JP2021008414A - タンパク質層接合体 - Google Patents
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Abstract
Description
[1] 第1のタンパク質樹脂層と、第2のタンパク質樹脂層と、第1及び第2のタンパク質樹脂層の間に介在する中間層と、を備える、タンパク質層接合体であって、中間層がタンパク質層である、タンパク質層接合体。
[2] [1]に記載のタンパク質層接合体を製造する方法であって、
第1のタンパク質を樹脂化して、第1のタンパク質樹脂層を形成する工程と、
第2のタンパク質を樹脂化して、第2のタンパク質樹脂層を形成する工程と、
第3のタンパク質を含む中間層前駆体が第1及び第2のタンパク質樹脂層に挟まれるように、第1及び第2のタンパク質樹脂層並びに中間層前駆体を配置し、その後、加熱加圧する工程と、を備える、タンパク質層接合体の製造方法。
[3] 中間体前駆体が、固体状である、[2]に記載の方法。
[4] 中間層前駆体が、粉末、フィルム、シート及び繊維のいずれか1つの形態である、[3]に記載の方法。
[5] 第1のタンパク質樹脂層を形成する工程が、樹脂化された第1のタンパク質を塑性加工する工程を含む、[2]〜[4]のいずれかに記載の方法。
[6] 第2のタンパク質樹脂層を形成する工程が、樹脂化された第2のタンパク質を塑性加工する工程を含む、[2]〜[5]のいずれかに記載の方法。
[7] 第1のタンパク質、第2のタンパク質及び第3のタンパク質のうちの少なくとも1つが、天然クモ糸タンパク又は天然クモ糸タンパクから誘導される組換えポリペプチドである、[2]〜[6]のいずれかに記載の方法。
[8] 第1のタンパク質、第2のタンパク質及び第3のタンパク質が、それぞれ独立に、天然クモ糸タンパク又は天然クモ糸タンパクから誘導される組換えポリペプチドである、[2]〜[7]のいずれかに記載の方法。
タンパク質樹脂層及び中間層前駆体に含まれるタンパク質は、構造タンパク質又はこれから誘導される組換えポリペプチドであってもよい。構造タンパク質は、生体構造を構築する役割を有するタンパク質であり、酵素、ホルモン、抗体等の機能タンパク質とは異なる。具体的には、フィブロイン(例えば、クモ糸フィブロイン、絹糸フィブロイン等)、コラーゲン、レシリン、エラスチン及びケラチン、並びにこれらに由来するタンパク質等を挙げることができる。タンパク質は、天然由来のものでもよく、人為的に製造された人造タンパク質であってもよい。また、人造タンパク質のアミノ酸配列は、天然由来のタンパク質のアミノ酸配列と同一でも異なっていてもよい。
式1:[(A)nモチーフ−REP]m、又は式2:[(A)nモチーフ−REP]m−(A)nモチーフで表されるドメイン配列を含むクモ糸フィブロインにおいて、最もC末端側に位置する(A)nモチーフからドメイン配列のC末端までの配列をドメイン配列から除いた配列に含まれる全てのREPにおいて、その領域に含まれるGPGXXモチーフの個数の総数を3倍した数(即ち、GPGXXモチーフ中のG及びPの総数に相当)をsとし、最もC末端側に位置する(A)nモチーフからドメイン配列のC末端までの配列をドメイン配列から除き、更に(A)nモチーフを除いた全REPのアミノ酸残基の総数をtとしたときに、GPGXXモチーフ含有率はs/tとして算出される。
式1:[(A)nモチーフ−REP]m、又は式2:[(A)nモチーフ−REP]m−(A)nモチーフで表されるドメイン配列を含むクモ糸フィブロインにおいて、最もC末端側に位置する(A)nモチーフからドメイン配列のC末端までの配列をドメイン配列から除いた配列(図4の「領域A」に相当する配列。)に含まれる全てのREPにおいて、その領域に含まれるグルタミン残基の総数をuとし、最もC末端側に位置する(A)nモチーフからドメイン配列のC末端までの配列をドメイン配列から除き、更に(A)nモチーフを除いた全REPのアミノ酸残基の総数をtとしたときに、グルタミン残基含有率はu/tとして算出される。グルタミン残基含有率の算出において、「最もC末端側に位置する(A)nモチーフからドメイン配列のC末端までの配列をドメイン配列から除いた配列」を対象としている理由は、上述した理由と同様である。
式1:[(A)nモチーフ−REP]m、又は式2:[(A)nモチーフ−REP]m−(A)nモチーフで表されるドメイン配列を含むクモ糸フィブロインにおいて、最もC末端側に位置する(A)nモチーフからドメイン配列のC末端までの配列をドメイン配列から除いた配列(図4の「領域A」に相当する配列。)に含まれる全てのREPにおいて、その領域の各アミノ酸残基の疎水性指標の総和をvとし、最もC末端側に位置する(A)nモチーフからドメイン配列のC末端までの配列をドメイン配列から除き、更に(A)nモチーフを除いた全REPのアミノ酸残基の総数をtとしたときに、REPの疎水性度はv/tとして算出される。REPの疎水性度の算出において、「最もC末端側に位置する(A)nモチーフからドメイン配列のC末端までの配列をドメイン配列から除いた配列」を対象としている理由は、上述した理由と同様である。
ステップS01では、以下の手順にしたがい、組換えポリペプチドを調製する。
組換えポリペプチドの製造方法について、以下に詳述する。目的とする組換えポリペプチドは、例えば、構造タンパク質をコードする遺伝子配列と、当該遺伝子配列に作動可能に連結された1又は複数の調節配列とを有する発現ベクターで形質転換された宿主により、当該遺伝子を発現させることにより生産することができる。
ステップS02では、タンパク質を含む組成物を金型(モールド)に導入し、成形加工して、タンパク質樹脂体(モールド成形体)を得る。この成形加工において、組成物を加熱および/または加圧してもよい。
ステップS03では、ステップS02とステップS04の間(ステップS04の前)に、必要に応じて、タンパク質樹脂体を乾燥する。その場合、乾燥は、真空中及び/又は100℃の環境下に30分から3日間静置することが好ましい。ステップS02の前に水を加えた場合、乾燥は、真空中及び/又は100℃の環境下に1分から10日間静置することが好ましい。
ステップS04では、ステップS03で得られるタンパク質樹脂体に圧力をかけて塑性加工する。塑性加工は、材料に力を加えて変形させ、材料の塑性を利用して、材料を所定の形状又は寸法に成形する方法であり、たとえば、自由鍛造、型鍛造、圧延加工等が挙げられる。ステップS04では、たとえば2本の円筒状のロールを有する延伸機が用いられる。ステップS04では、たとえば2本のロールでタンパク質樹脂体(モールド成形体)を挟み込んで圧力を加えつつ、2本のロールをそれぞれ回転させて送り出す(圧延)。これにより、タンパク質樹脂体の全体を圧延する。1回のみの圧延を行ってもよいが、複数回の圧延を行ってもよい。すなわち、ステップS04を複数回繰り返してもよい。ステップS04は、タンパク質樹脂体を加熱することなく行われてもよい。一方、ステップS04において、タンパク質樹脂体を加熱してもよい。その場合、加熱延伸機(圧延ローラ)が用いられ得る。延伸機は、手動でローラを回転させる形式であってもよく、電動等の自動でローラを回転させる形式であってもよい。延伸機における送出し速度は、任意に調整可能である。加熱延伸機が用いられる場合、たとえばローラにヒータが内蔵される。ローラの温度は、任意に調整可能である。
圧下率(%)=[圧延前のタンパク質樹脂体の厚さh1−圧延後のタンパク質樹脂体の厚さh2]/[圧延前のタンパク質樹脂体の厚さh1]。
ステップS05では、ステップS04の後に、必要に応じて、タンパク質樹脂体を乾燥する。その場合、乾燥は、真空中及び/又は100℃の環境下に30分から3日間静置することが好ましい。
ステップS06では、まず、第3のタンパク質を含む中間層前駆体が第1及び第2のタンパク質樹脂層に挟まれるように、第1及び第2のタンパク質樹脂層並びに中間層前駆体を配置したアセンブリを得る。その後、当該アセンブリを加熱加圧する。
(1)構造タンパク質発現株の作製
ネフィラ・クラビペス(Nephila clavipes)由来のフィブロイン(GenBankアクセッション番号:P46804.1、GI:1174415)の塩基配列及びアミノ酸配列をGenBankのウェブデータベースより取得した後、生産性の向上を目的としてアミノ酸残基の置換、挿入及び欠失を施し、さらにN末端に配列番号12で示されるアミノ酸配列(タグ配列及びヒンジ配列)を付加して、配列番号45で示されるアミノ酸配列を有する組換えフィブロイン(以下、「PRT587」ともいう。)を設計した。
上記で得られたPRT587をコードする遺伝子を含むpET22b(+)発現ベクターで、大腸菌BLR(DE3)を形質転換した。形質転換された大腸菌を、アンピシリンを含む2mLのLB培地で15時間培養後、同培養液を、表4に示すシード培養用培地100mLに、OD600が0.005となるように添加した。培養液の温度を30℃に保ち、OD600が5になるまでフラスコにて、さらに約15時間培養を行い、シード培養液を得た。
IPTGを添加してから2時間後に回収した菌体を20mM Tris−HCl緩衝液(pH7.4)で洗浄した。洗浄後の菌体を約1mMのフェニルメチルスルホニルフルオリド(PMSF)を含む20mM Tris−HCl緩衝液(pH7.4)に懸濁させ、高圧ホモジナイザー(GEA Niro Soavi社)で細胞を破砕した。破砕した細胞を遠心分離し、沈殿物を得た。得られた沈殿物を、高純度になるまで20mM Tris−HCl緩衝液(pH7.4)で洗浄した。洗浄後の沈殿物を100mg/mLの濃度になるように8M グアニジン緩衝液(8Mグアニジン塩酸塩、10mMリン酸二水素ナトリウム、20mM NaCl、1mM Tris−HCl、pH7.0)で懸濁し、60℃で30分間、スターラーで撹拌し、溶解させた。溶解後、透析チューブ(三光純薬株式会社製のセルロースチューブ36/32)を用いて水で透析を行った。透析後に得られた白色の凝集タンパク質を遠心分離により回収し、凍結乾燥機で水分を除き、凍結乾燥粉末を回収した。
上記で得られた人工クモ糸粉末(水分含有量:7.64%)をステンレス製治具に充填し、ホットプレス機を用いて温度150℃、圧力50MPaで5分間、加熱および加圧を行い、タンパク質樹脂体を得た。タンパク質樹脂体の形状は、25mm×35mm×1.0mmの直方体であった。
得られたタンパク質樹脂体を、第1及び第2のタンパク質樹脂層として使用し、中間層前駆体として、PRT587の凍結乾燥粉末を使用した。具体的には、25mm×35mmの金型にタンパク質樹脂体(PRT587)を投入し、その上に中間層前駆体(PRT587の粉末、0.1g)を撒き、その後でもう1つのタンパク質樹脂体(PRT587)を投入した。金型を150℃、15MPaで5分間、加熱および加圧を行い、タンパク質層接合体を得た。
上記で得られた人工クモ糸粉末(水分含有量:7.91%)をステンレス製治具に充填し、ホットプレス機を用いて温度150℃、圧力50MPaで5分間、加熱および加圧を行い、タンパク質樹脂体を得た。タンパク質樹脂体の形状は、60mm×180mm×3.5mmの直方体であった。
得られたタンパク質樹脂体を、温度180℃、圧延速度0.1m/min、ローラ荷重5.0kN、ギャップ0.75mmの条件で、圧延処理した。圧延後の樹脂体の厚さは、1mmであった。圧延後の樹脂体を25mm×35mm×1mmとなるように、ダイヤモンドカッターを用いて、裁断した。圧延後の樹脂体を用いた他は、実施例1と同様にして、タンパク質層接合体を得た。
上記で得られた人工クモ糸粉末(水分含有量:7.64%)をステンレス製治具に充填し、ホットプレス機を用いて温度150℃、圧力50MPaで5分間、加熱および加圧を行い、タンパク質樹脂体を得た。タンパク質樹脂体の形状は、25mm×35mm×2.0mmの直方体であった。
上記で得られた人工クモ糸粉末(水分含有量:7.50%)をステンレス製治具に充填し、ホットプレス機を用いて温度150℃、圧力50MPaで5分間、加熱および加圧を行い、タンパク質樹脂体を得た。タンパク質樹脂体の形状は、25mm×35mm×3.5mmの直方体であった。
得られたタンパク質樹脂体を、温度180℃、圧延速度0.03m/min、ローラ荷重5.0kN、ギャップ0.75mmの条件で、圧延処理した。圧延後の樹脂体の厚さは、1mmであった。圧延後の樹脂体を25mm×35mm×1mmとなるように、ダイヤモンドカッターを用いて、裁断した。
上記で得られた人工クモ糸粉末(水分含有量:7.91%)をステンレス製治具に充填し、ホットプレス機を用いて温度150℃、圧力50MPaで5分間、加熱および加圧を行い、タンパク質樹脂体を得た。タンパク質樹脂体の形状は、60mm×180mm×3.5mmの直方体であった。
得られたタンパク質樹脂体を、温度180℃、圧延速度0.1m/min、ローラ荷重5.0kN、ギャップ0.75mmの条件で、圧延処理した。圧延後の樹脂体の厚さは、1mmであった。圧延後の樹脂体を25mm×35mm×1mmとなるように、ダイヤモンドカッターを用いて、裁断した。
25mm×35mmの金型にタンパク質樹脂体(PRT587)を投入し、その表面上にPRT799溶液(PRT799:1g、エタノール:2.475g、グリシン:0.75g、水:5.775g)10gを刷毛で塗布した。その後、もう1つのタンパク質樹脂体(PRT587)を投入した。金型を150℃、15MPaで5分間、加熱および加圧を行い、圧力を維持したまま徐々に温度を下げて、中間層が固まるまで放置することにより、タンパク質層接合体を得た。
上記で得られた人工クモ糸粉末(水分含有量:7.91%)をステンレス製治具に充填し、ホットプレス機を用いて温度150℃、圧力50MPaで5分間、加熱および加圧を行い、タンパク質樹脂体を得た。タンパク質樹脂体の形状は、60mm×180mm×3.5mmの直方体であった。
得られたタンパク質樹脂体を、温度180℃、圧延速度0.03m/min、ローラ荷重5.0kN、ギャップ0.75mmの条件で、圧延処理した。圧延後の樹脂体の厚さは、1mmであった。圧延後の樹脂体を25mm×35mm×1mmとなるように、ダイヤモンドカッターを用いて、裁断した。
中間層前駆体の使用に代えて、タンパク質樹脂体を加湿処理(相対湿度93%RHの環境のチャンバー内に7時間静置する)した他は、実施例2と同様にして、タンパク質層接合体を得た。
切り出した試験片に対し、卓上形精密万能試験機(株式会社島津製作所製、オートグラフAGS−X 1kN)を用いて三点曲げ試験を行い、曲げ強度及び曲げ弾性率を測定した。測定条件は、支点間距離14mm、試験速度1mm/minとした。
Claims (8)
- 第1のタンパク質樹脂層と、第2のタンパク質樹脂層と、第1及び第2のタンパク質樹脂層の間に介在する中間層と、を備える、タンパク質層接合体であって、
前記中間層がタンパク質層である、タンパク質層接合体。 - 請求項1に記載のタンパク質層接合体を製造する方法であって、
第1のタンパク質を樹脂化して、第1のタンパク質樹脂層を形成する工程と、
第2のタンパク質を樹脂化して、第2のタンパク質樹脂層を形成する工程と、
第3のタンパク質を含む中間層前駆体が第1及び第2のタンパク質樹脂層に挟まれるように、第1及び第2のタンパク質樹脂層並びに中間層前駆体を配置し、その後、加熱加圧する工程と、を備える、タンパク質層接合体の製造方法。 - 前記中間層前駆体が、固体状である、請求項2に記載の方法。
- 前記中間層前駆体が、粉末、フィルム、シート及び繊維のいずれか1つの形態である、請求項3に記載の方法。
- 前記第1のタンパク質樹脂層を形成する工程が、樹脂化された第1のタンパク質を塑性加工する工程を含む、請求項2〜4のいずれか一項に記載の方法。
- 前記第2のタンパク質樹脂層を形成する工程が、樹脂化された第2のタンパク質を塑性加工する工程を含む、請求項2〜5のいずれか一項に記載の方法。
- 第1のタンパク質、第2のタンパク質及び第3のタンパク質のうちの少なくとも1つが、天然クモ糸タンパク又は天然クモ糸タンパクから誘導される組換えポリペプチドである、請求項2〜6のいずれか一項に記載の方法。
- 第1のタンパク質、第2のタンパク質及び第3のタンパク質が、それぞれ独立に、天然クモ糸タンパク又は天然クモ糸タンパクから誘導される組換えポリペプチドである、請求項2〜7のいずれか一項に記載の方法。
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