CN108699260A - 成形体及其制造方法、以及使成形体的结晶度提高的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明在一个方面提供一种将含有蛋白质的成形体前体暴露于相对湿度为80％以上的环境中而得到成形体的成形体的制造方法。

Description

成形体及其制造方法、以及使成形体的结晶度提高的方法
技术领域
本发明涉及成形体及其制造方法、以及使成形体的结晶度提高的方法。
背景技术
近年来，由于环境保护意识的提高，正在推进石油来源的材料的替代物质的研究，作为其候选，可以列举在强度等方面优良的蛋白质。蛋白质也能够应用于以往主要由石油来源的材料形成的膜、纤维等成形体。例如在专利文献1中公开了一种生物分解性成形体，其特征在于，在蛋白质和增塑剂中添加了分解延缓剂和/或耐水性赋予剂。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：日本特开平8-73613号公报
发明内容
发明所要解决的问题
本发明的目的在于提供具有高结晶度的成形体及其制造方法。
用于解决问题的方法
本发明人对含有蛋白质的成形体进行了研究，结果发现，通过将成形体暴露于相对湿度高的环境中，虽然其机制及暴露后的成形体的结构和特性尚不明确，但成形体的结晶度提高。本发明人推测，通过使成形体的结晶度提高，可得到在应力、弹性模量等方面优良的成形体。
本发明在一个方面提供将含有蛋白质的成形体前体暴露于相对湿度为80％以上的环境中而得到成形体的成形体的制造方法。
本发明在另一方面提供含有具有在相对湿度为80％以上的环境中暴露的历程的蛋白质的成形体。
本发明在另一方面提供通过将含有蛋白质的成形体暴露于相对湿度为80％以上的环境中而使成形体的结晶度提高的方法。
发明效果
根据本发明，能够提供具有高结晶度的成形体及其制造方法。
附图说明
图1是用于对将试样暴露于饱和盐水环境中的方法进行说明的示意图。
图2是示出蚕膜的广角X射线散射测定的结果的图。
图3是示出使用蚕膜的情况下的相对湿度与结晶度的关系的图。
图4是示出蛛丝丝心蛋白膜的广角X射线散射测定的结果的图。
图5是示出使用蛛丝丝心蛋白膜的情况下的相对湿度与结晶度的关系的图。
具体实施方式
以下，详细地对本发明的实施方式进行说明。
一个实施方式的成形体的制造方法至少具备将含有蛋白质的成形体前体暴露于相对湿度为80％以上的环境中的暴露工序。
本实施方式的成形体和成形体前体(以下也将它们统括地简称为“成形体”)优选含有蛋白质作为主要成分。蛋白质相对于成形体整体的含量没有特别限定。成形体可以含有除了作为主要成分的蛋白质以外的夹杂物等。蛋白质的种类也没有特别限制，可以列举例如结构蛋白质或来源于该结构蛋白质的蛋白质等。结构蛋白质是指在生物体内形成或保持结构、形态等的蛋白质。作为结构蛋白质，可以列举例如丝心蛋白、角蛋白、胶原蛋白、弹性蛋白和节肢弹性蛋白等。
结构蛋白质可以含有选自由丝心蛋白和角蛋白组成的组中的一种以上。丝心蛋白例如可以为选自由蚕丝丝心蛋白、蛛丝丝心蛋白和蜂丝丝心蛋白组成的组中的一种以上。结构蛋白质可以为蚕丝丝心蛋白、蛛丝丝心蛋白或它们的组合。在组合使用蚕丝丝心蛋白和蛛丝丝心蛋白的情况下，蚕丝丝心蛋白的比例相对于蛛丝丝心蛋白100质量份例如可以为40质量份以下、30质量份以下或10质量份以下。
蚕丝是由作为家蚕(Bombyx mori)的幼虫的蚕所形成的茧得到的纤维。通常，一根茧丝由两根蚕丝丝心蛋白和从外侧包覆它们的胶质(丝胶蛋白)构成。蚕丝丝心蛋白由多个原纤维构成。蚕丝丝心蛋白被4层丝胶蛋白包覆。实际使用中，通过精炼将外侧的丝胶蛋白溶解去除，所得到的蚕丝长丝被用于衣料用途。一般的蚕丝具有1.33的比重、平均3.3分特克斯(decitex)的纤度和约1300m～约1500m的纤维长度。蚕丝丝心蛋白以野生蚕或家蚕的茧、或者旧的或废弃的丝绸料为原料而得到。
蚕丝丝心蛋白可以为除去丝胶蛋白的蚕丝丝心蛋白、未除去丝胶蛋白的蚕丝丝心蛋白或它们的组合。除去丝胶蛋白的蚕丝丝心蛋白是对将包覆蚕丝丝心蛋白的丝胶蛋白和其他脂肪成分等除去并进行纯化而得到的。如此纯化后的蚕丝丝心蛋白优选以冷冻干燥粉末的形式使用。未除去丝胶蛋白的蚕丝丝心蛋白是未将丝胶蛋白等除去的未纯化的蚕丝丝心蛋白。
蜂丝丝心蛋白是蜂的幼虫所产生的蛋白质，可以含有选自由天然蜂丝蛋白和来源于天然蜂丝蛋白的多肽组成的组中的多肽。
蛛丝丝心蛋白含有选自由天然蛛丝蛋白和来源于天然蛛丝蛋白的多肽组成的组中的蛛丝多肽。
作为天然蛛丝蛋白，可以列举例如大吐丝管牵引丝蛋白、横丝蛋白和小壶状腺蛋白。大吐丝管牵引丝具有由结晶区域和无定形区域(也称为非晶区域)构成的重复区域，因此推测其兼具高的应力和伸缩性。蛛丝的横丝具有不具有结晶区域而具有由无定形区域构成的重复区域的特征。另一方面，与大吐丝管牵引丝相比，横丝的应力差，但具有高伸缩性。认为这是因为横丝的大部分由无定形区域构成。
大吐丝管牵引丝蛋白由蜘蛛的大壶状腺产生，具有强韧性优良的特征。作为大吐丝管牵引丝蛋白，可以列举例如来源于金纺蜘蛛(Nephila clavipes)的大壶状腺丝蛋白MaSp1和MaSp2、以及来源于十字园蛛(Araneus diadematus)的ADF3和ADF4。ADF3是十字园蛛的两种主要牵引丝蛋白之一。来源于天然蛛丝蛋白的多肽可以为来源于这些牵引丝蛋白的多肽。来源于ADF3的多肽比较容易合成，并且在强伸度和强韧性方面具有优良的特性。
横丝蛋白由蜘蛛的鞭状腺(flagelliform gland)产生。作为横丝蛋白，可以列举例如来源于金纺蜘蛛(Nephila clavipes)的鞭状腺丝蛋白(flagelliform silkprotein)。
来源于天然蛛丝蛋白的多肽可以为重组蛛丝蛋白。作为重组蛛丝蛋白，可以列举天然型蛛丝蛋白的突变体、类似体或衍生物等。这样的多肽的适当的一例为大吐丝管牵引丝蛋白的重组蛛丝蛋白(也称为“来源于大吐丝管牵引丝蛋白的多肽”)。
作为丝心蛋白样蛋白质的、大吐丝管牵引丝来源的蛋白质和蚕丝来源的蛋白质可以列举例如包含式1：[(A)n基序-REP1]m所表示的结构域序列的蛋白质(在此，式1中，(A)n基序表示由4～20个氨基酸残基构成的氨基酸序列，并且丙氨酸残基数相对于(A)n基序中的全部氨基酸残基数为80％以上。REP1表示由10～200个氨基酸残基构成的氨基酸序列。m表示8～300的整数。多个存在的(A)n基序可以为相互相同的氨基酸序列，也可以为不同的氨基酸序列。多个存在的REP1可以为相互相同的氨基酸序列，也可以为不同的氨基酸序列)。具体而言，可以列举包含序列号1所示的氨基酸序列的蛋白质。
作为来源于横丝蛋白的蛋白质，可以列举例如包含式2：[REP2]o所表示的结构域序列的蛋白质(在此，式2中，REP2表示由Gly-Pro-Gly-Gly-X构成的氨基酸序列，X表示选自由丙氨酸(Ala)、丝氨酸(Ser)、酪氨酸(Tyr)和缬氨酸(Val)组成的组中的一种氨基酸。o表示8～300的整数)。具体而言，可以列举包含序列号2所示的氨基酸序列的蛋白质。序列号2所示的氨基酸序列是将由NCBI数据库获得的金纺蜘蛛的鞭状腺丝蛋白的部分序列(NCBI登录号：AAF36090、GI：7106224)的重复部分和基序所对应的从N末端起第1220位残基至第1659位残基的氨基酸序列(记作PR1序列)与由NCBI数据库获得的金纺蜘蛛的鞭状腺丝蛋白的部分序列(NCBI登录号：AAC38847、GI：2833649)的C末端起第816位残基至第907位残基的C末端氨基酸序列结合，在结合后的序列的N末端附加序列号7所示的氨基酸序列(标签序列和铰链序列)而得到的氨基酸序列。
作为胶原蛋白来源的蛋白质，可以列举例如包含式3：[REP3]p所表示的结构域序列的蛋白质(在此，式3中，p表示5～300的整数。REP3表示由Gly-X-Y构成的氨基酸序列，X和Y表示Gly以外的任意氨基酸残基。多个存在的REP3可以为相互相同的氨基酸序列，也可以为不同的氨基酸序列)。具体而言，可以列举包含序列号3所示的氨基酸序列的蛋白质。序列号3所示的氨基酸序列是在由NCBI数据库获得的人IV型胶原蛋白的部分序列(NCBI的Genebank的登录号：CAA56335.1、GI：3702452)的重复部分和基序所对应的从第301位残基至第540位残基的氨基酸序列的N末端附加序列号7所示的氨基酸序列(标签序列和铰链序列)而得到的氨基酸序列。
作为节肢弹性蛋白来源的蛋白质，可以列举例如包含式4：[REP4]q所表示的结构域序列的蛋白质(在此，式4中，q表示4～300的整数。REP4表示由Ser-J-J-Tyr-Gly-U-Pro构成的氨基酸序列。J表示任意的氨基酸残基，特别优选为选自由Asp、Ser和Thr组成的组中的氨基酸残基。U表示任意的氨基酸残基，特别优选为选自由Pro、Ala、Thr和Ser组成的组中的氨基酸残基。多个存在的REP4可以为相互相同的氨基酸序列，也可以为不同的氨基酸序列)。具体而言，可以列举包含序列号4所示的氨基酸序列的蛋白质。序列号4所示的氨基酸序列是在节肢弹性蛋白(NCBI的Genebank的登录号NP 611157、G1：24654243)的氨基酸序列中将第87位残基的Thr置换为Ser、且将第95位残基的Asn置换为Asp的序列的从第19位残基至第321位残基的氨基酸序列的N末端附加序列号7所示的氨基酸序列(标签序列和铰链序列)而得到的氨基酸序列。
作为弹性蛋白来源的蛋白质，可以列举例如具有NCBI的Genebank的登录号AAC98395(人)、I47076(绵羊)、NP786966(牛)等的氨基酸序列的蛋白质。具体而言，可以列举包含序列号5所示的氨基酸序列的蛋白质。序列号5所示的氨基酸序列是在NCBI的Genebank的登录号AAC98395的氨基酸序列的第121位残基至第390位残基的氨基酸序列的N末端附加序列号7所示的氨基酸序列(标签序列和铰链序列)而得到的氨基酸序列。
作为角蛋白来源的蛋白质，可以列举例如山羊(Capra hircus)I型角蛋白等。具体而言，可以列举包含序列号6所示的氨基酸序列(NCBI的Genebank的登录号ACY30466的氨基酸序列)的蛋白质。
上述的结构蛋白质和来源于该结构蛋白质的蛋白质可以单独使用一种或者组合使用两种以上。
作为主要成分含有在蛋白质成形体和蛋白质成形体前体中的蛋白质例如可以通过利用具有编码该蛋白质的核酸序列和与该核酸序列以可工作的方式连接的一个或多个调节序列的表达载体对宿主进行转化，利用转化后的宿主对该核酸进行表达来生产。
编码作为主要成分含有在蛋白质成形体和蛋白质成形体前体中的蛋白质的核酸的制造方法没有特别限制。例如，可以通过利用编码天然结构蛋白质的基因、使用聚合酶链式反应(PCR)等进行扩增并进行克隆化的方法或者以化学方式进行合成的方法来制造该核酸。核酸的化学合成方法也没有特别限制，例如可以基于由NCBI的网络数据库等获得的结构蛋白质的氨基酸序列信息，通过利用PCR等将利用AKTA oligopilot plus 10/100(GEHealth Japan株式会社)等自动合成的寡核苷酸连接的方法对基因进行化学合成。此时，为了易于进行蛋白质的纯化和/或确认，可以合成编码在上述氨基酸序列的N末端附加有由起始密码子和His10标签构成的氨基酸序列的氨基酸序列所构成的蛋白质的核酸。
调节序列是对宿主中的重组蛋白质的表达进行调控的序列(例如启动子、增强子、核糖体结合序列、转录终止序列等)，可以根据宿主的种类适当选择。作为启动子，可以使用在宿主细胞中发挥功能、能够诱导目标蛋白质表达的诱导型启动子。诱导型启动子是可以通过存在诱导物质(表达诱导剂)、不存在阻抑分子、或者温度、渗透压或pH值的上升或降低等物理因素来调控转录的启动子。
表达载体的种类可以根据宿主的种类适当选择质粒载体、病毒载体、柯斯质粒(cosmid)载体、福斯质粒(fosmid)载体、人工染色体载体等。作为表达载体，优选使用在宿主细胞中能够自主复制、或者能够并入到宿主的染色体中、且在能够对编码目标蛋白质的核酸进行转录的位置含有启动子的表达载体。
作为宿主，可以适当使用原核生物以及酵母、丝状真菌、昆虫细胞、动物细胞和植物细胞等真核生物中的任意一种。
作为原核生物的宿主的优选例，可以列举属于埃希氏菌属、短芽孢杆菌属、沙雷氏菌属、芽孢杆菌属、微杆菌属、短杆菌属、棒杆菌属和假单胞菌属等的细菌。作为属于埃希氏菌属的微生物，可以列举例如大肠埃希氏菌等。作为属于短芽孢杆菌属的微生物，可以列举例如土壤短芽孢杆菌等。作为属于沙雷氏菌属的微生物，可以列举例如液化沙雷氏菌等。作为属于芽孢杆菌属的微生物，可以列举例如枯草芽孢杆菌等。作为属于微杆菌属的微生物，可以列举例如嗜氨微杆菌等。作为属于短杆菌属的微生物，可以列举例如叉开短杆菌等。作为属于棒杆菌属的微生物，可以列举产氨棒杆菌等。作为属于假单胞菌(Pseudomonas)属的微生物，可以列举例如恶臭假单胞菌等。
在以原核生物作为宿主的情况下，作为导入编码目标蛋白质的核酸的载体，可以列举例如pBTrp2(勃林格殷格翰公司制造)、pGEX(Pharmacia公司制造)、pUC18、pBluescriptII、pSupex、pET22b、pCold、pUB110、pNCO2(日本特开2002-238569号公报)等。
作为真核生物的宿主，可以列举例如酵母和丝状真菌(霉菌等)。作为酵母，可以列举例如属于酵母属、毕赤酵母属、裂殖酵母属等的酵母。作为丝状真菌，可以列举例如曲霉属、青霉属、木霉属等的丝状真菌。
在以真核生物为宿主的情况下，作为导入编码目标蛋白质的核酸的载体，可以列举例如YEP13(ATCC37115)、YEp24(ATCC37051)等。作为向上述宿主细胞中导入表达载体的方法，只要是向上述宿主细胞中导入DNA的方法则均可以使用。可以列举例如使用钙离子的方法[Proc.Natl.Acad.Sci.USA，69,2110(1972)]、电穿孔法、原生质球法、原生质体法、醋酸锂法、感受态细胞法等。
作为基于利用表达载体进行了转化的宿主的核酸的表达方法，除了直接表达以外，还可以依据分子克隆第二版中记载的方法等进行分泌生产、融合蛋白质表达等。
蛋白质例如可以通过将利用表达载体进行了转化的宿主在培养用培养基中进行培养，使该蛋白质在培养用培养基中生成蓄积、并从该培养用培养基中收集来制造。将宿主在培养用培养基中进行培养的方法可以按照宿主的培养中通常使用的方法来进行。
在宿主为大肠杆菌等原核生物或酵母等真核生物的情况下，作为培养用培养基，只要是含有宿主可同化的碳源、氮源和无机盐类等、能够高效地进行宿主的培养的培养基，则可以使用天然培养基、合成培养基中的任意一种。
作为碳源，只要是上述转化微生物可同化的碳源即可，可以使用例如葡萄糖、果糖、蔗糖以及含有这些糖的糖蜜、淀粉和淀粉水解物等碳水化合物、乙酸和丙酸等有机酸、以及乙醇和丙醇等醇类。作为氮源，可以使用例如氨、氯化铵、硫酸铵、乙酸铵和磷酸铵等无机酸或有机酸的铵盐、其他含氮化合物、以及蛋白胨、肉提取物、酵母提取物、玉米浆、酪蛋白水解物、豆粕和豆粕水解物、各种发酵菌体及其消化产物。作为无机盐，可以使用例如磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、磷酸镁、硫酸镁、氯化钠、硫酸亚铁、硫酸锰、硫酸铜和碳酸钙。
大肠杆菌等原核生物或酵母等真核生物的培养例如可以在振荡培养或深部通气搅拌培养等需氧条件下进行。培养温度例如为15～40℃。培养时间通常为16小时～7天。培养中的培养用培养基的pH优选保持于3.0～9.0。培养用培养基的pH的调整可以使用无机酸、有机酸、碱溶液、尿素、碳酸钙和氨等进行。
另外，培养中，可以根据需要在培养用培养基中添加氨苄青霉素和四环素等抗生素。在对利用使用诱导型启动子作为启动子的表达载体进行了转化的微生物进行培养时，可以根据需要在培养基中添加诱导剂。例如，在对利用使用lac启动子的表达载体进行了转化的微生物进行培养时，可以在培养基中添加异丙基-β-D-硫代半乳糖苷等；在对利用使用trp启动子的表达载体进行了转化的微生物进行培养时，可以在培养基中添加吲哚丙烯酸等。
所表达的蛋白质的分离、纯化可以利用通常使用的方法来进行。例如，在该蛋白质以溶解状态在细胞内表达的情况下，在培养结束后，通过离心分离回收宿主细胞，悬浮于水系缓冲液中后，利用超声波破碎机、弗氏压碎器、Manton-Gaulin匀浆器和戴诺研磨机(DYNO-MILL)等将宿主细胞破碎，得到无细胞提取液。从通过对该无细胞提取液进行离心分离而得到的上清中，单独或组合使用蛋白质的分离纯化中通常使用的方法、即溶剂提取法、利用硫酸铵等的盐析法、脱盐法、利用有机溶剂的沉淀法、使用二乙氨基乙基(DEAE)-琼脂糖、DIAIONHPA-75(三菱化成公司制造)等树脂的阴离子交换层析法、使用S-琼脂糖FF(Pharmacia公司制造)等树脂的阳离子交换层析法、使用丁基琼脂糖、苯基琼脂糖等树脂的疏水性层析法、使用分子筛的凝胶过滤法、亲和层析法、色谱聚焦法、等电点电泳等电泳法等方法，能够得到纯化制备品。
另外，在蛋白质在细胞内形成不溶体而进行表达的情况下，同样地回收宿主细胞后将其破碎并进行离心分离，由此以沉淀级分的形式回收蛋白质的不溶体。回收的蛋白质的不溶体可以利用蛋白质变性剂进行可溶化。该操作后，通过与上述同样的分离纯化法能够得到蛋白质的纯化制备品。在该蛋白质被分泌至细胞外的情况下，可以从培养上清中回收该蛋白质。即，通过利用离心分离等方法对培养物进行处理而取得培养上清，通过使用与上述同样的分离纯化法，能够从该培养上清中得到纯化制备品。
从以大肠杆菌等微生物为宿主进行重组蛋白质生产的情况下的生产率的观点出发，蛋白质或多肽的分子量可以为500kDa以下、300kDa以下、200kDa以下或100kDa以下，且可以为10kDa以上。具有上述分子量的蛋白质或多肽可以通过相互进行交联等而进一步高分子量化。
可以将蚕丝丝心蛋白和蛛丝丝心蛋白等上述结构蛋白质与其他蛋白质组合。作为其他蛋白质，可以列举例如胶原蛋白、大豆蛋白、酪蛋白、角蛋白和乳清蛋白。通过将其他蛋白质与结构蛋白质组合使用，能够调整来源于蛋白质的物性。在组合使用情况下，其他蛋白质的比例例如相对于结构蛋白质100质量份可以为40质量份以下、30质量份以下或10质量份以下。
本实施方式的成形体没有特别限制，可以为膜、纤维、发泡体、树脂板等。膜例如通过形成含有蛋白质和溶剂的蛋白质溶液的膜并从所形成的膜中除去溶剂的方法而得到。纤维例如通过将含有蛋白质和溶剂的蛋白质溶液进行纺丝并从纺丝后的蛋白质溶液中除去溶剂的方法而得到。即，本实施方式的成形体的制造方法可以在暴露工序之前进一步具备例如由含有蛋白质和溶剂的蛋白质溶液成形出成形体前体的成形工序。
成形工序中使用的溶剂例如可以为极性溶剂。极性溶剂例如可以包含选自由水、二甲基亚砜(DMSO)、二甲基甲酰胺(DMF)、六氟丙酮(HFA)和六氟异丙醇(HFIP)组成的组中的一种以上的溶剂。从得到更高浓度的溶液的观点出发，极性溶剂可以为单独的二甲基亚砜或者二甲基亚砜与水的混合溶剂，从减少对环境的不良影响的观点出发，可以为水。
以蛋白质溶液的总质量为基准，蛋白质溶液中的蛋白质的含量可以为15质量％以上、30质量％以上、40质量％以上或50质量％以上。从蛋白质溶液的制造效率的观点出发，以蛋白质溶液的总质量为基准，蛋白质的含量可以为70质量％以下、65质量％以下或60质量％以下。
蛋白质溶液可以在蛋白质和溶剂的基础上进一步含有一种或两种以上的无机盐。无机盐可以列举例如由以下所示的路易斯酸和路易斯碱构成的无机盐。路易斯碱例如可以为含氧酸根离子(硝酸根离子、高氯酸根离子等)、金属含氧酸根离子(高锰酸根离子等)、卤化物离子、硫氰酸根离子、氰酸根离子等。路易斯酸例如可以为碱金属离子、碱土金属离子等金属离子、铵根离子等多原子离子、络离子等。作为无机盐的具体例，可以列举氯化锂、溴化锂、碘化锂、硝酸锂、高氯酸锂和硫氰酸锂之类的锂盐、氯化钙、溴化钙、碘化钙、硝酸钙、高氯酸钙和硫氰酸钙之类的钙盐、氯化铁、溴化铁、碘化铁、硝酸铁、高氯酸铁和硫氰酸铁之类的铁盐、以及氯化铝、溴化铝、碘化铝、硝酸铝、高氯酸铝和硫氰酸铝之类的铝盐、氯化钾、溴化钾、碘化钾、硝酸钾、高氯酸钾和硫氰酸钾之类的钾盐、氯化钠、溴化钠、碘化钠、硝酸钠、高氯酸钠和硫氰酸钠之类的钠盐、氯化锌、溴化锌、碘化锌、硝酸锌、高氯酸锌和硫氰酸锌之类的锌盐、氯化镁、溴化镁、碘化镁、硝酸镁、高氯酸镁和硫氰酸镁之类的镁盐、氯化钡、溴化钡、碘化钡、硝酸钡、高氯酸钡和硫氰酸钡之类的钡盐、氯化锶、溴化锶、碘化锶、硝酸锶、高氯酸锶和硫氰酸锶之类的锶盐等。
无机盐的含量相对于蛋白质的总量100质量份可以为1.0质量份以上、5.0质量份以上、9.0质量份以上、15质量份以上或20.0质量份以上。无机盐的含量相对于蛋白质的总量100质量份可以为40质量份以下、35质量份以下或30质量份以下。
蛋白质溶液可以根据需要进一步含有各种添加剂。作为添加剂，可以列举例如增塑剂、流平剂、交联剂、结晶成核剂、抗氧化剂、紫外线吸收剂、着色剂、填料和合成树脂。添加剂的含量相对于蛋白质的总量100质量份可以为50质量份以下。
在暴露工序中，将例如如上得到的成形体前体暴露于相对湿度为80％以上的环境(以下也称为“暴露环境”)中。本发明中的相对湿度是指将利用湿度计(例如株式会社佐藤计量器制作所、HIGHEST II型湿度计(带温度计)、7542-00)测定的相对湿度换算成25℃下的相对湿度而得到的值。
从进一步提高成形体的结晶度的观点出发，暴露环境的相对湿度优选为81.0％以上、81.5％以上、82.0％以上、82.5％以上、83.0％以上、83.5％以上或84.0％以上，更优选为85.0％以上、90.0％以上或95.0％以上。此时，优选对暴露环境的相对湿度进行调节，以使置于暴露环境中的成形体前体(成形体中间体)的含水率以成形体中间体的总量为基准达到8.5质量％以上、10质量％以上、13质量％以上、15质量％以上、17质量％以上或18质量％以上。
暴露环境的温度没有特别限制，例如可以为0℃以上、5℃以上、15℃以上、20℃以上或25℃以上，另外，例如可以为120℃以下、100℃以下、80℃以下、60℃以下或40℃以下。
将成形体前体在相对湿度为80％以上的环境中暴露的时间没有特别限定，可根据成形体前体的形状、大小、厚度等适当进行选择，例如可以为10秒钟以上、10分钟以上、1小时以上或24小时以上，另外，例如可以为336小时以下或168小时以下。
暴露环境的气氛没有特别限制，例如可以为大气气氛。暴露环境的压力没有特别限制，例如可以为大气压，也可以为加压下。
在本实施方式的制造方法中，可以在暴露工序之前使成形体前体干燥(干燥工序)。由此，能够使暴露工序前的成形体前体的含水率减少至零或接近于零的值。其结果，与暴露工序前的成形体前体的含水量不清楚的情况(不进行干燥工序的情况)相比，能够更容易地实施对暴露环境的相对湿度进行调节以使置于暴露环境中的成形体前体的含水率以成形体前体(成形体中间体)的总量为基准达到所期望的值的操作。也可以在暴露工序之后使成形体干燥。暴露工序之前或之后的干燥例如可以为真空干燥、加热干燥或真空加热干燥。
通过如上所述地经过暴露工序，可得到具有高结晶度的成形体。另外，通过经过暴露工序，可得到具有较大微晶尺寸的成形体。即，本实施方式在一个方式中也可以说是通过将含有蛋白质的成形体暴露于相对湿度为80％以上的环境中而使该成形体的结晶度提高的方法。另外，也可以说是通过将含有蛋白质的成形体暴露于相对湿度为80％以上的环境中而使该成形体的微晶尺寸提高的方法。
需要说明的是，在如上所述使成形体的结晶度提高的方法或使成形体的微晶尺寸提高的方法中，也可以在暴露工序之前或之后使成形体干燥。通过在暴露工序之前使成形体干燥，与上述的成形体的制造方法同样地，能够使暴露工序前的成形体的含水率减少至零或接近于零的值。其结果，容易进行暴露环境的相对湿度的调节操作。
本实施方式在一个方式中为通过上述制造方法得到的成形体，即含有具有在相对湿度为80％以上的环境中暴露的历程的蛋白质的成形体。在所得到的成形体为膜的情况下，膜的厚度例如可以为3～1000μm或5～100μm。在所得到的成形体为纤维的情况下，纤维的平均径例如可以为5～300μm或5～50μm。
实施例
以下，基于实施例进一步具体地对本发明进行说明，但本发明并不限定于以下的实施例。
(实施例1)
使用野生的蚕(Bombyx mori)的茧，按照D.N.Rockwood et al.，NatureProtocols，vol.6[10](2011)中记载的步骤来制作膜。以下示出步骤的概要。
首先，将除去内容物后的蚕茧细小地切断，在0.02M的碳酸钠(Na2CO3)水溶液中煮30分钟。然后，将所得到的蚕丝用MilliQ水进行20分钟水洗，将上述工序重复3次。接着，除去蚕丝的水气，使其干燥。将干燥后的蚕丝浸泡于9.3M溴化锂(LiBr)水溶液中，在60℃下用约4小时使其溶解。将所得到的溶液移至透析膜中，进行约72小时的透析。将透析后的溶液在4℃下以12700G离心分离20分钟，除去杂质。重复几次该操作后，使溶液的上清(蛋白质浓度为7.4质量％)流到平板上，使其干燥。如此得到蚕膜(含有蚕丝蛋白的膜)。所得到的蚕膜的厚度为约55μm～约75μm。
另外地，为了制作任意的湿度环境，使用MilliQ水和多个种类的盐，准备饱和盐水。将所使用的盐的种类和利用其饱和盐水实现的湿度环境示于表1(示出JISB 7920中记载的值)。
[表1]
接着，将所制作的蚕膜切断成12mm×12mm的大小，得到多张膜。然后，将上述各膜在40℃下真空干燥24小时。接着，如图1(a)、(b)(图1(b)为图1(a)的I-I线向视断面图)所示，在设置于支撑体1的中央的窗部2上配置干燥后的膜3，将膜3的两端用固定部4固定于支撑体1，制作试样5。与此同样地制作数量与膜的数量相同的试样5。将所制作的多个试样5分别在不同的饱和盐水(湿度)环境中在24.2℃下暴露约1周。此时，如图1(c)所示，将各试样5收容于注射器6内，将该注射器6与饱和盐水7一起收容于密闭容器8内，由此将膜3在不浸泡于饱和盐水7中的情况下暴露于大气气氛的各湿度环境中。另外，在上述各湿度环境之外，在40℃下真空干燥24小时后立即将膜收容于注射器6内，并收容于铺有干燥剂的密闭容器8内(其中，未收容饱和盐水7)，由此准备相对湿度0％(干燥)的环境，将暴露于上述各湿度环境中的试样之外的试样5在该环境中暴露约1周。
将如上暴露于相互不同的测定环境中的多个试样5在置于饱和盐水环境中的状态下直接放入大型放射光设备SPring-8中，进行广角X射线散射测定。广角X射线散射(WAXD或WAXS)的测定使用BL45XU。装置的测定条件如下所述。
波长：
检测器：Pilatus3 2M(株式会社理学制造)
相机长度：244.84mm
曝光时间：10秒
光束中心：[X]727.63mm、[Y]864.79mm
各试样5的广角X射线散射测定的湿度条件设定为尽可能地与静置的饱和盐水环境接近的湿度条件。将各试样5在各饱和盐水环境中的暴露时的湿度与广角X射线散射测定时的湿度的对应关系示于表2。
[表2]
使用数据分析用软件KaleidaGraph制作广角X射线散射的一维曲线。将所得到的衍射数据示于图2。基于所得到的衍射数据，由下述(1)式算出结晶度(％)。
结晶度(％)＝[表示结晶区域的峰面积/(表示结晶区域的峰面积+表示非晶区域的峰面积)]×100…(1)
将暴露环境的相对湿度与膜的结晶度的关系示于图3。
由图2和图3的结果表明，确认了：含有蚕丝蛋白的成形体(膜)通过暴露于相对湿度为80％以上的环境中，其结晶度提高。
(实施例2)
接着，使用重组蛛丝蛋白，如下制作膜。
1.重组蛛丝蛋白(重组蛛丝丝心蛋白：PRT410)的制造
(编码蛛丝蛋白的基因的合成和表达载体的构建)
基于金纺蜘蛛(Nephila clavipes)来源的丝心蛋白(GenBank登录号：P46804.1、GI：1174415)的碱基序列和氨基酸序列，设计出具有序列号1所示的氨基酸序列的改造丝心蛋白(以下也称为“PRT410”)。
序列号1所示的氨基酸序列具有以提高生产率为目的对金纺蜘蛛来源的丝心蛋白的氨基酸序列实施了氨基酸残基的置换、插入和缺失的氨基酸序列，且进一步在N末端附加有序列号7所示的氨基酸序列(标签序列和铰链序列)。
接着，合成编码PRT410的核酸。对于该核酸，在5’末端附加有NdeI位点且在终止密码子下游附加有EcoRI位点。将该核酸克隆至克隆载体(pUC118)中。然后，利用NdeI和EcoRI对该核酸进行限制酶处理而将其切出后，重组到蛋白表达载体pET-22b(+)中，得到表达载体。
利用包含编码PRT410的核酸的pET22b(+)表达载体对大肠杆菌BLR(DE3)进行转化。将该转化大肠杆菌在含有氨苄西林的2mL的LB培养基中培养15小时。将该培养液添加到含有氨苄西林的100mL的种子培养用培养基(表3)中，以使OD600达到0.005。将培养液温度保持于30℃，进行烧瓶培养直至OD600达到5为止(约15小时)，得到种子培养液。
[表3]
种子培养用培养基
将该种子培养液添加到添加有500ml的生产培养基(下述表4)的发酵罐中，以使OD600达到0.05。将培养液温度保持于37℃，在pH6.9下控制为恒定而进行培养。另外，将培养液中的溶解氧浓度维持为溶解氧饱和浓度的20％。
[表4]
生产培养基
在生产培养基中的葡萄糖完全被消耗后，立即以1mL/分钟的速度添加补料液(葡萄糖455g/1L、酵母提取物120g/1L)。将培养液温度保持于37℃，在pH6.9下控制为恒定而进行培养。另外，将培养液中的溶解氧浓度维持为溶解氧饱和浓度的20％，进行20小时培养。然后，向培养液中添加1M的异丙基-β-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)，以使终浓度达到1mM，对PRT410进行表达诱导。在添加IPTG后经过20小时的时刻，离心分离培养液，回收菌体。使用由添加IPTG前和添加IPTG后的培养液制备的菌体进行SDS-PAGE，根据依赖于IPTG添加的、与PRT410相当的大小的条带的出现，确认了PRT410的表达。
(PRT410的纯化)
将添加IPTG后2小时后回收的菌体用20mM Tris-HCl缓冲液(pH7.4)进行清洗。使清洗后的菌体悬浮在包含约1mM的PMSF的20mM Tris-HCl缓冲液(pH7.4)中，利用高压均质器(GEA Niro Soavi公司)将细胞破碎。将破碎的细胞离心分离，得到沉淀物。利用20mMTris-HCl缓冲液(pH7.4)清洗所得到的沉淀物，直至达到高纯度为止。将清洗后的沉淀物以达到100mg/mL的浓度的方式悬浮在8M胍缓冲液(8M胍盐酸盐、10mM磷酸二氢钠、20mM NaCl、1mM Tris-HCl、pH7.0)中，在60℃下用搅拌器搅拌30分钟，使其溶解。溶解后，使用透析管(三光纯药株式会社制造的纤维素管36/32)在水中进行透析。通过离心分离回收透析后得到的白色凝集蛋白质(PRT410)，利用冷冻干燥机除去水分，回收冷冻干燥粉末。
所得到的冷冻干燥粉末中的PRT410的纯化度通过使用Totallab(nonlineardynamics ltd.)对粉末的聚丙烯酰胺凝胶电泳的结果进行图像分析来确认。其结果，PRT410的纯化度为约85％。
2.蛛丝蛋白膜(蛛丝丝心蛋白膜)的制造
(胶液的制备)
将上述的重组蛛丝丝心蛋白(PRT410)18g、纯水57g、クリンソルブP-724g和甘油1g投入到高压微型反应器(OM labtech株式会社制造、型号“MMJ-500”)中。关闭反应器的盖子，在100℃下加热40分钟，使蛛丝丝心蛋白溶解，制备胶液(蛋白质的比例为18质量％)。
(膜流延成形)
使用涂布机(株式会社井元制作所制造、型号“IMC-70F-B”)，将所制备的胶液在基板的表面进行流延成形，制成湿润膜。作为基板，使用在厚度75μm的聚对苯二甲酸乙二醇酯膜(PET)表面固定了有机硅化合物的脱模膜(帝人杜邦薄膜株式会社制造、商标名“Purex”、38μm)。
(干燥)
将成形后的湿润膜在60℃下静置2分钟、在100℃下静置2分钟，使其干燥。然后，将膜从基板剥离。如此得到的蛛丝丝心蛋白膜(含有蛛丝丝心蛋白的膜)的厚度为约16μm。
接着，将所制作的蛛丝丝心蛋白膜切断成20mm×20mm的大小，得到3张膜。除了使所使用的盐的种类为NaCl、KCl和K2SO4以外，与实施例1同样地将3张膜分别在不同的饱和盐水(湿度)环境中在25℃下暴露约1天。然后，在恒温恒湿槽(espec公司制造、LHL-113)中在20℃/65％的条件下静置约3天。
将如上所述分别在不同的湿度环境下暴露的3张膜与实施例1同样地在置于饱和盐水环境中的状态下直接放入大型放射光设备SPring-8中，对各膜进行广角X射线散射测定。
与实施例1同样地，使用数据分析用软件KaleidaGraph制作广角X射线散射的一维曲线。将所得到的衍射数据示于图4。进一步基于所得到的衍射数据，由上述式(1)算出结晶度(％)。将暴露环境的相对湿度与膜的结晶度的关系示于图5。
由图4和图5的结果表明，确认了：含有重组蛛丝蛋白的成形体(膜)通过暴露于相对湿度为80％以上的环境中，其结晶度提高。
标号说明
1…支撑体、2…窗部、3…膜、4…固定部、5…试样、6…注射器、7…饱和盐水、8…密闭容器。
序列表
<110> 国立研究开发法人理化学研究所（RIKEN）
丝芭博株式会社（Spiber Inc.）
小岛冲压工业株式会社（KOJIMA INDUSTRIES CORPORATION）
<120> 成形体及其制造方法、以及使成形体的结晶度提高的方法（Molded body,manufacturing method thereof and method for improving crystallinity of moldedbody）
<130> FP16-0814-00
<160> 7
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 601
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PRT410 (CRY1_L_A5_giza_QQQ)
<400> 1
Met His His His His His His Ser Ser Gly Ser Ser Gly Pro Gly Gln
1 5 10 15
Gln Gly Pro Tyr Gly Pro Gly Ala Ser Ala Ala Ala Ala Ala Gly Gln
20 25 30
Asn Gly Pro Gly Ser Gly Gln Gln Gly Pro Gly Gln Ser Gly Gln Tyr
35 40 45
Gly Pro Gly Gln Gln Gly Pro Gly Gln Gln Gly Pro Gly Ser Ser Ala
50 55 60
Ala Ala Ala Ala Gly Pro Gly Gln Tyr Gly Pro Gly Gln Gln Gly Pro
65 70 75 80
Ser Ala Ser Ala Ala Ala Ala Ala Gly Pro Gly Ser Gly Gln Gln Gly
85 90 95
Pro Gly Ala Ser Gly Gln Tyr Gly Pro Gly Gln Gln Gly Pro Gly Gln
100 105 110
Gln Gly Pro Gly Ser Ser Ala Ala Ala Ala Ala Gly Gln Tyr Gly Ser
115 120 125
Gly Pro Gly Gln Gln Gly Pro Tyr Gly Ser Ala Ala Ala Ala Ala Gly
130 135 140
Pro Gly Ser Gly Gln Tyr Gly Gln Gly Pro Tyr Gly Pro Gly Ala Ser
145 150 155 160
Gly Pro Gly Gln Tyr Gly Pro Gly Gln Gln Gly Pro Ser Ala Ser Ala
165 170 175
Ala Ala Ala Ala Gly Ser Gly Gln Gln Gly Pro Gly Gln Tyr Gly Pro
180 185 190
Tyr Ala Ser Ala Ala Ala Ala Ala Gly Gln Tyr Gly Ser Gly Pro Gly
195 200 205
Gln Gln Gly Pro Tyr Gly Pro Gly Gln Ser Gly Ser Gly Gln Gln Gly
210 215 220
Pro Gly Gln Gln Gly Pro Tyr Ala Ser Ala Ala Ala Ala Ala Gly Pro
225 230 235 240
Gly Gln Gln Gly Pro Tyr Gly Pro Gly Ser Ser Ala Ala Ala Ala Ala
245 250 255
Gly Gln Tyr Gly Tyr Gly Pro Gly Gln Gln Gly Pro Tyr Gly Pro Gly
260 265 270
Ala Ser Gly Gln Asn Gly Pro Gly Ser Gly Gln Tyr Gly Pro Gly Gln
275 280 285
Gln Gly Pro Gly Gln Ser Ala Ala Ala Ala Ala Gly Pro Gly Gln Gln
290 295 300
Gly Pro Tyr Gly Pro Gly Ala Ser Ala Ala Ala Ala Ala Gly Gln Tyr
305 310 315 320
Gly Pro Gly Gln Gln Gly Pro Gly Gln Tyr Gly Pro Gly Ser Ser Gly
325 330 335
Pro Gly Gln Gln Gly Pro Tyr Gly Pro Gly Ser Ser Ala Ala Ala Ala
340 345 350
Ala Gly Gln Tyr Gly Pro Gly Gln Gln Gly Pro Tyr Gly Pro Gly Gln
355 360 365
Ser Ala Ala Ala Ala Ala Gly Gln Tyr Gln Gln Gly Pro Gly Gln Gln
370 375 380
Gly Pro Tyr Gly Pro Gly Ala Ser Gly Pro Gly Gln Gln Gly Pro Tyr
385 390 395 400
Gly Pro Gly Ala Ser Ala Ala Ala Ala Ala Gly Pro Gly Gln Tyr Gly
405 410 415
Pro Gly Gln Gln Gly Pro Ser Ala Ser Ala Ala Ala Ala Ala Gly Gln
420 425 430
Tyr Gly Ser Gly Pro Gly Gln Tyr Gly Pro Tyr Gly Pro Gly Gln Ser
435 440 445
Gly Pro Gly Ser Gly Gln Gln Gly Gln Gly Pro Tyr Gly Pro Gly Ala
450 455 460
Ser Ala Ala Ala Ala Ala Gly Gln Tyr Gly Pro Gly Gln Gln Gly Pro
465 470 475 480
Tyr Gly Pro Gly Gln Ser Ala Ala Ala Ala Ala Gly Pro Gly Ser Gly
485 490 495
Gln Tyr Gly Pro Gly Ala Ser Gly Gln Asn Gly Pro Gly Ser Gly Gln
500 505 510
Tyr Gly Pro Gly Gln Gln Gly Pro Gly Gln Ser Ala Ala Ala Ala Ala
515 520 525
Gly Gln Tyr Gln Gln Gly Pro Gly Gln Gln Gly Pro Tyr Gly Pro Gly
530 535 540
Ala Ser Ala Ala Ala Ala Ala Gly Gln Tyr Gly Ser Gly Pro Gly Gln
545 550 555 560
Gln Gly Pro Tyr Gly Pro Gly Gln Ser Gly Ser Gly Gln Gln Gly Pro
565 570 575
Gly Gln Gln Gly Pro Tyr Ala Ser Ala Ala Ala Ala Ala Gly Pro Gly
580 585 590
Ser Gly Gln Gln Gly Pro Gly Ala Ser
595 600
<210> 2
<211> 559
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Recombinant spider silk protein Flag_92_short2
<400> 2
Met His His His His His His His His His His Ser Ser Gly Ser Ser
1 5 10 15
Leu Glu Val Leu Phe Gln Gly Pro Gly Ala Gly Gly Ser Gly Pro Gly
20 25 30
Gly Ala Gly Pro Gly Gly Val Gly Pro Gly Gly Ser Gly Pro Gly Gly
35 40 45
Val Gly Pro Gly Gly Ser Gly Pro Gly Gly Val Gly Pro Gly Gly Ser
50 55 60
Gly Pro Gly Gly Val Gly Pro Gly Gly Ala Gly Gly Pro Tyr Gly Pro
65 70 75 80
Gly Gly Ser Gly Pro Gly Gly Ala Gly Gly Ala Gly Gly Pro Gly Gly
85 90 95
Ala Tyr Gly Pro Gly Gly Ser Tyr Gly Pro Gly Gly Ser Gly Gly Pro
100 105 110
Gly Gly Ala Gly Gly Pro Tyr Gly Pro Gly Gly Glu Gly Pro Gly Gly
115 120 125
Ala Gly Gly Pro Tyr Gly Pro Gly Gly Ala Gly Gly Pro Tyr Gly Pro
130 135 140
Gly Gly Ala Gly Gly Pro Tyr Gly Pro Gly Gly Glu Gly Gly Pro Tyr
145 150 155 160
Gly Pro Gly Gly Ser Tyr Gly Pro Gly Gly Ala Gly Gly Pro Tyr Gly
165 170 175
Pro Gly Gly Pro Tyr Gly Pro Gly Gly Glu Gly Pro Gly Gly Ala Gly
180 185 190
Gly Pro Tyr Gly Pro Gly Gly Val Gly Pro Gly Gly Gly Gly Pro Gly
195 200 205
Gly Tyr Gly Pro Gly Gly Ala Gly Pro Gly Gly Tyr Gly Pro Gly Gly
210 215 220
Ser Gly Pro Gly Gly Tyr Gly Pro Gly Gly Ser Gly Pro Gly Gly Tyr
225 230 235 240
Gly Pro Gly Gly Ser Gly Pro Gly Gly Tyr Gly Pro Gly Gly Ser Gly
245 250 255
Pro Gly Gly Tyr Gly Pro Gly Gly Ser Gly Pro Gly Gly Ser Gly Pro
260 265 270
Gly Gly Tyr Gly Pro Gly Gly Ser Gly Pro Gly Gly Ser Gly Pro Gly
275 280 285
Gly Tyr Gly Pro Gly Gly Ser Gly Pro Gly Gly Tyr Gly Pro Gly Gly
290 295 300
Ser Gly Pro Gly Gly Ser Gly Pro Gly Gly Tyr Gly Pro Gly Gly Ser
305 310 315 320
Gly Pro Gly Gly Ser Gly Pro Gly Gly Tyr Gly Pro Gly Gly Ser Gly
325 330 335
Pro Gly Gly Phe Gly Pro Gly Gly Phe Gly Pro Gly Gly Ser Gly Pro
340 345 350
Gly Gly Tyr Gly Pro Gly Gly Ser Gly Pro Gly Gly Ala Gly Pro Gly
355 360 365
Gly Val Gly Pro Gly Gly Phe Gly Pro Gly Gly Ala Gly Pro Gly Gly
370 375 380
Ala Gly Pro Gly Gly Ala Gly Pro Gly Gly Ala Gly Pro Gly Gly Ala
385 390 395 400
Gly Pro Gly Gly Ala Gly Pro Gly Gly Ala Gly Pro Gly Gly Ala Gly
405 410 415
Pro Gly Gly Ala Gly Gly Ala Gly Gly Ala Gly Gly Ala Gly Gly Ser
420 425 430
Gly Gly Ala Gly Gly Ser Gly Gly Thr Thr Ile Ile Glu Asp Leu Asp
435 440 445
Ile Thr Ile Asp Gly Ala Asp Gly Pro Ile Thr Ile Ser Glu Glu Leu
450 455 460
Thr Ile Ser Ala Tyr Tyr Pro Ser Ser Arg Val Pro Asp Met Val Asn
465 470 475 480
Gly Ile Met Ser Ala Met Gln Gly Ser Gly Phe Asn Tyr Gln Met Phe
485 490 495
Gly Asn Met Leu Ser Gln Tyr Ser Ser Gly Ser Gly Thr Cys Asn Pro
500 505 510
Asn Asn Val Asn Val Leu Met Asp Ala Leu Leu Ala Ala Leu His Cys
515 520 525
Leu Ser Asn His Gly Ser Ser Ser Phe Ala Pro Ser Pro Thr Pro Ala
530 535 540
Ala Met Ser Ala Tyr Ser Asn Ser Val Gly Arg Met Phe Ala Tyr
545 550 555
<210> 3
<211> 252
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Collagen-type4-Kai
<400> 3
Met His His His His His His Ser Ser Gly Ser Ser Lys Asp Gly Val
1 5 10 15
Pro Gly Phe Pro Gly Ser Glu Gly Val Lys Gly Asn Arg Gly Phe Pro
20 25 30
Gly Leu Met Gly Glu Asp Gly Ile Lys Gly Gln Lys Gly Asp Ile Gly
35 40 45
Pro Pro Gly Phe Arg Gly Pro Thr Glu Tyr Tyr Asp Thr Tyr Gln Glu
50 55 60
Lys Gly Asp Glu Gly Thr Pro Gly Pro Pro Gly Pro Arg Gly Ala Arg
65 70 75 80
Gly Pro Gln Gly Pro Ser Gly Pro Pro Gly Val Pro Gly Ser Pro Gly
85 90 95
Ser Ser Arg Pro Gly Leu Arg Gly Ala Pro Gly Trp Pro Gly Leu Lys
100 105 110
Gly Ser Lys Gly Glu Arg Gly Arg Pro Gly Lys Asp Ala Met Gly Thr
115 120 125
Pro Gly Ser Pro Gly Cys Ala Gly Ser Pro Gly Leu Pro Gly Ser Pro
130 135 140
Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly Asp Ile Val Phe Arg Lys Gly Pro Pro
145 150 155 160
Gly Asp His Gly Leu Pro Gly Tyr Leu Gly Ser Pro Gly Ile Pro Gly
165 170 175
Val Asp Gly Pro Lys Gly Glu Pro Gly Leu Leu Cys Thr Gln Cys Pro
180 185 190
Tyr Ile Pro Gly Pro Pro Gly Leu Pro Gly Leu Pro Gly Leu His Gly
195 200 205
Val Lys Gly Ile Pro Gly Arg Gln Gly Ala Ala Gly Leu Lys Gly Ser
210 215 220
Pro Gly Ser Pro Gly Asn Thr Gly Leu Pro Gly Phe Pro Gly Phe Pro
225 230 235 240
Gly Ala Gln Gly Asp Pro Gly Leu Lys Gly Glu Lys
245 250
<210> 4
<211> 310
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Resilin-Kai
<400> 4
Met His His His His His His Pro Glu Pro Pro Val Asn Ser Tyr Leu
1 5 10 15
Pro Pro Ser Asp Ser Tyr Gly Ala Pro Gly Gln Ser Gly Pro Gly Gly
20 25 30
Arg Pro Ser Asp Ser Tyr Gly Ala Pro Gly Gly Gly Asn Gly Gly Arg
35 40 45
Pro Ser Asp Ser Tyr Gly Ala Pro Gly Gln Gly Gln Gly Gln Gly Gln
50 55 60
Gly Gln Gly Gly Tyr Ala Gly Lys Pro Ser Asp Ser Tyr Gly Ala Pro
65 70 75 80
Gly Gly Gly Asp Gly Asn Gly Gly Arg Pro Ser Ser Ser Tyr Gly Ala
85 90 95
Pro Gly Gly Gly Asn Gly Gly Arg Pro Ser Asp Thr Tyr Gly Ala Pro
100 105 110
Gly Gly Gly Asn Gly Gly Arg Pro Ser Asp Thr Tyr Gly Ala Pro Gly
115 120 125
Gly Gly Gly Asn Gly Asn Gly Gly Arg Pro Ser Ser Ser Tyr Gly Ala
130 135 140
Pro Gly Gln Gly Gln Gly Asn Gly Asn Gly Gly Arg Pro Ser Ser Ser
145 150 155 160
Tyr Gly Ala Pro Gly Gly Gly Asn Gly Gly Arg Pro Ser Asp Thr Tyr
165 170 175
Gly Ala Pro Gly Gly Gly Asn Gly Gly Arg Pro Ser Asp Thr Tyr Gly
180 185 190
Ala Pro Gly Gly Gly Asn Asn Gly Gly Arg Pro Ser Ser Ser Tyr Gly
195 200 205
Ala Pro Gly Gly Gly Asn Gly Gly Arg Pro Ser Asp Thr Tyr Gly Ala
210 215 220
Pro Gly Gly Gly Asn Gly Asn Gly Ser Gly Gly Arg Pro Ser Ser Ser
225 230 235 240
Tyr Gly Ala Pro Gly Gln Gly Gln Gly Gly Phe Gly Gly Arg Pro Ser
245 250 255
Asp Ser Tyr Gly Ala Pro Gly Gln Asn Gln Lys Pro Ser Asp Ser Tyr
260 265 270
Gly Ala Pro Gly Ser Gly Asn Gly Asn Gly Gly Arg Pro Ser Ser Ser
275 280 285
Tyr Gly Ala Pro Gly Ser Gly Pro Gly Gly Arg Pro Ser Asp Ser Tyr
290 295 300
Gly Pro Pro Ala Ser Gly
305 310
<210> 5
<211> 282
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> elastin short
<400> 5
Met His His His His His His Ser Ser Gly Ser Ser Leu Gly Val Ser
1 5 10 15
Ala Gly Ala Val Val Pro Gln Pro Gly Ala Gly Val Lys Pro Gly Lys
20 25 30
Val Pro Gly Val Gly Leu Pro Gly Val Tyr Pro Gly Gly Val Leu Pro
35 40 45
Gly Ala Arg Phe Pro Gly Val Gly Val Leu Pro Gly Val Pro Thr Gly
50 55 60
Ala Gly Val Lys Pro Lys Ala Pro Gly Val Gly Gly Ala Phe Ala Gly
65 70 75 80
Ile Pro Gly Val Gly Pro Phe Gly Gly Pro Gln Pro Gly Val Pro Leu
85 90 95
Gly Tyr Pro Ile Lys Ala Pro Lys Leu Pro Gly Gly Tyr Gly Leu Pro
100 105 110
Tyr Thr Thr Gly Lys Leu Pro Tyr Gly Tyr Gly Pro Gly Gly Val Ala
115 120 125
Gly Ala Ala Gly Lys Ala Gly Tyr Pro Thr Gly Thr Gly Val Gly Pro
130 135 140
Gln Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Lys Ala Ala Ala Lys Phe Gly Ala
145 150 155 160
Gly Ala Ala Gly Val Leu Pro Gly Val Gly Gly Ala Gly Val Pro Gly
165 170 175
Val Pro Gly Ala Ile Pro Gly Ile Gly Gly Ile Ala Gly Val Gly Thr
180 185 190
Pro Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Lys Ala Ala Lys Tyr
195 200 205
Gly Ala Ala Ala Gly Leu Val Pro Gly Gly Pro Gly Phe Gly Pro Gly
210 215 220
Val Val Gly Val Pro Gly Ala Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly
225 230 235 240
Ala Gly Ile Pro Val Val Pro Gly Ala Gly Ile Pro Gly Ala Ala Val
245 250 255
Pro Gly Val Val Ser Pro Glu Ala Ala Ala Lys Ala Ala Ala Lys Ala
260 265 270
Ala Lys Tyr Gly Ala Arg Pro Gly Val Gly
275 280
<210> 6
<211> 468
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> type I keratin 26
<400> 6
Met Ser Phe Arg Leu Ser Gly Val Ser Arg Arg Leu Cys Ser Gln Ala
1 5 10 15
Gly Thr Gly Arg Leu Thr Gly Gly Arg Thr Gly Phe Arg Ala Gly Asn
20 25 30
Val Cys Ser Gly Leu Gly Ala Gly Ser Ser Phe Ser Gly Pro Leu Gly
35 40 45
Ser Val Ser Ser Lys Gly Ser Phe Ser His Gly Gly Gly Gly Leu Gly
50 55 60
Ser Gly Val Cys Thr Gly Phe Leu Glu Asn Glu His Gly Leu Leu Pro
65 70 75 80
Gly Asn Glu Lys Val Thr Leu Gln Asn Leu Asn Asp Arg Leu Ala Ser
85 90 95
Tyr Leu Asp His Val Cys Thr Leu Glu Glu Ala Asn Ala Asp Leu Glu
100 105 110
Gln Lys Ile Lys Gly Trp Tyr Glu Lys Tyr Gly Pro Gly Ser Gly Arg
115 120 125
Gln Leu Ala His Asp Tyr Ser Lys Tyr Phe Ser Val Thr Glu Asp Leu
130 135 140
Lys Arg Gln Ile Ile Ser Val Thr Thr Cys Asn Ala Ser Ile Val Leu
145 150 155 160
Gln Asn Glu Asn Ala Arg Leu Thr Ala Asp Asp Phe Arg Leu Lys Cys
165 170 175
Glu Asn Glu Leu Ala Leu His Gln Ser Val Glu Ala Asp Ile Asn Gly
180 185 190
Leu His Arg Val Met Asp Glu Leu Thr Leu Cys Thr Ser Asp Leu Glu
195 200 205
Met Gln Cys Glu Ala Leu Ser Glu Glu Leu Thr Tyr Leu Lys Lys Asn
210 215 220
His Gln Glu Glu Met Lys Val Met Gln Gly Ala Ala Arg Gly Asn Val
225 230 235 240
Asn Val Glu Ile Asn Ala Ala Pro Gly Val Asp Leu Thr Val Leu Leu
245 250 255
Asn Asn Met Arg Ala Glu Tyr Glu Asp Leu Ala Glu Gln Asn His Glu
260 265 270
Asp Ala Glu Ala Trp Phe Ser Glu Lys Ser Thr Ser Leu His Gln Gln
275 280 285
Ile Ser Asp Asp Ala Gly Ala Ala Met Ala Ala Arg Asn Glu Leu Met
290 295 300
Glu Leu Lys Arg Asn Leu Gln Thr Leu Glu Ile Glu Leu Gln Ser Leu
305 310 315 320
Leu Ala Met Lys His Ser Tyr Glu Cys Ser Leu Ala Glu Thr Glu Ser
325 330 335
Asn Tyr Cys His Gln Leu Gln Gln Ile Gln Glu Gln Ile Gly Ala Met
340 345 350
Glu Asp Gln Leu Gln Gln Ile Arg Met Glu Thr Glu Gly Gln Lys Leu
355 360 365
Glu His Glu Arg Leu Leu Asp Val Lys Ile Phe Leu Glu Lys Glu Ile
370 375 380
Glu Met Tyr Cys Lys Leu Ile Asp Gly Glu Gly Arg Lys Ser Lys Ser
385 390 395 400
Thr Cys Tyr Lys Ser Glu Gly Arg Gly Pro Lys Asn Ser Glu Asn Gln
405 410 415
Val Lys Asp Ser Lys Glu Glu Ala Val Val Lys Thr Val Val Gly Glu
420 425 430
Leu Asp Gln Leu Gly Ser Val Leu Ser Leu Arg Val His Ser Val Glu
435 440 445
Glu Lys Ser Ser Lys Ile Ser Asn Ile Thr Met Glu Gln Arg Leu Pro
450 455 460
Ser Lys Val Pro
465
<210> 7
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> His Tag
<400> 7
Met His His His His His His Ser Ser Gly Ser Ser
1 5 10

Claims (14)

1.一种成形体的制造方法，将含有蛋白质的成形体前体暴露于相对湿度为80％以上的环境中而得到成形体。
2.如权利要求1所述的制造方法，其中，使所述成形体前体在所述暴露之前干燥。
3.如权利要求1或2所述的制造方法，其中，所述蛋白质为结构蛋白质。
4.如权利要求1～3中任一项所述的制造方法，其中，所述蛋白质为选自由角蛋白、胶原蛋白、弹性蛋白、节肢弹性蛋白、蚕丝丝心蛋白和蛛丝丝心蛋白组成的组中的至少一种。
5.如权利要求1～4中任一项所述的制造方法，其中，所述蛋白质为蛛丝丝心蛋白。
6.一种成形体，其含有具有在相对湿度为80％以上的环境中暴露的历程的蛋白质。
7.如权利要求6所述的成形体，其中，所述蛋白质为结构蛋白质。
8.如权利要求6或7所述的成形体，其中，所述蛋白质为选自由角蛋白、胶原蛋白、弹性蛋白、节肢弹性蛋白、蚕丝丝心蛋白和蛛丝丝心蛋白组成的组中的至少一种。
9.如权利要求6～8中任一项所述的成形体，其中，所述蛋白质为蛛丝丝心蛋白。
10.一种通过将含有蛋白质的成形体暴露于相对湿度为80％以上的环境中而使所述成形体的结晶度提高的方法。
11.如权利要求10所述的方法，其中，使所述成形体在所述暴露之前干燥。
12.如权利要求10或11所述的方法，其中，所述蛋白质为结构蛋白质。
13.如权利要求10～12中任一项所述的方法，其中，所述蛋白质为选自由角蛋白、胶原蛋白、弹性蛋白、节肢弹性蛋白、蚕丝丝心蛋白和蛛丝丝心蛋白组成的组中的至少一种。
14.如权利要求10～13中任一项所述的方法，其中，所述蛋白质为蛛丝丝心蛋白。
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