノ酸配列と同一であり、配列番号２に示されるアミノ酸配列は、配列番号１に示されるアミノ酸配列のＣ末端から２０残基取り除いたアミノ酸配列と同一であり、配列番号３に示されるアミノ酸配列は、配列番号１に示されるアミノ酸配列のＣ末端から２９残基取り除いたアミノ酸配列と同一である。

式１：ＲＥＰ１−ＲＥＰ２（１）で示されるアミノ酸配列の単位を２以上含むポリペプチドとしては、例えば、配列番号７に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドを用いることができる。配列番号７に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドは、Ｎ末端に開始コドン、Ｈｉｓ１０タグ及びＨＲＶ３Ｃプロテアーゼ（Ｈｕｍａｎｒｈｉｎｏｖｉｒｕｓ３Ｃプロテアーゼ）認識サイトからなるアミノ酸配列（配列番号４）を付加したＡＤＦ３のアミノ酸配列（ＮＣＢＩアクセッション番号：ＡＡＣ４７０１０、ＧＩ：１２６３２８７）において、翻訳が第５４３番目アミノ酸残基で終止するように変異させたものである。

また、式１：ＲＥＰ１−ＲＥＰ２（１）で示されるアミノ酸配列の単位を２以上含むポリペプチドとしては、配列番号７に示されるアミノ酸配列において１又は複数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、結晶領域と無定型領域からなる繰り返し領域を有するタンパク質を用いることができる。本発明において、「１又は複数個」とは、例えば、１〜４０個、１〜３５個、１〜３０個、１〜２５個、１〜２０個、１〜１５個、１〜１０個、或は１又は数個を意味する。また、本発明において、「１又は数個」は、１〜９個、１〜８個、１〜７個、１〜６個、１〜５個、１〜４個、１〜３個、１〜２個、又は１個を意味する。

また、式１：ＲＥＰ１−ＲＥＰ２（１）で示されるアミノ酸配列の単位を２以上含むポリペプチドとしては、例えば、配列番号８に示されているアミノ酸配列を有する、ＡＤＦ４由来の組換えタンパク質が挙げられる。配列番号８に示されているアミノ酸配列は、ＮＣＢＩデータベースから入手したＡＤＦ４の部分的なアミノ酸配列（ＮＣＢＩアクセッション番号：ＡＡＣ４７０１１、ＧＩ：１２６３２８９）のＮ末端に開始コドン、Ｈｉｓ１０タグ及びＨＲＶ３Ｃプロテアーゼ（Ｈｕｍａｎｒｈｉｎｏｖｉｒｕｓ３Ｃプロテアーゼ）認識サイトからなるアミノ酸配列（配列番号４）を付加したものである。また、式１：ＲＥＰ１−ＲＥＰ２（１）で示されるアミノ酸配列の単位を２以上含むポリペプチドとしては、配列番号８に示されるアミノ酸配列において１又は複数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、結晶領域と無定型領域からなる繰り返し領域を有するポリペプチドを用いてもよい。また、式１：ＲＥＰ１−ＲＥＰ２（１）で示されるアミノ酸配列の単位を２以上含むポリペプチドとしては、例えば、配列番号９に示されているアミノ酸配列を有する、ＭａＳｐ２由来の組換えタンパク質が挙げられる。配列番号９に示されているアミノ酸配列は、ＮＣＢＩデータベースから入手したＭａＳｐ２の部分的な配列（ＮＣＢＩアクセッション番号：ＡＡＴ７５３１３、ＧＩ：５０３６３１４７）のＮ末端に開始コドン、Ｈｉｓ１０タグ及びＨＲＶ３Ｃプロテアーゼ（Ｈｕｍａｎｒｈｉｎｏｖｉｒｕｓ３Ｃプロテアーゼ）認識サイトからなるアミノ酸配列を付加したものである。また、式１：ＲＥＰ１−ＲＥＰ２（１）で示されるアミノ酸配列の単位を２以上含むポリペプチドとしては、配列番号９に示されるアミノ酸配列において１又は複数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、結晶領域と無定型領域からなる繰り返し領域を有するポリペプチドを用いてもよい。

横糸タンパク質に由来するポリペプチドとしては、式２：ＲＥＰ３（２）で示されるアミノ酸配列の単位を１０以上、好ましくは２０以上、より好ましくは３０以上含むポリペプチドが挙げられる。横糸タンパク質に由来するポリペプチドは、大腸菌等の微生物を宿主とした組み換えタンパク質生産を行う場合、生産性の観点から、分子量が５００ｋＤａ以下であることが好ましく、より好ましくは３００ｋＤａ以下であり、さらに好ましくは２００ｋＤａ以下である。

式（２）において、ＲＥＰ３はＧｌｙ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｘから構成されるアミノ酸配列を意味し、ＸはＡｌａ、Ｓｅｒ、Ｔｙｒ及びＶａｌからなる群から選ばれる一つのアミノ酸を意味する。

クモ糸において、横糸は結晶領域を持たず、無定形領域からなる繰り返し領域を持つことが大きな特徴である。大吐糸管しおり糸などにおいては結晶領域と無定形領域からなる繰り返し領域を持つため、高い応力と伸縮性を併せ持つと推測される。一方、横糸については、大吐糸管しおり糸に比べると応力は劣るが、高い伸縮性を持つ。これは横糸の大部分が無定形領域によって構成されているためだと考えられている。

式２：ＲＥＰ３（２）で示されるアミノ酸配列の単位を１０以上含むポリペプチドとしては、例えば、配列番号１０に示されるアミノ酸配列を有する、鞭毛状絹タンパク質由来の組換えタンパク質が挙げられる。配列番号１０に示されているアミノ酸配列は、ＮＣＢＩデータベースから入手したアメリカジョロウグモの鞭毛状絹タンパク質の部分配列（ＮＣＢＩアクセッション番号：ＡＡＦ３６０９０、ＧＩ：７１０６２２４）のリピート部分及びモチーフに該当するＮ末端から１２２０残基目から１６５９残基目までのアミノ酸配列（ＰＲ１配列と記す。）と、ＮＣＢＩデータベースから入手したアメリカジョロウグモの鞭毛状絹タンパク質の部分配列（ＮＣＢＩアクセッション番号：ＡＡＣ３８８４７、ＧＩ：２８３３６４９）のＣ末端から８１６残基目から９０７残基目までのＣ末端アミノ酸配列を結合し、結合した配列のＮ末端に開始コドン、Ｈｉｓ１０タグ及びＨＲＶ３Ｃプロテアーゼ認識サイトからなるアミノ酸配列（配列番号４）を付加したアミノ酸配列である。また、式２：ＲＥＰ３（２）で示されるアミノ酸配列の単位を１０以上含むポリペプチドとしては、配列番号１０に示されるアミノ酸配列において１又は複数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、無定形領域からなる繰り返し領域を有するポリペプチドを用いてもよい。

ポリペプチドは、ポリペプチドをコードする遺伝子を含有する発現ベクターで形質転換した宿主を用いて製造することができる。遺伝子の製造方法は特に制限されず、天然型クモ糸タンパク質をコードする遺伝子をクモ由来の細胞からポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）などで増幅しクローニングするか、若しくは化学的に合成する。遺伝子の化学的な合成方法も特に制限されず、例えば、ＮＣＢＩのウェブデータベースなどより入手した天然型クモ糸タンパク質のアミノ酸配列情報をもとに、ＡＫＴＡｏｌｉｇｏｐｉｌｏｔｐｌｕｓ１０／１００（ＧＥヘルスケア・ジャパン株式会社）などで自動合成したオリゴヌクレオチドをＰＣＲなどで連結して合成することができる。この際に、タンパク質の精製や確認を容易にするため、上記のアミノ酸配列のＮ末端に開始コドン及びＨｉｓ１０タグからなるアミノ酸配列を付加したアミノ酸配列からなるタンパク質、をコードする遺伝子を合成してもよい。

発現ベクターとしては、ＤＮＡ配列からタンパク質を発現し得るプラスミド、ファージ、ウイルスなどを用いることができる。プラスミド型発現ベクターとしては、宿主細胞内で目的の遺伝子が発現し、かつそれ自体が増幅することのできるものであればよく、特に限定されない。例えば宿主として大腸菌Ｒｏｓｅｔｔａ（ＤＥ３）を用いる場合は、ｐＥＴ２２ｂ（＋）プラスミドベクター、ｐＣｏｌｄプラスミドベクターなどを用いることができる。中でも、タンパク質の生産性の観点から、ｐＥＴ２２ｂ（＋）プラスミドベクターを用いることが好ましい。宿主としては、例えば動物細胞、植物細胞、微生物などを用いることができる。

本発明で使用するポリペプチドは、ニワオニグモ（Ａｒａｎｅｕｓｄｉａｄｅｍａｔｕｓ）の２つの主要なしおり糸タンパク質の一つであるＡＤＦ３由来のポリペプチドであることが好ましい。このポリペプチドは強伸度及びタフネスが基本的に高く、合成し易いことも利点として挙げられる。

以下、実施例により本発明を更に詳しく説明するが、本発明の技術思想を逸脱しない限り、本発明はこれらの実施例に制限されるものではない。

＜遺伝子合成＞
（１）ＡＤＦ３Ｋａｉの遺伝子の合成
ニワオニグモの２つの主要なしおり糸タンパク質の一つであるＡＤＦ３の部分的なアミノ酸配列（ＮＣＢＩアクセッション番号：ＡＡＣ４７０１０、ＧＩ：１２６３２８７）をＮＣＢＩのウェブデータベースより取得し、同配列のＮ末端に開始コドン及びＨｉｓ１０タグおよびＨＲＶ３Ｃプロテアーゼ（Ｈｕｍａｎｒｈｉｎｏｖｉｒｕｓ３Ｃプロテアーゼ）認識サイトからなる（配列番号４）を付加したアミノ酸配列（配列番号５）、をコードする遺伝子を、ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ社に合成受託した。その結果、配列番号６で示す塩基配列からなるＡＤＦ３Ｋａｉの遺伝子が導入されたｐＵＣ５７ベクター（遺伝子の５’末端直上流にＮｄｅＩサイト、及び５’末端直下流にＸｂａＩサイト有り）を取得した。その後、同遺伝子をＮｄｅＩ及びＥｃｏＲＩで制限酵素処理し、ｐＥＴ２２ｂ（＋）発現ベクターに組み換えた。

（２）ＡＤＦ３Ｋａｉ−ｎｏＮＲの遺伝子の合成
上記で得られたＡＤＦ３Ｋａｉの遺伝子が導入されたｐＥＴ２２ｂ（＋）ベクターを鋳型に、ＰｒｉｍｅＳｔａｒＭｕｔａｇｅｎｅｓｉｓＢａｓａｌＫｉｔ（タカラバイオ株式会社製）を用いた部位特異的変異導入により、ＡＤＦ３Ｋａｉのアミノ酸配列（配列番号５）における第５４３番目のアミノ酸残基バリン（Ｖａｌ）に対応するコドンＧＴＧを終止コドンＴＡＡに変異させ、配列番号１１に示すＡＤＦ３Ｋａｉ−ｎｏＮＲの遺伝子をｐＥＴ２２ｂ（＋）上に構築した。変異の導入の正確性については、３１３０ｘｌＧｅｎｅｔｉｃＡｎａｌｙｚｅｒ（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いたシーケンス反応により確認した。なお、ＡＤＦ３Ｋａｉ−ｎｏＮＲのアミノ酸配列は配列番号７で示すとおりである。

＜タンパク質の発現＞
上記で得られたＡＤＦ３Ｋａｉ−ｎｏＮＲの遺伝子配列を含むｐＥＴ２２ｂ（＋）発現ベクターを、大腸菌Ｒｏｓｅｔｔａ（ＤＥ３）に形質転換した。得られたシングルコロニーを、アンピシリンを含む２ｍＬのＬＢ培地で１５時間培養後、同培養液１．４ｍＬを、アンピシリンを含む１４０ｍＬのＬＢ培地に添加し、３７℃、２００ｒｐｍの条件下で、培養液のＯＤ_６００が３．５になるまで培養した。次に、ＯＤ_６００が３．５の培養液を、アンピシリンを含む７Ｌの２×ＹＴ培地に５０％グルコース１４０ｍＬと共に加え、ＯＤ_６００が４．０になるまでさらに培養した。その後、得られたＯＤ_６００が４．０の培養液に、終濃度が０．５ｍＭになるようにイソプロピル−β−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を添加してタンパク質発現を誘導した。ＩＰＴＧ添加後２時間経過した時点で、培養液を遠心分離し、菌体を回収した。ＩＰＴＧ添加前とＩＰＴＧ添加後の培養液から調製したタンパク質溶液をポリアクリルアミドゲルに泳動させたところ、ＩＰＴＧ添加に依存して目的サイズのバンドが観察され、目的とするタンパク質が発現していることを確認した。ＡＤＦ３Ｋａｉ−ｎｏＮＲのタンパク質を発現している大腸菌を冷凍庫（−２０℃）で保存した。

＜ポリペプチド調製例＞
（Ｉ）遠沈管（５０ｍＬ）に、ＡＤＦ３Ｋａｉ−ｎｏＮＲのタンパク質を発現している大腸菌の菌体約４．５ｇと、緩衝液ＡＩ（２０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．４）３０ｍｌを添加し、ミキサー（ＧＥ社製、ＳＩ−０２８６、レベル１０）で菌体を分散させた後、遠心分離機（トミー精工製、ＭＸ−３０５）で遠心分離（１０，０００ｒｐｍ、１０分、室温）し、上清を捨てた。
（ＩＩ）遠心分離で得られた沈殿物（菌体）に緩衝液ＡＩを３０ｍＬと、０．１ＭのＰＭＳＦ（イソプロパノールで溶解）を０．３ｍＬ添加し、上記ＧＥ社製のミキサー（レベル１０）で３分間分散させた。その後、超音波破砕機（ＳＯＮＩＣ＆ＭＡＴＥＲＩＡＬＳＩＮＣ製、ＶＣＸ５００）を用いて菌体を破砕し、遠心分離（１０，０００ｒｐｍ、１０分、室温）した。
（ＩＩＩ）遠心分離で得られた沈殿物に緩衝液ＡＩを３０ｍＬ加え、ミキサー（ＩＫＡ社製、Ｔ１８ベーシックウルトラタラックス、レベル２）で３分間分散させた後、上記トミー精工製の遠心分離機で遠心分離（１０，０００ｒｐｍ、１０分、室温）し、上清を除去した。
（ＩＶ）上清を捨てた遠沈管に７．５Ｍの尿素緩衝液Ｉ（７．５Ｍ尿素、１０ｍＭリン酸二水素ナトリウム、２０ｍＭＮａＣｌ、１ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．０）を加え、上記ＳＭＴ社製の超音波破砕機（レベル７）で沈殿を良く分散させた。その後、上記タイテック社製のシェイカー（２００ｒｐｍ、６０℃）で１２０分間溶解させた。溶解後のタンパク質溶液を上記トミー精工製の遠心分離機で遠心分離（１１，０００×ｇ、１０分、室温）し、上清を透析チューブ（三光純薬株式会社製、セルロースチューブ３６／３２）を用いて水で透析を行った。透析後に得られた白色の凝集タンパク質を遠心分離により回収し、凍結乾燥機で水分をのぞき、凍結乾燥粉末を回収した。得られた凍結乾燥粉末における目的タンパク質ＡＤＦ３Ｋａｉ−ｎｏＮＲの精製度は、粉末のポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＣＢＢ染色）の結果をＴｏｔａｌｌａｂ（ｎｏｎｌｉｎｅａｒｄｙｎａｍｉｃｓｌｔｄ．）を用いて画像解析することにより確認した。その結果、ＡＤＦ３Ｋａｉ−ｎｏＮＲの精製度は約８５％であった。

（実施例１）
＜モールド成形体の作製方法＞
上記「ポリペプチド調製例」で得られた凍結乾燥粉末（以下「サンプル」という。）を１．３５ｇ量り取り、このサンプルを図１に示す加圧成形機１０の金型２（円柱形状の金型であり、断面が３５ｍｍ×１５ｍｍの長方形状の貫通孔を有している。）の貫通孔内に導入した。この際、厚みが均等になるようにサンプルを加えていった。全てのサンプルを導入した後、金型２の加熱を開始するとともに、ハンドプレス機（ＮＰａシステム株式会社製、ＮＴ−１００Ｈ−Ｖ０９）を用いて、上側ピン４と下側ピン６を貫通孔内に挿入することでサンプルの加圧を行った。この際、サンプルの加圧条件が４０ｋＮとなるように制御した。サンプルの温度が２００℃になったところで加熱を中止し、スポットクーラー（トラスコ中山株式会社製、ＴＳ−２５ＥＰ−１）で冷却して、サンプルの温度が５０℃になったところで取り出し、バリ取りを行った後、３５ｍｍ×１５ｍｍ×２ｍｍの直方体形状のモールド成形体を得た。
実施例１では、サンプルの温度が２００℃になったところで加熱を中止し、スポットクーラーで冷却して、サンプルの温度が５０℃になったところで取り出した。すなわち加熱温度（Ｘ）は２００℃であり、加熱温度に到達した直後に急冷を開始したためアニール時間（Ｙ）は０分であった。

（実施例２）
加熱温度（Ｘ）を１００℃、及びアニール時間（Ｙ）３０分、加圧条件を３０ｋＮにした他は、実施例１と同様にしてモールド成形体を得た。

＜曲げ弾性率及び曲げ強度測定方法＞
得られたモールド成形体については、恒温恒湿槽（ｅｓｐｅｃ社製、ＬＨＬ−１１３）で２０℃／６５％の条件下で１日静置した後、以下の測定を行った。
すなわち、オートグラフ（島津製作所株式会社製、ＡＧ−Ｘｐｌｕｓ）にて籠治具を用いて、三点曲げ試験を行った。使用したロードセルは５０ｋＮであった。この際、三点曲げの支点間距離を２７ｍｍに固定し、測定速度を１ｍｍ／分とした。また、モールド成形体のサイズをマイクロノギスで測定し、治具に設置し測定を行った。曲げ弾性率は０．０５〜０．２５％までの変位（ひずみ）から求めた。

＜透明性測定方法＞
得られたモールド成形体について、厚さ方向（２ｍｍ厚）の透明性を目視で測定し、透明性がある場合を○、ない場合を×とした。すなわち、モールド成形体をＳｐｉｂｅｒ社のロゴが印刷された紙の上に載せ、ロゴが見えるかどうかで透明性を確認した。

（比較例１〜４）
ポリエーテルエーテルケトン（ＰＥＥＫ）、ポリカーボネート（ＰＣ）、ポリメタクリル酸メチル（ＰＭＭＡ）、ＡＢＳ樹脂（ＡＢＳ）を用いて、実施例１と同様にして３５ｍｍ×１５ｍｍ×２ｍｍの直方体形状の成形体を得た。これらの成形体について、恒温恒湿槽（ｅｓｐｅｃ社製、ＬＨＬ−１１３）で２０℃／６５％の条件下で１日静置した後、実施例１と同様に、曲げ弾性率、曲げ強度及び透明性を測定した。

実施例と比較例の結果をまとめて、以下の表１に示す。実施例１の透明性を評価したときのモールド成形体の写真を図３に示す。

（実施例２〜１７）
加熱温度（Ｘ）及びアニール時間（Ｙ）を以下の表２の通り変化させ、加圧条件を３０ｋＮにした他は、実施例１と同様にしてモールド成形体を得た。

（実施例１８〜２３）
加熱温度（Ｘ）、アニール時間（Ｙ）及び加圧条件を以下の表３の通りにした他は、実施例１と同様にしてモールド成形体を得た。

実施例５〜７、１６〜１７について実施例１と同様にして曲げ弾性率及び曲げ強度を測定し、表４にまとめた。

２…金型、４…上側ピン、６…下側ピン、８ａ…加熱加圧前の組成物、８ｂ…加熱加圧後の組成物、１０…加圧成形機。

Claims

ポリペプチドを含む組成物のモールド成形体であって、
前記ポリペプチドは、天然クモ糸タンパク質及び天然クモ糸タンパク質に由来するポリペプチドからなる群より選ばれる少なくとも１種である、モールド成形体。
前記モールド成形体は、曲げ弾性率が４．５ＧＰａを超えている成形体である、請求項１に記載のモールド成形体。
前記モールド成形体は、加熱加圧成形体である、請求項１又は２に記載のモールド成形体。
天然クモ糸タンパク質及び天然クモ糸タンパク質に由来するポリペプチドからなる群より選ばれる少なくとも１種を含む組成物を、加熱及び加圧する工程を備える、モールド成形体の製造方法。