CN104684540A - 在丝纤蛋白生物材料中对不相混溶的相的包封 - Google Patents

在丝纤蛋白生物材料中对不相混溶的相的包封 Download PDF

Info

Publication number
CN104684540A
CN104684540A CN201380047460.3A CN201380047460A CN104684540A CN 104684540 A CN104684540 A CN 104684540A CN 201380047460 A CN201380047460 A CN 201380047460A CN 104684540 A CN104684540 A CN 104684540A
Authority
CN
China
Prior art keywords
silk
compositions
granule
activating agent
miscible
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201380047460.3A
Other languages
English (en)
Inventor
戴维·L·卡普兰
菲奥伦佐·奥米内托
E·M·普里查德
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Tufts University
Original Assignee
Tufts University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Tufts University filed Critical Tufts University
Publication of CN104684540A publication Critical patent/CN104684540A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/30—Macromolecular organic or inorganic compounds, e.g. inorganic polyphosphates
    • A61K47/42—Proteins; Polypeptides; Degradation products thereof; Derivatives thereof, e.g. albumin, gelatin or zein
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23L—FOODS, FOODSTUFFS, OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT COVERED BY SUBCLASSES A21D OR A23B-A23J; THEIR PREPARATION OR TREATMENT, e.g. COOKING, MODIFICATION OF NUTRITIVE QUALITIES, PHYSICAL TREATMENT; PRESERVATION OF FOODS OR FOODSTUFFS, IN GENERAL
    • A23L35/00—Food or foodstuffs not provided for in groups A23L5/00 – A23L33/00; Preparation or treatment thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/01—Hydrocarbons
    • A61K31/015—Hydrocarbons carbocyclic
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/185—Acids; Anhydrides, halides or salts thereof, e.g. sulfur acids, imidic, hydrazonic or hydroximic acids
    • A61K31/19—Carboxylic acids, e.g. valproic acid
    • A61K31/20—Carboxylic acids, e.g. valproic acid having a carboxyl group bound to a chain of seven or more carbon atoms, e.g. stearic, palmitic, arachidic acids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/335—Heterocyclic compounds having oxygen as the only ring hetero atom, e.g. fungichromin
    • A61K31/35—Heterocyclic compounds having oxygen as the only ring hetero atom, e.g. fungichromin having six-membered rings with one oxygen as the only ring hetero atom
    • A61K31/352—Heterocyclic compounds having oxygen as the only ring hetero atom, e.g. fungichromin having six-membered rings with one oxygen as the only ring hetero atom condensed with carbocyclic rings, e.g. methantheline 
    • A61K31/353—3,4-Dihydrobenzopyrans, e.g. chroman, catechin
    • A61K31/355—Tocopherols, e.g. vitamin E
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7042—Compounds having saccharide radicals and heterocyclic rings
    • A61K31/7052—Compounds having saccharide radicals and heterocyclic rings having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. nucleosides, nucleotides
    • A61K31/706—Compounds having saccharide radicals and heterocyclic rings having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. nucleosides, nucleotides containing six-membered rings with nitrogen as a ring hetero atom
    • A61K31/7064—Compounds having saccharide radicals and heterocyclic rings having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. nucleosides, nucleotides containing six-membered rings with nitrogen as a ring hetero atom containing condensed or non-condensed pyrimidines
    • A61K31/7076—Compounds having saccharide radicals and heterocyclic rings having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. nucleosides, nucleotides containing six-membered rings with nitrogen as a ring hetero atom containing condensed or non-condensed pyrimidines containing purines, e.g. adenosine, adenylic acid
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/46—Ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. skin, bone, milk, cotton fibre, eggshell, oxgall or plant extracts
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K8/00—Cosmetics or similar toiletry preparations
    • A61K8/02—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by special physical form
    • A61K8/11—Encapsulated compositions
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K8/00—Cosmetics or similar toiletry preparations
    • A61K8/18—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition
    • A61K8/30—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition containing organic compounds
    • A61K8/64—Proteins; Peptides; Derivatives or degradation products thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/10—Dispersions; Emulsions
    • A61K9/107—Emulsions ; Emulsion preconcentrates; Micelles
    • A61K9/1075—Microemulsions or submicron emulsions; Preconcentrates or solids thereof; Micelles, e.g. made of phospholipids or block copolymers
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/70—Web, sheet or filament bases ; Films; Fibres of the matrix type containing drug
    • A61K9/7007—Drug-containing films, membranes or sheets
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
    • A61L27/36—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix
    • A61L27/3604—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix characterised by the human or animal origin of the biological material, e.g. hair, fascia, fish scales, silk, shellac, pericardium, pleura, renal tissue, amniotic membrane, parenchymal tissue, fetal tissue, muscle tissue, fat tissue, enamel
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
    • A61L27/50—Materials characterised by their function or physical properties, e.g. injectable or lubricating compositions, shape-memory materials, surface modified materials
    • A61L27/54—Biologically active materials, e.g. therapeutic substances
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23V—INDEXING SCHEME RELATING TO FOODS, FOODSTUFFS OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES AND LACTIC OR PROPIONIC ACID BACTERIA USED IN FOODSTUFFS OR FOOD PREPARATION
    • A23V2002/00—Food compositions, function of food ingredients or processes for food or foodstuffs

Abstract

本申请所述的各个方面的实施方式涉及用于在基于丝的材料中包封和/或稳定油、脂质、疏水性和/或亲脂性化合物的组合物和方法。本申请所述的组合物能够用于多种应用，例如药品、化妆品、食品、诊断和组织工程应用。

Description

在丝纤蛋白生物材料中对不相混溶的相的包封
相关申请的交叉引用
本申请根据35U.S.C.§119(e)要求2012年7月13日提交的美国临时申请号61/671,336和2013年3月15日提交的61/791,185的优先权，其全部内容均通过引用并入本申请。
发明领域
本申请一般地涉及用于在生物相容性基质中包封和/或稳定包含活性剂的油、脂质、疏水性或亲脂性化合物的组合物和方法。
背景技术
此前已在制药工业中使用的以改善药物生物利用度、使药物稳定以对抗多种降解途径、使副作用最小化或改善药物的释放动力学的包封或微包封技术也已经被讨论用于其他领域，例如食品(Gibbs等，1999；Madene等，2006)和香料(Berthier等，2010；Ouali等，2006)。微包封通常是一种方法，在所述方法中微小的颗粒或液滴被保护性涂层所包围，或者其包埋于包封基质或膜中，以便在所掺入的化合物与周围环境之间提供物理屏障(等，2006；Madene等，2006；Gharsallaoui等，2007；Sohail等，2011)。
此前已经报道了多种包封材料和技术(参见例如Gouin，2004；Gibbs等，1999；Gharsallaoui等，2007；Madene等，2006；Kuang等，2010)。被讨论可用作包封基质的一些生物聚合物包括例如天然胶(例如阿拉伯胶、海藻酸盐、角叉菜胶)、蛋白(例如牛乳或乳清蛋白、明胶)、具有不同右旋糖当量的麦芽糖糊精和蜡及其混合物(Gharsallaoui等，2007)。可以将蛋白作为包封材料，因为其理化性质(包括例如两亲性特性、具有自结合和与多种物质相互作用的能力、具有较高的分子量以及分子链的柔性)能够提供用于包封的多种功能性性质(包括例如溶解度、粘度、乳化作用和薄膜形成)(Madene等，2006；Gharsallaoui等，2007；Baranauskiene等，2006；Dickinson,2011)。在乳剂形成过程中，蛋白分子能够通过在新形成的油-水界面的迅速吸附起到乳化剂的作用，形成空间-稳定的层(Arshady等，1990；Madene等，2006；Dickinson,2011)。然而，使用蛋白作为包封材料用于某些应用可能是具有挑战性的。例如，明胶具有严重的缺点，这限制了其广泛的应用。即使在较低的浓度下明胶也具有很高的粘度，在冷水中具有较低的溶解度，戊二醛(用于使明胶交联的化学试剂)对人体是有毒性的(Jun-xia等，2011)。此外，由于近期出现的疾病如朊病毒，使得对动物来源蛋白安全性问题的关注有所增加(Chourpa等，2006)。
而且，多种现有的包封方法需要的工艺条件会导致脆弱的化合物降解和/或损害最终产物的安全性(如暴露于高热下或使用毒性交联化学物质(Liu等，1996；Qian等，1997；Demura等，1989；Lu等，2010))。例如，已对将水性蛋白溶液分散在油浴中的油包水乳剂(有时使用乳化剂和/或表面活性剂进行稳定)中制备蛋白微球，然后通过利用热处理或化学处理的悬浮交联稳定所述蛋白进行了探讨(Arshady,1990；Jayakrishnan等，1994；Esposito等，1996；Imsombut等，2010)。Imsombut等已使用这种方法制备出了丝微球，其使用乙酸乙酯作为油相、司盘80作为油溶性乳化剂以及京尼平作为交联剂(Imsombut等，2010)。然而，不使用化学添加剂的工艺是优选的，因为化学添加剂可能在体内具有毒性副作用或对脆弱的化合物造成损害(Esposito等，1996)。已对在油包水乳剂中的蛋白液滴不经过化学处理而是通过加热油浴以交联所述蛋白基质而转变成微粒进行了讨论(Arshady,1990；Esposito等，1996)。然而，考虑到很多活性剂具有对温度敏感的性质最好避免加热(Jun-xia等，2011；Kanakdande等，2007)。因此，开发一种能够减少不稳定分子(例如挥发性和/或亲脂性分子)的损失、维持这些不稳定分子在消费产品中的存在和/或保护并稳定这些不稳定分子的新型包封技术仍是一项尚未被满足的需求。
概述
多种现有的包封方法需要的工艺条件会导致不稳定分子(例如挥发性、疏水性和/或亲脂性分子)降解和/或损害最终产物的安全性和/或有效性(如暴露于高热下或使用毒性交联化学物质)。因此，开发一种能够改善不稳定分子(例如挥发性、疏水性和/或亲脂性分子)的包封效率、保护并稳定这些不稳定分子和/或使这些不稳定分子可控地释放的新型包封技术仍是一项尚未被满足的需求。
发明人特别地提出了使用基于乳剂的工艺在丝生物材料中包封油的新技术，该技术利用了丝独特的性质，包括例如两亲性、生物相容性、水性和周围环境下处理以及具有可调节的物理交联性能。例如，在一些实施方式中，使用美国专利申请号8,187,616中描述的超声诱导的丝自组装制备丝水凝胶代替常规用于稳定在油包水(W/O)和油包水包油(O/W/O)类型乳剂中的水性蛋白相的热或化学悬浮交联。例如，通过将丝溶液(任选地包含油滴)超声并将经超声的丝溶液转移至油浴中生产负载油(任选地含有油溶性活性剂)或负载水溶性活性剂的稳定的丝微粒和大颗粒。已发现油微液滴能够在水性丝溶液中稳定地乳化而无需加入任何乳化剂，并且油微液滴的存在不会阻碍丝自组装成固态的丝材料如薄膜或水凝胶网络。发明人还发现在O/W/O乳剂中，颗粒的形态和在所述丝对内部油相的亲脂性活性剂的渗透性(或者所述亲脂性活性剂从内部油相向周围环境的释放)至少部分由丝溶液的浓度、对丝的处理和/或超声所决定。这些在丝生物材料中的油相的稳定乳剂(包封了油的丝生物材料)能够用于多种应用，例如在组织工程中如模拟具有较高脂质含量的组织，以及用于递送和/或稳定/贮存在所述丝生物材料的油相中是可溶的活性剂如治疗剂、诊断剂、食品添加剂、脂质和化妆品活性剂。
因此，本申请提供的各种方面的实施方式涉及组合物，所述组合物包含分散于基于丝的材料中的不相混溶的相(例如油相)的乳剂，以及制备和使用所述组合物的方法。在一些实施方式中，所述不相混溶的相可以含有至少一种油溶性的、疏水性或亲脂性活性剂。在一些实施方式中，为了在水性丝中生产油滴的稳定乳剂，可以对丝混合物进行超声处理。在这些实施方式中，可以将含有分散的油滴的所述经超声的丝溶液进一步引入油浴中以形成负载油的丝颗粒(例如包封了一个或多个油滴的丝颗粒)。
在一个方面，本申请涉及基于丝的乳剂组合物。所述组合物包含至少两个不相混溶的相，第一不相混溶的相包含基于丝的材料和第二不相混溶的相包含活性剂，其中所述第一不相混溶的相包封所述第二不相混溶的相(换言之，所述第二不相混溶的相分散于所述第一不相混溶的相中)，并且所述第二不相混溶的相不包括脂质体。
在一些实施方式中，所述第二不相混溶的相可以包含脂质成分，例如但不限于油、脂肪酸、甘油脂质、甘油磷脂、鞘脂，糖脂、聚酮化合物，甾醇脂和异戊烯醇脂质。在一些实施方式中，所述脂质成分可以不含磷脂。在一些实施方式中，所述脂质成分可以不含甘油磷脂。在一个实施方式中，所述脂质成分是油。
所述第二不相混溶的相能够形成任意尺寸和/或形状的单个或多个(例如至少两个或多个)液滴。所述液滴的尺寸和/或形状能够随着多种因素改变，包括例如丝溶液的浓度和/或对丝的处理。在一些实施方式中，所述液滴尺寸的范围可以为约1nm至约1000μm，或者约5nm至约500μm。
任意优选地是可溶于所述第二不相混溶的相中的活性剂均可以包括在所述第二不相混溶的相中。在一些实施方式中，在所述第二不相混溶的相中存在的活性剂是挥发性的、疏水性的和/或亲脂性的分子。所述挥发性的、疏水性的和/或亲脂性的分子的示例包括但不限于治疗剂、营养剂、化妆剂、染色剂、益生菌剂、染料、芳香族化合物、脂肪族化合物(例如但不限于烷烃、烯烃、炔烃、环脂肪族化合物如环烷烃、环烯烃和环炔烃)、小分子及其任意组合。
在一些实施方式中，所述第二不相混溶的相还可以包封第三不相混溶的相，例如水相。
当所述第二不相混溶的相可以是液体时，所述第一不相混溶的相(包含基于丝的材料)可以是固态/或胶状。或者，当所述第二不相混溶的相可以是固态/胶状时，所述第一不相混溶的相(包含基于丝的材料)可以是固态/胶状。在一些实施方式中，所述水相可以包含孔并且所述油相可以占据至少一个所述孔。
所述第二不相混溶的相(例如脂质液滴)与所述第一不相混溶的相(例如基于丝的材料)的体积比可以随着乳液构造、丝溶液的浓度、对丝的处理、超声处理和/或对所述组合物的应用而改变。在一些实施方式中，所述脂质液滴与所述基于丝的材料的体积比范围可以为从约1000:1至约1:1000，或从约500:1至约1:500，从约100:1至约1:100或者从约10:1至约1:10。
所述第一不相混溶的相包含基于丝的材料。所述基于丝的材料在水性介质中可以是可溶性的或不溶性的。所述基于丝的材料在水性介质中的溶解度可以由在丝纤蛋白中β片层的含量控制。例如，可以通过对所述基于丝的材料进行后处理以增加在所述丝纤蛋白中β片层的含量，所述后处理增加β片层的形成以使得其含量足以使得基于丝的材料在水性介质中能够对抗溶解。
在一些实施方式中，所述第一不相混溶的相还可以包含添加剂和/或第二活性剂。在一些实施方式中，可以将所述添加剂和/或所述第二活性剂掺入所述基于丝的材料中。所述第二活性剂可以是任意优选地可溶于所述第一不相混溶的相的试剂。
可以加入所述第一不相混溶的相中的所述添加剂的非限制性示例包括生物相容性聚合物；增塑剂(例如甘油)；刺激应答剂；乳化剂或乳剂稳定剂(例如聚乙烯醇和卵磷脂)、表面活性剂(例如聚山梨醇酯-20)、界面张力降低剂(例如盐)、β-片层诱导剂(例如盐)、可检测剂、有机或无机小分子；糖类；寡糖；多糖；生物大分子，例如肽、蛋白以及肽类似物和衍生物；拟肽；抗体及其抗原结合片段；核酸；核酸类似物和衍生物；糖原或其他糖；免疫原；抗原；由生物材料如细菌、植物、真菌或动物细胞制备的提取物；动物组织；天然存在的或合成的组合物；及其任意组合。根据所述基于丝的材料的形式，所述添加剂可以以任意形式存在，例如包括但不限于颗粒(例如纳米粒或微粒，包括等离子体颗粒)、纤维、管、薄膜、凝胶、网状物、垫、无纺垫、粉末或其任意组合。在一些实施方式中，所述添加剂可以包括丝材料，例如但不限于丝颗粒、丝纤维、微米尺寸的丝纤维、未经加工的丝纤维及其任意组合。
在一些实施方式中，所述基于丝的材料可以在其至少一个表面上包含光学图样。例如，所述光学图样可以包含能够提供光学功能的全息图或图样阵列，所述光学功能例如但不限于光反射、衍射、散射、晕彩及其任意组合。
所述基于丝的材料可以以任意形式或形状存在。例如，所述基于丝的材料可以是薄膜、薄片、凝胶或水凝胶、筛网、垫、无纺垫、织物、支架、管、板或块、纤维、颗粒、粉末、三维结构、植入物、泡沫或海绵、针、冻干材料、多孔材料、无孔材料或其任意组合的形式。在一些实施方式中，所述基于丝的材料可以以水合状态(例如作为水凝胶)存在。在一些实施方式中，所述基于丝的材料可以以干燥状态存在，例如通过在室温条件下干燥和/或通过冻干。在一些实施方式中，所述冻干的基于丝的材料可以是多孔的。
在一些实施方式中，所述基于丝的材料能够形成薄膜。
在一些实施方式中，所述基于丝的材料能够形成支架。
在一些实施方式中，所述基于丝的材料能够形成颗粒。因此，本申请的其他方面涉及包含脂质液滴乳剂的丝颗粒，以及包含所述丝颗粒的组合物。在一个方面，本申请提供了一种丝颗粒，所述丝颗粒包含至少两个不相混溶的相，第一不相混溶的相包含丝纤蛋白并且第二不相混溶的相包含活性剂，其中所述第一不相混溶的相包封所述第二不相混溶的相(换言之，所述第二不相混溶的相分散于所述第一不相混溶的相中)，并且所述第二不相混溶的相不包括脂质体。
所述丝颗粒可以是任意尺寸。例如，所述丝颗粒的尺寸范围可以是从约10nm至约10mm、或者从约50nm至约5mm。
在所述丝颗粒中所述第二不相混溶的相可以形成单个或多个(例如至少两个或更多个)任意尺寸和/或形状的液滴。所述液滴的尺寸和/或形状的范围可以随着多种因素而改变，所述因素包括例如丝溶液的浓度、对丝的处理和/或所述丝颗粒的尺寸。在一些实施方式中，所述液滴的尺寸范围可以是从约1nm至约1000μm，或者从约5nm至约500μm。
本申请还提供了组合物，所述组合物包含多个(例如至少两个或更多)所述丝颗粒的一个或多个实施方式。根据预定用途(例如但不限于药物产品、化妆产品、个人护理产品和食品产品)，可以将所述组合物制剂以形成乳剂、胶体、乳膏、凝胶、洗剂、糊剂、软膏、搽剂、香膏、液体、固体(例如蜡)、薄膜、薄片、织物、网状物、海绵、气雾剂、粉末、支架或其任意组合。
根据本申请所述的各个方面，丝可以起到乳化剂的功能以稳定分散于基于丝的材料中的脂质液滴的乳剂。而且，丝可以稳定包封于其中的活性剂，如国际专利申请号WO2012/145739中所述，其内容通过引用并入本申请。因此，本申请的又一个方面涉及一种贮存稳定的基于丝的乳剂组合物。所述贮存稳定包含本申请所述的基于丝的乳剂组合物或本申请所述的丝颗粒，其中存在于所述组合物或丝颗粒的所述第二不相混溶的相(例如脂质液滴)中的所述活性剂(例如挥发性的、疏水性的和/或亲脂性药剂)在将所述组合物(a)经过至少一个冻融循环，或者(b)在约为室温或高于室温的温度下保持至少约24小时，或者(c)经过(a)和(b)两者后保持其原始生物活性和/或原始载量的至少约30％。
本申请所述的贮存稳定的组合物可以保护所述活性剂使其免于因温度波动和/或未进行冷藏而导致失活和/或降解。在一些实施方式中，当将其暴露于光照条件或者至少约10％或更高的相对湿度时，本申请所述的贮存稳定的组合物还能够稳定所述活性剂。因此，在一些实施方式中，在将所述组合物也保持在暴露于光照的条件下后，存在于所述组合物或丝颗粒的所述第二不相混溶的相(例如脂质液滴)中的所述活性剂(例如挥发性的、疏水性的和/或亲脂性药剂)仍能够保持其原始生物活性和/或原始载量的至少约30％。在一些实施方式中，在将所述组合物也保持在相对湿度至少约10％或更高的条件下后，存在于所述组合物或丝颗粒的所述第二不相混溶的相(例如脂质液滴)中的所述活性剂(例如挥发性的、疏水性的和/或亲脂性药剂)仍能够保持其原始生物活性和/或原始载量的至少约30％。
在一些实施方式中，所述基于丝的材料或所述丝颗粒可以以干燥状态或冻干状态存在。
可以采用本领域公知的任意方法生产本申请所述的负载脂质液滴的丝颗粒。例如，在一些实施方式中，可以生产中空的丝颗粒，例如使用相分离方法，如在国际专利申请号WO 2011/041395中所描述的，或脂质模板引导制备方法，如在国际专利申请号WO2008/118133中所描述的，随后将其浸没在油溶液中以便将油负载/扩散进入所述丝颗粒。在一些实施方式中，可以对脂质液滴在水性丝溶液中的乳剂进行冷冻干燥处理。在一些实施方式中，可以采用如本申请所述的新制备工艺生产负载脂质液滴的丝颗粒，可以对所述方法进行控制以生产在其中包封一个或多个脂质液滴的丝颗粒。
制备本申请所述的负载脂质液滴的丝颗粒的新工艺包括(a)提供分散在处于溶胶-凝胶转变的丝溶液(其中所述丝溶液保持在混合状态)中的非水性液滴的乳剂；和(b)将预先确定体积的所述乳剂加入到非水相中，以使得所述丝溶液在所述非水相中形成在其中包封至少一个非水性液滴的丝颗粒。
在一些实施方式中，步骤(a)中的所述乳剂可以通过将非水性、不相混溶的相加入到所述丝溶液中生产，以形成分散于所述丝溶液中的非水性液滴的乳剂。在一些实施方式中，所述非水性液滴还可以包含本申请所述的挥发性的、疏水性的和/或亲脂性的分子。在这些实施方式中，可以在形成所述乳剂之前将所述挥发性的、疏水性的和/或亲脂性的分子加入所述非水性不相混溶的相中。
当将所述丝溶液加入非水相例如油相时，所述丝溶液的溶胶-凝胶转变可以持续任意时间，只要包含所述非水性液滴的所述丝溶液在加入到非水相时仍保持溶液状态即可，然后其能够在所述非水相中形成凝胶颗粒。在一些实施方式中，所述溶胶-凝胶转变能够持续至少约15分钟或更长时间，包括例如至少约30分钟、至少约1小时、至少约2小时或更长时间。
尽管可以采用本领域公知的任意方法诱导所述丝溶液的溶胶-凝胶转变，包括例如超声、剪切应力、电凝胶化、pH降低、盐加入、空气干燥、水退火、水蒸气退火、醇浸没或其任意组合，在一个实施方式中，可以通过超声诱导所述丝溶液的溶胶-凝胶转变。在一些实施方式中，可以在振幅约1％至约50％、或约5％至约25％、或约10％至约15％的条件下进行所述超声。在一些实施方式中，所述超声的持续时间可以从约5秒至约90秒、或从约15秒至约60秒或者从约30秒至约45秒。可以对超声处理参数(例如振幅、时间或这两者)进行控制，以使得所得到的丝颗粒具有所需的材料性质(例如丝颗粒尺寸和/或形状、脂质液滴尺寸和/或形状和/或作为包封材料的丝的渗透性)。
除了超声处理参数以外，所述丝颗粒材料性质的其他控制参数包括例如但不限于丝溶液的性质(例如组分、浓度、溶液粘度、丝脱胶时间)、颗粒制备参数(例如存在或不存在颗粒涂层、丝纤蛋白与脂质相的体积比、和加入连续相(例如油相)的基于丝的乳剂(脂质液滴分散于所述溶胶-凝胶丝溶液中)的体积、对所述丝颗粒的后处理(例如但不限于β片层诱导处理如冻干、水退火和水蒸气退火)(如果有的话)及其任意组合。
仅作为示例之用，所述丝溶液的浓度能够部分地影响脂质包封的构象。例如，较高浓度的丝溶液能够产生在整个含丝的相中悬浮了多个油滴的分散液(称为“微球”)，而浓度较低的丝溶液能够产生“微囊”构象，其中在各颗粒中均含有被丝囊所围绕的一个较大的脂质液滴。因此，所述丝溶液能够具有的浓度为约0.5％(w/v)至约30％(w/v)、约1％(w/v)至约15％(w/v)或约2％(w/v)至约7％(w/v)。
在一些实施方式中，所述溶胶-凝胶溶液还可以包含本申请所述的活性剂。
通过将预先确定体积的步骤(a)中得到的乳剂加入非水相(例如油相)中，例如通过挤出样工艺滴加，能够控制所得到的丝颗粒的尺寸。例如，所述乳剂预先确定的体积基本上与所述丝颗粒所需的尺寸相对应或成比例。
在一些实施方式中，所述方法还可以包括从所述非水相中分离所形成的丝颗粒。
在一些实施方式中，所述方法还可以包括对所述丝颗粒进行后处理。所述后处理可以包括改变所述丝颗粒的至少一种材料性质的任意处理。如，在一些实施方式中，所述后处理可以包括脱水处理(例如通过干燥或冻干)以生产干燥状态的丝颗粒。在一些实施方式中，所述丝颗粒的冻干可以在其中的丝基质中引入多孔性结构。在其他实施方式中，所述后处理可以包括在所述颗粒的丝纤蛋白中进一步诱导构象改变的处理。可以通过例如但不限于冻干或冷冻干燥、水退火、水蒸气退火、醇浸没、超声、剪切应力、电凝胶化、pH降低、盐加入、空气干燥、电纺丝、延展或其任意组合中的一种或多种诱导丝纤蛋白中的构象改变。
本申请所述的组合物的不同实施方式可以用于，例如，组织工程中如模拟具有较高脂质含量的组织，或者使本申请所述的挥发性的、疏水性的和/或亲脂性的试剂控释和/或稳定。因此，本申请还提供了使用所述组合物的一个或多个实施方式的方法。例如，本申请所述的组合物的一些实施方式可以用于稳定在所述组合物的第二不相混溶的相中存在的活性剂(例如在油相内存在的挥发性的、疏水性的和/或亲脂性的试剂)。因此，在一个方面，所述使用方法可以包括保持本申请所述的至少一种组合物(包括本申请所述的贮存稳定的组合物)或至少一种丝颗粒，并且其中存在于所述组合物或所述丝颗粒的所述第二不相混溶的相中的所述活性剂在将所述组合物(a)经过至少一个冻融循环，或者(b)在约为室温或高于室温的温度下保持至少约24小时，或者(c)经过(a)和(b)两者后保持其原始生物活性和/或原始载量的至少约30％。在一些实施方式中，所述组合物可以保持至少约1个月或更长时间。
附加的或替代性的，本申请所述组合物的一些实施方式可以用于使活性剂(例如在油相内存在的挥发性的、疏水性的和/或亲脂性的试剂)从所述组合物的所述第二不相混溶的相中控制释放出来。因此，在一个方面，所述使用的方法可以包括保持本申请所述的至少一种组合物(包括本申请所述的贮存稳定的组合物)或至少一种丝颗粒，其中所述基于丝的材料对所述至少一种活性剂是可渗透的，以使得所述活性剂能够通过所述基于丝的材料以预先确定的速率释放进入周围的环境中。在一些实施方式中，可以通过例如调整在所述基于丝的材料中存在的β-片层构象的丝纤蛋白的量、所述基于丝的材料的孔隙度或其组合控制预先确定的所述释放速率。
所述组合物可以在任意环境条件下保持。例如，在一些实施方式中，所述组合物可以保持在约为室温的条件下。在其他实施方式中，所述组合物可以保持在约37℃或更高的温度下。在一些实施方式中，所述组合物可以保持在暴露于光照的条件下。在一些实施方式中，所述组合物可以保持在相对湿度至少约10％或更高的条件下。
在另一个方面，本申请提供了一种递送活性剂(例如挥发性的、疏水性的和/或亲脂性的试剂)的方法，所述方法包括应用于或给予对象本申请所述的至少一种组合物(包括本申请所述的贮存稳定的组合物)或至少一种丝颗粒，所述组合物或丝颗粒的基于丝的材料对所述活性剂是可渗透的，以使得在将所述组合物应用于或给予所述对象后所述活性剂能够通过所述基于丝的材料以预先确定的速率释放。
根据应用目的和/或应用部位，在一些实施方式中，在所述组合物的所述第二不相混溶的相中存在的所述活性剂(例如在油相内存在的挥发性的、疏水性的和/或亲脂性的试剂)可以释放进入周围的环境中，例如空气中。在这些实施方式中，可以将所述组合物局部地应用于所述对象。在一个实施方式中，可以将所述组合物应用于对象的皮肤或表面。所述对象可以是活体对象，例如哺乳动物对象，或者其可以是物理对象，如制品。
或者，当将所述组合物体内应用或施用时，在所述组合物的所述第二不相混溶的相中存在的所述活性剂(例如在油相内存在的挥发性的、疏水性的和/或亲脂性的试剂)可以释放至对象的靶生物细胞。在这些实施方式中，可以将所述组合物口服或胃肠外应用于或给予所述对象。
附图简述
图1是使用油/水/油(O/W/O)乳剂制备示例性包封油的丝微粒的示意图，所述丝微粒含有经超声处理的丝纤蛋白水溶液作为包封的水相。一旦经过超声，丝开始转变为物理上交联的水不溶性水凝胶状态，但是其在可控的时间段内仍处于溶液状态，这取决于例如所述丝的性质和/或超声参数。在溶液状态时，油在所述丝溶液中能够被乳化，并且所述W/O乳剂还能够在连续的油相中被乳化。在所述连续的油相中，所述包封了油的丝液滴保持在球形构象中直至交联完成，此时所述丝成为油的稳定的、水不溶性的水凝胶包封基质。
图2A-2B是显示与水性丝溶液混合的含有染料的油的乳剂的图像。图2A是显示葵花油的乳剂的图像，所述葵花油的乳剂中含有与～7％(w/v)水性丝溶液混合的油红O(Oil RedO)，油与丝的比例为～1:3(v/v)，其在超声前倒置混合(～10min)。图2B是显示葵花油的乳剂的图像，所述葵花油的乳剂中含有与～7％(w/v)水性丝溶液混合的油红O，油与丝的比例为～1:3(v/v)，其在轻柔超声(～10％的振幅～5秒)后倒置混合(～10min)。比例尺＝250μm。
图3A-3B是分别显示仅由丝溶液(图3A)和油微乳(图3B)(油：丝为～1:20；丝为～3％(w/v)，经～45分钟的脱胶制备)制备的并使用相同的全息图样模具浇铸的全息图样丝薄膜的图像。
图4A-4F是显示根据本申请所述的一个或多个实施方式的丝液滴的照片。图4A显示了保持在葵花油浴中的球形液滴中的经超声的丝溶液(可由所述颗粒略呈半透明状态证明：丝没有完全转变为水凝胶状态)。图4B显示了保持在葵花油浴中的球形液滴中的经超声的丝溶液，所述丝溶液含有负载有分散了油红O的油的微液滴。图4C是保持在球形液滴中的经超声的丝溶液的侧视图，其中所述经超声的丝溶液含有绿色食用色素以易于目测辨识。图4D显示了仅由经超声的丝制备的水凝胶丝球，其能够在葵花油浴中完全交联，在从所述油浴中移出后保持其形状。图4E显示了在脱水前负载油的丝水凝胶微球(丝基质是软水凝胶)。图4F显示了负载油的丝球，其特征为具有更坚固、更致密的丝包封基质，其为所述丝水凝胶网状物在环境条件下干燥过夜脱水所获得的。
图5A-5D是显示负载活性剂的丝颗粒的图像。图5A是显示负载阿霉素的丝水凝胶大颗粒的照片，所述丝水凝胶大颗粒通过将受控体积的含有阿霉素的溶胶-凝胶丝溶液移入葵花油浴中制备。图5B是显示负载食用色素的丝水凝胶大颗粒的照片，所述丝水凝胶大颗粒通过将受控体积的含有食用色素的溶胶-凝胶丝溶液移入葵花油浴中制备，并且脱水的丝大颗粒通过将丝水凝胶大颗粒干燥制备。图5C-5D是通过将加入葵花油浴中的丝超声制备的丝微球的图像(水/油(W/O)乳剂)(丝含有1:100体积比的用于目测辨识的食用色素)。比例尺＝100μL。
图6A-6B是显示使用O/W/O乳剂制备的包封油的丝微粒的图像，例如，使用～60分钟脱胶时间再生丝纤蛋白溶液。图6A是显示使用～6％(w/v)丝溶液在～15％的振幅下超声～45秒制备的O/W/O乳剂的图像，其中将所述丝脱胶约～60分钟。图6B是显示使用～3％(w/v)丝溶液在～15％的振幅下超声～30秒制备的O/W/O乳剂的图像，其中将所述丝脱胶约60分钟。比例尺＝300μm。
图7A-7D是显示使用O/W/O乳剂制备的包封油的丝微粒的图像，其使用经不同超声参数处理的～6％(w/v)丝溶液，其中将所述丝脱胶～30分钟。图7A-7B显示了包封油的丝微粒，其中丝在～10％的振幅下超声处理～15秒。图7C-7D显示了包封油的丝微粒，其中丝在～15％的振幅下超声处理～15秒。
图8A-8D是油(例如油红O)从丝微粒的内部油囊向外部油相(例如葵花油浴)相对扩散的吸光度测定结果(在～518nm)。图8A显示了对应于未经过超声的丝的吸光度测定结果。图8B显示了对应于在～15％的振幅下超声处理约30秒的～3％(w/v)丝溶液的吸光度测定结果，所述丝的脱胶持续时间是变化的(例如30分钟或60分钟)。图8C显示了对应于～6％(w/v)丝溶液的吸光度测定结果，所述丝溶液采用～30分钟脱胶持续时间随后暴露于变化的超声条件下制备：无超声、在～10％的振幅下超声～15秒或者在～15％的振幅下超声～15秒。图8D显示了对应于～6％(w/v)丝溶液的吸光度测定结果，所述丝溶液采用～60分钟脱胶持续时间随后暴露于变化的超声条件下制备：无超声、在～15％的振幅下超声～30秒或者在～15％的振幅下超声～45秒。
图9A-9B是显示在O/W/O微球中形成丝“皮肤”的图像：在外部油-水界面，所述丝皮肤出现“袋状”(图9A)或形成“折皱”(图9B，白色箭头)。
图10是显示对未经处理的、负载染料的丝薄膜在水中溶解进行时程研究的一组照片。负载靛蓝胭脂红(上面一行)和荧光黄(下面一行)的未经处理的丝薄膜在暴露于～37℃的水中～3分钟内开始溶解并且在浸入约30分钟后完全溶解。
图11A-11B是显示通过在反射图样硅模具上浇铸油-丝微乳制备的自支撑2D微棱镜阵列的一组照片。图11A是未使用闪光灯拍摄的照片和图11B是使用闪光灯拍摄的，表明其保留了反射的功能性。
图12是显示丝水凝胶球的照片，所述丝水凝胶球通过超声所述丝溶液，并向所述经超声但仍处于溶液状态的丝中加入食用色素(所加入的食用色素的体积保持恒定，如所示的改变红色、蓝色和黄色食用色素的比例)，等分加入油浴并使得其在环境条件的压力和温度下交联完全。
图13显示了加入葵花油层后丝的胶凝化时间缩短，这表明油水界面增加油颗粒周围丝蛋白的组装。
图14是显示具有不同的油与丝比例的包封油的丝微粒图像的一系列图像。所述图像表明增加油与丝的比例能够增加粒径。
发明详述
开发一种能够改善不稳定分子(例如挥发性、疏水性和/或亲脂性分子)的包封效率、保护和稳定这些不稳定分子和/或使这些不稳定分子可控地释放的新型包封技术仍是一项尚未被满足的需求。发明人特别地提出了在丝生物材料中包封油的新技术，该技术能够实现在水性和周围环境下处理以及具有可调节的丝胶凝化性能。例如，在一些实施方式中，可以通过超声诱导丝纤蛋白的胶凝化，如在美国专利号8,187,616中所描述的，该处理能够提供在溶胶-凝胶状态下的丝溶液，其能够保持足够长时间的溶液状态以便在其胶凝前进行双乳化。因此，在一些实施方式中，可以通过例如超声丝溶液(任选地包含油滴)并且将经超声的丝溶液转移至油浴中生产负载油(任选地含有油溶性活性剂)或负载水溶性活性剂的稳定的丝微粒或大颗粒。已发现油微液滴能够在水性丝溶液中稳定地乳化而无需加入任何乳化剂并且油微液滴的存在不会阻碍丝自组装成固态的丝材料如薄膜或水凝胶网络。发明人还发现在O/W/O乳剂中，颗粒的形态和在所述丝对油相内部的亲脂性活性剂的渗透性(或者所述亲脂性活性剂从油相内部向周围环境的释放)至少部分地由丝溶液的浓度、对丝的处理和/或超声所决定。这些在丝生物材料中的油相的稳定乳剂(包封了油的丝生物材料)能够用于多种应用，例如在组织工程中如模拟具有较高脂质含量的组织，以及用于递送和/或稳定/贮存在可溶于所述丝生物材料的油相中的活性剂如治疗剂、诊断剂、食品添加剂如食用色素或调味剂、脂质和化妆品活性剂或添加剂如抗氧化剂、以及挥发性物质如释放气味的物质(如香料或香水)。因此，本申请提供的各个方面的实施方式涉及组合物，所述组合物包含分散于基于丝的材料中的不相混溶的相(例如液态油相)的乳剂，以及制备和使用所述组合物的方法。
包含至少两个不相混溶的相的基于丝的组合物(例如丝颗粒)
在一个方面，本申请提供了涉及基于丝的乳剂组合物。所述组合物包含至少两个不相混溶的相，第一不相混溶的相包含基于丝的材料而且第二不相混溶的相比包含活性剂，其中所述第一不相混溶的相包封所述第二不相混溶的相。换言之，所述第二不相混溶的相分散于所述第一不相混溶的相中，形成所述第二不相混溶的相分散于所述第一不相混溶的相中的乳剂。
术语“不相混溶的”取其通常含义指在将两种此类材料混合时两种材料不能完全混溶从而导致在混合物中含有一个以上的相。在一些实施方式中，在本申请中提供的两个不相混溶的相可以是不能完全混溶的两种液体。在一些实施方式中，在本申请中提供的两个不相混溶的相可以是形成固体-液体界面的液体和固体材料。在一些实施方式中，在本申请中提供的两个不相混溶的相可以是形成固体-固体界面的两种固体。在一些实施方式中，在本申请中提供的两个“不相混溶的”相是完全或几乎完全不相混溶的，即这使得混合物含有两相，其中各相含有至少约95％，优选地至少约99％的单一相。此外，该术语旨在包含两个不相混溶的相能够形成乳剂的情况。例如，在一个实施方式中，所述两个不相混溶的相可以包括基于丝的材料和基于脂质的材料，其能够形成乳剂，在其中脂质液滴分散于基于丝的材料中。
第二不相混溶的相：所述第二不相混溶的相可以是能够与包含基于丝的材料的所述第一不相混溶的相形成界面的任意流体或材料。所述第二不相混溶的相的示例包括但不限于非极性有机溶剂、脂质成分、聚合物(例如但不限于聚乙烯醇、聚(乙二醇)以及基于乙烯氧化物和丙烯氧化物(例如)的嵌段共聚物)和水凝胶。在一些实施方式中，所述第二不相混溶的相可以包含脂质成分，例如但不限于油、脂肪酸、甘油脂质、甘油磷脂、鞘脂，糖脂、聚酮化合物，甾醇脂和异戊烯醇脂质。
在一些实施方式中，所述第二不相混溶的相不包括脂质体。在本申请中使用的术语“脂质体”指包含一个或多个脂质双分子层的微囊。在结构上，脂质体的尺寸和形态范围为从长管至球形。因此，在一些实施方式中，所述脂质成分不含包含在适于脂质体形成的条件下能够形成脂质体的脂肪酸的长链分子。此类脂质成分的示例包括但不限于磷脂酰胆碱(PC)、磷脂酰乙醇胺(PE)、磷脂酸(PA)、磷脂酰甘油(PG)、甾醇如胆固醇、和非自然-脂质、阳离子脂质如DOTMA(N-(1-(2,3-二氧基氧)丙基)-N,N,N-三甲基氯化铵)，以及1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DOPC)；1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DOPE)；1,2-二月桂酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DLPC)和1,2-二肉豆蔻酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DMPC)及其任意组合。在一些实施方式中，所述脂质成分可以不含磷脂。在一些实施方式中，所述脂质成分可以不含甘油磷脂。
在一些实施方式中，所述脂质成分是油。在本申请中使用的术语“油”通常指来源于天然来源如动物或植物或者人工制备的可流动的(在室温下)油。在一些实施方式中，所述术语“油”指来源于动物或植物的可流动的可食用油，包括但不限于鱼油、液态动物脂肪以及蔬菜或植物油，包括但不限于玉米油、椰子油、大豆油、橄榄油、棉籽油、红花油、葵花油、油菜籽油、花生油及其组合(氢化的、非氢化的和部分氢化的油)。能够在本申请中使用的油的其他示例包括但不限于植物油(例如杏仁油、花生油、山金车油、摩洛哥坚果油、鳄梨油、巴巴苏油、猴面包树油、黑籽油、黑莓籽油、黑醋栗籽油、蓝莓籽油、琉璃苣油、金盏花油、亚麻荠油、山茶籽油、蓖麻油、樱桃仁油、可可豆脂、月见草油、葡萄柚油、葡萄籽油、榛子油、大麻籽油、荷荷巴油、柠檬籽油、酸橙籽油、亚麻籽油，夏威夷果油、澳洲坚果油、玉米油、芒果油、白芒花籽油、瓜子油，辣木油、橙籽油、棕榈油、木瓜籽油、激情籽油(passion seed oil)、桃仁油、李子油、石榴籽油、罂粟籽油、南瓜籽油、菜籽油(或油菜籽)油、红树莓籽油、米糠油、玫瑰果油、沙棘油、芝麻油、草莓籽油、甜杏仁油、核桃油、小麦胚芽油)；鱼油(例如：沙丁鱼油、鲭鱼油、鲱鱼油、鳕鱼肝油、牡蛎油)；动物油(例如：共轭亚油酸)；或其他油(例如：石蜡油、环烷基油、芳香油、硅油)；或其任意混合物。
所述油可以包含液体，或者液体和固体颗粒的组合(例如在液体基质中的脂肪颗粒)此外，所述术语“油”可以包括脂肪替代品，其能够用于替代或与动物和/或植物油联用。适宜的脂肪替代品是蔗糖聚酯，如来自Procter&Gamble Co.(宝洁公司)商品名为的。下述美国专利公开了脂肪替代品并且其通过引用并入本申请：1989年11月14日授权的US 4,880,657；1990年10月2日授权的US 4,960,602；1989年5月30日授权的US4,835,001；1996年1月2日授权的US 5,422,131。其他适宜的脂肪替代品包括来自纳贝斯克的品牌产品和各种烷氧基化多元醇如通过引用并入本申请的下述美国专利中所描述的那些：4,983,329；5,175,323；5,288,884；5,298,637；5,362,894；5,387,429；5,446,843；5,589,217；5,597,605；5,603,978和5,641,534。
第二不相混溶的相的数量可以随着不同应用而改变。例如，在一些实施方式中，所述第二不相混溶的相能够形成单一隔室或液滴。在其他实施方式中，所述第二不相混溶的相能够形成多个(例如至少两个或多个包括2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40个或者更多个)隔室或液滴。
所述隔室或液滴的尺寸和/或形状可以随多种因素而改变，包括例如丝的粒径、丝溶液的浓度和/或对丝的处理。在一些实施方式中，所述隔室或液滴的尺寸范围可以是约1nm至约1000μm，或约5nm至约500μm。在一些实施方式中，所述隔室或液滴的尺寸范围可以是约1nm至约1000nm、或约2nm至约750nm、或约5nm至约500nm、或约10nm至约250nm。在一些实施方式中，所述隔室或液滴的尺寸范围可以是约1μm至约1000μm、或约5μm至约750μm、或约10μm至约500μm、或约25μm至约250μm。
在所述第二不相混溶的相(例如油)中优先溶解的和/或能够理想地被分散的任意活性剂均可以包括在所述第二不相混溶的相中。应将在本申请中提及的术语“优先溶解的”理解为指，与在第一不相混溶的相中(例如基于丝的材料)相比所，述活性剂在第二不相混溶的相中具有更高的溶解水平或速率，例如，高至少约10％或者更多，包括例如至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、至少约95％或更多。在一些实施方式中，所述活性剂在第二不相混溶的相中的溶解水平或速率可以比其在第一不相混溶的相中高至少约1.5倍、至少约2倍、至少约3倍、至少约4倍、至少约5倍、至少约10倍或更多。在一些实施方式中，所述术语“优先溶解的”指活性剂在第一不相混溶的相中是完全不溶的但在第二不相混溶的相中是部分或完全溶解的。
在一些实施方式中，存在于第二不相混溶的相中的活性剂是挥发性的、疏水性的和/或亲脂性的试剂。所述挥发性的、疏水性的和/或亲脂性分子的示例包括但不限于治疗剂、营养剂、化妆剂、食品添加剂(例如着色剂或调味剂物质)、益生菌剂、染料、芳香族化合物、释放气味的物质、脂肪族化合物(例如但不限于烷烃、烯烃、炔烃、环脂肪族化合物如环烷烃、环烯烃和环炔烃)、小分子及其任意组合。
在本申请中使用的术语“挥发性试剂”指可蒸发的分子、物质、组合物或其成分。所述挥发性试剂包括但不限于“释放气味的物质”。在本申请中使用的术语“释放气味的物质”指能够使周围环境具有气味包括但不限于令人愉快的、可口的味道的分子、组合物或成分，因此其也包括作为杀虫剂、驱虫剂、空气清新剂、除臭剂、芳香剂、芳香疗法的味道或气味，或者其作用为调节、修饰或以其它方式改变空气或修饰环境的任意其他气味。因此，应理解香水、香料、芳香物质和/或味道，例如在香料制品、食品、化妆品、个人护理产品等中使用的，通常包含一种或多种挥发性试剂均应包含在本申请中。在一些实施方式中，挥发性试剂可以包含从天然物质中提取的天然香料，如水果、植物、花，例如玫瑰精油和薄荷精油，以及人工制备的合成香料，如柠檬烯和芳樟醇。芳香植物部分如水果、草药和树(包括干燥的植物部分如百花香)也可以包括在本申请中。
在一些实施方式中，所述挥发性试剂可以是挥发油。术语“挥发油”指在室温和大气压力下与皮肤接触后能够在少于1小时的时间内蒸发的油(或非水性介质)。在一些实施方式中，所述挥发油可以是挥发性化妆用油，其在室温下是液体，例如在室温和大气压力下具有非零的蒸汽压，例如，具有范围从0.13Pa至40,000Pa(10-3至300mmHg)、从1.3Pa至13,000Pa(0.01至100mmHg)或从1.3Pa至1300Pa(0.01至10mmHg)的蒸汽压。
在本申请中使用的术语“疏水性试剂”指分子、物质、组合物或其成分与在水性介质中相比在非水性介质中(例如有机溶剂或亲脂性溶剂)具有更高的溶解度，例如高至少约10％或更多。在一些实施方式中，所述疏水性试剂与在水性介质中相比在非水性介质中(例如有机溶剂或亲脂性溶剂)可以具有更高的溶解度，所述溶解度高至少约10％或更多，包括例如至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％或更多。在一些实施方式中，所述疏水性试剂与在水性介质中相比在非水性介质中(例如有机溶剂或亲脂性溶剂)可以具有更高的溶解度，所述溶解度至少约1.5倍或更多，包括例如至少约2倍、至少约3倍、至少约4倍、至少约5倍、至少约6倍、至少约7倍、至少约8倍、至少约9倍或更多。
在本申请中使用的术语“亲脂性试剂”指分子、物质、组合物或其成分与在水性介质中相比在油、脂肪、脂质和/或非极性溶剂如己烷或甲苯中具有更高的溶解度，例如高至少约10％或更多。在一些实施方式中，所述亲脂性试剂与在水性介质中相比在油、脂肪、脂质和/或非极性溶剂如正己烷或甲苯中可以具有更高的溶解度，所述溶解度高至少约10％或更多，包括例如至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％或更多。在一些实施方式中，所述亲脂性试剂与在水性介质中相比在油、脂肪、脂质和/或非极性溶剂如正己烷或甲苯中可以具有更高的溶解度，所述溶解度高至少约1.5倍或更多，包括例如至少约2倍、至少约3倍、至少约4倍、至少约5倍、至少约6倍、至少约7倍、至少约8倍、至少约9倍或更多。
在一些实施方式中，所述第二不相混溶的相还可以包封第三不相混溶的相。在一些实施方式中，所述第三不相混溶的相可以包含水相。例如，所述第三不相混溶的相可以包含基于丝的材料。可替代地或附加地，所述第三不相混溶的相可以包含与所述第二不相混溶的相部分或完全不相混溶的材料，例如水凝胶材料。
组合使用的第二不相混溶的相(例如脂质隔室或液滴)与第一不相混溶的相(例如基于丝的材料)的体积比可以随着乳剂的构造(例如如本申请所述的“微球”VS.“微囊”)、丝溶液浓度、对丝的处理、超声处理和/或对组合物的应用的改变而改变。在一些实施方式中，所述脂质隔室或液滴与所述基于丝的材料的体积比范围可以从约1000:1至约1:1000、从约500:1至约1:500、从约100:1至约1:100或从约10:1至约1:10。在一些实施方式中，所述脂质隔室或液滴与所述基于丝的材料的体积比范围可以从约1:1至约1:1000、从约1:2至约1:500、或从约1:5至约1:100或从约1:10至约1:100。在一个实施方式中，所述脂质隔室或液滴与所述基于丝的材料的体积比范围可以从约1:5至约1:20。
第一不相混溶的相：所述第一不相混溶的相包含基于丝的材料。在本申请中使用的术语“基于丝的材料”指一种材料，其中丝纤蛋白构成了全部材料的至少约10％，包括占全部材料的至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、至少约95％、高达和包括100％或者在约30％和约100％之间的任意百分率。在某些实施方式中，所述基于丝的材料可以基本上由丝纤蛋白形成。在不同的实施方式中，所述基于丝的材料可以基本上由丝纤蛋白和至少一种活性剂形成。在所述丝纤蛋白构成少于全部材料的100％的一些实施方式中，所述基于丝的材料可以包含添加剂，例如不同材料和/或成分，包括但不限于金属、合成聚合物，例如但不限于聚(乙烯醇)、聚(乙烯吡咯烷酮)、水凝胶、尼龙、电子元件、光学元件、活性剂、本申请中所述的任意添加剂及其任意组合。
可以对所述基于丝的材料的溶解度进行调整，例如基于β片层的含量。因此，在一些实施方式中，至少在第一不相混溶的相中的所述基于丝的材料在水溶液中能够溶解或能够重新溶解。因此，在一些实施方式中，本申请所述的基于丝的乳剂组合物可以是可溶的。例如，所述可溶的基于丝的乳剂组合物(例如以薄膜形式存在)在暴露于水性环境时(如浸入缓冲液中(图10)或者当将其与湿润的或含水的组织或表面接触时)能够溶解。将包封脂质液滴的基于丝的材料(例如包含活性剂的油滴)溶解能够使得所述脂质液滴释放，并且进而使得在其中负载的所述活性剂(如果有的话)释放到周围的环境中。
在替代性的实施方式中，至少在第一不相混溶的相中的所述基于丝的材料在水溶液中可以是不溶性的。例如，可以通过将所述基于丝的材料进行后处理增加β片层在丝纤蛋白中的含量，以使得其达到足以能够使基于丝的材料在水性介质中对抗溶解的量。
在一些实施方式中，所述基于丝的材料还可以在其至少一个表面上包含光学或光子图样。例如，所述光学或光子图样可以包含图样化的衍射光学表面如全息衍射光栅和/或图样的阵列以提供光学功能，例如但不限于光反射、衍射、散射、晕彩及其任意组合。在国际专利申请号WO 2009/061823和WO 2009/155397中对在基于丝的材料上形成光学或光子图样的方法进行了描述，其内容通过引用并入本申请。例如，如实施例2中所示，可以将油-丝微乳浇铸在全息模具、具有晕彩表面的塑料片层或具有反射图样的硅胶模具上，并且如图3A-3B和图11A-11B所示所得到的基于丝的乳剂组合物能够保持光学性质(例如全息衍射、晕彩和/或光反射)。
在一些实施方式中，所述第一不相混溶的相还可以包含一种或多种(例如1、2、3、4、5种或更多种)活性剂。在一些实施方式中，可以将所述活性剂掺入所述基于丝的材料中。所述活性剂可以共价地或非共价地与丝纤蛋白连接和/或可以均匀或不均匀地整合至所述基于丝纤蛋白的材料中。在所述第一不相混溶的相和/或所述基于丝的材料中的所述活性剂的总量的范围可以占所述组合物中丝纤蛋白总量的约0.1wt％至约0.99wt％、约0.1wt％至约70wt％、约5wt％至约60wt％、约10wt％至约50wt％、约15wt％至约45wt％或者约20wt％至约40wt％。在一些实施方式中，掺入所述第一不相混溶的相中的所述活性剂可以是水溶性的和/或能够分散于所述第一不相混溶的相中的活性剂。
添加剂：在一些实施方式中，所述第一不相混溶的相还可以包含一种或多种(例如1、2、3、4、5种或更多种)添加剂。在一些实施方式中，可以将所述添加剂掺入所述基于丝的材料中。所述添加剂可以共价或非共价地与丝纤蛋白连接和/或可以均匀或不均匀地整合在所述基于丝纤蛋白的材料中。不希望受到理论的束缚，添加剂能够为所述组合物或固态丝纤蛋白或丝纤蛋白颗粒提供一种或多种所需的性质，例如强度、弹性、易于加工和处理、生物相容性、溶解度、生物体吸收性、无气泡、表面形态、包封在其中的活性剂(如果有的话)的释放速率和/或增加的稳定性、光学功能、治疗潜能等。
添加剂可以选自生物相容性聚合物或生物聚合物；增塑剂(例如甘油)；乳剂稳定剂(例如卵磷脂和聚乙烯醇)、表面活性剂(例如聚山梨醇酯-20)；界面张力调节剂如表面活性剂(例如盐)；β-片层诱导剂(例如盐)；可检测剂(例如荧光分子)；有机或无机小分子；糖类；寡糖；多糖；生物大分子，例如肽、蛋白以及肽类似物和衍生物；拟肽；抗体及其抗原结合片段；核酸；核酸类似物和衍生物；糖原或其他糖；免疫原；抗原；由生物材料如细菌、植物、真菌或动物细胞制备的提取物；动物组织；天然存在的或合成的组合物；及其任意组合。而且，所述添加剂可以是任意物理形式。例如，所述添加剂可以是颗粒、纤维、薄膜、管状、凝胶、网状物、垫、无纺垫、粉末、液体或其任意组合。在一些实施方式中，所述添加剂可以是颗粒(例如微粒或纳米粒)。在一些实施方式中，所述添加剂可以包含第二活性剂。所述第二活性剂可以是任意在所述第一不相混溶的相中优先溶解和/或分散于所述第一不相混溶的相中的活性剂。
添加剂在所述第一不相混溶的相和/或所述基于丝的材料中的总量的范围可以是占所述组合物中总的丝纤蛋白的约0.1wt％至约0.99wt％、约0.1wt％至约70wt％、约5wt％至约60wt％、约10wt％至约50wt％、约15wt％至约45wt％或者约20wt％至约40wt％。
可以选择向所述第一不相混溶的相和/或所述基于丝的材料中加入的适宜的添加剂，例如根据不同的应用。仅作为举例之用，当本申请所述的组合物是组织支架时，所述组织支架包含多个分散于基于丝的材料中的第二不相混溶的相(例如脂质隔室或液滴)，所述组合物可以包含增加所述支架机械性能(如有需要的话)和/或改善在所述支架中的细胞性能(例如增殖、粘附和/或存活)的添加剂。
仅作为举例之用，在一些实施方式中，所述添加剂可以包括磷酸钙(CaP)材料。在本申请中使用的术语“磷酸钙材料”指由钙和磷酸离子组成的任意材料。术语“磷酸钙材料”旨在包括天然存在的和合成的由钙和磷酸离子组成的材料。所述磷酸钙材料可以选自例如透钙磷石、磷酸八钙、磷酸三钙(也称作三钙磷酸盐和正磷酸钙)、磷酸氢钙、磷酸二氢钙、磷灰石和/或羟基磷灰石中的一种或多种。而且，三钙磷酸盐(TCP)可以是α或β晶型的。在一些实施方式中，所述磷酸钙材料是β磷酸三钙或磷灰石，例如羟基磷灰石(HA)。
在一些实施方式中，所述第一不相混溶的相和/或所述基于丝的材料可以包含磁性颗粒以形成磁敏感性组合物，如在2013年4月15日提交的国际专利申请号PCT/US13/36539中所描述的，其内容通过引用并入本申请。
在一些实施方式中，所述第一不相混溶的相和/或所述基于丝的材料可以包含作为添加剂的丝材料，例如，以产生具有改善的机械性质的丝纤蛋白复合材料(例如在所述第一不相混溶的相中为100％丝复合材料)。能够用作添加剂的丝材料的示例包括但不限于丝颗粒、丝纤维、丝微米级纤维、丝粉末和未经加工的丝纤维。在一些实施方式中，所述添加剂可以是丝颗粒或粉末。生产丝纤蛋白颗粒(例如纳米粒和微粒)的多种方法是本领域公知的。在一些实施方式中，可以采用聚乙烯醇(PVA)相分离法生产所述丝颗粒，如在例如国际申请号WO 2011/041395中所描述的，其全部内容通过引用并入本申请。再例如美国专利申请公开号U.S.2010/0028451和PCT申请公开号WO 2008/118133(使用脂质作为模板生产丝微球或纳米球)以及Wenk等，J Control Release,Silk fibroin spheres as aplatform for controlled drug delivery(丝纤蛋白球作为用于控释药物递送的平台),2008；132:26-34(使用喷雾法生产丝微球或纳米球)，描述了生产丝纤蛋白颗粒的其他方法，其全部内容通过引用并入本申请。
在通常情况下，丝纤蛋白颗粒或粉末可以通过在丝纤蛋白溶液中诱导凝胶化并缩小所得到的丝纤蛋白凝胶而将其制成颗粒获得，例如通过研磨、切割、粉碎、筛分、过筛和/或过滤。可以通过超声丝纤蛋白溶液；向丝溶液施加剪切应力；调节丝溶液中的盐含量和/或调节丝溶液的pH生产丝纤蛋白凝胶。可以通过将丝溶液置于电场和/或使用酸降低丝溶液的pH改变所述丝纤蛋白溶液的pH。例如在美国专利申请公开号U.S.2010/0178304和国际专利申请公开号WO 2008/150861中描述了使用超声生产丝凝胶的方法，其全部内容通过引用并入本申请。例如在国际申请公开号WO 2011/005381中描述了使用剪切应力生产丝纤蛋白凝胶的方法，其全部内容通过引用并入本申请。例如在美国专利申请公开号US2011/0171239中描述了使用调节丝溶液的pH生产丝纤蛋白凝胶的方法，其全部内容通过引用并入本申请。
在一些实施方式中，可以使用冻干的方法生产丝颗粒，如在2012年10月26日提交的美国临时专利申请序列号61/719,146；和在2013年4月12日提交的国际专利申请号PCT/US13/36356中所描述的，其全部内容通过引用并入本申请。特别地，可以通过冻干丝溶液生产丝纤蛋白泡沫。然后将所述泡沫缩小成颗粒。例如，可以将丝溶液冷却至某一温度，在该温度下液态运载体转化成多个固态结晶或颗粒，并除去所述多个固态结晶或颗粒的至少一些以保留多孔的丝材料(例如丝泡沫)。冷却后，可以至少部分地通过升华、蒸发和/或冻干除去液态运载体。在一些实施方式中，可以在减压条件下除去所述液态运载体。
任选地，可以在形成后改变在所述丝纤蛋白泡沫中的所述丝纤蛋白的构象。不希望受到理论的束缚，所诱导的构象改变能够改变所述丝纤蛋白在丝颗粒中的结晶，例如丝II β-片层结晶。其能够改变活性剂从所述丝基质中的释放速率。所述构象改变可以由本领域公知的任意方法诱导，包括但不限于醇浸没(例如乙醇、甲醇)、水退火、水蒸气退火、热退火、剪切应力(例如通过涡旋)、超声(例如通过超声处理)、降低pH(例如pH滴定)和/或将所述丝颗粒暴露于电场及其任意组合。
在一些实施方式中，在所述丝纤蛋白中未诱导构象改变，即在使所述泡沫形成颗粒之前在所述丝纤蛋白泡沫中的所述丝纤蛋白的结晶度未改变或变化。
形成后，可以将所述丝纤蛋白泡沫进行研磨、切割、粉碎或其任意组合的处理以形成丝颗粒。例如，可以将所述丝纤蛋白泡沫在常规的混合器中混合或在球磨机中研磨以形成所需尺寸的丝颗粒。
不受限制，所述丝纤蛋白颗粒可以是任何所需的尺寸。在一些实施方式中，所述颗粒的尺寸范围可以是从约0.01μm至约1000μm、约0.05μm至约500μm、约0.1μm至约250μm、约0.25μm至约200μm或者约0.5μm至约100μm。而且，所述丝颗粒可以是任意形状或形式，例如球状、棒状、椭圆形、圆柱形、胶囊形或盘状。
在一些实施方式中，所述丝纤蛋白颗粒可以是微粒或纳米粒。在一些实施方式中，所述丝颗粒的粒径可以为约0.01μm至约1000μm、约0.05μm至约750μm、约0.1μm至约500μm、约0.25μm至约250μm或者约0.5μm至约100μm。在一些实施方式中，所述丝颗粒的粒径为约0.1nm至约1000nm、约0.5nm至约500nm、约1nm至约250nm、约10nm至约150nm或者约15nm至约100nm。
在所述第一不相混溶的相和/或所述基于丝的材料中所述丝纤蛋白颗粒的量的范围可以从约1％至约99％(w/w或w/v)。在一些实施方式中，在所述第一不相混溶的相和/或所述基于丝的材料中所述丝颗粒的量的范围可以从约5％至约95％(w/w或w/v)、从约10％至约90％(w/w或w/v)、从约15％至约80％(w/w或w/v)、从约20％至约75％(w/w或w/v)、从约25％至约60％(w/w或w/v)或者从约30％至约50％(w/w或w/v)。在一些实施方式中，在所述第一不相混溶的相和/或所述基于丝的材料中所述丝颗粒的量可以低于20％。
在通常情况下，本申请所述的组合物可以包含任意丝纤蛋白与丝纤蛋白颗粒的比例。例如，在所述溶液中丝纤蛋白与丝颗粒的比例范围可以为从约1000:1至约1:1000。所述比例可以基于重量或摩尔数。在一些实施方式中，在所述溶液中丝纤蛋白与丝颗粒的比例范围可以从约500:1至约1:500(w/w)、从约250:1至约1:250(w/w)、从约50:1至约1:200(w/w)、从约10:1至约1:150(w/w)或者从约5:1至约1:100(w/w)。在一些实施方式中，在所述溶液中丝纤蛋白与丝颗粒的比例可以为约1:99(w/w)、约1:4(w/w)、约2:3(w/w)、约1:1(w/w)或约4:1(w/w)。在一些实施方式中，所述丝颗粒的量等于或低于所述丝纤蛋白的量，即丝纤蛋白与丝颗粒的比例为1:1。在一些实施方式中，在所述组合物中高分子量丝纤蛋白与丝颗粒的比例可以为约1:1、约1:0.75、约1:0.5或约1:0.25。
在一些实施方式中，所述添加剂可以是丝纤维。在一些实施方式中，丝纤维可以通过所述纤维在HFIP中再溶解的部分而化学连接，并连接至所述第一不相混溶的相和/或所述基于丝的材料，例如，在美国专利申请公开号US20110046686中所描述的，其内容通过引用并入本申请。
在一些实施方式中，所述丝纤维可以是微纤维或纳米纤维。在一些实施方式中，所述添加剂可以是微米级的丝纤维(10-600μm)。微米级丝纤维可以通过水解脱胶的丝纤蛋白或通过增加脱胶工艺的崩裂(boing)时间获得。例如在Mandal等，PNAS,2012,doi:10.1073/pnas.1119474109；和2013年4月5日提交的PCT申请号PCT/US13/35389中描述了将丝纤蛋白碱性水解以获得微米级的丝纤维，其全部内容通过引用并入本申请。由于从HFIP丝溶液中制备的再生丝纤维具有较高的机械强度，在一些实施方式中，还可以将所述再生的丝纤维作为添加剂。
在一些实施方式中，所述丝纤维可以是未经过处理的丝纤维，例如生丝或生丝纤维。术语“生丝”或“生丝纤维”指未经过处理以除去丝胶蛋白的丝纤维，并且因此其包括，例如，直接从蚕茧中获得的丝纤维。因此，未经处理的丝纤维指直接从丝腺中获得丝纤蛋白。当丝纤蛋白直接从丝腺中获得时，可以对其进行干燥，将其结构称为固态的丝I。因此，未经处理的丝纤维包含大部分处于丝I构象的丝纤蛋白。另一方面，再生的或经处理的丝纤维包含基本上为丝II或β-片层结晶的丝纤蛋白。
在一些实施方式中，所述添加剂可以包含至少一种生物相容性聚合物，包括至少两种生物相容性聚合物、至少三种生物相容性聚合物或更多种。例如，所述第一不相混溶的相和/或所述基于丝的材料可以包含一种或多种生物相容性聚合物，其总浓度为约0.1wt％至约70wt％、约1wt％至约60wt％、约10wt％至约50wt％、约15wt％至约45wt％或者约20wt％至约40wt％。在一些实施方式中，可以将所述生物相容性聚合物均匀地或不均匀地掺入所述第一不相混溶的相和/或基于丝的材料中。在其他实施方式中，可以将所述生物相容性聚合物涂覆在所述第一不相混溶的相和/或所述基于丝的材料的表面上。在任意实施方式中，所述生物相容性聚合物可以与在所述第一不相混溶的相和/或所述基于丝的材料中的丝纤蛋白共价或非共价地连接。在一些实施方式中，所述生物相容性聚合物能够与所述第一不相混溶的相和/或所述基于丝的材料中的丝纤蛋白混合。
所述生物相容性聚合物的示例可以包括不可降解的和/或生物可降解的聚合物，例如但不限于聚乳酸(PLA)、聚乙醇酸(PGA)，聚丙交酯-共-乙交酯(PLGA)、聚酯、聚(原酸酯)、聚(膦嗪)、聚(磷酸酯)、聚己内酯、明胶、胶原蛋白、纤连蛋白、角蛋白、聚天冬氨酸、藻酸盐、壳聚糖、甲壳素、透明质酸、果胶、聚羟基脂肪酸酯、葡聚糖、和聚酸酐、聚环氧乙烷(PEO)、聚(乙二醇)(PEG)、三嵌段共聚物、聚赖氨酸，藻酸盐、聚天冬氨酸及其任意衍生物和其任意组合。参见例如国际申请号：WO 04/062697；WO 05/012606。国际专利申请的内容均通过引用并入本申请。适于根据本公开的用途的其他示例性生物相容性聚合物包括例如在US专利号No.6,302,848；No.6,395,734；No.6,127,143；No.5,263,992；No.6,379,690；No.5,015,476；No.4,806,355；No.6,372,244；No.6,310,188；No.5,093,489；No.US 387,413；No.6,325,810；No.6,337,198；No.US6,267,776；No.5,576,881；No.6,245,537；No.5,902,800和No.5,270,419中所描述的那些，其全部内容均通过引用并入本申请。
在一些实施方式中，所述生物相容性聚合物可以包含PEG或PEO。在本申请中使用的术语“聚乙二醇”或“PEG”指含有约20至约2000000个连接的单体的乙二醇聚合物，典型地约50-1000个连接的单体，通常约100-300个。PEG也称为聚环氧乙烷(PEO)或聚氧化乙烯(POE)，这取决于其分子量。在通常情况下，PEG、PEO和POE是化学同义词，但是PEG在此前趋向于指分子量低于20,000g/mol的寡聚物和聚合物，PEO指分子量高于20,000g/mol的聚合物，POE指任意分子量的聚合物。PEG和PEO是液体或低熔点固体，这取决于其分子量。PEG由环氧乙烷的聚合反应制备，市售的分子量范围较为宽泛，为从300g/mol至10,000,000g/mol。尽管具有不同分子量的PEG和PEO用于不同的应用中，且由于链长效应使其具有不同的物理性质(例如粘度)，但是其化学性质几乎相同。可以得到不同形式的PEG，其取决于聚合反应中使用的引发剂-最常见的引发剂是单官能团的甲基醚PEG或甲氧基聚(乙二醇)，缩写为mPEG。低分子量PEG也可以以更纯的低聚物形式获得，称为单分散的、均一的或离散的PEG，其也可以以不同的几何形状获得。
在本申请中使用的术语PEG旨在是包容性的而非排他性的。术语PEG包括任意形式的聚(乙二醇)，包括烷氧基PEG、双功能性PEG、多臂PEG、叉状PEG、分枝PEG、悬垂PEG(即具有悬垂于聚合物主链的一个或多个官能团的PEG或相关聚合物)或者在其中具有可降解的连接的PEG。而且，所述PEG的主链可以是线性的或具有支链的。支链聚合物的主链通常是本领域公知的。通常地，支链聚合物具有中心支链核心部分以及多个与所述中心支链核心连接的线性聚合物链。PEG通常使用的是支链形式，其能够通过将环氧乙烷与不同多元醇加成制备，如甘油、季戊四醇和山梨醇。所述中心支链部分还可以来源于多种氨基酸，如赖氨酸。支链聚(乙二醇)可以以通式形式R(-PEG-OH)m表示，其中R代表核心部分，如甘油或季戊四醇，m代表臂的数量。多臂PEG分子也能够作为生物相容性聚合物，如美国专利号5,932,462中所描述的那些，其通过引用整体并入本申请。
一些示例性PEG包括但不限于PEG20、PEG30、PEG40、PEG60、PEG80、PEG100、PEG115、PEG200、PEG300、PEG400、PEG500、PEG600、PEG1000、PEG1500、PEG2000、PEG3350、PEG4000、PEG4600、PEG5000、PEG6000、PEG8000、PEG11000、PEG12000、PEG15000、PEG 20000、PEG250000、PEG500000、PEG100000、PEG2000000等。在一些实施方式中，PEG为MW 10,000道尔顿。在一些实施方式中，PEG为MW 100,000，即PEO为MW 100,000。
在一些实施方式中，所述添加剂可以包括水解丝纤蛋白的酶。不希望受到理论的束缚，此类酶能够用于控制所述第一不相混溶的相和/或所述基于丝的材料的降解。
在一些实施方式中，能够包括在所述第一不相混溶的相和/或所述基于丝的材料中的添加剂可以包括但不限于本申请所述的生物相容性聚合物、本申请所述的活性剂、等离子体颗粒、甘油及其任意组合。
在一些实施方式中，所述基于丝的材料可以是多孔的。例如，所述多孔的基于丝的材料可以通过将本申请所述的组合物冻干生产。在这些实施方式中，所述基于丝的材料的孔隙度可以为至少约1％、至少约5％、至少约10％、至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％或者更高。在本申请中使用的术语“孔隙度”是对材料中孔隙空间的检测指标，其是孔隙的体积占总体积的分数，以0至100％之间的百分数表示(或0和1之间)。孔隙度的测定方法是本领域技术人员熟知的，例如使用标准化的技术，如水银孔率法和气体吸附，例如氮气吸附。
所述多孔的基于丝的材料可以具有任意孔径。在本申请中使用的术语“孔径”指孔的横截面的直径或有效直径。术语“孔径”还可以指根据多个孔的测量结果的孔的横截面的平均直径或平均有效直径。不是圆形的横截面的有效直径等于与非圆形横截面具有相同截面积的圆形横截面的直径。在一些实施方式中，固态丝纤蛋白的孔可以具有的尺寸分布范围为从约1nm至约1000μm、从约5nm至约500μm、从约10nm至约250μm、从约50nm至约200μm、从约100nm至约150μm或者从约1μm至约100μm。在一些实施方式中，当将所述基于丝的材料水化时可以是可溶胀的。然后所述孔的尺寸可能发生改变，其取决于在所述丝基质中的水含量。在一些实施方式中，所述孔可以充满流体如水或空气。
在一些实施方式中，所述基于丝的材料在其表面的至少一部分上还可以包含一个或多个涂层。所述涂层能够为所述基于丝的材料提供功能性和/或物理性性质(例如但不限于控制其中包封的活性剂的释放速率；维持所述基于丝的材料的水合作用；控制表面光滑度和/或连接用于靶向递送的靶向配体)。
本申请所述的任意生物相容性聚合物均能够用于涂覆本申请所述的丝颗粒的外表面。在一些实施方式中，所述涂层可以包含亲水性聚合物。在本申请中使用的术语“亲水性聚合物”指可溶于水和/或能够保留水的聚合物。亲水性聚合物的示例包括但不限于均聚物如基于纤维素的聚合物、基于蛋白的聚合物、水溶性基于乙烯基的聚合物、水溶性基于丙烯酸的聚合物和基于丙烯酰胺的聚合物，以及合成的聚合物如交联的亲水性聚合物。在一些实施方式中，在所述涂层中使用的亲水性聚合物可以包括下述中的一个或任意组合：聚乙二醇、聚环氧乙烷、聚乙二醇共聚物(例如聚(乙二醇-共-丙二醇)共聚物、聚(乙二醇)-聚(丙二醇)-聚(乙二醇)嵌段共聚物，或聚(丙二醇)-聚(乙二醇)-聚(丙二醇)嵌段共聚物)、聚(丙二醇)、聚(2-甲基丙烯酸羟乙酯)、聚(乙烯醇)、聚(丙烯酸)、聚(甲基丙烯酸)、聚乙烯吡咯烷酮、纤维素醚、藻酸盐、壳聚糖、透明质酸、胶原蛋白及其混合物或组合。在一些实施方式中，所述涂层可以包含聚乙二醇和/或聚(环氧乙烷)。在一些实施方式中，所述涂层可以包含疏水性聚合物(例如不是本申请所定义的亲水性聚合物)。
在所述基于丝的材料的表面上可以具有任意数量的涂层，例如1、2、3、4、5、6层或更多层涂层。在一些实施方式中，具有至少2层、至少3层、至少4层、至少5层、至少6层或更多层涂层。
各涂层可以含有至少1层或更多层，例如，1、2、3、4、5层。在各层中的材料可以是不同的或交替的。在一个实施方式中，涂层可以具有至少两层。
在一些实施方式中，所述涂层可以包含丝纤蛋白层。参见例如国际申请号WO2007/016524，其描述了形成丝涂层的示例性方法。在一些实施方式中，所述涂层可以包含与丝层叠加的生物相容性聚合物层(例如包含本申请所述的亲水性聚合物)。在这些实施方式中，所述亲水性聚合物层可以包含聚(环氧乙烷)(PEO)。
在一些实施方式中，所述涂层还可以包含如本申请所述的添加剂。例如，所述涂层还可以包含造影剂和/或染料。
所述基于丝的材料可以以任意形式或形状存在。在下文的章节“基于丝的材料的各种形式的示例”中描述了所述基于丝的材料的一些形式。例如，所述基于丝的材料可以是薄膜、薄片、凝胶或水凝胶、网状物、垫、无纺垫、织物、支架、管、板或块、纤维、颗粒、粉末、三维结构、植入物、泡沫或海绵、针、冻干材料、多孔材料、无孔材料或其任意组合的形式。在一些实施方式中，所述基于丝的材料可以以水合状态(例如作为水凝胶)存在。在一些实施方式中，所述基于丝的材料可以以干燥状态存在，例如通过在周围环境下干燥和/或通过冻干。
在一些实施方式中，所述基于丝的材料能够形成薄膜。所述第二不相混溶的相(例如油滴)可以均匀地或随机分散于所述基于丝的材料中。在一些实施方式中，在所述基于丝的材料中存在脂质液滴(例如油滴)会使得所述薄膜不透明，而非如在单独的基于丝的薄膜中(无脂质液滴的乳剂)所见的是透明的。当在所述薄膜中存在的脂质液滴(例如油滴)浓度越高时，能够使得基于丝的乳剂薄膜的不透明程度越高。
在一些实施方式中，所述基于丝的材料可以形成支架。所述第二不相混溶的相(例如油滴)可以均匀地或随机地分散于基于丝的支架中。
负载一个或多个脂质或油滴的丝颗粒：在一些实施方式中，所述基于丝的材料能够形成颗粒。在一个特定的方面，本申请提供了一种丝颗粒，所述丝颗粒包含丝纤蛋白和包封在其中的至少一个或多个脂质液滴(例如油滴)。所述丝颗粒包含至少两个不相混溶的相，第一不相混溶的相包含丝纤蛋白并且第二不相混溶的相包含活性剂，其中所述第一不相混溶的相包封所述第二不相混溶的相(或换言之，所述第二不相混溶的相分散在所述第一不相混溶的相中)。在一些实施方式中，所述第二不相混溶的相可以不包括脂质体。
所述丝颗粒的尺寸能够根据不同的应用而改变，例如化妆品、治疗剂和/或组织工程应用。因此，所述丝颗粒可以是任意尺寸。例如，所述丝颗粒尺寸的范围可以是从约10nm至约10mm、或从约50nm至约5mm。在一些实施方式中，所述丝颗粒尺寸的范围可以是从约10nm至约1000nm、从约10nm至约500nm或者从约20nm至约250nm。在一些实施方式中，所述丝颗粒尺寸的范围可以是从约1μm至约1000μm、或从约5μm至约500μm、或从约10μm至约250μm。在一些实施方式中，所述丝颗粒尺寸的范围可以是从约0.1mm至约10mm、或从约0.5mm至约10mm、从约0.5mm至约8mm或者从约1mm至约5mm。
如上文所述，所述第二不相混溶的相能够在所述丝颗粒中形成单个或多个(例如至少两个或更多个)任意尺寸和/或形状的液滴。所述液滴的尺寸和/或形状能够随着多种因素而改变，包括例如丝溶液的浓度、对丝的处理和/或所述丝颗粒的尺寸。在一些实施方式中，所述液滴的尺寸范围可以为约1nm至约1000μm或者约5nm至约500μm。在一些实施方式中，所述隔室或液滴的尺寸范围可以是从约1nm至约1000nm、或约2nm至约750nm、或约5nm至约500nm、或约10nm至约250nm。在一些实施方式中，所述隔室或液滴的尺寸范围可以是从约1μm至约1000μm、或约5μm至约750μm、或约10μm至约500μm、或约25μm至约250μm。
本申请所述的丝颗粒能够引入上文所述的任意基于丝的乳剂组合物的实施方式中所描述的至少一个或多个特性。
包含本申请所述的丝颗粒的示例性组合物
本申请所提供的又一个方面是一种组合物，所述组合物包含本申请所述的丝颗粒集合或多个丝颗粒。本申请所述的组合物能够用于任意应用，例如但不限于个人护理(包括例如护肤、护发、化妆品和个人卫生产品)、治疗性产品、组织工程和/或食品产品。根据其意向用途，可以将本申请所述的组合物制成乳剂、胶体、乳膏、凝胶、洗剂、糊剂、软膏、搽剂、香膏、液体、固体、薄膜、薄片、织物、网状物、海绵、气溶胶、粉末、支架或其任意组合的形式。
在一些实施方式中，可以将所述组合物制剂以供在药物组合物或产品例如薄膜、片剂、凝胶胶囊、粉末、软膏、液体、贴片或者在递送装置例如注射器中使用。对包含本申请所述的丝颗粒的药物组合物的其他描述例如用于控制或持续释放的用途见于下文所述的章节“药物组合物和控制/持续释放”。
在一些实施方式中，可以将所述组合物制剂以供在个人护理组合物中使用。例如，在一些实施方式中，可以将所述个人护理组合物制成霜、油、乳液、粉末、精华、凝胶、洗发剂、护发剂、软膏、泡沫、喷雾剂、气溶胶、摩丝或其任意组合形式的护发组合物或护肤组合物。在其他实施方式中，可以将所述个人护理组合物制成粉、润肤露、霜、口红、指甲油、染发剂、香膏、喷雾、睫毛膏、香水、固体香水或其任意组合形式的化妆品组合物。
在一些实施方式中，所述个人护理组合物可以包含释放气味的组合物(例如香料组合物)，其中所述组合物是固体(例如蜡)、薄膜、薄片、织物、网状物、海绵、粉末、液体、胶体、乳剂、霜剂、凝胶、洗剂、糊剂、软膏、搽剂、香膏、喷雾、滚珠或其任意组合形式。在一些实施方式中，本申请所述的组合物可以用于稳定和/或提供至少一种释放气味的物质的控释或持续释放，例如但不限于香料、香水或能够使周围环境具有香味的任意分子/组合物。例如，可以将至少一种释放气味的物质加入所述第一不相混溶的相(例如基于丝的材料)和/或所述第二不相混溶的相(例如油滴)，这取决于其在各相中的溶解度。在通常情况下，释放气味的物质例如但不限于香料和香水可以是油溶性的。因此，可以至少将释放气味的物质加入本申请所述的第二不相混溶的相(例如油滴)中。在下文的章节“个人护理组合物”和“释放气味的组合物”中对关于包含本申请所述的丝颗粒的个人护理和香料组合物的其他信息进行了详细描述。
在一些实施方式中，可以将所述组合物制剂以供在食品组合物中使用，包括但不限于固体食品、液体食品、饮料、乳剂、浆状物、凝乳、干燥食品、包装食物产品、生食品、加工食品、粉剂、颗粒剂、膳食补充剂、可食用物质/材料、口香糖或其任意组合。食品组合物可以包括但不限于被任何对象消费的食品组合物，包括例如人或者家畜或被狩猎的动物，如猫科动物例如如猫；犬科动物例如犬；狐狸；狼；鸟类例如鸡、鸸鹋、鸵鸟、鸟类；和鱼类例如鳟鱼、鲶鱼、鲑鱼和观赏鱼。
在一些实施方式中，所述组合物能够用于稳定和/或向至少一种食品成分、调味剂物质、营养素和/或维生素提供控制释放或持续释放。例如，可以将至少一种食品成分、调味剂物质、营养素和/或维生素加入所述第一不相混溶的相(例如所述基于丝的材料)和/或所述第二不相混溶的相(例如油滴)，这取决于其在各相中的溶解度。在一些实施方式中，所述组合物能够在所述食品组合物中作为食品添加剂使用。所述食品添加剂能够以任意形式存在，例如粉末、颗粒、浆状物、液体、溶液、固体、乳剂、胶体或其任意组合。在一些实施方式中，可以将所述组合物制成食品产品中的装饰，例如蛋糕上的装饰如全息图。在一些实施方式中，本申请所述的组合物可以是如下章节所述的“调味剂组合物”。
根据本申请所述的各个方面，丝可以作为乳化剂以稳定分散于基于丝的材料中的脂质液滴的乳剂。而且，丝能够稳定或保持包封于其中的活性剂的活性，如在国际专利申请号WO 2012/145739所描述的，其内容通过引用并入本申请。因此，本申请的又一个方面涉及贮存稳定的基于丝的乳剂组合物。所述贮存稳定包含本申请所述的基于丝的乳剂组合物或本申请所述的丝颗粒，其中在所述组合物或所述丝颗粒的第二不相混溶的相(例如脂质液滴)中存在的所述活性剂(例如挥发性的、疏水性的和/或亲脂性的试剂)在将所述组合物(a)经过至少一个冻融循环，或(b)在约为室温或室温以上的温度下保持至少约24小时，或者(c)经过(a)和(b)两者后保持其原始生物活性和/或原始载量的至少约30％。
当涉及活性剂时，在本申请中使用的术语“保持”("maintaining"、"maintain"和"maintenance")指当所述试剂存在于含有丝纤蛋白的组合物中时，保持、维持或保留所述试剂的生物活性和/或载量。在一些实施方式中，所述试剂保持在本申请所述的组合物的基于丝的材料中。在一些实施方式中，所述试剂保持在分散于本申请所述的组合物的基于丝的材料的脂质液滴(例如油滴)的内部。在一些实施方式中，所述活性剂保持其原始生物活性和/或原始载量的至少约10％(例如其原始生物活性和/或原始载量的10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或更多)。
在本申请中使用的术语“生物活性”通常指活性剂与生物靶点相互作用和/或在生物靶点上产生作用的能力。例如，生物活性可以包括但不限于在生物靶点诱发刺激性、抑制性、调节性、毒性或致死性应答。所述生物靶点可以是分子或细胞。例如，生物活性可以指活性剂调节酶的作用/活性、阻断受体、刺激受体(例如包括嗅觉受体和味觉受体)、调节一种或多种基因的表达水平、调节细胞增殖、调节细胞分化、调节细胞形态或其任意组合的能力。在一些例子中，生物活性可以指化合物在细胞中产生毒性作用的能力。
在本申请中使用的术语“原始生物活性”涉及活性剂时通常指在将所述试剂引入本申请所述的组合物之前时该试剂的生物活性。在一些实施方式中，可以在将所述试剂引入本申请所述的组合物之前立即或之后立即测定其原始生物活性。也就是说，可以在例如将所述试剂引入所述组合物之前或者在将所述试剂引入所述活性剂之前或之后约20分钟内测定活性剂的原始生物活性。在一些例子中，可以在例如将所述试剂引入丝纤蛋白基质之前或之后约10秒、约15秒、约20秒、约25秒、约30秒、约1分钟、约2分钟、约3分钟、约4分钟、约5分钟、约6分钟、约7分钟、约8分钟、约9分钟、约10分钟、约11分钟、约12分钟、约13分钟、约14分钟、约15分钟、约16分钟、约17分钟、约18分钟、约19分钟或约20分钟测定活性剂的原始生物活性。
在一些实施方式中，术语“原始生物活性”指活性剂的最大生物活性，例如在将所述活性剂例如通过复溶或通过增加温度活化后立即检测的生物活性。例如，如果所述活性剂初始是粉末状的，则可以在将其复溶后立即测定所述活性剂的原始生物活性。术语“原始生物活性”包括在由生产厂商指定的条件下测定的活性剂的生物活性。测定活性剂生物活性的方法是本领域公知的，例如通过质谱。
在本申请中使用的术语“冻融循环”描述了一系列交替进行的冷冻和溶解，并且还包括一系列交替的冷冻的(固态)和流体状态。例如一个冻融循环涉及冷冻的(固态)和流体状态之间的一次状态改变。在冷冻和溶解或者冷冻的和流体状态之间的时间间隔可以是任意时间段，例如小时、天、周或月。例如，一旦活性剂组合物被冷冻或处于冷冻状态，其能够持续贮存在零度以下的冷冻状态，例如在约-20℃至-80℃之间，直至需要将其解冻以供再次使用。组合物的冷冻可以迅速进行，例如在液氮中，或逐渐进行，例如在冷冻温度下，例如在约-20℃至-80℃之间。冷冻组合物的解冻可以在0℃以上的任意温度下迅速进行例如在室温下或逐渐进行例如在冰上。
本申请所述的贮存稳定的组合物可以保护所述活性剂以使其免于由于温度波动或冻融循环和/或没有冷藏保存而导致的失活和/或降解。在一些实施方式中，当其暴露于光照或至少约10％或更高的相对湿度时本申请所述的贮存稳定的组合物还能够稳定所述活性剂。因此，在一些实施方式中，在将所述组合物还保持在暴露于光照的条件下例如不同波长和/或来自不同光源的光时存在于所述组合物或所述丝颗粒的第二不相混溶的相(例如脂质液滴)中的所述活性剂(例如挥发性的、疏水性的和/或亲脂性的试剂)能够保持其原始生物活性和/或原始载量的至少约30％。在一些实施方式中，本申请所述的组合物能够保持在暴露于UV或红外线辐射的条件下。在一些实施方式中，本申请所述的组合物能够保持在可见光的条件下。
在一些实施方式中，在将所述组合物保持在相对湿度至少约10％或更高、例如至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、至少约95％或更高时，在所述组合物或所述丝颗粒的第二不相混溶的相(例如脂质液滴)中的所述活性剂(例如挥发性的、疏水性的和/或亲脂性的试剂)能够保持其原始生物活性和/或原始载量的至少约30％。本申请中使用的术语“相对湿度”是在空气和水蒸气的混合物中测定水蒸气的量的结果。通常将其定义为在空气-水混合物中水蒸气的分压，以在这些条件下饱和蒸汽压的百分率表示。
在一些实施方式中，所述基于丝的材料或组合物可以处于干燥状态。如在此处和整个说明书中所使用的，术语“干燥状态”指组合物的含水量不超过50％或更低的状态，包括例如不超过40％、不超过30％、不超过20％、不超过10％、不超过5％、不超过1％或者更低。在一些实施方式中，在干燥状态的所述基于丝的材料或组合物是基本上无水的。可以通过本领域公知的任意方法将水从本申请所述的基于丝的材料或组合物中除去，例如空气干燥、冻干、高压灭菌及其任意组合。在一些实施方式中，可以将所述基于丝的材料或组合物冻干。
生产本申请所述的丝颗粒或组合物的方法
本申请还提供了生产本申请所述的丝颗粒或本申请所述的组合物的方法。例如，本申请所述的组合物在通常情况下可以通过包括形成分散于基于丝的材料中的所述第二不相混溶的相(例如脂质或油滴)的乳剂的工艺而生产。丝可以作为乳化剂以稳定脂质或油滴的乳剂，因此不需要再另外加入乳化剂。
可以采用本领域公知的任意方法生产本申请所述的负载脂质液滴的丝颗粒。例如，在一些实施方式中，可以生产中空的丝颗粒，例如使用相分离方法，如在国际专利申请号WO 2011/041395中所描述的，或脂质模板引导的制备方法，如在国际专利申请号WO2008/118133中所描述的，随后将其浸没在油溶液中以便将油负载/分散进入所述丝颗粒中。在一些实施方式中，可以将在水性丝溶液中的脂质/油滴的乳剂进行冻干处理，以使其形成丝涂覆的脂质/油颗粒。在一些实施方式中，可以对所述乳剂进行超声和/或冻融处理以生产分散于所述基于丝的材料中的尺寸更小的脂质/油滴。可以直接或交替使用丝涂覆的脂质/油颗粒，将其混悬于水性介质中，以便进一步将其包封于基于丝的基质中，其能够用于生产负载多个丝涂覆的脂质/油颗粒的丝颗粒。
尽管可以采用本领域公知的方法生产本申请所述的组合物和/或丝颗粒，但是开发了一种生产本申请所述的丝颗粒的新方法，其中可以对所述方法进行控制以生产在其中包封一个或多个脂质液滴的丝颗粒。所述方法包括(a)提供分散在处于溶胶-凝胶转变的丝溶液(在这种情况下，所述丝溶液保持在可混合状态)中的非水性液滴的乳剂；和(b)将预先确定体积的乳剂加入非水相中。所述丝溶液在非水相中形成在其中包封至少一个所述非水性液滴的至少一个丝颗粒。
在一些实施方式中，在步骤(a)中的所述乳剂可以通过如下方法生产：将非水性的、不相混溶的相加入到所述丝溶液中，以形成分散于所述丝溶液的非水性液滴的乳剂。在一些实施方式中，可以在将所述非水性、不相混溶的相加入到所述丝溶液之前对所述丝溶液进行处理以诱导溶胶-凝胶转变。在其他实施方式中，可以在对所述混合物进行处理以诱导溶胶-凝胶转变之前将所述非水性、不相混溶的相加入到所述丝溶液中。所述非水性、不相混溶的相可以是与所述丝溶液不相混溶的和/或形成界面的任意流体，例如包括但不限于脂质成分、油、聚合物(例如聚乙烯醇、聚(乙二醇)和)、有机溶剂及其任意组合。
在一些实施方式中，所述非水性、不相混溶的相可以包含脂质成分，例如但不限于油、脂肪酸、甘油脂质、甘油磷脂、鞘脂，糖脂、聚酮化合物，甾醇脂和异戊烯醇脂质。在一些实施方式中，所述非水性、不相混溶的相不包括在适于脂质体形成的条件下能够形成脂质体的脂质成分。可以不包括的此类脂质成分的示例包括但不限于磷脂酰胆碱(PC)、磷脂酰乙醇胺(PE)、磷脂酸(PA)、磷脂酰甘油(PG)、甾醇如胆固醇、和非天然脂质、阳离子油如DOTMA(N-(1-(2,3-二氧基氧)丙基)-N,N,N-三甲基氯化铵)，以及1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DOPC)；1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DOPE)；1,2-二月桂酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DLPC)和1,2-二肉豆蔻酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DMPC)及其任意组合。在一些实施方式中，所述脂质成分可以不包括磷脂。在一些实施方式中，所述脂质成分可以不包括甘油磷脂。
在一些实施方式中，所述非水性、不相混溶的相是上文所定义的油。在一个实施方式中，所述非水性、不相混溶的相是来源于植物的油，例如葵花油。
加入所述丝溶液中的所述非水性、不相混溶的相的体积可以改变，例如根据分散于所述丝溶液中的非水性液滴的粒径和/或浓度。在一些实施方式中，可以以非水性、不相混溶的相与丝的体积比为约1:1至约1:500、或约1:2至约1:250、或约1:3至约1:100、或约1:5至约1:50将所述非水性、不相混溶的相加入所述丝溶液中。
在一些实施方式中，在所述乳剂中的所述非水性液滴还可以包含至少一种或多种(例如1、2、3、4种或者更多种)活性剂，例如本申请所定义的挥发性、疏水性和/或亲脂性试剂。在一些实施方式中，可以在将所述非水性、不相混溶的相加入所述丝溶液中以形成乳剂之前将所述活性剂例如挥发性、疏水性和/或亲脂性试剂加入到所述非水性、不相混溶的相中。挥发性、疏水性和/或亲脂性试剂的示例可以包括但不限于治疗剂、营养剂、化妆剂、食品添加剂(例如着色剂、调味剂物质)、释放气味的物质(例如香料)、益生菌剂、染料、芳香族化合物、脂肪族化合物(例如烷烃、烯烃、炔烃、环烷烃、环烯烃和环炔烃)或其任意组合。
在一些实施方式中，包括在所述非水性液滴中的所述活性剂可以以油的形式提供，例如挥发油或精油，其通常是含有来自植物的挥发性芳香化合物的浓缩疏水性油。
在一些实施方式中，可以对包含非水性液滴的所述丝溶液(分散于所述丝溶液中的非水性液滴的乳剂)进行超声和/或冻融处理。不希望受到理论的束缚，所述超声和/或冻融处理能够减小在所述丝溶液中分散的所述非水性液滴的尺寸。仅作为示例之用，在超声前，油与水性丝溶液混合的乳剂可以显示出的平均油滴直径为约100μm至约700μm(例如如图2A所示为～420μm)。对所述乳剂进行轻柔超声(例如振幅～10％持续约5秒)降低了平均油滴直径至小于50μm、或小于25μm、或小于10μm、或小于5μm或者更小(例如如图2B所示小于25μm)。
在本申请中使用的术语“溶胶-凝胶转变”指丝溶液的状态，其在某段时间以可流动的液体形式存在，然后在这段时间之后其转变成凝胶形式。根据本申请所述的实施方式，具有溶胶-凝胶转变的丝溶液能够在足够长的时间内保持溶液相以进行双重乳化，然后转变成凝胶，以便将所述油滴包封于其中。因此，包含所述油滴的所述丝溶液的溶胶-凝胶转变能够持续一段时间，所述时间足以使得当将其加入非水相(例如但不限于油和有机溶剂如聚乙烯醇)时其保持乳剂或溶液状态，并且然后在所述非水相中(例如但不限于油和有机溶剂如聚乙烯醇)形成包封油滴的凝胶颗粒。在一些实施方式中，所述溶胶-凝胶转变能够持续至少约5秒、至少约10秒、至少约20秒、至少约30秒、至少约40秒、至少约50秒、至少约60秒或者更长时间。在一些实施方式中，所述凝胶-溶胶转变能够持续至少约5分钟、至少约10分钟、至少约15分钟、至少约30分钟、至少约1小时、或至少约2小时或者更长时间。在一些实施方式中，所述溶胶-凝胶转变能够持续至少约6小时、至少约12小时、至少约1天、至少约2天或者更长时间。在一些实施方式中，所述溶胶-凝胶转变能够持续不超过2天、不超过1天、不超过12小时、不超过6小时、不超过3小时、不超过2小时、不超过1小时、不超过30分钟、不超过15分钟、不超过10分钟、不超过5分钟、不超过1分钟或者更短的时间。
可以采用公知的在丝纤蛋白中诱导构象改变的任意方法诱导所述丝溶液的溶胶-凝胶转变，包括例如通过电凝胶化、pH降低、剪切应力、涡旋、超声、电纺丝、盐加成、空气干燥、水退火、水蒸气退火、醇浸没和/或任意其他丝胶凝化方法。在一些实施方式中，可以通过超声诱导所述丝溶液的溶胶-凝胶转变。本领域技术人员能够对超声处理进行控制以调整溶胶-凝胶转变的持续时间，参见例如美国专利号8,187,616，其全部内容通过引用并入本申请。在一个实施方式中，可以在振幅约1％至约50％、或约5％至约25％或者约10％至约15％的条件下进行所述超声。在一些实施方式中，所述超声的持续时间可以为从约5秒至约90秒、或从约15秒至约60秒或者从约30秒至约45秒。可以对超声处理参数(例如振幅、时间或这两者)进行相应的控制以对其进行调整，以使得所得到的丝颗粒具有所需的材料性质(例如丝粒径和/或形状、脂质液滴尺寸和/或形状和/或丝作为包封材料的渗透性)。仅作为示例之用，如实施例1所示，随着超声强度的增加(例如通过增加振幅和/或持续时间如振幅～10％持续15秒，见图7A-7B，与～15％持续～15秒相比，见图7C-7D)，所得到的丝颗粒似乎更加延长和不规则。此外，所述基于丝的材料对油相内部存在的活性剂的渗透性降低(图8C-8D)。
除了超声处理参数以外，所述丝颗粒材料性质的其他控制参数包括但不限于丝溶液的性质(例如组分、浓度、溶液粘度、丝脱胶时间)、颗粒制备参数(例如存在或不存在颗粒涂层、丝纤蛋白与油相的体积比、加入连续相(例如油或有机溶剂如聚乙烯醇)的基于丝的乳剂(油滴分散于所述溶胶-凝胶丝溶液中)的体积)、被包封的活性剂的疏水性、所述丝颗粒的后处理(例如但不限于β片层诱导处理，如冻干、水退火和水蒸气退火)(如果有的话)及其任意组合。
仅作为示例之用，所述丝溶液的浓度能够部分地影响脂质包封的构象。例如，较高浓度的丝溶液能够产生在整个含丝的相中悬浮了多个油滴的分散液(称为“微球”)，而浓度较低的丝溶液能够产生“微囊”构象，其中在各单个颗粒中均含有被丝囊所围绕的一个较大的脂质液滴。因此，用于生产基于丝的材料的所述丝溶液可以是任意浓度，例如其范围从约0.5％(w/v)至约30％(w/v)。在一些实施方式中，针对预期的机械性质使用低于0.5％(w/v)或者高于30％(w/v)的丝浓度可能是理想的。在一些实施方式中，所述丝溶液能够具有的浓度为约1％(w/v)至约15％(w/v)、或约2％(w/v)至约7％(w/v)。
在一些实施方式中，对所述丝溶液浓度的选择可能依赖于蚕丝的脱胶时间。在一些实施方式中，所述蚕丝脱胶时间的范围可以从约少于5分钟至约60分钟。不希望受到理论的束缚，所述丝溶液的粘度通常随着脱胶时间的缩短而增加。因此，在一些实施方式中，为了保持一定的溶液粘度，从具有较长的脱胶时间的丝中获得的较高浓度的丝溶液可能是需要的。在蚕丝脱胶较短时间的一些实施方式中，例如少于15分钟，所述丝溶液的浓度可能低至0.5％以维持所述基于丝的材料的结构完整性。关于在形成不同基于丝的材料中使用轻脱胶的丝的信息参见例如2013年7月9日提交的国际专利申请号PCT/US13/49740。
在一些实施方式中，所述丝溶液还可以包含至少一种或多种本申请所述的活性剂。例如，在一些实施方式中，所述丝溶液还可以包含至少两种、至少3种、至少4种、至少5重或者更多种本申请所述的活性剂。因此，在一些实施方式中，所述方法还包括在对所述丝溶液进行处理以诱导溶胶-凝胶转变的之前或之后将至少一种活性剂加入所述丝纤蛋白溶液中。
在一些实施方式中，所述丝溶液可以包含至少一种本申请所述的添加剂。在一些实施方式中，所述丝溶液还可以包含至少一种生物相容性聚合物或生物聚合物；增塑剂(例如甘油)；乳剂稳定剂(例如卵磷脂和/或聚乙烯醇)、表面活性剂(例如聚山梨醇酯-20)；界面张力调节剂如表面活性剂(例如盐)；β-片层诱导剂(例如盐)；可检测剂(例如荧光分子)。在一个实施方式中，所述丝溶液还可以包含乳剂稳定剂(例如卵磷脂和/或聚乙烯醇)。
通过将预先确定体积的步骤(a)中得到的乳剂加入非水相(例如油相或有机溶剂如聚乙烯醇)中，例如通过挤出样工艺滴加，能够控制所得到的丝颗粒的尺寸。例如，所述乳剂的预先确定的体积基本上与所述丝颗粒所需的尺寸相对应或成比例。挤出样工艺的特征为能够精确控制粒径和组合物的负载。例如，挤出样工艺可以包括将受控体积的已知组合物移取或注射至连续相，例如油相。在一些实施方式中，可以使用微流体生产更小的丝颗粒，如已针对其他生物材料微粒进行的(Chu等，2007；Tan和Takeuchi,2007；Ren等，2010)。
尽管通常将乳剂(将非水性液滴分散于所述丝溶液中的)加入非水相(例如油相或有机溶剂如聚乙烯醇)以形成包封至少一个非水性液滴的丝颗粒，在一些实施方式中，可以将所述乳剂加入含有表面活性剂(能够降低界面张力的任意分子，例如但不限于聚山梨醇酯-20)的水溶液中。在一个实施方式中，可以将所述乳剂加入包含表面活性剂(例如但不限于聚山梨醇酯-20)的盐溶液中(例如但不限于氯化钠(NaCl))。在这个实施方式中，不仅在所述盐溶液中能够形成丝颗粒，而且在存在所述盐的条件下丝纤蛋白中还能够形成β片层(例如已知NaCl在丝纤蛋白中诱导β片层)。
在一些实施方式中，所述方法还包括从所述非水相中分离所形成的丝颗粒。从乳剂的连续相中分离分散颗粒的方法是本领域公知的，例如过滤和/或离心，并且可以将其在本申请中使用。
在一些实施方式中，所述方法还可以包括选择所形成的特定尺寸或在选定尺寸分布范围内的丝颗粒。
在一些实施方式中，可以将所述丝颗粒保持在橡胶状、水合凝胶状态。在一些实施方式中，所述方法还可以包括对所述丝颗粒进行后处理。所述后处理可以包括改变所述丝颗粒的至少一种材料性质(例如但不限于所得到的丝颗粒的溶解度、孔隙度和/或机械性质)的任意处理。例如，在一些实施方式中，所述后处理可以包括脱水处理(例如通过干燥或冻干)以生产干燥状态的丝颗粒。在一些实施方式中，所述丝颗粒的冻干可以在其中的丝基质中诱导多孔性结构。在其他实施方式中，所述后处理可以包括在所述颗粒的丝纤蛋白中进一步诱导构象改变的处理。可以通过例如但不限于冻干或冷冻干燥、水退火、水蒸气退火、醇浸没、超声、剪切应力、电凝胶化、pH降低、盐加成、空气干燥、电纺丝、延展或其任意组合中的一种或多种诱导丝纤蛋白中的构象改变。在一些实施方式中，可以对所述丝颗粒和/或基于丝的组合物进行冷冻干燥。在一些实施方式中，根据下文中的详细描述例如水蒸气退火，可以对所述丝颗粒和/或基于丝的组合物进行退火处理。
在一些实施方式中，所述方法还包括在所述丝颗粒的外表面上形成涂层。所述涂层可以作为屏障以保持湿度和/或增加被所述基于丝的材料所围绕的油相内部包封的挥发性、疏水性和/或亲脂性试剂的保留。替代性的或附加的，所述涂层可以用于控制被所述基于丝的材料所围绕的油相内部包封的所述挥发性、疏水性和/或亲脂性试剂的释放。在一些实施方式中，所述涂层可以用于控制本申请所述的组合物的光学性质，例如减少反射的涂层。在一些实施方式中，所述涂层可以用于改善所述颗粒表面的光滑度。在一些实施方式中，所述涂层可以用于改善所述丝颗粒对特定细胞的靶向性。
可以采用本领域公知的任意方法将所述涂层应用于所述丝颗粒的外表面上，例如浸涂、喷涂、化学气相沉积、物理气相沉积、电镀、电化学法、溶胶-凝胶法、光学涂覆、粉末涂覆、粉末淤浆涂覆、离心及其任意组合。
本申请所述的任意生物相容性聚合物均能够用于涂覆本申请所述的丝颗粒的外表面。在一些实施方式中，所述涂层可以包含亲水性聚合物。亲水性聚合物的示例包括但不限于均聚物如基于纤维素的聚合物、基于蛋白的聚合物、水溶性基于乙烯基的聚合物、水溶性基于丙烯酸的聚合物和基于丙烯酰胺的聚合物，以及合成的聚合物如交联的亲水性聚合物，例如聚(氧化乙烯)。
在一些实施方式中，所述涂层可以包含丝纤蛋白层。对于形成丝涂层的示例性方法的描述参见例如国际专利申请号WO 2007/016524。例如，可以通过将所述丝颗粒的外表面与丝溶液接触并且诱导在丝纤蛋白中的构象改变形成丝涂层，例如使用本领域公知的任意方法和/或本申请所述的任意方法。
在一些实施方式中，所述涂层可以包含与丝层所交叠的亲水性聚合物层。在这些实施方式中，所述亲水性聚合物层可以包含聚(氧化乙烯)(PEO)。为了形成包含与丝层交叠的亲水性聚合物层的涂层，仅作为示例之用，可以将所述丝颗粒的外表面与亲水性溶液接触以形成亲水性聚合物层，并且然后可以将所得到的亲水性聚合物层与丝溶液接触以形成涂覆所述亲水性聚合物涂层的丝涂层。
不希望受到理论的束缚，尽管PEO是高粘性的并且可以具有保水性屏障的功能，但是增加的丝涂层能够对所包封的物质提供保护。所述丝层能够起到限制PEO扩散和阻止快速失水的作用。不希望受到理论的束缚，PEO/丝复合涂层能够有助于保持所述丝颗粒周围的水化并且阻止挥发性试剂如香料的提前释放。
在一些实施方式中，所述涂层还包含本申请所述的添加剂。例如，所述涂层还可以包含造影剂和/或染料。
使用本申请所述的丝颗粒和/或基于丝的组合物的示例性方法
可以将本申请所述的组合物的不同实施方式用于例如组织工程中如模拟具有较高脂质含量的组织，或用于使本申请所述的挥发性、疏水性和/或亲脂性试剂控释和/或稳定。因此，本申请还提供了使用所述组合物的一个或多个实施方式的方法。例如，本申请所述组合物的一些实施方式可以用于稳定在所述组合物的第二不相混溶的相中的活性剂(例如存在于油相内部中的挥发性的、疏水性的和/或亲脂性的试剂)。所述丝颗粒和/或基于丝的组合物可以以某种形式使用以便在室温或高于室温的条件下贮存和稳定或保持不稳定的和/或挥发性材料的生物活性和/或负载。因此，在一些实施方式中，所述丝颗粒和/或基于丝的组合物可以用于保持活性剂在特定条件下的稳定性和/或用作给予对象的活性剂的储库。因此，在一个方面，所述使用方法可以包括保持本申请所述的至少一种组合物(包括本申请所述的贮存稳定的组合物)或至少一种丝颗粒，其中存在所述组合物或所述丝颗粒的第二不相混溶的相中的所述活性剂能够在当将所述组合物(a)经过至少一个冻融循环，或(b)在约为室温或高于室温的温度下保持至少约24小时，或者(c)经过(a)和(b)两者时能够保持其原始生物活性和/或原始负载的至少一部分(例如至少约30％或者更高，包括例如至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％或者更高)。
在一些实施方式中，可以将所述组合物保持至少约1个月或更长时间，例如至少约2个月或更长时间、至少约3个月、至少约4个月、至少约5个月或者更长时间。
此外或替代性的，本申请所述组合物的一些实施方式可以用于使活性剂(例如在油相内部存在的挥发性、疏水性和/或亲脂性试剂)从所述组合物的第二不相混溶的相中可控地释放。因此，在一个方面，所述使用方法可以包括保持本申请所述的至少一种组合物(包括本申请所述的贮存稳定的组合物)或至少一种丝颗粒，其中所述基于丝的材料对所述至少一种活性剂是可渗透的以使得所述活性剂能够通过所述基于丝的材料以预先确定的速率释放进入周围的环境中。在一些实施方式中，所述预先确定的速率可以通过例如调整在所述基于丝的材料中存在的丝纤蛋白的β片层构象的量、所述基于丝的材料的孔隙度或其组合控制。生产多孔性丝材料的方法是本领域公知的，例如通过致孔剂浸出法和/或冷冻干燥。
所述组合物可以在任意环境条件下保持。例如，在一些实施方式中，所述组合物可以在约为室温的条件下保持。在其他实施方式中，所述组合物可以在约37℃或更高的温度下保持。在一些实施方式中，所述组合物可以在暴露于光照的条件下保持。在一些实施方式中，所述组合物可以在相对湿度至少约10％或更高的条件下保持，包括例如至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％或者更高。
本申请所述的丝颗粒和/或基于丝的组合物还可以用于递送活性剂，例如不稳定的和/或挥发性的材料。递送活性剂(例如挥发性的、疏水性的和/或亲水性的试剂)的方法包括应用于或给予对象本申请所述的至少一种组合物(包括本申请所述的贮存稳定的组合物)或至少一种丝颗粒，所述组合物或丝颗粒的基于丝的材料对所述活性剂是可渗透的以使得在将所述组合物应用于或给予所述对象后所述活性剂能够通过所述基于丝的材料以预先确定的速率释放所述活性剂。
在一些实施方式中，所述活性剂能够释放进入周围的环境中。本申请所述的术语“周围的环境”指本申请所述的丝颗粒或基于丝的组合物的周围，其取决于所述丝颗粒或基于丝的组合物所处的或应用的场所。根据应用目的和/或应用部位，在一些实施方式中，在所述组合物的第二不相混溶的相中存在的所述活性剂(例如存在于油相内部中的挥发性的、疏水性的和/或亲脂性的试剂)可以释放进入周围的环境中，例如周围的空气中。在这些实施方式中，可以将所述组合物局部地应用于所述对象。在一个实施方式中，可以将所述组合物应用于对象的皮肤或表面。所述对象可以是活体对象，例如哺乳动物对象，或者其可以是物理对象，如制品。
或者，当将所述组合物在体内应用或施用时，在所述组合物的第二不相混溶的相中存在的所述活性剂(例如存在于油相内部中的挥发性的、疏水性的和/或亲脂性的试剂)能够释放至对象的靶生物细胞。在这些实施方式中，所述组合物可以口服或胃肠外应用于或给予所述对象。
在丝纤蛋白中诱导构象改变(例如β片层的形成)
在一些实施方式中，可以将本申请所述的丝颗粒和/或基于丝的组合物制成水不溶性的，例如通过增加丝纤蛋白中β片层的含量。有多种不同的用于在基于丝的材料中诱导丝纤蛋白的构象改变(例如β片层的形成)的方法。不希望受到理论的束缚，诱导丝纤蛋白的构象改变能够改变在所述基于丝的材料中的丝纤蛋白的结晶度，例如丝IIβ片层的结晶度。这能够改变包封在所述丝基质中的分子(如果有的话)的释放速率和/或改变所述丝基质的降解速率(进而所掺入的脂质相的释放)。可以采用本领域公知的任意方法诱导丝纤蛋白的构象改变，包括但不限于醇浸没(例如乙醇、甲醇)、水退火、水蒸气退火、热退火、剪切应力、超声(例如通过超声处理)、降低pH(例如pH滴定和/或将丝基质暴露于电场)、冷冻干燥及其任意组合。例如，可以通过一种或多种方法在丝纤蛋白中获得β片层构象，包括但不限于受控制的缓慢干燥(Lu等，10Biomacromolecules 1032(2009))；水退火(Jin等，15Adv.Funct.Mats.1241(2005)；Hu等，12Biomacromolecules 1686(2011))；伸展(Demura&Asakura,33Biotech&Bioengin.598(1989))；压缩；溶剂浸没包括甲醇(Hofmann等，111J Control Release.219(2006))，乙醇(Miyairi等，56J.Fermen.Tech.303(1978))，戊二醛(Acharya等，3Biotechnol J.226(2008))和1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(EDC)(Bayraktar等，60Eur J Pharm Biopharm.373(2005))；调节pH例如pH滴定和/或将丝基质暴露于电场(参见例如美国专利申请号US2011/0171239)；热处理；剪切应力(参见例如国际专利申请号：WO 2011/005381)，超声，例如超声处理(参见例如美国专利申请公开号U.S.2010/0178304和国际专利申请号WO2008/150861)；及其任意组合。上文中列出的所有参考文献的内容均通过引用整体并入本申请。
在一些实施方式中，本申请所述的丝颗粒和/或基于丝的组合物可以包含不稳定的和/或挥发性活性剂，其可能需要温和的丝处理方法。因此，在一些实施方式中，可以通过水退火在所述丝颗粒和/或基于丝的组合物中诱导β片层的形成。有多种不同的用于水退火的方法。一种水退火的方法涉及使用水蒸气处理固化的而非可溶形式的丝纤蛋白。不希望受到理论的束缚，据信水分子的作用是增塑剂，其使得丝纤蛋白分子的链移动以促进氢键形成，从而导致β片层二级结构的增加。这一过程在本申请中也称为“水蒸气退火”、不希望受到理论的束缚，据信物理上温度控制的水蒸气退火(TCWVA)提供了一种简单并有效的获得分子结构精确控制的丝生物材料(例如本申请公开的丝基质)的方法。可以在控制β片层的结晶度的情况下制备丝基质，从使用4℃的条件下的较低含量(α螺旋占主要地位的丝I结构)至100℃的条件下的较高含量～60％的结晶度(β-片层占主要地位的丝II结构)。这种物理方法覆盖了在丝材料的制备过程中此前报道的控制结晶的结构范围，其还是一种更加简单、绿色化学、对再现性具有严格控制的方法。对温度控制的水蒸气退火的描述，参见例如Hu等，Regulation of Silk Material Structure By Temperature ControlledWater Vapor Annealing,Biomacromolecules,2011,12(5):1686-1696，其全部内容通过引用并入本申请。
退火的另一种方法是将水从丝材料/基质的丝纤蛋白中缓慢地、受控的蒸发。对缓慢地、受控的干燥的描述参见例如，Lu等，Acta.Biomater.2010,6(4):1380-1387。
不希望受到理论的束缚，据信水退火提供了一种简单并有效在基于丝的材料和组合物中获得精细受控的丝纤蛋白分子结构的方法。使用水退火，可以在控制β片层的结晶度的情况下制备所述基于丝的材料，从使用4℃的条件下的较低含量(α螺旋占主要地位的丝I结构)至100℃条件下的较高含量～60％结晶度(β-片层占主要地位的丝II结构)。这种物理方法覆盖了在丝材料的制备过程中此前报道的控制结晶的结构范围，其还是一种更加简单、绿色化学、对再现性具有严格控制的方法。对水或水蒸气退火的描述参见例如2004年4月12日提交的PCT/US2004/011199；2005年6月13日提交的PCT/US2005/020844；Jin等，Adv.Funct.Mats.2005,15:1241；和Hu等，2011,12(5):1686-1696，其全部内容均通过引用并入本申请。因此，在一些实施方式中，所述基于丝的材料包含至少10％的β-片层结晶度，例如15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、70％、85％、90％、95％或更高含量，但不是100％(即并非所有的丝纤蛋白均为β-片层构象)。在一些实施方式中，在所述组合物中全部的丝纤蛋白均为β-片层构象，即100％的β-片层结晶度。术语β-片层结晶度和丝II在本申请中可以互换使用。因此，β-片层结晶度％的表述也指处于丝II构象的丝纤蛋白的含量。
所述退火步骤可以在水蒸气环境中(如在充满水蒸气的小室中)进行不同的时间。不希望受到理论的束缚，退火的时间长度影响在所述基于丝的材料中获得的β-片层结晶度的量。因此，典型的退火时间范围为从几秒到几天。在一些实施方式中，所述退火为从几秒至几小时的一段时间。例如，退火时间范围为从几秒(例如约5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55或60秒)至约2、6、12、24、36或48小时。
在所述退火处理中使用的水蒸气的温度影响所获得的β-片层结晶度的量。参见HU等，Biomacromolecules,12:1686-1696。因此，所述退火可以在任意所需的温度下进行。例如，所述退火可以在水蒸气温度从约4℃至约120℃的范围内进行。可以根据等式(I)计算在所述丝基质中获得所需量的β-片层结晶度的最佳水蒸气：
C＝a(1-exp(-k.T))   (I)
其中C是β-片层结晶度，a为62.59，k为0.028和T为退火温度。参见HU等，Biomacromolecules,12:1686-1696。
不希望受到理论的束缚，在退火发生时的压力也能够影响β-片层结晶的程度或量。在一些实施方式中，所述接触可以在真空环境中进行。
在退火发生时的相对湿度也能够影响β-片层结晶的程度或量。所述基于丝的材料与水或水蒸气接触时的相对湿度范围可以从约5％至100％。例如，相对湿度可以从约5％至约95％、从约10％至约90％或者从约15％至约85％。在一些实施方式中，相对湿度是90％或者更高。
诱导丝纤蛋白中β-片层的形成的另一种有用的方法是通过使用有机溶剂将所述基于丝的材料脱水，所述有机溶剂如醇，例如甲醇、乙醇、异丙醇、丙酮等。此类溶剂具有使丝纤蛋白脱水的作用，其促进丝纤蛋白分子“包装”以形成β片层结构。在一些实施方式中，可以使用醇对基于丝的材料进行处理，例如甲醇、乙醇等。所述醇的浓度可以是至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或100％。在一些实施方式中，醇的浓度是约90％。
无论使用什么方法诱导β片层的形成，经处理的丝纤蛋白均能够具有较高的结晶程度，以使得其变成不溶性的。在一些实施方式中，“较高的结晶程度”指β片层的含量为约20％至约70％之间，例如约20％、约25％、约30％、约35％、约40％、约45％、约50％、约55％、约60％、约65％和约75％。
在一些实施方式中，诱导β片层的形成能够提供包含丝IIβ片层结晶的含量为至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或至少95％但不是100％(即所有的丝均以丝IIβ片层构象形式存在)的基于丝的材料。在一些实施方式中，所述基于丝的材料可以具有100％的丝IIβ片层结晶度。
使用本申请公开的方法和组合物能够在基于丝的材料中获得所需的β片层结晶度，同时使所述活性剂保持其原始活性的至少50％(例如50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或更高)。不受限制的，所述活性剂能够分布在所述基于丝的材料中，其被所述基质所包封、被所述基质所包被或其任意组合。
在基于丝的材料和/或在与丝不相混溶的隔室或液滴例如油中包封的活性剂的示例
在本申请中使用的术语“活性剂”指当将此类分子、化合物或组合物掺入基于丝的材料和/或与丝不相混溶的隔室(例如包含脂质的隔室，例如油)中时其活性需要被保持的任意分子、化合物或组合物。不受限制的，所述活性剂可以选自下组：有机或无机小分子；糖类；寡糖；多糖；肽；肽类似物和衍生物；拟肽；蛋白；抗原；抗体；抗体的抗原结合片段；酶；免疫原；疫苗；核酸，例如DNA、RNA、寡核苷酸、多核苷酸、siRNA、shRNA、modRNA(包括LNA)反义寡核苷酸、适体、核酶、活化的RNA、诱捕性寡核苷酸等；核酸类似物和衍生物，例如肽核酸、锁核酸、经修饰的核酸等；抗生素；治疗剂；细胞；病毒；细菌；由生物材料如细菌、病毒、植物、真菌或动物细胞制备的提取物；动物组织；天然存在的或合成的组合物及其任意组合。在一些实施方式中，与在第二不相混溶的相中相比，包封在第一不相混溶的相中的所述活性剂在所述第一不相混溶的相中具有更高的溶解性。在一些实施方式中，与在第一不相混溶的相中相比，包封在第二不相混溶的相中的所述活性剂在所述第二不相混溶的相中具有更高的溶解性。
获得包含丝纤蛋白和活性剂的组合物的方法是本领域中熟知的。然而，制备包含丝纤蛋白和活性剂的组合物并且保持所述活性剂至少一些的原始生物活性和/或原始负载的方法尚未被阐明。特别是，当所述组合物需要在制备后进行后处理时。多种活性剂对制备所述基于丝的基质所使用的条件是敏感的并且一旦被包封在所述丝基质中时就可能丧失其活性。例如，大部分生物分子对有机溶剂(如醇)敏感。当与有机溶剂接触时，这些分子可能损失其至少一部分的活性。因此，依赖有机溶剂生产所述组合物的条件可能对将要在基于丝的基质中保持的活性剂是不利的。
因此，在一些实施方式中，所述活性剂是生物分子。在本申请中使用的术语“生物分子”指已知存在于生物系统中的任意分子，包括氨基酸、蛋白、肽、抗体、抗体的抗原结合片段、核酸(包括DNA和RNA)、糖类、多糖等。如在本申请中所使用的，生物分子包括天然存在的那些以及使用公知的技术修饰的那些。
在一些实施方式中，所述活性剂是治疗剂。在本申请中使用的术语“治疗剂”是指给予生物体用于诊断、治疗、预防性医疗或兽用目的的分子、一组分子、复合物或物质。在本申请中使用的术语“治疗剂”包括“药物”或“疫苗”。该术语包括外部和内部施用的外用、局部和全身性人用和动物用药物、治疗、疗法、保健品、药妆、生物制品、装置、诊断法和避孕剂，包括用于临床和兽用筛选、阻止、预防、治愈、疗养、检测、成像、诊断、治疗、手术、监测、化妆、修复、法医等的配制品。该术语还用于涉及农药、工作场所、部队、工厂和环境的治疗或疗法，其包括能够识别细胞受体、膜受体、激素受体、治疗受体、微生物、病毒的选定分子或选定核酸序列或者包含或能够接触植物、动物和/或人的选定靶点。该术语还能够特别地包括核酸和包含核酸的化合物，所述核酸产生治疗作用，例如脱氧核糖核酸(DNA)、核糖核酸(RNA)或者其混合物或组合，包括例如DNAnanoplex。
术语“治疗剂”还包括在其所应用的生物系统中能够提供局部或全身性的生物学、生理学或治疗作用的药剂。例如，所述治疗剂能够发挥作用以控制感染或炎症、增强细胞生长和组织再生、控制肿瘤生长、作为镇痛剂、促进抗细胞粘附、增强骨生长以及其他功能。其他适宜的治疗剂可以包括抗病毒剂、激素、抗体或治疗性蛋白。其他治疗剂包括前药，其为给予时不具有生物活性但是在给予对象后通过代谢或某种其他机制转化为生物活性剂的药剂。此外，基于丝的药物递送组合物可以含有两种或多种治疗剂的组合。
示例性的治疗剂包括但不限于见于Harrison’s Principles of Internal Medicine，第13版，T.R.Harrison等编著，McGraw-Hill N.Y.,NY；Physicians’Desk Reference，第50版，1997,Oradell New Jersey,Medical Economics Co.；Pharmacological Basis of Therapeutics，第8版，Goodman and Gilman,1990；United States Pharmacopeia,The National Formulary,USP XII NFXVII,1990；现行版本的Goodman and Oilman’s The Pharmacological Basis of Therapeutics；以及现行版本的The Merck Index中的那些，其全部内容均通过引用并入本申请。
其他活性剂的示例包括但不限于：细胞粘附介导剂，例如胶原蛋白、弹性蛋白、纤连蛋白、玻连蛋白、层粘连蛋白、蛋白聚糖或含有已知整合素结合结构域的肽，例如“RGD”整合素结合序列或其变体，已知其能够影响细胞的粘附(Schaffner P&Dard 2003Cell MolLife Sci.Jan；60(1):119-32；Hersel U.等，2003Biomaterials.Nov；24(24):4385-415)；生物活性配体；以及增强或排斥特定的多种细胞或组织向内生长的物质。增强增殖或分化的添加剂的其他示例包括但不限于骨诱导性物质，如骨形态发生蛋白(BMP)；细胞因子、生长因子如表皮生长因子(EGF)、血小板来源的生长因子(PDGF)、胰岛素样生长因子(IGF-I和II)、TGF-β1等。
尽管本申请所述的任意活性剂均能够包封在与丝不相混溶的相中(在本申请中称为“第二不相混溶的相”，而在本申请中所述的“第一不相混溶的相”包含基于丝的基质)，在一些实施方式中，在所述第二不相混溶的相中存在的活性剂可以包含疏水性或亲脂性分子。在本申请中使用的术语“疏水性分子”指在水中不能完全溶解的分子。在本申请中使用的术语“亲脂性分子”指趋向于与脂质或脂肪结合或溶解于其中的分子。所述疏水性或亲脂性分子的示例可以包括但不限于治疗剂、营养剂(例如脂溶性维生素)、化妆品、着色剂、益生菌剂、染料、芳香族化合物、脂肪族化合物(例如烷烃、烯烃、炔烃、环烷烃、环烯烃和环炔烃)或其任意组合。
此外，丝纤蛋白与活性剂的比例或者与丝不相混溶的相与活性剂的比例可以是任意所需的比例。例如，丝纤蛋白与活性剂的比例或者与丝不相混溶的相与活性剂的比例的范围可以是从约1:1000至约1000:1、约1:500至约500:1、约1:250至约250:1、约1:125至约125:1、约1:100至约100:1、约1:50至约50:1、约1:25至约25:1、约1:10至约10:1、约1:5至约5:1、约1:3至约3:1或约1:1。丝纤蛋白与活性剂的比例或者与丝不相混溶的相与活性剂的比例可以随着多种因素而改变，包括活性剂的选择、丝纤蛋白的浓度、基于丝的材料的形式、与丝不相混溶的相的规格等。本领域技术人员能够确定丝纤蛋白与活性剂的适宜比例，例如通过测定如本申请所描述的不同比例下活性剂的生物活性而确定。
不同形式的基于丝的材料
如本申请所述的，包封不相混溶的相(任选地包含活性剂)的基于丝的材料可以是任意形式、形状或尺寸的。例如，所述基于丝的材料可以是溶液、纤维、薄膜、薄片、垫、无纺垫、网状物、海绵、泡沫、凝胶、水凝胶、管、颗粒(例如纳米粒或微粒、凝胶样颗粒)、粉末、支架、三维结构、组织工程结构、在基材上的涂层或其任意组合。
在一些实施方式中，所述基于丝的材料可以是可注射组合物的形式。在本申请中使用的术语“可注射的组合物”指具有适宜的粘度以便易于通过常规套管注射的组合物，所述套管具有18号针头的尺寸或更细的尺寸。在一个更特定的实施方式中，根据本发明的组合物能够通过21号针。为符合这些可注射的标准，根据本发明的组合物应具有小于约60,000cSt的粘度。
在一些实施方式中，所述活性剂在所述基于丝的材料中是分布均匀的或均质的。在一些实施方式中，所述活性剂被所述基于丝的材料中的丝纤蛋白所包封。在一些实施方式中，所述活性剂被丝纤蛋白层所涂覆。
在一些实施方式中，所述基于丝的材料处于在其中包含腔或洞的基质形式中并且至少部分量的所述活性剂存在于所述腔或洞中。在一些实施方式中，所述丝纤蛋白处于在其中包含腔或洞的基质形式中并且至少部分量的所述活性剂存在于所述腔或洞中并且至少部分量的所述活性剂分布在丝纤蛋白本身的网络中。在一些实施方式中，当所述基质包含腔或洞时，至少5％(例如至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少98％)的所述活性剂存在于由所述基于丝的材料形成的腔或洞中。在一些实施方式中，全部量的所述活性剂存在于所述腔/洞中。
如上文所示，包含活性剂的所述基于丝的材料可以是任意形式、形状或尺寸。因此，在一些实施方式中，所述基于丝的材料是纤维形式的。在本申请中使用的术语“纤维”指相对柔软的单位物质，其具有较高的横跨垂直于其长度的截面的长宽比。制备丝纤蛋白纤维的方法是本领域熟知的。可以通过电纺丝溶液、拉制丝溶液等制备纤维。电纺丝材料如纤维以及制备其的方法参见例如WO2011/008842，其全部内容通过引用并入本申请。不受限制的，所述活性剂可以分布于所述纤维的丝纤蛋白基质中、存在于所述纤维的表面上或其任意组合。
在一些实施方式中，包含所述活性剂的所述基于丝的材料可以是薄膜形式，例如丝薄膜。在本申请中使用的术语“薄膜”指平面或管状的柔性结构。值得注意的是，术语“薄膜”使用其通常含义包括网、薄膜、薄片、层叠等。在一些实施方式中，所述薄膜是具有图样的薄膜，例如纳米图样薄膜。制备丝纤蛋白薄膜的示例性方法参见例如，WO2004/000915和WO 2005/012606，这两者的全部内容均通过引用并入本申请。不受限制的，所述活性剂能够分布于所述薄膜中、存在于所述薄膜的表面上、被所述薄膜所涂覆或其任意组合。
在一些实施方式中，所述丝基质可以是丝颗粒的形式，例如丝纳米球或丝微球。在本申请中使用的术语“颗粒”包括球、棒、壳体和棱柱；并且这些颗粒可以是网络或聚集体的一部分。不受限制的，所述颗粒可以具有从nm至毫米的任意尺寸。在本申请中使用的术语“微粒”指粒径为约1μm至约1000μm的颗粒。在本申请中使用的术语“纳米粒”指粒径为约0.1nm至约1000nm的颗粒。
本领域的普通技术人员将理解颗粒通常显示出分布在所示“尺寸”附近的粒径。除非另有明示，在本申请中使用的术语“粒径”指颗粒尺寸分布的模式，即最常出现的尺寸分布的值。用于测定粒径的方法是本领域技术人员公知的，例如通过动态光散射(如光相关光谱、激光衍射、小角激光光散射(LALLS)和中等角度激光光散射(MALLS))、光遮蔽方法(例如Coulter分析法)或其他技术(例如作为流变学，和光学或电子显微镜)。
在一些实施方式中，所述颗粒可以基本上是球形。“基本上是球形”指所述颗粒横截面的最长与最短长度垂直轴之比小于或等于约1.5。基本上是球形的颗粒不要求线性对称。而且，所述颗粒可以具有与所述颗粒的总体尺寸相比尺寸较小的表面纹理，如线条或凹陷，并且所述颗粒仍基本上为球形。在一些实施方式中，所述颗粒最长和最短轴之间的长度比为小于或等于约1.5、小于或等于约1.45、小于或等于约1.4、小于或等于约1.35、小于或等于约1.30、小于或等于约1.25、小于或等于约1.20、小于或等于约1.15、小于或等于约1.1。不希望受到理论的束缚，在基本上是球形的颗粒中表面接触是最小的，其使得在贮存时所述颗粒不期望的聚集被最大程度的减少。很多结晶和薄片具有平坦的表面，其能够产生较大的表面接触面积，在此处能够发生由离子或非离子相互作用导致的聚集。球形使得接触面积更小。
在一些实施方式中，所述颗粒具有基本上相同的粒径。具有较宽尺寸分布的颗粒，其中具有相对较大和较小的颗粒，这使得较小的颗粒会填充进入所述较大颗粒之间的空隙中，从而形成了新的接触表面。较宽的粒径分布会产生较多的结合聚集的接触机会从而导致形成更大的球形。本申请所述的颗粒具有较窄的粒径分布，从而使得接触聚集的机会被最大程度的减少。“较窄的粒径分布”指较小球形颗粒中占90％体积的直径与占10％体积的直径的比值小于或等于5的粒径分布。在一些实施方式中，在所述较小球形颗粒中占90％体积的直径与占10％体积的直径的比值小于或等于4.5、小于或等于4、小于或等于3.5、小于或等于3、小于或等于2.5、小于或等于2、小于或等于1.5、小于或等于约1.45、小于或等于约1.40、小于或等于约1.35、小于或等于约1.3、小于或等于约1.25、小于或等于约1.20、小于或等于约1.15、小于或等于约1.1。
还可以使用几何标准偏差(GSD)表示较窄的粒径分布。GSD的计算涉及在累积小于百分数15.9％和84.1％的条件下确定有效的截止直径(ECD)。GSD等于小于84.17％的ECD与小于15.9％的ECD的比值的平方根。当GSD<2.5时GSD具有较窄的粒径分布。在一些实施方式中，GSD小于2、小于1.75或者小于1.5。在一个实施方式中，GSD小于1.8。
不受限制的，丝纤蛋白和活性剂可以制剂成至少六种类型的颗粒：(1)包含由丝纤蛋白形成的核的纳米颗粒，所述活性剂吸收/吸附在所述纳米颗粒核上或在其上形成涂层；(2)包含由所述活性剂形成的核的纳米颗粒，其被一层或多层丝纤蛋白涂覆；(3)包含大致匀质的丝纤蛋白和活性剂的混合物的纳米颗粒；(4)包含核的纳米颗粒，所述核含有丝纤蛋白和所述活性剂的混合物并且在丝纤蛋白的核上具有涂层；(5)包含丝纤蛋白或活性剂以外的材料的核的纳米颗粒，其涂覆一个或多个层，所述层包含活性剂或丝纤蛋白或者活性剂和丝纤蛋白的任意组合；和(6)包含(1)-(5)中的任意一种纳米颗粒的纳米颗粒并且进一步包含丝纤蛋白或活性剂以外的材料的一个或多个层，例如聚合物。对丝纤蛋白颗粒(例如微球、纳米球或凝胶样颗粒)及其制备方法的描述参见例如美国专利号8,187,616；和美国专利申请公开号US 2008/0085272、US 2010/0028451、US2012/0052124、US 2012/0070427、US 2012/0187591，其全部内容通过引用并入本申请。不受限制的，所述活性剂可以分布于所述薄膜的丝纤蛋白基质中、存在于所述薄膜的表面上、被所述薄膜所涂覆或其任意组合。
在一些实施方式中，所述基于丝的材料可以是泡沫或海绵的形式。用于制备丝凝胶和水凝胶的方法是本领域熟知的。在一些实施方式中，所述泡沫或海绵是有图案的泡沫或海绵，例如具有纳米图样的泡沫或海绵。用于制备丝泡沫和海绵的示例性方法参见例如，WO2004/000915、WO 2004/000255和WO 2005/012606，其全部内容通过引用整体并入本申请。不受限制的，所述活性剂能够分布于所述泡沫或海绵的丝纤蛋白基质中、吸附于所述泡沫或海绵的表面上、存在于所述泡沫或海绵的孔中或其任意组合。
在一些实施方式中，所述基于丝的材料可以是凝胶或水凝胶的形式。在本申请中使用的术语“水凝胶”指其显示出能够在水中溶胀并且在其结构中保留相当一部分水且不溶解的基于丝的材料。用于制备丝凝胶和水凝胶的方法是本领域熟知的。用于制备丝凝胶和水凝胶的示例性方法参见例如，WO 2005/012606，其内容通过引用整体并入本申请。不受限制的，所述活性剂能够分布于所述凝胶或水凝胶的丝纤蛋白基质中、吸附于所述凝胶或水凝胶或海绵的表面上、存在于所述凝胶或水凝胶的孔中或其任意组合。
在一些实施方式中，所述基于丝的材料可以是圆柱形基质的形式，例如丝管。所述活性剂能够存在于所述圆柱形基质的管腔中或分散于所述圆柱形基质的壁中。所述丝管可以使用本领域公知的任意方法制备。例如，可以使用模塑、浸渍、电纺丝、凝胶纺丝等制备管。对凝胶纺丝的描述参见Lovett等(Biomaterials,29(35):4650-4657(2008))并且对凝胶纺丝管构建的描述参见2009年4月8日提交的PCT申请号PCT/US2009/039870，这两者的内容通过引用整体并入本申请。对使用浸渍涂覆法构建的丝管的描述参见2008年8月11日提交的PCT申请号PCT/US2008/072742，其内容通过引用整体并入本申请。对使用薄膜纺丝法构建的丝管的描述参见2013年3月11日提交的PCT申请号PCT/US2013/030206和2012年3月20日提交的美国临时专利申请号61/613,185。不希望受到理论的束缚，据信与浸渍-涂覆技术相比使用薄膜纺丝或凝胶纺丝能够更容易地控制所述丝管的内部和外部直径。
在一些实施方式中，所述基于丝的材料可以是多孔的。例如，所述丝基质可以具有的孔隙度为至少约10％、至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％或者更高。过高的孔隙度可能生产出较低机械性质的丝基质，但是包封于其中的分子能够更加迅速的释放。然而，过低的孔隙度可能降低在所述基质中所包封的分子的释放。因此，本领域技术人员能够基于多种因素对孔隙度进行调整，例如但不限于所需的释放速率、包封于所述基质中分子的分子尺寸和/或扩散系数、和/或浓度、在所述丝管中丝纤蛋白的量、和/或所述基质所需的物理或机械性质。在本申请中使用的术语“孔隙度”是在材料中的空隙空间的检测指标并且其是空隙体积占总体积的分数，以0和100％之间的百分数表示(或0和1之间)。孔隙度的测定是本领域技术人员熟知的，例如使用标准技术如水银孔率法和气体吸附，例如氮气吸附。
多孔的基于丝的材料可以具有任意孔径。在本申请中使用的术语“孔径”指所述孔的横截面的直径或有效直径。术语“孔径”还可以指基于多个孔的测定结果的所述孔的横截面的平均直径或平均有效直径。不是圆形的横截面的有效直径等于与非圆形的横截面具有相同横截面积的圆形横截面的直径。在一些实施方式中，所述基质的孔可以具有的尺寸分布范围为从约50nm至约1000μm、从约250nm至约500μm、从约500nm至约250μm、从约1μm至约200μm、从约10μm至约150μm或者从约50μm至约100μm。在一些实施方式中，当水化时所述丝基质是能够被溶胀的。然后所述孔的尺寸可能会改变，这取决于在所述丝基质中的含水量。在一些实施方式中，所述孔可以被流体(如水或空气)填充。
在基于丝的材料中形成孔的方法是本领域公知的并且包括但不限于致孔剂浸出法、冷冻干燥法和/或气体形成法。在基于丝的材料中形成孔的示例性方法参见例如，美国专利申请公开号US 2010/0279112和US 2010/0279112；美国专利号7,842,780；和WO2004062697，其全部内容通过引用整体并入本申请。
尽管并不意味着被理论所束缚，可以通过不同的纺丝后处理对基于丝的材料的多孔性、结构和机械性质进行控制如蒸汽退火、热处理、醇处理、空气干燥、冻干等。此外，可以通过改变工艺参数来控制包封于所述基质中的分子的任意所需的释放速率、性质或动力学，如基质厚度、丝分子量、在所述基质中的丝浓度、β片层构象结构、丝IIβ片层结晶度或多孔性和孔径。
在一些实施方式中，所述基于丝的材料可以是植入物或支架的形式，如药物递送储库。在本申请中使用的术语“植入物”包括在其范围内旨在植入脊椎动物机体中的任意装置，特别是哺乳动物如人。植入物可以是用于使活性剂在对象中受控的、持续释放的药物递送储库。
对于在丝纤蛋白基质中掺入活性剂而言，可以将所述活性剂包括在用于生产所述基质的丝纤蛋白溶液中。或者或此外，可以将预形成的基于丝的材料加入包含所述活性剂的溶液中并使得所述活性剂吸附于所述基质之中/上面。
对于掺入所述基于丝的材料而言，所述活性剂可以以适于用于制备所述基于丝的材料的特定方法的任意形式。例如，所述活性剂可以是固体、液体或凝胶形式。在一些实施方式中，所述活性剂是溶液、粉末、压缩粉末或粒状形式。在一些实施方式中，所述活性剂可以包封于丝纤蛋白颗粒中以便掺入所述基于丝的材料。所述活性剂可以包封于丝基质中，例如通过在处理成所需的材料状态前将治疗剂混入丝溶液，例如用于掺入本申请所公开的基于丝的材料的微球或纳米球。包封活性剂的丝纤蛋白颗粒的描述参见例如，美国专利号8,187,616；和美国专利申请公开号US 2008/0085272、US 2010/0028451、US2012/0052124、US 2012/0070427、US 2012/0187591，其全部内容通过引用并入本申请。
丝纤蛋白
在本申请中使用的术语“丝纤蛋白”("silk fibroin"或"fibroin")包括蚕丝纤蛋白和昆虫或蜘蛛丝蛋白。参见例如Lucas等，13Adv.Protein Chem.107(1958)。任意类型的丝纤蛋白均能够用于根据本发明的方面。丝纤蛋白由蚕生产，如家蚕(Bombyx mori)，其是最常见的和环保的可再生资源。例如，丝纤蛋白可以通过从家蚕的茧中提取丝胶获得。有机的蚕茧也是可以市售获得的。但是，可以使用多种不同的丝，包括蛛丝(例如来自Nephilaclavipes)、转基因丝、基因工程丝(重组丝)，如来自细菌、酵母、哺乳动物细胞、转基因动物或转基因植物及其变体的。参见例如，WO 97/08315和美国专利号5,245,012，这两者的内容均通过引用整体并入本申请。在一些实施方式中，丝纤蛋白可以来自其他来源如蜘蛛、其他蚕、蜂及其生物工程变体。在一些实施方式中，丝纤蛋白可以提取自蚕或转基因蚕的腺体。参见例如，WO2007/098951，其内容均通过引用整体并入本申请。在一些实施方式中，丝纤蛋白不含或基本上不含丝胶，即丝纤蛋白是基本上除去丝胶的丝纤蛋白。
在一些实施方式中，所述丝纤蛋白可以包括两亲性肽。在其他实施方式中，所述丝纤蛋白可以不含两亲性肽。“两亲性肽”具有亲水性和疏水性性质。两亲性分子通常能够通过将疏水性部分嵌入脂质膜并将亲水性部分暴露于水性环境与生物膜相互作用。在一些实施方式中，所述两亲性肽可以包含RGD基序。两亲性肽的一个例子是23RGD肽，其氨基酸序列为：
HOOC-Gly-ArgGly-Asp-Ile-Pro-Ala-Ser-Ser-Lys-Gly-Gly-Gly-Gly-SerArg-Leu-Leu-Leu-Leu-Leu-Leu-Arg-NH2。两亲性肽的其他例子包括在美国专利申请号US 2011/0008406中公开的一种，其内容通过引用并入本申请。
可以采用本领域技术人员公知的任意常规方法制备丝纤蛋白溶液。例如，将家蚕的茧在水性溶液中煮沸约30分钟。优选地，所述水性溶液是约0.02M的Na2CO3。使用例如水对茧进行漂洗以提取丝胶蛋白，并且将提取的丝溶解在水性盐溶液中。用于该目的的盐包括溴化锂、硫氰酸锂、硝酸钙或者能够溶解丝的其他化学物质。优选地，将提取的丝溶解在约9-12M LiBr溶液中。随后使用例如透析或层析除去盐。
如有必要的话，然后使用例如针对吸湿的聚合物的透析对溶液进行浓缩，例如PEG、聚氧化乙烯、直链淀粉或丝胶。优选地，PEG的分子量为8,000-10,000g/mol和浓度为10–50％。使用slide-a-lyzer透析盒(例如Pierce,MW CO 3500)。但是，可以使用任意透析系统。将透析进行一段时间以足以使得水性丝溶液的终浓度为10-30％之间。在大多数情况下，透析进行2-12小时就足够了。参见例如，PCT申请PCT/US/04/11199，其内容通过引用并入本申请。
或者，可以使用有机溶剂生产丝纤蛋白溶液。此类方法已在例如Li,M.等，J.Appl.PolySci.2001,79,2192-2199；Min,S.等，Sen’I Gakkaishi 1997,54,85-92；Nazarov,R.等，Biomacromolecules 2004May-Jun；5(3):718-26中进行了描述。能够用于生产丝溶液的示例性有机溶剂包括但不限于六氟异丙醇(HFIP)。参见例如，国际申请号WO2004/000915，其内容均通过引用整体并入本申请。
不希望受到理论的束缚，据信用于制备本申请公开的组合物的丝的分子量可能对所述组合物的性质具有影响，如活性剂的释放动力学、溶胀比率、降解、机械性质等。
用于形成所述组合物的丝纤蛋白溶液可以具有任意所需的丝纤蛋白浓度，例如从约1％至约50％(w/v)的丝纤蛋白浓度。在一些实施方式中，所述丝纤蛋白溶液具有从约10％至约40％或从15％至约35％(w/v)的丝纤蛋白浓度。在一个实施方式中，所述丝纤蛋白溶液具有从约20％至约30％(w/v)的丝纤蛋白浓度。在一个实施方式中，所述丝纤蛋白溶液具有约30％(w/v)的丝纤蛋白浓度。在一些实施方式中，所述丝纤蛋白溶液具有从约0.1％至约30％(w/v)、约0.5％至约15％(w/v)、约1％至约8％(w/v)或约1.5％至约5％(w/v)的丝纤蛋白浓度。在一些实施方式中，所述丝纤蛋白溶液具有约5％至约30％(w/v)、约10％至约25％(w/v)或约15至约20％(w/v)的丝纤蛋白浓度。
可以针对不同的应用或所述基质所需的机械或化学性质对制备所述组合物的丝纤蛋白进行修饰(例如以便于在基于丝纤蛋白的材料中形成添加剂(例如活性剂)的梯度)。本领域技术人员能够选择适宜的方法对丝纤蛋白进行修饰，例如根据丝纤蛋白的侧链基团、丝纤蛋白所需的反应性和/或丝纤蛋白上所需的电荷密度。在一个实施方式中，可以使用氨基酸侧链化学对丝纤蛋白进行修饰，如通过共价键合的化学修饰或者电荷-电荷之间相互作用的修饰。示例性的化学修饰方法包括但不限于碳二亚胺偶联反应(参见例如美国专利申请号US 2007/0212730)、重氮偶联反应(参见例如美国专利申请号No.US2009/0232963)、亲和素-生物素相互作用(参见例如国际申请号WO 2011/011347)和具有PEG聚合物的化学活性或活化的衍生物的PEG化(参见例如国际申请号WO2010/057142)。还可以通过基因修饰对丝纤蛋白进行修饰以改变丝蛋白的功能(参见例如国际申请号WO 2011/006133)。例如，可以对丝纤蛋白进行基因修饰，其能够对丝提供进一步的修饰如入引融合多肽，所述融合多肽包含纤维蛋白结构域和矿化结构域，其能够用于形成有机-无机复合物。参见WO 2006/076711。在一些实施方式中，可以对丝纤蛋白进行基因修饰以便与蛋白融合，例如治疗性蛋白。此外，可以将基于丝纤蛋白的材料与化学物质组合，如甘油，以例如影响所述材料的柔性。参见例如WO 2010/042798，含有甘油的改性丝薄膜。前述专利申请的内容均通过引用并入本申请。
调味剂组合物
在一些实施方式中，本申请所述的丝颗粒和组合物可以用于调味剂组合物中。调味剂组合物指包含至少一种调味剂物质的组合物。在本申请中将术语“调味剂”或“调味剂物质”理解为指具有食品或其他物质的感官印象的物质。在一些实施方式中，调味剂或调味剂物质可以包含本申请所述的释放气味的物质，因为某些物质可以包含香味和调味性质。可以将所述调味剂或调味剂物质掺入本申请所述的组合物或丝颗粒的第二不相混溶的相(例如油滴)中。本申请所述的组合物和/或所述丝颗粒能够用于稳定和/或控制所述调味剂或调味剂物质的释放。
在一些实施方式中，所述调味剂组合物可以包含其他不同的调味剂(“调味剂辅助成分”)和/或调味剂佐剂。可以将这些成分掺入本申请所述的组合物和/或丝颗粒的第二不相混溶的相中。在多个参考文献中对用作调味剂辅助成分的调味剂的示例进行了描述，如S.Arctander,Perfume and Flavour Chemicals,1969,Montclair,New Jersey,USA；Flavor Base2010from Leffingwell and Associates；Fenaroli's Handbook of Flavor Ingredients，第六版；或者在其他类似性质的著作中，以及在调味剂领域丰富的专利文献中(例如但不限于国际专利申请号WO 2011/138696，其内容通过引用并入本申请)，并且熟练的调香师能够容易地基于其普通知识并根据其预期的应用或所需的感官效应选择适宜的调味剂辅助成分。
调味剂佐剂是本领域公知的并且能够从下述中选择，例如但不限于，溶剂、粘合剂、稀释剂、崩解剂、润滑剂、着色剂、防腐剂、抗氧化剂、乳化剂、稳定剂、香味增强剂、甜味剂、抗结块剂、酶、含酶制剂等。用于调味剂或香料化合物的运载体或稀释剂的示例可以见于例如“Perfume and Flavor Chemicals”,S.Arctander,Ed.,Vol.I&II、“Perfume andFlavor Materials of Natural Origin”,S.Arctander,1960；“Flavorings”，E.Ziegler和H.Ziegler(ed),Wiley-VCH Weinheim,1998以及“CTFA Cosmetic Ingredient Handbook”。
可以将本申请所述的调味剂组合物加入任意适宜形式的食品或食物产品中，例如作为液体、作为糊剂、作为固体或在与运载体/颗粒结合或涂覆于其上的包封形式中或作为粉末。仅作为举例，可以将所述调味剂组合物加入，例如，但不限于，粉状汤料、方便面、干香蒜酱混合物、干咸味菜肴；用于面条的稳定的面团调味剂；饮料或食品，例如，饮料如果汁饮料、果酒、乳酸饮料、碳酸饮料、清凉饮料和其他饮料等；冰品如冰激凌、冰冻果子露、冰棒等；日式和西式糕点；果酱；糖果；果冻；口香糖；面包；奢侈饮品如咖啡、可可、红茶、乌龙茶、绿茶等；汤如日式汤、西式汤、中式汤等；调味品；速溶饮品或食品；零食；口腔护理组合物如洁齿剂、口腔清洁剂、漱口剂、片剂、口香糖等；和药品如皮肤外用制剂(例如泥敷剂或软膏)、内服药等。
可以掺入各种前述制品或产品中的所述调味剂组合物的比例可以在较宽泛的值范围内改变。当将根据本发明的化合物与本领域通常使用的调味剂辅助成分、溶剂或添加剂混合时，这些值取决于被调味的所述制品的性质和所期望的感官效果，以及在给定基质中辅助成分的性质。在一些实施方式中，调味剂物质的浓度范围可以是从约0.1ppm至约100ppm。
释放气味的组合物
在一些实施方式中，本申请所述的丝颗粒和组合物可以用于释放气味的组合物中。释放气味的组合物指包含本申请所述的至少一种释放气味的物质的组合物。可以将所述释放气味的物质掺入本申请所述的组合物或所述丝颗粒的第二不相混溶的相(例如油相)中。本申请所述的组合物和/或丝颗粒可以用于稳定和/或控制所述释放气味的物质的释放。在一些实施方式中，释放气味的物质可以包含本申请所述的调味剂或调味剂物质，因为某些物质能够包含芳香和调味性质。
在一些实施方式中，所述释放气味的组合物是香料组合物。在这些实施方式中，所述释放气味的物质可以包含一种或多种不同的合成芳香化学物质、天然精油(例如佛手柑油、白松香油、柠檬油、天竺葵油、熏衣草油、柑橘油等)、合成精油、柑橘油、动物芳香化学物质、植物芳香化学物质(例如基于鲜花或基于水果的)以及本领域公知的任意香料成分，例如，但不限于α-蒎烯、柠檬烯、顺-3-己烯醇、苯乙醇、乙酸苏合香酯，丁子香酚、玫瑰氧化物、芳樟醇、苯甲醛、麝香酮、Thesaron(高砂国际公司的产品)、丁酸乙酯、2-甲基丁酸等以及下文中所述的任意香料成分，例如，S.Arctander,“Perfume and FlavorChemicals”,1969,Montclair,New Jersey,USA，以及国际专利申请号WO 2013/064412；WO2012/126686；WO 2010/061316；WO 2010/082684；WO 2008/004145；WO 2008/026140；WO 2007/054853；WO 2006/043177；WO 2006/030268；WO 2001/093813和美国专利号6,743,768以及美国专利申请号US 2005/0101498，其内容均通过引用并入本申请。
本申请所述的香料组合物可以作为下述产品中的香料成分：香料产品如香水、淡香精、淡香水、古龙水等；皮肤护理制品，洁面乳、雪花膏、洁肤霜、冷霜、按摩霜、乳液、花露水、粉底液、面膜、卸妆水等；化妆用品，粉底、蜜粉、粉饼、扑粉、口红、胭脂、唇膏、腮红、眼线、睫毛膏、眼影、眉笔、眼膜、指甲油、洗甲水等；发用化妆品，发蜡、润发油、梳整水、发蜡条、发用固体、护发油、焗油膏、发乳、护发素、发露、发胶、生发剂、染发剂等；晒黑化妆品，晒黑产品、防晒产品等；药妆，止汗剂、须后水和凝胶、烫发剂、药皂、药用洗发水、药用皮肤化妆品等；护发产品，洗发液、染发剂、免洗洗发液、护发素、护理品、发膜等；肥皂，洗面皂(toilet soap)、浴皂、香皂(perfumed soap)、透明皂、合成皂等；身体清洁剂，沐浴液、沐浴露、洗手液等；和沐浴制品、沐浴制品(例如浴盐、沐浴片和沐浴液)、泡沫浴液(例如泡泡浴)、浴油(例如沐浴香水和沐浴胶囊)、奶浴、沐浴胶、沐浴香精块等；洗涤剂，衣物重垢型洗涤剂、衣物轻垢型洗涤剂、液体洗涤剂、洗衣皂、浓缩洗涤剂、皂粉等；织物柔顺剂，柔顺剂、家具护理用品等；清洁试剂(cleaning agent)，清洁剂(cleanser)、房屋清洁剂、厕所清洁剂、浴室清洁剂、玻璃清洁剂、脱模剂、排水管清洁剂；厨房清洁剂，厨房皂、厨房合成皂、餐具清洁剂等；漂白剂，氧化型漂白剂(例如基于氯的漂白剂或基于氧的漂白剂)、还原型漂白剂(例如基于硫的漂白剂)、荧光漂白剂等；气溶胶，喷雾型、粉末喷雾型等；除臭-芳香剂，固体型、凝胶型、液体型等；其他制品，棉纸、厕纸等；和在本申请所述的个人护理组合物的一些实施方式中。
掺入目的产品和/或个人护理组合物中的释放气味的组合物的量的范围可以为以重量计从0.001至50％，和更优选地以重量计从0.01至20％。
在一些实施方式中，可以将至少一种固定剂加入到所述香料组合物中。可以使用，例如，但不限于，乙二醇、丙二醇、二丙二醇、丙三醇、己二醇、苯甲酸苄酯、柠檬酸三乙酯、邻苯二甲酸二乙酯、氢化松香酸甲酯、中链脂肪酸甘油三酯和中链脂肪酸甘油二酯。
个人护理组合物
在一些实施方式中，可以将本申请所述的丝颗粒和组合物可以以不同类型的个人护理组合物的形式提供。在一个实施方式中，可以将所述个人护理组合物制成选自下组的护发组合物：洗发液、护发素、去屑护理品、造型产品、造型护发素、头发修复或护理精华、乳液、霜、发油和化学护理品。在另一个实施方式中，所述造型产品选自下组：喷雾、摩丝、染发剂、凝胶、泡沫及其组合。在另一个实施方式中，所述化学护理品选自下组：烫发剂、顺发剂，和持久的、半持久的和临时染色剂及其组合。
在另一个实施方式中，可以将所述个人护理组合物制成选自下组形式的皮肤护理组合物：保湿沐浴乳、沐浴乳、抗菌清洁剂、皮肤保护护理品、润肤露、面霜、保湿霜、洁面乳、基于表面活性剂的面部清洁剂、面部磨砂凝胶、爽肤水、磨砂膏、面膜、须后乳液和防晒霜。
在另一个实施方式中，可以将所述个人护理组合物制成选自下组形式的化妆品组合物：眼胶、口红、唇彩、润唇膏、睫毛膏、眼线、粉饼配方、粉底、香料和/或固体香水。在进一步的实施方式中，所述化妆品组合物包含彩妆组合物。彩妆组合物包括但不限于彩妆，如睫毛膏、口红、唇线、眼影、眼线、胭脂、扑粉、粉底和指甲油。
在又一个实施方式中，可以将所述个人护理组合物制成选自下组形式的指甲护理组合物：指甲油(nail enamel)、角质层护理品、指甲擦光油(nail polish)、指甲护理品和洗甲水。
在又一个实施方式中，可以将所述个人护理组合物制成选自下组形式的口腔护理组合物：牙膏、漱口水、口气清新剂、美白护理品和惰性载体基材。
在又一个实施方式中，所述个人护理组合物可以包含释放气味的物质/组合物(例如香料组合物)和/或调味剂物质/组合物，例如以提供和/或改善所述个人护理组合物的气味和/或味道。
所述个人护理组合物可以是适于用户的应用需求和/或喜好的任意形式。例如，所述个人护理组合物可以是乳化的载剂形式，如营养霜或露、稳定的凝胶或分散系统，如皮肤软化剂、营养乳液、营养霜、按摩霜、护理精华、脂质体递送系统、外用脸部面膜、基于表面活性剂的清洁系统如洗发液或沐浴露、气雾或喷雾形式的分散剂或乳剂、头发或皮肤护理剂、造型助剂或着色产品如液、霜、固体、无水或笔形式的化妆品。
在本申请所述各种个人护理组合物的一些实施方式中，所述组合物还可以包含本申请所述的活性成分或活性剂。本领域技术人员将知晓多种用于个人护理组合物中的活性成分或活性剂，可以在本申请中使用其中的任意一个，参见例如McCutcheon's FunctionalMaterials,North American and International Editions,(2003)，MC Publishing Co出版。例如，本申请所述的个人护理组合物可以包含以所述组合物重量计从约0.0001％至约20％的皮肤护理活性成分。在另一个实施方式中，所述个人护理组合物包含以所述组合物的重量计从约0.001％至约5％的皮肤护理活性成分。在又一个实施方式中，所述个人护理组合物包含以所述组合物的重量计从约0.01％至约2％的皮肤护理活性成分。
在一些实施方式中，本申请所述的丝颗粒和组合物可以用于稳定和/或使至少一种皮肤护理活性成分控制释放或持续释放。皮肤护理活性成分包括但不限于抗氧化剂，如生育酚和抗坏血酸衍生物；视黄酸或视黄醇；精油；生物类黄酮、萜类、合成的生物类黄酮和萜类等；维生素和维生素衍生物；羟基和多羟基酸及其衍生物，如AHA和BHA及其反应产物；肽和多肽及其衍生物，如糖肽和亲脂化的肽、热休克蛋白和细胞因子；酶和酶抑制剂及其衍生物如蛋白酶、MMP抑制剂、过氧化氢酶、辅酶Q10、葡萄糖氧化酶和超氧化物歧化酶(SOD)；氨基酸及其衍生物；细菌、真菌和酵母发酵产物及其衍生物，包括蘑菇、藻类和海藻及其衍生物；植物甾醇以及植物和植物部分提取物；磷脂及其衍生物；去头屑剂，如吡啶硫酮锌，和化学或有机防晒剂如乙基己基甲氧基肉桂酸酯、阿伏苯宗、苯基苯丙咪唑磺酸和/或氧化锌。本申请还提供了包含所述活性成分的递送系统。
除了上文所述的活性剂以外，所述个人护理组合物还可以包含生理上可接受的运载体或赋形剂。特别地，本申请所述的个人护理组合物可以包含安全并有效量的皮肤学上可接受的运载体，其适于局部应用于皮肤或头发，在其中掺入精油物质和任选地其他物质以使得所述精油物质和任选地其他成分能够以适宜的浓度递送至所述皮肤或头发。因此所述运载体可以作为所述精油成分的稀释剂、分散剂或溶剂等以确保其能够以适宜的浓度平均地应用于和分布于所选定的靶点。
还可以将本申请所述的有效量的丝颗粒和组合物包括在应用于角质材料如指甲和头发的个人护理组合物中，其包括但不限于用作头发喷雾组合物、头发造型组合物、洗发液和/或护发素组合物、用于头发生长调节的组合物以及出于治疗皮脂溢出、皮炎和/或头皮屑的目的用于头发和头皮的组合物的那些。
可以将有效量的本申请所述的丝颗粒和组合物包括在适于皮肤、牙齿、指甲和头发局部应用的个人护理组合物中。这些组合物可以以乳膏、洗剂、凝胶、混悬剂、分散剂、微乳、纳米分散剂、微球、水凝胶、乳剂(例如水包油和油包水，以及复乳)和多层凝胶等形式存在(参见例如，The Chemistry and Manufacture of Cosmetics,Schlossman等，1998)，以及可以将其制成水性或硅酮组合物或可以将其制成在连续水相中含一个或多个油相的乳剂(或者在油相中含水相)。
还可以将多种可选的成分如中和剂、香料、香水和香水稳定剂、着色剂、表面活性剂、乳化剂和/或增稠剂加入本申请的个人护理组合物中。任意附加成分应增强所述产品，例如使皮肤柔软/光滑方面的益处。此外，任意此类成分不应对所述产品的美学性质产生负面影响。
适宜地，本申请所述个人护理组合物的pH范围为从约3.5至约10，特别地从约4至约8，并且更特别地从约5至约7，其中根据需要通过加入酸、碱或缓冲盐调整最终组合物的pH，其取决于所述组合物的形式和所述化合物所需的pH。
本领域技术人员将知晓制备本发明的个人护理组合物的各种技术，其均可以在本申请中使用。
药物组合物和控制/持续释放
本申请公开的所述丝颗粒和/或基于丝的组合物提供了使活性剂从基于丝的材料中和/或从与丝不相混溶的相(例如脂质隔室如油)中的控制或持续释放。在本申请中使用的术语“持续性递送”指在给药后的一段时间内在体内或体外持续地递送活性剂。例如，持续释放能够发生在至少几天、一周或几周的一段时间内。在体内持续性递送所述药剂能够通过例如所述药剂随着时间的推移具有持续性的治疗效果证明。或者，所述药剂的持续性递送能够通过检测随着时间的推移所述药剂在体内的存在情况证明。在一些实施方式中，所述持续性释放是在1周、2周、3周、4周、1个月、2个月、3个月、4个月、5个月、6个月或者更长的一段时间内。
在一些实施方式中，本申请所述的丝颗粒和/或基于丝的组合物可以用于药物递送，并且提供或释放一定量的所述活性剂，其提供的治疗作用与在相同时间段内所述活性剂的推荐剂量相似。例如，如果所述活性剂的推荐剂量是每日一次，则所述组合物释放活性剂的量足以提供与其每日一次的给药剂量相似的治疗作用。
活性剂的每日释放范围可以从约1ng/天至约1000mg/天。例如，所释放的量的下限可以为从1至1000(例如1至1000之间的所有整数)和上限可以从1至1000(例如1至1000之间的所有整数)，其中所述下限和上限的单位能够独立地选自ng/天、μg/天、mg/天或其任意组合。
在一些实施方式中，所述每日范围可以从约1μg/天至约10mg/天、从约0.25μg/天至约2.5mg/天、或者从约0.5μg/天至约5mg/天。在一些实施方式中，所述活性剂的每日释放范围可以从约100ng/天至1mg/天，例如，或约500ng/天至5mg/天、或者约100μg/天。
在一些实施方式中，所述活性剂在一段时间内的释放可以遵循接近零级释放的动力学。例如，可以在1周、2周、3周、4周、1个月、2个月、3个月、4个月、5个月、6个月、12个月、1年或者更长的一段时间内达到接近零级的释放动力学。
在一些实施方式中，本申请所述的组合物未观察到明显的表观初期突释释放。因此，在一些实施方式中，在本申请所述组合物施用的前48、24、18、12或6小时内，所述活性剂的突释量为在所述组合物中存在的活性剂总量的低于25％、低于20％、低于15％、低于10％、低于9％、低于8％、低于7％、低于6％、低于5％、低于4％、低于3％、低于2％或者低于1％。在一些实施方式中，在施用的前6或12小时、1、2、3、4、5、6、7天、1和2周内所述活性剂无显著的或可检测的初始突释。
在又一个方面，本申请提供了在体内持续性递送活性剂的方法。所述方法包括给予对象包含本申请所述的活性剂的本申请所述的丝颗粒和/或组合物。不希望受到理论的束缚，所述活性剂能够每日以治疗有效量释放。在本申请中使用的术语“治疗有效量”指有效提供所需结果的活性剂的量。治疗有效量的确定对本领域技术人员而言是容易的。在通常情况下，治疗有效量可以根据对象的病史、年龄、状况、性别以及在所述对象中的医疗状况的严重程度和类型，和给予的用于抑制神经退行性病变病理过程的其他药剂的情况而改变。可以从待治疗状况的动物模型获得关于将递送治疗有效量的化合物的效能和剂量的指导原则。
根据本申请所公开的，包含所述活性剂的所述基于丝的材料能够在一段时间内向对象提供治疗有效量的活性剂，所述一段时间与当所述活性剂未与所述基于丝的材料一同给予时的时间相同或比其更长。例如，一天释放的活性剂的量提供的治疗效果与当所述活性剂未与本申请所述的基于丝的材料一同给予时其推荐的每日剂量提供的治疗效果相似。
对于施用至对象而言，可以将所述基于丝的材料制成药学上可接受的组合物，所述组合物中包含本申请所述的基于丝的材料，其与一种或多种药学上可接受的运载体(添加剂)和/或稀释剂制剂。可以将所述组合物特别地制成以固体或液体形式施用，包括适于下述的那些：(1)口服施用，例如，灌药(水性或非水性溶液或混悬液)、锭剂、糖丸、胶囊、丸剂、片剂(例如靶向于口腔、舌下和全身吸收的那些)、大丸剂、粉剂、颗粒剂、应用于舌的糊剂；(2)胃肠外施用，作为例如无菌溶液或混悬液，或持续释放制剂，例如通过皮下、肌内、静脉内或硬膜外注射；(3)局部应用，例如，作为应用于皮肤的乳膏、软膏、或控释贴片或喷雾；(4)阴道内或直肠内，例如，作为阴道栓、乳膏或泡沫；(5)舌下施用；(6)眼内施用；(7)透皮施用；(8)跨粘膜施用或(9)鼻内施用。此外，可以使用药物递送组合物将化合物植入或注射给予患者。参见，例如，Urquhart等，Ann.Rev.Pharmacol.Toxicol.24:199-236(1984)；Lewis,ed."Controlled Release of Pesticides andPharmaceuticals"(Plenum Press,New York,1981)；美国专利号3,773,919和美国专利号353,270,960。
在本申请中使用的术语“药学上可接受的”指在医学判断的范围内适于与人类和动物的组织接触而不会产生过度的毒性、刺激、过敏应答或者其他问题或并发症，并具有合理的收益/风险比的那些化合物、材料、组合物和/或剂型。
在本申请中使用的术语“药学上可接受的运载体”指药学上可接受的材料、组合物或载剂，如液体或固体填充剂、稀释剂、赋形剂、生产助剂(例如润滑剂，滑石粉，硬脂酸钙或锌或者硬脂酸)、或者包封溶剂的材料，其涉及将对象化合物从机体的一个器官或部分携带或转运至机体的另一个器官或部分。各运载体必须是“可接受的”指其与所述处方的其他成分具有相容性并且不会对患者造成伤害。能够作为药学上可接受的运载体的一些示例性材料包括：(1)糖，如乳糖、葡萄糖和蔗糖；(2)淀粉，如玉米淀粉和马铃薯淀粉；(3)纤维素及其衍生物，如羧甲基纤维素钠、甲基纤维素、乙基纤维素、微晶纤维素和乙酸纤维素；(4)粉状西黄蓍胶；(5)麦芽；(6)明胶；(7)润滑剂，如硬脂酸镁、十二烷基硫酸钠和滑石粉；(8)赋形剂，如可可豆酯和栓剂蜡；(9)油，如花生油、棉籽油、红花油、芝麻油、橄榄油、玉米油和大豆油；(10)二元醇，如丙二醇；(11)多元醇，如甘油、山梨醇、甘露醇和聚乙二醇(PEG)；(12)酯，如油酸乙酯和月桂酸乙酯；(13)琼脂；(14)缓冲剂，如氢氧化镁和氢氧化铝；(15)海藻酸；(16)无热原水；(17)等渗盐水；(18)林格氏液；(19)乙醇；(10)pH缓冲液；(21)聚酯，聚碳酸酯和/或聚酸酐；(22)膨胀剂，如多肽和氨基酸；(23)血清成分，如血清白蛋白、HDL和LDL；(22)C2-C12醇，如乙醇；和(23)在药物制剂中使用的其他无毒的相容性物质。润湿剂、着色剂、释放剂、包衣剂、甜味剂、调味剂、香味剂、防腐剂和抗氧化剂也可以存在于制剂中。术语如“赋形剂”、“运载体”、“药学上可接受的运载体”等在本申请中可以互换使用。
药学上可接受的抗氧化剂包括但不限于(1)水溶性抗氧化剂，如抗坏血酸、盐酸半胱氨酸、硫酸氢钠、焦亚硫酸钠、亚硫酸钠等；(2)油溶性抗氧化剂，如抗坏血酸棕榈酸酯、丁基羟基茴香醚(BHA)、丁基羟基甲苯(BHT)、卵磷脂、没食子酸丙酯、α-生育酚等；和(3)金属螯合剂，如柠檬酸、乙二胺四乙酸(EDTA)、山梨醇、酒石酸、磷酸等。
在本申请中使用的术语“施用”指通过使得至少部分所述药物活性剂的位置在所需位点的方法或途径将药物递送组合物置于对象中。可以通过在对象中产生有效治疗的任意适宜途径施用本申请所述的药物递送组合物，即施用的结果为使得至少部分所递送的所述药物活性剂递送进入对象中的所需位置。示例性的递送方式包括但不限于植入(implant)、注射、输注、滴注、移植(implantation)或摄入。“注射”包括但不限于静脉内、肌内、动脉内、鞘内、心室内、囊内、眶内，心内、皮内、腹腔内、经气管、皮下、关节内、包膜下、蛛网膜下、脊柱内、脑脊柱内和胸骨内注射和输注。
在一些实施方式中，可以将本申请所述的基于丝的材料植入对象中。在本申请中使用的术语“植入”及其在语法上相关的术语指将所述基于丝的材料临时性、半永久性或永久性定位在对象中的特定位置。该术语不需要将所述基于丝的材料永久性固定在特定位置或定位。示例性的体内位置包括但不限于伤口、创伤或疾病部位。
添加剂的其他示例
在一些实施方式中，所述基于丝的材料和/或组合物还可以含有一种或多种添加剂。例如，所述组合物可以由丝纤蛋白溶液制备，所述丝纤蛋白溶液包含一种或多种(例如1、2、3、4、5种或更多种)添加剂。不希望受到理论的束缚，添加剂可以为基于丝的材料提供所需的性质，例如提供柔性、溶解度、易于加工等。
在一些实施方式中，所述第二不相混溶的相还包含一种或多种添加剂。例如，所述组合物可以由第二不相混溶的溶液制备，所述第二不相混溶的溶液包含一种或多种(例如1、2、3、4、5种或更多种)添加剂。不希望受到理论的束缚，添加剂可以为所述第二不相混溶的相提供所需的性质，例如乳剂稳定性。
不受限制的，添加剂可以选自有机或无机小分子；糖类；寡糖；多糖；聚合物；蛋白；肽；肽类似物和衍生物；拟肽；核酸；核酸类似物等。在溶液中添加剂的总量可以占在溶液中丝纤蛋白总量的从约0.1wt％至约70wt％、从约5wt％至约60wt％、从约10wt％至约50wt％、从约15wt％至约45wt％或者从约20wt％至约40wt％。
在一些实施方式中，添加剂是此前描述的生物相容性聚合物。
在一个实施方式中，所述添加剂是甘油，其能够影响基于丝的材料的柔性和/或溶解度。基于丝的材料，例如包含甘油的丝薄膜，参见WO 2010/042798，其内容通过引用整体并入本申请。
在一些实施方式中，所述添加剂是稳定剂。在本申请中使用的术语“稳定剂”指能够对活性剂具有稳定作用的以便能够辅助维持所述药剂生物活性的化合物和组合物。在一些实施方式中，所述稳定剂可以是所述活性剂生物活性所需的辅因子。
在一些实施方式中，所述添加剂可以包括刺激应答剂。在本申请中使用的术语“刺激应答”指能够针对本申请所述刺激而改变的一种或多种化学、物理和/或生物学性质。根据所述刺激应答剂的特性和/或性质，能够发生多种类型的应答，包括例如但不限于尺寸改变、密度改变、化学结构改变、构象改变、酶促反应、氧化还原反应、键或键合断裂/形成、磁性质改变、细胞因子产生和/或分泌、光学性质改变(例如但不限于颜色和不透明性)、机械性质改变(例如但不限于柔性、刚性、多孔性)、基质降解、信号传递、发热、发光及其任意组合。
在一些实施方式中，能够包封于基于丝的材料中的刺激应答剂包括等离子体颗粒或金纳米颗粒，其在经过特定波长的光照射后其能够发光和/或发热。在这个实施方式中，所述等离子体颗粒或金纳米颗粒能够在基于丝的材料中局部产热，例如便于包封于其中的活性剂的释放，和/或所述丝基质的降解。
靶向配体
对于本申请所述的丝颗粒或组合物的一些实施方式而言，所述基于丝的材料还包含靶向配体。在这些实施方式中，本申请所述的丝颗粒或组合物可以用于靶向特异性细胞以递送活性剂。在本申请中使用的术语“靶向配体”指其能够在体内和/或体外促进所述基于丝的组合物靶向细胞、器官、组织和/或受体的任意材料或物质。所述靶向配体可以是合成的、半合成的或天然存在的。能够作为靶向配体的材料或物质包括例如蛋白包括抗体、抗体片段、激素、激素类似物、糖蛋白和凝集素、肽、多肽、氨基酸、糖、糖类包括单糖和多糖、碳水化合物、维生素、类固醇、类固醇类似物、激素、辅因子、和遗传物质包括核苷、核苷酸、核苷酸构建体、肽核酸(PNA)、适体和多核苷酸。在本申请中的其他靶向配体包括细胞粘附分子(CAM)，其中包括例如细胞因子、整合素、钙粘蛋白、免疫球蛋白和选择素。丝药物递送组合物还可以包括前体靶向配体。靶向配体的前体指能够转化成靶向配体的任意材料或物质。此类转化可以涉及，例如将前体锚定在靶向配体上。示例性的靶向前体部分包括马来酰亚胺基团、二硫化物基团如邻吡啶基二硫化物、乙烯基砜基团、叠氮基和[AGR]碘代乙酰基。
所述靶向配体可以共价(例如交联)或非共价地与所述基于丝的材料连接。例如，靶向配体可以与用于制备所述丝基质的丝纤蛋白共价连接。替代性地或此外，靶向配体可以与在用于制备所述基于丝的物质的丝纤蛋白溶液中存在的添加剂连接。
能够被任意下述编号的段落定义的本申请所述各个方面的实施方式：
1.一种丝颗粒，所述丝颗粒包含至少两个不相混溶的相，第一不相混溶的相包含基于丝的材料并且第二不相混溶的相包含活性剂，其中所述第一不相混溶的相包封所述第二不相混溶的相并且所述第二不相混溶的相不包括脂质体。
2.根据段落1所述的丝颗粒，其中所述第二不相混溶的相包含脂质成分。
3.根据段落2所述的丝颗粒，其中所述脂质成分包含油。
4.根据段落1-3中任意一项所述的丝颗粒，其中所述第二不相混溶的相形成单一隔室。
5.根据段落1-3中任意一项所述的丝颗粒，其中所述第二不相混溶的相形成多个隔室。
6.根据段落4或5所述的丝颗粒，其中所述单一或多个隔室的尺寸范围为从约1nm至约1000μm，或者从约5nm至约500μm。
7.根据段落1-6中任意一项所述的丝颗粒，其中在所述第二不相混溶的相中存在的所述活性剂包含疏水性或亲脂性分子。
8.根据段落7所述的丝颗粒，其中所述疏水性或亲脂性分子包含治疗剂、营养剂、化妆剂、染色剂、益生菌剂、染料、芳香族化合物、脂肪族化合物(例如烷烃、烯烃、炔烃、环烷烃、环烯烃和环炔烃)、小分子或其任意组合。
9.根据段落1-8中任意一项所述的丝颗粒，其中所述基于丝的材料包含添加剂。
10.根据段落9所述的丝颗粒，其中所述添加剂选自下组：生物相容性聚合物；增塑剂(例如甘油)；刺激应答剂；活性剂、有机或无机小分子；糖类；寡糖；多糖；生物大分子，例如肽、蛋白以及肽类似物和衍生物；拟肽；抗体及其抗原结合片段；核酸；核酸类似物和衍生物；糖原或其他糖；免疫原；抗原；由生物材料如细菌、植物、真菌或动物细胞制备的提取物；动物组织；天然存在的或合成的组合物；及其任意组合。
11.根据段落9或10所述的丝颗粒，其中所述添加剂以颗粒(例如纳米颗粒或微粒，包括等离子体颗粒)、纤维、管、粉末或其任意组合形式存在。
12.根据段落9-11中任意一项所述的丝颗粒，其中所述添加剂包含丝材料，例如丝颗粒、丝纤维、微米尺寸的丝纤维、未经加工的丝纤维及其任意组合。
13.根据段落1-12中任意一项所述的丝颗粒，其中所述第二不相混溶的相包封第三不相混溶的相。
14.根据段落1-13中任意一项所述的丝颗粒，其中所述基于丝的材料以水凝胶形式存在。
15.根据段落1-14中任意一项所述的丝颗粒，其中所述基于丝的材料以干燥状态或冻干形式存在。
16.根据段落15所述的丝颗粒，其中所述冻干的丝基质是多孔的。
17.根据段落1-16中任意一项所述的丝颗粒，其中在所述第一不相混溶的相中的所述基于丝的材料在水溶液中是可溶的。
18.根据段落1-17中任意一项所述的丝颗粒，其中将在所述基于丝的材料中β-片层的含量调整为足以使得所述基于丝的材料在水溶液中对抗溶解的量。
19.根据段落1-18中任意一项所述的丝颗粒，其中所述丝颗粒的尺寸范围为从约10nm至约10mm，或者从约50nm至约5mm。
20.一种组合物，所述组合物包含包封于基于丝的材料中的多个脂质隔室。
21.根据段落20所述的组合物，其中所述脂质隔室的尺寸范围为从约1nm至约1000μm，或者从约5nm至约500μm。
22.根据段落20或21所述的组合物，其中所述脂质隔室与所述基于丝的材料的体积比的范围为从约1000:1至约1:1000、从约500:1至约1:500或者从约100:1至约1:100。
23.根据段落20-22中任意一项所述的组合物，其中所述基于丝的材料以选自下组的形式存在：薄膜、薄片、凝胶或水凝胶、网状物、垫、无纺垫、织物、支架、管、板或块、纤维、颗粒、粉末、三维结构、植入物、泡沫或海绵、针、冻干材料、多孔材料、无孔材料及其任意组合。
24.根据段落20-23中任意一项所述的组合物，其中所述基于丝的材料包含薄膜。
25.根据段落20-24中任意一项所述的组合物，其中所述基于丝的材料包含支架。
26.根据段落20-25中任意一项所述的组合物，其中所述基于丝的材料包含光学图样。
27.根据段落26所述的组合物，其中所述光学图样包括提供了光学功能的全息图或图样阵列。
28.根据段落20-27中任意一项所述的组合物，其中所述脂质隔室还包含活性剂。
29.根据段落20-28中任意一项所述的组合物，其中所述活性剂包含疏水性或亲脂性分子。
30.根据段落29所述的组合物，其中所述疏水性或亲脂性分子包含治疗剂、营养剂、化妆剂、染色剂、益生菌剂、染料、芳香族化合物、脂肪族化合物(例如烷烃、烯烃、炔烃、环烷烃、环烯烃和环炔烃)、小分子或其任意组合。
31.根据段落20-30中任意一项所述的组合物，其中所述基于丝的材料包含添加剂。
32.根据段落31所述的组合物，其中所述添加剂选自下组：生物相容性聚合物；增塑剂(例如甘油)；刺激应答剂；有机或无机小分子；糖类；寡糖；多糖；生物大分子，例如肽、蛋白以及肽类似物和衍生物；拟肽；抗体及其抗原结合片段；核酸；核酸类似物和衍生物；糖原或其他糖；免疫原；抗原；由生物材料如细菌、植物、真菌或动物细胞制备的提取物；动物组织；天然存在的或合成的组合物；及其任意组合。
33.根据段落31或32所述的组合物，其中所述添加剂以选自下组的形式存在：颗粒、纤维、管、薄膜、凝胶、网状物、垫、无纺垫、粉末及其任意组合。
34.根据段落31-33中任意一项所述的组合物，其中所述添加剂包含丝材料，例如丝颗粒、丝纤维、微米尺寸的丝纤维、未经加工的丝纤维及其任意组合。
35.一种组合物，所述组合物包含段落1-19中任意一项所述的丝颗粒的集合。
36.根据段落35所述的组合物，其中所述组合物是乳剂、胶体、乳膏、凝胶、洗剂、糊剂、软膏、搽剂、香膏、液体、固体、薄膜、薄片、织物、网状物、海绵、气雾剂、粉末、支架或其任意组合。
37.根据段落35或36所述的组合物，其中将所述组合物制剂以供在药物产品中使用。
38.根据段落35或36所述的组合物，其中将所述组合物制剂以供在化妆品产品中使用。
39.根据段落35或36所述的组合物，其中将所述组合物制剂以供在个人护理产品中使用。
40.根据段落35或36所述的组合物，其中将所述组合物制剂以供在食品产品中使用。
41.一种贮存稳定的组合物，所述组合物包含根据段落1-19中任意一项所述的丝颗粒或者段落20-40中任意一项所述的组合物，其中存在于所述丝颗粒的第二不相混溶的相中的所述活性剂，或者存在于所述脂质成分中的疏水性或亲脂性分子在所述组合物(a)经过至少一个冻融循环，或者(b)在约为室温或高于室温的温度下保持至少约24小时，或者(c)经过(a)和(b)两者后保持其原始生物活性的至少约30％。
42.根据段落41所述的组合物，其中所述组合物保持在暴露于光照条件下。
43.根据段落41或42所述的组合物，其中所述组合物保持在相对湿度至少约10％的条件下。
44.根据段落41-43中任意一项所述的组合物，其中所述丝颗粒或所述组合物的基于丝的材料处于干燥状态。
45.一种生产丝颗粒的方法，所述方法包括：
a.提供分散在处于溶胶-凝胶转变的丝溶液(在这种情况下，所述丝溶液保持在可混合状态)中的非水性液滴的乳剂；和
b.将预先确定体积的所述乳剂与非水相接触，以使得所述丝溶液在所述非水相中形成在其中包封至少一个非水性液滴的丝颗粒。
46.根据段落45所述的方法，其中所述溶胶-凝胶转变持续约至少1小时，或者至少约2小时。
47.根据段落45或46所述的方法，其中所述丝溶液的溶胶-凝胶转变由超声诱导。
48.根据段落47所述的方法，其中所述超声以振幅约5％至约20％，或者约10％至约15％进行。
49.根据段落47或48所述的方法，其中所述超声持续时间为从约15秒至约60秒，或者从约30秒至约45秒。
50.根据段落45-49中任意一项所述的方法，其中所述丝溶液的浓度为约1％(w/v)至约15％(w/v)，或者约2％(w/v)至约7％(w/v)。
51.根据段落45-50中任意一项所述的方法，其中所述方法还包括将活性剂加入处于溶胶-凝胶转变的所述丝纤蛋白溶液中。
52.根据段落45-51中任意一项所述的方法，其中所述非水性液滴还包含疏水性或亲脂性分子。
53.根据段落52所述的方法，其中所述疏水性或亲脂性分子包含治疗剂、营养剂、化妆剂、染色剂、益生菌剂、染料、芳香族化合物、脂肪族化合物(例如烷烃、烯烃、炔烃、环烷烃、环烯烃和环炔烃)、小分子或其任意组合。
54.根据段落45-53中任意一项所述的方法，其中所述乳剂通过将非水性、不相混溶的相加入所述丝溶液中，从而形成分散于所述丝溶液中的所述非水性液滴而生产。
55.根据段落45-54中任意一项所述的方法，其中所述乳剂预先确定的体积基本上对应于所述丝颗粒所需的尺寸。
56.根据段落45-55中任意一项所述的方法，所述方法还包括从所述非水相中分离所述丝颗粒。
57.根据段落45-56中任意一项所述的方法，其中所述方法还包括对所述丝颗粒进行后处理。
58.根据段落57所述的方法，其中所述后处理还诱导在所述颗粒的丝纤蛋白中的构象改变。
59.根据段落58所述的方法，其中所述诱导构象改变包括冻干或冷冻干燥、水退火、水蒸气退火、醇浸没、超声、剪切应力、电凝胶化、pH降低、盐加入、空气干燥、电纺丝、延展中的一种或多种或其任意组合。
60.根据段落57-59中任意一项所述的方法，其中所述后处理包括将所述丝颗粒冷冻干燥。
61.一种方法，所述方法包括下述步骤：保持组合物，其中所述组合物包含包封于基于丝的材料中的至少一个脂质隔室和分散于所述至少一个脂质隔室中的至少一种活性剂，并且其中所述活性剂在所述组合物(a)经过至少一个冻融循环，或者(b)在约为室温或高于室温的温度下保持至少约24小时，或者(c)经过(a)和(b)两者后保持其原始生物活性的至少约30％。
62.根据段落61所述的方法，其中所述组合物保持至少约1个月。
63.一种方法，所述方法包括下述步骤：保持组合物，其中所述组合物包含包封于基于丝的材料中的至少一个脂质隔室和分散于所述至少一个脂质隔室中的至少一种活性剂，并且其中所述基于丝的材料对所述至少一种活性剂是可渗透的以使得所述活性剂通过所述基于丝的材料以预先确定的速率释放进入周围的环境中。
64.根据段落63所述的方法，其中通过调整所述基于丝的材料中丝纤蛋白β-片层构象的含量、所述基于丝的材料的孔隙度或其组合控制所述预先确定的速率。
65.根据段落63或64所述的方法，其中所述组合物保持在约为室温的条件下。
66.根据段落61-65中任意一项所述的方法，其中所述组合物是乳剂、胶体、乳膏、凝胶、洗剂、糊剂、软膏、搽剂、香膏、液体、固体、薄膜、薄片、织物、网状物、海绵、气雾剂、粉末或其任意组合。
67.根据段落61-66中任意一项所述的方法，其中所述组合物是冻干的。
68.根据段落61-67中任意一项所述的方法，其中所述组合物保持在约37℃或更高的温度下。
69.根据段落61-68中任意一项所述的方法，其中所述组合物保持在暴露于光照的条件下。
70.根据段落61-69中任意一项所述的方法，其中所述组合物保持在相对湿度至少约10％的条件下。
71.根据段落61-70中任意一项所述的方法，其中所述活性剂包含疏水性或亲脂性活性剂。
72.根据段落71所述的方法，其中所述疏水性或亲脂性分子包含治疗剂、营养剂、化妆剂、染色剂、益生菌剂、染料、芳香族化合物、脂肪族化合物(例如烷烃、烯烃、炔烃、环烷烃、环烯烃和环炔烃)或其任意组合。
73.根据段落61-72中任意一项所述的方法，其中所述基于丝的材料包含添加剂。
74.根据段落73所述的方法，其中所述添加剂选自下组：生物相容性聚合物；增塑剂(例如甘油)；刺激应答剂；有机或无机小分子；糖类；寡糖；多糖；生物大分子，例如肽、蛋白以及肽类似物和衍生物；拟肽；抗体及其抗原结合片段；核酸；核酸类似物和衍生物；糖原或其他糖；免疫原；抗原；由生物材料如细菌、植物、真菌或动物细胞制备的提取物；动物组织；天然存在的或合成的组合物；及其任意组合。
75.根据段落73或74所述的方法，其中所述添加剂以选自下组的形式存在：颗粒、纤维、管、薄膜、凝胶、网状物、垫、无纺垫、粉末及其任意组合。
76.根据段落73-75中任意一项所述的方法，其中所述添加剂包含丝材料，例如丝颗粒、丝纤维、微米尺寸的丝纤维、未经加工的丝纤维或其任意组合。
77.一种递送活性剂的方法，所述方法包括应用或给予对象组合物，所述组合物包含基于丝的材料，所述基于丝的材料包封在其中含有活性剂的至少一个脂质隔室，所述基于丝的材料对所述活性剂是可渗透的以使得在将所述组合物应用于或给予所述对象后所述活性剂通过所述基于丝的材料以预先确定的速率释放。
78.根据段落77所述的方法，其中所述活性剂被释放进入周围的环境中。
79.根据段落77或78所述的方法，其中所述活性剂被释放至所述对象的至少一个靶细胞。
80.根据段落77-79中任意一项所述的方法，其中所述活性剂包括疏水性或亲脂性活性剂。
81.根据段落80所述的方法，其中所述疏水性或亲脂性分子包含治疗剂、营养剂、化妆剂、染色剂、益生菌剂、染料、芳香族化合物、脂肪族化合物(例如烷烃、烯烃、炔烃、环烷烃、环烯烃和环炔烃)或其任意组合。
82.根据段落77-81中任意一项所述的方法，其中所述基于丝的材料包含添加剂。
83.根据段落77-82中任意一项所述的方法，其中所述组合物局部应用于或给予所述对象。
84.根据段落83所述的方法，其中所述组合物应用于所述对象的皮肤上。
85.根据段落77-82中任意一项所述的方法，其中所述组合物口服应用于或给予所述对象。
86.一种丝颗粒，所述丝颗粒包含至少两个不相混溶的相，第一不相混溶的相包含基于丝的材料并且第二不相混溶的相包含活性剂，其中所述第一不相混溶的相包封所述第二不相混溶的相并且所述第二不相混溶的相不包括脂质体。
87.根据段落86所述的丝颗粒，其中所述第二不相混溶的相包含脂质成分。
88.根据段落87所述的丝颗粒，其中所述脂质成分包含油。
89.根据段落86-88中任意一项所述的丝颗粒，其中所述第二不相混溶的相形成单一隔室。
90.根据段落86-89中任意一项所述的丝颗粒，其中所述第二不相混溶的相形成多个隔室。
91.根据段落89或90所述的丝颗粒，其中所述单一或多个隔室的尺寸范围为从约1μm至约1000μm，或者从约10μm至约500μm。
92.根据段落86-91中任意一项所述的丝颗粒，其中在所述第二不相混溶的相中存在的所述活性剂包含疏水性或亲脂性分子。
93.根据段落92所述的丝颗粒，其中所述疏水性或亲脂性分子包含治疗剂、营养剂、化妆剂、染色剂、益生菌剂、染料、芳香族化合物、脂肪族化合物(例如烷烃、烯烃、炔烃、环烷烃、环烯烃和环炔烃)或其任意组合。
94.根据段落86-93中任意一项所述的丝颗粒，其中所述基于丝的材料包含添加剂。
95.根据段落94所述的丝颗粒，其中所述添加剂包含生物聚合物、活性剂、等离子体颗粒、甘油及其任意组合。
96.根据段落86-95中任意一项所述的丝颗粒，其中所述第二不相混溶的相包封第三不相混溶的相。
97.根据段落86-96中任意一项所述的丝颗粒，其中所述基于丝的材料以水凝胶形式存在。
98.根据段落86-96中任意一项所述的丝颗粒，其中所述基于丝的材料以干燥状态或冻干形式存在。
99.根据段落98所述的丝颗粒，其中所述冻干的丝基质是多孔的。
100.根据段落86-99中任意一项所述的丝颗粒，其中在所述第一不相混溶的相中的所述基于丝的材料在水溶液中是可溶的。
101.根据段落86-99中任意一项所述的丝颗粒，其中将在所述基于丝的材料中β-片层的含量调整为足以使得所述基于丝的材料在水溶液中对抗溶解的量。
102.根据段落86-101中任意一项所述的丝颗粒，其中所述丝颗粒的尺寸范围为从约0.1mm至约10mm，或者从约0.5mm至约5mm。
103.一种组合物，所述组合物包含包封于基于丝的材料中的多个脂质隔室。
104.根据段落103所述的组合物，其中所述脂质隔室的尺寸范围为从约1μm至约1000μm，或者从约10μm至约500μm。
105.根据段落103或104所述的组合物，其中所述脂质隔室与所述基于丝的材料的体积比的范围为从约1:1至约1:1000、从约1:5至约1:500或者从约1:10至约1:100。
106.根据段落103-105中任意一项所述的组合物，其中所述基于丝的材料包含薄膜。
107.根据段落106所述的组合物，其中所述基于丝的材料包含光学图样。
108.根据段落107所述的组合物，其中所述光学图样包括提供了光学功能的全息图或图样阵列。
109.根据段落103-108中任意一项所述的组合物，其中所述基于丝的材料包含支架。
110.根据段落103-109中任意一项所述的组合物，其中所述脂质隔室还包含活性剂。
111.根据段落110所述的组合物，其中所述活性剂包含疏水性或亲脂性分子。
112.根据段落111所述的组合物，其中所述疏水性或亲脂性分子包含治疗剂、营养剂、化妆剂、染色剂、益生菌剂、染料、芳香族化合物、脂肪族化合物(例如烷烃、烯烃、炔烃、环烷烃、环烯烃和环炔烃)或其任意组合。
113.根据段落103-112中任意一项所述的组合物，其中所述基于丝的材料包含添加剂。
114.根据段落113所述的组合物，其中所述添加剂包含生物聚合物、活性剂、等离子体颗粒、甘油及其任意组合。
115.一种组合物，所述组合物包含段落86-102中任意一项所述的丝颗粒的集合。
116.根据段落115所述的组合物，其中所述组合物是乳剂、胶体、乳膏、凝胶、洗剂、糊剂、软膏、搽剂、香膏、液体、固体、薄膜、薄片、织物、网状物、海绵、气雾剂、粉末或其任意组合。
117.根据段落115或116所述的组合物，其中将所述组合物制剂以供在药物产品中使用。
118.根据段落115或116所述的组合物，其中将所述组合物制剂以供在化妆品产品中使用。
119.根据段落115或116所述的组合物，其中将所述组合物制剂以供在食品产品中使用。
120.一种贮存稳定的组合物，所述组合物包含段落86-102中任意一项所述的丝颗粒或者段落103-119中任意一项所述的组合物，其中存在于所述丝颗粒的第二不相混溶的相中的所述活性剂，或者存在于所述脂质成分中的疏水性或亲脂性分子在所述组合物(a)经过至少一个冻融循环，或者(b)在约为室温或高于室温的温度下保持至少约24小时，或者(c)经过(a)和(b)两者后保持其原始生物活性的至少约30％。
121.根据段落120所述的组合物，其中所述组合物保持在暴露于光照的条件下。
122.根据段落120或121所述的组合物，其中所述组合物保持在相对湿度至少约10％的条件下。
123.根据段落120-122中任意一项所述的组合物，其中所述交联的丝基质处于干燥状态。
124.一种生产丝颗粒的方法，所述方法包括：
a.提供或获得分散在处于溶胶-凝胶转变的丝溶液(在这种情况下，所述丝溶液保持在可混合状态)中的非水性液滴的乳剂；和
b.将预先确定体积的所述乳剂与非水相接触，以使得所述丝溶液包封至少一个非水性液滴和凝胶以形成分散于所述非水相中的丝颗粒。
125.根据段落124所述的方法，其中所述溶胶-凝胶转变持续约至少1小时，或者至少约2小时。
126.根据段落124或125所述的方法，其中所述丝溶液溶胶-凝胶转变由超声诱导。
127.根据段落126所述的方法，其中所述超声以振幅约5％至约20％，或者约10％至约15％进行。
128.根据段落126或127所述的方法，其中所述超声持续从约15秒至约60秒，或者从约30秒至约45秒。
129.根据段落124-128所述的方法，其中所述丝溶液的浓度为约1％(w/v)至约15％(w/v)，或者约2％(w/v)至约7％(w/v)。
130.根据段落124-129中任意一项所述的方法，其所述方法还包括将活性剂加入处于溶胶-凝胶转变的所述丝纤蛋白溶液中。
131.根据段落124-130中任意一项所述的方法，其中所述非水性液滴还包含疏水性或亲脂性分子。
132.根据段落131所述的方法，其中所述疏水性或亲脂性分子包含治疗剂、营养剂、化妆剂、染色剂、益生菌剂、染料、芳香族化合物、脂肪族化合物(例如烷烃、烯烃、炔烃、环烷烃、环烯烃和环炔烃)或其任意组合。
133.根据段落123-132中任意一项所述的方法，其中所述乳剂通过将非水性、不相混溶的相加入所述丝溶液中，从而形成分散于所述丝溶液中的所述非水性液滴而生产。
134.根据段落124-133中任意一项所述的方法，其中所述乳剂预先确定的体积对应于所述丝颗粒所需的尺寸。
135.根据段落124-134中任意一项所述的方法，所述方法还包括从所述非水相中分离所述丝颗粒。
136.根据段落124-135中任意一项所述的方法，所述方法还包括将所述丝颗粒冷冻干燥。
137.一种方法，所述方法包括下述步骤：保持组合物，其中所述组合物包含包封于基于丝的材料中的至少一个脂质隔室和分布于所述至少一个脂质隔室中的至少一种活性剂，并且其中所述活性剂在所述组合物(a)经过至少一个冻融循环，或者(b)在约为室温或高于室温的温度下保持至少约24小时，或者(c)经过(a)和(b)两者后保持其原始生物活性的至少约30％。
138.根据段落137所述的方法，其中所述组合物保持至少约1个月。
139.一种方法，所述方法包括下述步骤：保持组合物，其中所述组合物包含包封于基于丝的材料中的至少一个脂质隔室和分布于所述至少一个脂质隔室中的至少一种活性剂，并且其中所述基于丝的材料对所述至少一种活性剂是可渗透的以使得所述活性剂通过所述基于丝的材料以预先确定的速率释放进入周围的环境中。
140.根据段落139所述的方法，其中通过调整所述基于丝的材料中丝纤蛋白β-片层构象的含量、所述基于丝的材料的孔隙度或其组合控制所述预先确定的速率。
141.根据段落139或140所述的方法，其中所述组合物保持在约为室温的条件下。
142.根据段落137-141中任意一项所述的方法，其中所述组合物是乳剂、胶体、乳膏、凝胶、洗剂、糊剂、软膏、搽剂、香膏、液体、固体、薄膜、薄片、织物、网状物、海绵、气雾剂、粉末或其任意组合。
143.根据段落137-142中任意一项所述的方法，其中所述组合物是冻干的。
144.根据段落137-143中任意一项所述的方法，其中所述组合物保持在约37℃或更高的温度下。
145.根据段落137-144中任意一项所述的方法，其中所述组合物保持在暴露于光照条件下。
146.根据段落137-145中任意一项所述的方法，其中所述组合物保持在相对湿度至少约10％的条件下。
147.根据段落137-146中任意一项所述的方法，其中所述活性剂包括疏水性或亲脂性活性剂。
148.根据段落147所述的方法，其中所述疏水性或亲脂性分子包含治疗剂、营养剂、化妆剂、染色剂、益生菌剂、染料、芳香族化合物、脂肪族化合物(例如烷烃、烯烃、炔烃、环烷烃、环烯烃和环炔烃)或其任意组合。
149.根据段落137-148中任意一项所述的方法，其中所述基于丝的材料包含添加剂。
150.根据段落149所述的方法，其中所述添加剂包含生物聚合物、活性剂、等离子体颗粒、甘油及其任意组合。
151.一种递送活性剂的方法，所述方法包括应用或给予对象组合物，所述组合物包含基于丝的材料，所述基于丝的材料包封在其中含有活性剂的至少一个脂质隔室，所述基于丝的材料对所述活性剂是可渗透的以使得在将所述组合物应用于或给予所述对象后所述活性剂通过所述基于丝的材料以预先确定的速率释放。
152.根据段落151所述的方法，其中所述活性剂被释放进入周围的环境中。
153.根据段落151或152所述的方法，其中所述活性剂被释放至所述对象的至少一个靶细胞。
154.根据段落151-153中任意一项所述的方法，其中所述活性剂包含疏水性或亲脂性活性剂。
155.根据段落154所述的方法，其中所述疏水性或亲脂性分子包含治疗剂、营养剂、化妆剂、染色剂、益生菌剂、染料、芳香族化合物、脂肪族化合物(例如烷烃、烯烃、炔烃、环烷烃、环烯烃和环炔烃)或其任意组合。
156.根据段落151-155中任意一项所述的方法，其中所述基于丝的材料包含添加剂。
157.根据段落156所述的方法，其中所述添加剂包含生物聚合物、活性剂、等离子体颗粒、甘油及其任意组合。
158.根据段落151-157中任意一项所述的方法，其中所述组合物局部或口服应用于或给予所述对象。
159.根据段落151-158中任意一项所述的方法，其中所述组合物应用于所述对象的皮肤上。
一些选定的定义
除非另有说明或在上下文中有所暗示，下列术语和短语包括下文提供的含义。除非另有明确说明或从上下文中可明显看出，下列术语和短语不排除在所述术语或短语所属的领域中已具有的含义。提供所述定义以辅助描述本文所述方面的具体实施方式，而由于本发明的范围仅受权利要求所限，因此并不意味着限制所请求保护的发明。另外，除非上下文另有要求，单数术语应当涵盖复数，并且复数术语应当涵盖单数。
本申请中使用的术语“包含/包括(comprising或comprises)”涉及对实施方式必要的组合物、方法及其各自的组成部分，并且无论是否必要都仍然包括未指定的要素。
除非上下文明确地另有所指，单数术语“一(a/an)”和“该/所述(the)”涵盖复数的所指物。相似地，除非上下文明确地另有所指，单词“或(or)”意在涵盖“和(and)”。
除了在操作实施例中或另有指示的地方，本申请所用的表示成分的量或反应条件的全部数值在所有情况下都应该被理解为被术语“约”修饰。与百分比相连使用的术语“约”可意味着所指数值±5％。例如，约100意味着95至105。
尽管与本申请描述的方法和材料相似或等同的方法和材料可被用于本申请公开的操作或测试中，合适的方法和材料在下文有所描述。术语“包含/包括(comprises)”意思是“含有(includes)”。缩写“e.g.”源自拉丁文的例如(exempli gratia)，并且在本申请中用于表示非限制性的示例。因此，缩写“e.g.”与术语“例如(for example)”同义。
术语“管”在本申请中指在其中具有腔的伸长的轴。所述管通常可以是伸长的中空圆柱体，但是其也可以是中空的具有其他横截面形状的轴。
在本申请中使用的术语“多个”指2个或更多个，包括例如3个或更多个、4个或更多个、5个或更多个、6个或更多个、7个或更多个、8个或更多个、9个或更多个、10个或更多个、20个或更多个、30个或更多个、40个或更多个、50个或更多个、100个或更多个、500个或更多个、1000个或更多个、5000个或更多个或者10000个或更多个。
在本申请中使用的“对象”是指活的对象或物理上非活体的物体，例如制品。在一些实施方式中，对象是人或动物。通常，所述动物为脊椎动物，如灵长类动物、啮齿动物、家畜或狩猎动物。灵长类动物包括黑猩猩、食蟹猴、蜘蛛猴和猕猴(如恒河猴)。啮齿动物包括小鼠、大鼠、旱獭、雪貂、家兔和仓鼠。家畜和狩猎动物包括牛、马、猪、鹿、野牛、水牛、猫科物种(例如家猫)、犬科物种(例如狗、狐狸、狼)、鸟类(例如鸡、鸸鹋、鸵鸟)和鱼类(例如鳟鱼、鲶鱼和鲑鱼)。患者或对象包括前面所述的任何子集，例如，不包括一个或多个上组或物种(例如人类、灵长类动物或啮齿动物)的上述所有。在某些实施方式中，对象是哺乳动物，例如灵长类动物如人类。术语“患者”和“对象”在本申请中可互换使用。
术语“减少、降低或抑制(decrease/reduced/reduction/inhibit)”均在本申请中使用，通常指具有统计学意义的量的降低。然而，为避免疑问，“降低、减少或抑制”指与对照水平相比降低至少10％，例如，降低至少约20％、或至少约30％、或至少约40％、或至少约50％、或至少约60％、或至少约70％、或至少约80％、或至少约90％或者达到和包括降低100％(即，相对于对照样品为缺失水平(absent level))，或者相对于对照水平而言在10％-100％之间的任意降低量。
术语“增加、升高或活化(increased/increase/enhance/activate)”均在本申请中使用，通常指具有统计学意义的量的增加；为避免疑问，“增加、增强或活化”指与对照水平相比增加至少10％，例如，增加至少约20％、或至少约30％、或至少约40％、或至少约50％、或至少约60％、或至少约70％、或至少约80％、或至少约90％或者达到和包括增加100％，或者相对于对照水平而言在10％-100％之间的任意增加量，或者与对照水平相比增加至少约2倍、或至少约3倍、或至少约4倍、或至少约5倍、或至少约10倍，或者2倍和10之间的任意增加量或者更多。
术语“具有统计学意义”或“显著的”指具有统计学显著性并且通常指远离对照水平至少两个标准偏差(2SD)。该术语表示具有差异的统计学证据。将其定义为当零假设实际为真时做出决定以拒绝零假设的概率。
在本申请中可以互换使用的术语“基本上(essentially)”和“实质上(substantially)”指至少约60％、或者优选地至少约70％或至少约80％、或至少约90％、至少约95％、至少约97％或至少约99％或更多，或者70％和100％之间的任意整数的一部分。在一些实施方式中，术语“基本上”指至少约90％、至少约95％、至少约98％、至少约99％或更多，或者90％和100％之间的任意整数的一部分。在一些实施方式中，术语“基本上”可以包括100％。
在本申请中使用的术语“纳米图样”或“纳米图样化的”指在基于丝纤蛋白的基质例如薄膜或泡沫或者包含此类基于丝纤蛋白的基质的组合物中提供的较小的图样。在通常情况下，所述图样具有在纳米级(即10-9米)能够被适宜地检测的尺寸的结构特征，例如尺寸范围为1纳米至毫米。
在本申请中使用的术语“蛋白”和“肽”在本申请中可以互换使用，其指彼此之间通过邻近残基的α-氨基和羧基之间形成的肽键连接的一系列氨基酸残基。术语“蛋白”和“肽”在本申请中可以互换使用，指蛋白氨基酸的聚合物，包括经修饰的氨基酸(例如磷酸化的、糖基化的等)和氨基酸类似物，无论其尺寸或功能如何。尽管“蛋白”通常用于指相对较大的多肽，和“肽”通常用于指较小的多肽，在本申请中对这些术语的使用是重叠的并可以改变的。除非另有明示，在本申请中使用的术语“肽”指肽、多肽、蛋白和蛋白的片段。术语“蛋白”和“肽”当指基因产物及其片段时在本申请中可以互换使用。因此，示例性的肽或蛋白包括基因产物、天然存在的蛋白以及前述的同源物、直系同源物、旁系同源物、片段和其他等价物、变体、片段和类似物。
在本申请中使用的术语“核酸”或“寡核苷酸”或语法上的等效词在本申请中指共价连接在一起的至少两个核苷酸，包括其类似物或衍生物。示例性的寡核苷酸包括但不限于单链和双链siRNA和其他RNA干扰试剂(RNAi试剂或iRNA试剂)、shRNA(短发夹RNA)、反义寡核苷酸、适体、核酶和微型RNA(miRNA)。核酸可以是单链或双链的。核酸可以是DNA、RNA或杂交的，其中所述核酸含有脱氧核糖核苷酸和核糖核苷酸的任意组合，以及尿嘧啶、腺嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶和鸟嘌呤的任意组合。核酸可以包含一个或多个骨架修饰，例如磷酰胺(Beaucage等，Tetrahedron 49(10):1925(1993)及其中的参考文献；Letsinger,J.Org.Chem.35:3800(1970))、硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、邻甲基亚磷酰胺键(参见Eckstein,Oligonucleotides and Analogues:A Practical Approach,OxfordUniversity Press)或肽核酸键(参见Egholm,J.Am.Chem.Soc.114:1895(1992)；Meier等，Chem.Int.Ed.Engl.31:1008(1992)和Nielsen,Nature,365:566(1993)，其全部内容通过引用并入本申请)。核酸还可以包括对核苷酸的核碱基和/或糖部分的修饰。在糖部分的示例性的糖修饰包括2’-OH被卤素(例如氟)、邻甲基、邻甲氧基乙基、NH2、SH和S-甲基取代。术语“核酸”还包括经修饰的RNA(modRNA)。术语“核酸”还包括siRNA、shRNA或其任意组合。
术语“经修饰的RNA”指RNA的至少一部分被修饰，例如在其核糖单元中、在其含氮的碱基中、在其核苷间键基团中或其任意组合。因此，在一些实施方式中，“经修饰的RNA”可以含有不同于核糖的糖基部分，如其2'-OH基团被修饰的核糖单体部分。或者，或除了在其核糖单元被修饰以外，“经修饰的RNA”可以含有不同于A、C、G和U的含氮碱基(“非-RNA核碱基”)，如T或MeC。在一些实施方式中，“经修饰的RNA”可以含有不同于磷酸的(-O-P(O)2-O-)核苷间键基团，如-O-P(O,S)-O-。在一些实施方式中，经修饰的RNA可以包含锁核酸(LNA)。
在本申请中使用的术语“多糖”指其分子由彼此之间通过糖苷键连接的较大数量的单糖分子组成的大分子碳水化合物。术语多糖还旨在包括寡糖。所述多糖可以是同多糖或杂多糖。所述同多糖仅含有一种单元，而所述杂多糖由不同种类的单体单元组成。
术语“短干扰RNA”(siRNA)在本申请中也称为“小干扰RNA”，将其定义为其功能为抑制靶基因表达的试剂，例如通过RNAi。siRNA可以是化学合成的，其能够通过体外转录生产，或者其能够在宿主细胞中生产。siRNA分子还可以由切割双链RNA生产，将其中与信使RNA相同的一条链灭活。术语“siRNA”指小抑制性RNA双螺旋，其诱导RNA干扰(RNAi)途径。这些分子的长度是可以改变的(通常为18-30个碱基对)并且与反义链中的其靶mRNA具有不同程度的互补。一些siRNA(但不是全部)在其有意义60链和/或反义链的5'或3'末端具有未配对的悬挂碱基。术语“siRNA”包括两个分别的链的双螺旋，以及能够形成包含双螺旋区的发夹结构的单链。
在本申请中使用的术语“shRNA”指短的发夹RNA，其具有RNAi和/或siRNA的功能，但不同的是shRNA类型是稳定性增加的双链发夹样结构。在本申请中使用的术语“RNAi”指干扰RNA或RNA干扰分子，其是核酸分子或其类似物，例如抑制基因表达的基于RNA的分子。RNAi指选择性转录后基因沉默的一种方法。RNAi可以导致特定mRNA的破坏，或者阻止RNA如mRNA的加工或翻译。
在本申请中使用的术语“酶”指催化其他底物化学反应的蛋白分子，在反应完成后所述蛋白分子不被破坏或基本上不发生改变。该术语可以包括天然存在的酶和生物工程改造的酶或其混合物。酶家族的示例包括激酶、脱氢酶、氧化还原酶、GTPase、羧基转移酶、酰基转移酶、脱羧酶、转氨酶、消旋酶、甲基转移酶、甲酰基转移酶和α-酮基脱羧酶。
在本申请中使用的术语“疫苗”指当引入对象的机体后通过引起免疫系统活化、抗体形成和/或形成T-细胞和/或B-细胞应答的对特定疾病产生免疫性的死微生物、减毒活生物体、亚基抗原、类毒素抗原、缀合物抗原或其他类型抗原分子的任意配制品。在通常情况下，针对微生物的疫苗直接针对病毒、细菌、寄生虫、支原体或其他传染性物质的至少一部分。
在本申请中使用的术语“适体”指能够特异性地识别选定的非寡核苷酸分子或分子群组的单链、部分单链、部分双链或双链核苷酸序列。在一些实施方式中，所述适体通过沃森-克里克碱基配对或三螺旋形成以外的其他机制识别非寡核苷酸分子或分子群组。适体可以包括但不限于定义的序列区段和序列，其包含核苷酸、核糖核苷酸、脱氧核糖核苷酸、核苷酸类似物、经修饰的核苷酸和包含骨架修饰、分支点和非核苷酸残基、基团或桥接的核苷酸。选择用于与分子结合的适体的方法是本领域广泛知晓的并且对本领域普通技术人员而言是显而易见的。
在本申请中使用的术语“抗体”指完整的免疫球蛋白或者具有Fc(可结晶的片段)区或Fc区的FcRn结合片段的单克隆或多克隆的抗原结合片段。术语“抗体”还包括“抗体样分子”如所述抗体的片段，例如抗原结合片段。抗原结合片段可以由重组DNA技术或由酶促或化学切割完整的抗体而产生。“抗原结合片段”特别地包括Fab、Fab'、F(ab')2、Fv、dAb、和互补性决定区(CDR)片段、单链抗体(scFv)、单结构域抗体、嵌合抗体和双特异性抗体以及多肽，所述多肽含有足以使特定抗原与所述多肽结合的至少一部分免疫球蛋白。线性抗体也包括在本申请所述的目的中。术语Fab、Fc、pFc'、F(ab')2和Fv使用其标准的免疫学含义(Klein,Immunology(John Wiley,New York,N.Y.,1982)；Clark,W.R.(1986)The Experimental Foundations of Modern Immunology(Wiley&Sons,Inc.,New York)和Roitt,I.(1991)Essential Immunology，第7版，(Blackwell Scientific Publications,Oxford))。对多种抗原具有特异性的抗体或抗原结合片段可以从供应商如R&D Systems、BDBiosciences、e-Biosciences和Miltenyi购买获得，或者可以由本领域技术人员采用公知的方法针对这些细胞表面标记物激发获得。
在本申请中使用的术语“互补性决定区”(CDR，即CDR1、CDR2和CDR3)指抗体可变结构域的氨基酸残基，其存在是抗原结合所必须的。各可变结构域通常具有三个CDR区，以CDR1、CDR2和CDR3表示。各互补性决定区可以包含来自Kabat所定义的“互补性决定区”的氨基酸残基(即约在轻链可变结构域中的残基24-34(L1)、50-56(L2)和89-97(L3)和约在重链可变结构域中的残基31-35(H1)、50-65(H2)和95-102(H3)；Kabat等，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版，Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,Md.(1991))和/或来自“高变环”的那些残基(即约在轻链可变结构域中的残基26-32(L1)、50-52(L2)和91-96(L3)和约在重链可变结构域中的26-32(H1)、53-55(H2)和96-101(H3)；Chothia和Lesk J.Mol.Biol.196:901-917(1987))。在一些例子中，互补性决定区可以包括来自根据Kabat和高变环所定义的CDR区的氨基酸。
表述“线性抗体”指在Zapata等，Protein Eng.,8(10):1057-1062(1995)中描述的抗体。简言之，这些抗体包含一对串联Fd区段(VH-CH1-VH-CH1)，其与互补性轻链多肽一起形成一对抗原结合区。线性抗体可以是双特异性或单特异性的。
在本申请中使用的表达“单链Fv”或“scFv”抗体片段旨在指包含抗体的VH和VL结构域的抗体片段，其中这些结构域存在于单一多肽链中。优选地，Fv多肽还包含在VH和VL结构域之间的多肽接头，其能够使scFv形成用于抗原结合的所需结构。(ThePharmacology of Monoclonal Antibodies,vol.113,Rosenburg and Moore eds.,Springer-Verlag,New York,pp.269-315(1994))。
在本申请中使用的术语“双特异性抗体”指具有两个抗原结合位点的小抗体片段，该片段在同一多肽链(VH-VL)中包含与轻链可变结构域(VL)连接的重链可变结构域(VH)。通过使用非常短的接头以使其不能在同一链的两个结构域之间配对，迫使所述结构域与另一条链的互补结构域配对并形成两个抗原结合位点。(EP 404,097；WO 93/11161；Hollinger等，Proc.Natl.Acad.Sd.USA,P0:6444-6448(1993))。
在涉及抗体时，术语“生物活性”包括但不限于表位或抗原的结合亲和性、抗体的体内和/或体外稳定性、抗体的免疫原性质(例如当给予人类对象时)，和/或在体内或体外中和/或拮抗靶分子生物活性的能力。可以使用本领域公知的技术观察或测定前述的性质或特征，包括但不限于闪烁迫近分析法、ELISA、ORIGEN免疫测定(IGEN)、荧光淬灭、荧光ELISA、竞争性ELISA、SPR分析包括但不限于使用BIAcore生物传感器的SPR分析、体外和体内中和检测(参见例如国际公开号WO 2006/062685)、受体结合和使用来自不同来源的组织切片的免疫组化，包括人、灵长类或根据需要的其他来源。在涉及抗原时，“生物活性”包括免疫原性，对其的定义将在下文中详细讨论。在涉及病毒时，“生物活性”包括传染性，对其的定义将在下文中详细讨论。在涉及造影剂例如染料时，“生物活性”指当将造影剂给予对象时其增强对象体内的结构或流体对比度的能力。造影剂的生物活性还包括但不限于，在某些条件下其与生物环境相互作用和/或影响另一种分子应答的能力。
在本申请中使用的术语“小分子”指天然的或合成的分子包括但不限于肽、拟肽、氨基酸、氨基酸类似物、多核苷酸、多核苷酸类似物、适体、核苷酸、核苷酸类似物、分子量低于约10,000克每摩尔的有机或无机化合物(即包括杂有机和有机金属化合物)、分子量低于约5,000克每摩尔的有机或无机化合物、分子量低于约1,000克每摩尔的有机或无机化合物、分子量低于约500克每摩尔的有机或无机化合物以及此类化合物的盐、酯和其他药学上可接受的形式。
在本申请中使用的术语“细胞”指任意原核的或真核的细胞，包括植物、酵母、蠕虫、昆虫和哺乳动物。哺乳动物细胞包括但不限于；灵长类、人和来自任意目标动物的细胞，包括但不限于；小鼠、仓鼠、家兔、犬、猫、家畜，如马、牛、鼠、绵羊、犬、猫等。所述细胞可以是多种多样的组织类型的不限于如；造血、神经、间叶、皮肤、粘膜、基质、肌肉、脾、网状内皮、上皮、内皮、肝、肾、胃肠道、肺、T细胞等。干细胞、胚胎干(ES)细胞、ES来源的细胞和干细胞的祖细胞也包括在其中，包括但不限于造血、神经、基质、肌肉、心血管、肝、肺、胃肠道的干细胞等。在一些实施方式中，还可以使用酵母细胞作为细胞。在一些实施方式中，所述细胞可以是离体的或培养的细胞，例如在体外。例如，对于离体细胞而言，细胞可以来自对象，其中所述对象是健康的或患有某种疾病的。作为非限制性示例，细胞可以通过组织活检或本领域技术人员公知的其他手术方法获得。
在本申请中使用的术语“病毒载体”通常包括需要插入宿主细胞并且通常包括表达盒的外源性DNA。所述外源性DNA可以包括整个转录单位，启动子基因-polyA或者可以对所述载体进行工程改造以使其含有启动子/转录终止序列以使得仅需要插入目的基因。这些类型的控制序列是本领域公知的，并且包括用于转录起始的启动子，以及任选地包括操纵子和核糖体结合位点序列。病毒载体包括但不限于慢病毒(lentivirus)载体、逆转录病毒载体、慢病毒(lentiviral)载体、单纯疱疹病毒载体、腺病毒载体、腺相关病毒(AAV)载体、EPV、EBV或者其变体或衍生物。各公司的产品如市售的病毒载体，包括但不限于Avigen,Inc.(Alameda,Calif.；AAV载体)、Cell Genesys(Foster City,Calif.；逆转录病毒、腺病毒、AAV和慢病毒载体)、Clontech(逆转录病毒和杆状病毒载体)、Genovo,Inc.(Sharon Hill,Pa.；腺病毒和AAV载体)、Genvec(France；腺病毒载体)、IntroGene(Leiden,Netherlands；腺病毒载体)、Molecular Medicine(逆转录病毒、腺病毒、AAV和疱疹病毒载体)、Norgen(腺病毒载体)、Oxford BioMedica(Oxford,United Kingdom；慢病毒载体)和Transgene(Strasbourg,France；腺病毒、牛痘病毒、逆转录病毒和慢病毒载体)。
在本申请中使用的术语“病毒”指由包裹在蛋白衣壳中的核酸组成的感染剂。此类感染剂不能自主复制(即复制需要使用宿主细胞的机构)。病毒的基因组可以是单链的(ss)或双链的(ds)RNA或DNA，并且能够或不能使用逆转录酶(RT)。此外，ssRNA病毒可以是有意义链(+)或反义链(-)。示例性的病毒包括但不限于dsDNA病毒(例如腺病毒、疱疹病毒、痘病毒)、ssDNA病毒(例如细小病毒)、dsRNA病毒(例如呼肠孤病毒)、(+)ssRNA病毒(例如小核糖核酸病毒、披膜病毒)、(-)ssRNA病毒(例如正粘病毒、棒状病毒)、ssRNA-RT病毒，即在生命周期中具有DNA介导(+)的有意义链RNA(例如逆转录病毒)和dsDNA-RT病毒(例如嗜肝DNA病毒)。在一些实施方式中，病毒还可以包括野生型(天然的)病毒、被杀死的病毒、减毒活病毒、经修饰的病毒、重组病毒或其任意组合。病毒的其他示例包括但不限于包膜病毒、呼吸道合胞病毒、无包膜病毒、细菌噬菌体、重组病毒和病毒载体。在本申请中使用的术语“细菌噬菌体”指感染细菌的病毒。
在本申请中使用的术语“细菌”旨在包括细菌的所有变体，例如原核生物体和蓝藻细菌。细菌是小的(典型的线性尺寸约1m)、无隔室的，具有环状DNA和70s核糖体的细菌。
在本申请中使用术语“抗生素”描述降低微生物存活或抑制微生物生长或繁殖的化合物或组合物。如在本申请中所使用的，抗生素还旨在包括抗微生物剂、抑菌剂或杀菌剂。示例性的抗生素包括但不限于青霉素、头孢菌素、青霉烯类、碳青霉烯类、单环内酰胺类、氨基糖苷类、磺胺类、大环内酯类、四环素类、lincoside、喹诺酮类、氯霉素、万古霉素、甲硝唑、利福平、异烟肼、大观霉素、甲氧苄啶、磺胺甲恶唑等。
在本申请中使用的术语“抗原”指能够与选择性结合剂如抗体结合的分子或分子的部分，并且其还能够用于在动物中激发产生能够与该抗原的表位结合的抗体。抗原可以具有一个或多个表位。术语“抗原”还可以指能够被抗体或T细胞受体(TCR)(如果被MHC分子提呈的话)结合的分子。在本申请中使用的术语“抗原”还包括T-细胞表位。抗原还能够被免疫系统识别和/或能够诱导导致B和/或T淋巴细胞活化的体液免疫应答和/或细胞免疫应答。然而，至少在某些情况下，其可能要求抗原含有或连接至Th细胞表位并且在佐剂中提供。抗原可以具有一个或多个表位(B和T表位)。上文所述的特异性反应旨在表明抗原将优选地通常是采取以较高选择性的方式与其相应的抗体或TCR反应，而不与可能是由其他抗原激发产生的多种其他抗体或TCR反应。本申请中使用的抗原还可能是若干单一的抗原的混合物。
术语“免疫原”指能够在生物体内激发免疫应答的任意物质，例如疫苗。“免疫原”能够在给予对象后针对其自身诱导免疫应答。在本申请中使用的术语“免疫”在涉及免疫应答时指在接受对象中针对免疫原产生的体液(抗体介导的)和/或细胞(抗原特异性T细胞或其分泌产物介导的)应答。此类应答可以是通过给予对象免疫原或免疫原肽诱导的主动应答或者通过给予针对免疫原的抗体或致敏的T-细胞诱导的被动应答。细胞免疫应答通过提呈与I类或II类MHC分子结合的多肽表位以活化抗原特异性CD4+T辅助细胞和/或CD8+细胞毒性T细胞。此类应答还可能涉及单核细胞、巨噬细胞、NK细胞、嗜碱性粒细胞、树突状细胞、星形胶质细胞、小胶质细胞、嗜酸性粒细胞或先天免疫的其他成分的活化。
在本申请中使用的术语“前药”指能够通过某些化学或生理过程(例如酶促过程和代谢水解)转化为活性形式的化合物。因此，术语“前药”还指药学上可接受的生物活性化合物的前体。当给予对象时前药可以是无活性的，但是其在体内转化为活性化合物，例如通过水解成游离的羧酸或游离的羟基。前药化合物通常在生物体内在溶解度、组织相容性或延迟释放方面提供益处。术语“前药”还旨在包括任意共价键合的运载体，当将此类前药给予对象时其在体内释放活性化合物。在本申请中所述的活性化合物的前药可以通过在活性化合物中修饰存在的官能团制备，这样通过常规的操作或在体内所述修饰被裂解后得到母体活性化合物。前药包括其中的羟基、氨基或巯基与任意基团键合的化合物，当将所述活性化合物的前药给予对象后，其分别裂解成游离的羟基、氨基或巯基。例如，包含羟基的化合物可以以酯的形式给予，其在体内通过水解转化为羟基化合物。可以在体内转化成羟基化合物的适宜的酯包括乙酸酯、柠檬酸酯、乳酸酯、酒石酸酯、丙二酸酯、草酸酯、水杨酸酯、丙酸酯、琥珀酸酯、富马酸酯、甲酸酯、苯甲酸酯、马来酸酯、亚甲基-双-b-羟基萘甲酸酯、龙胆酸酯、羟乙基磺酸酯、二对甲苯酰酒石酸酯、甲磺酸酯、乙磺酸酯、苯磺酸酯、对甲苯磺酸酯、环己基氨基磺酸酯、奎尼酸酯、氨基酸的酯等。类似地，可以以酰胺形式给于包含胺基的化合物，例如乙酰胺、甲酰胺和苯甲酰胺，其通过水解在体内转化为胺化合物。参见Harper,“Drug Latentiation”in Jucker,ed.Progress in Drug Research4:221-294(1962)；Morozowich等，“Application of Physical Organic Principles to Pro-drugDesign”在E.B.Roche版中Design of Biopharmaceutical Properties through Pro-drugs andAnalogs,APHA Acad.Pharm.Sci.40(1977)；Bioreversible Carriers in Drug in Drug Design,Theory and Application,E.B.Roche,版,APHA Acad.Pharm.Sci.(1987)；Design of Pro-drugs,H.Bundgaard,Elsevier(1985)；Wang等，“Pro-drug approaches to the improved delivery ofpeptide drug”在Curr.Pharm.Design.5(4):265-287(1999)中；Pauletti等，(1997)Improvementin peptide bioavailability:Peptidomimetics and Pro-drug Strategies,Adv.Drug.Delivery Rev.27:235-256；Mizen等，(1998)“The Use of Esters as Pro-drugs for Oral Delivery of(3-Lactamantibiotics,”Pharm.Biotech.ll,:345-365；Gaignault等，(1996)“Designing Pro-drugs andBioprecursors I.Carrier Pro-drugs,”Pract.Med.Chem.671-696；Asgharnejad,“Improving OralDrug Transport”,在Transport Processes in Pharmaceutical Systems中,G.L.Amidon,P.I.Leeand E.M.Topp,Eds.,Marcell Dekker,p.185-218(2000)；Balant等，“Pro-drugs for theimprovement of drug absorption via different routes of administration”,Eur.J.Drug Metab.Pharmacokinet.,15(2):143-53(1990)；Balimane和Sinko,“Involvement of multiple transportersin the oral absorption of nucleoside analogues”,Adv.Drug Delivery Rev.,39(1-3):183-209(1999)；Browne,“Fosphenytoin(Cerebyx)”,Clin.Neuropharmacol.20(1):1-12(1997)；Bundgaard,“Bioreversible derivatization of drugs—principle and applicability to improve thetherapeutic effects of drugs”,Arch.Pharm.Chemi 86(1):1-39(1979)；Bundgaard H.“Improveddrug delivery by the pro-drug approach”,Controlled Drug Delivery 17:179-96(1987)；Bundgaard H.“Pro-drugs as a means to improve the delivery of peptide drugs”,Arfv.DrugDelivery Rev.8(1):1-38(1992)；Fleisher等，“Improved oral drug delivery:solubility limitationsovercome by the use of pro-drugs”,Arfv.Drug Delivery Rev.19(2):115-130(1996)；Fleisher等，“Design of pro-drugs for improved gastrointestinal absorption by intestinal enzyme targeting”,Methods Enzymol.112(Drug Enzyme Targeting,Pt.A):360-81,(1985)；Farquhar D等，“Biologically Reversible Phosphate-Protective Groups”,Pharm.Sci.,72(3):324-325(1983)；Freeman S等，“Bioreversible Protection for the Phospho Group:Chemical Stability andBioactivation of Di(4-acetoxy-benzyl)Methylphosphonate with Carboxyesterase,”Chem.Soc.,Chem.Commun.,875-877(1991)；Friis和Bundgaard,“Pro-drugs of phosphates andphosphonates:Novel lipophilic alphaacyloxyalkyl ester derivatives of phosphate-or phosphonatecontaining drugs masking the negative charges of these groups”,Eur.J.Pharm.Sci.4:49-59(1996)；Gangwar等，“Pro-drug,molecular structure and percutaneous delivery”,Des.Biopharm.Prop.Pro-drugs Analogs,[Symp.]Meeting Date 1976,409-21.(1977)；Nathwani和Wood,“Penicillins:a current review of their clinical pharmacology and therapeutic use”,Drugs 45(6):866-94(1993)；Sinhababu和Thakker,“Pro-drugs of anticancer agents”,Adv.Drug Delivery Rev.19(2):241-273(1996)；Stella等，“Pro-drugs.Do they have advantages in clinical practice？”,Drugs 29(5):455-73(1985)；Tan等，“Development and optimization of anti-HIV nucleosideanalogs and pro-drugs:A review of their cellular pharmacology,structure-activity relationshipsand pharmacokinetics”,Adv.Drug Delivery Rev.39(1-3):117-151(1999)；Taylor,“Improvedpassive oral drug delivery via pro-drugs”,Adv.Drug Delivery Rev.,19(2):131-148(1996)；Valentino和Borchardt,“Pro-drug strategies to enhance the intestinal absorption of peptides”,Drug Discovery Today 2(4):148-155(1997)；Wiebe和Knaus,“Concepts for the design ofanti-HIV nucleoside pro-drugs for treating cephalic HIV infection”,Adv.Drug Delivery Rev.:39(l-3):63-80(1999)；Waller等，“Pro-drugs”,Br.J.Clin.Pharmac.28:497-507(1989)，其全部内容均通过引用整体并入本申请。
在本申请中使用的术语“脂肪族化合物”指具有至少一个直链的、支链的或环状的C1-C12烃化合物，所述烃是完全饱和的或其含有一个或多个不饱和的单元，但是其不是芳香的。例如，适宜的脂肪族基团包括取代的或未被取代的线性、支链或环状烷基、烯基、炔基及其复合物，如环烷基、(环烷基)烷基、(环烯基)烷基或(环烷基)烯基。在不同实施方式中，所述脂肪族基团具有1至50个、1至20个、1至10个、1至8个、1至6个、1至4个、或者1个、2个或3个碳。
术语“烷基”(如果指化合物时在本申请中可以与“烷”互换使用)、“烯基”(如果指化合物时在本申请中可以与“烯”互换使用)和“炔基”(如果指化合物时在本申请中可以与“炔”互换使用)单独或作为更大基团的一部分使用指具有1至50个或1至20个或1至12个碳原子的直链和支链脂肪族基团。
当将脂肪族基团与分子其余部分连接的碳原子是饱和的碳原子时将使用本申请中使用的术语“烷基”。然而，烷基的其他碳原子可以包括不饱和性。因此，烷基包括但不限于甲基、乙基、丙基、烯丙基、炔丙基、丁基、戊基和己基。
当将脂肪族基团与分子其余部分连接的碳原子形成碳碳双键时将使用本申请中使用的术语“烯基”。烯基包括但不限于乙烯基、1-丙烯基、1-丁烯基、1-戊烯基和1-己烯基。
当脂肪族基团与分子其余部分连接的碳原子形成碳碳三键时将使用本申请中使用的术语“炔基”。炔基包括但不限于乙炔基、1-丙炔基、1-丁炔基、1-戊炔基和1-己炔基。
术语“环脂肪族化合物”指具有至少一个饱和的或部分不饱和的环状3至约14元脂肪族环系的化合物，其中所述脂肪族环系是任选取代的。在一些实施方式中，所述环脂肪族是具有3-8个或3-6个环碳原子的单环烃。非限制性示例包括环烷、环烯和环炔，环丙烷基、环丁烷基、环戊烷基、环戊烯基、环己烷基、环己烯基、环庚烷基、环庚烯基、环辛烷基、环辛烯基和环辛二烯基。在一些实施方式中，所述环脂肪族是具有6-12个、6-10个或6-8个环碳原子的桥连或稠合的双环烃，其中在所述双环系上的任意单个环是3-8元的。在一些实施方式中，在环脂肪族上的两个相邻的取代基与其中的环原子一起形成任选取代的稠合的5至6元芳香环或3-8元非芳香环，其具有选自下组的0-3个环杂原子：O、N和S。因此，术语“环脂肪族”包括与一个或多个芳基、杂芳基或杂环基环稠合的脂肪族环，其中连接的基团或点在所述脂肪族环上。非限制性示例包括茚满基、5,6,7,8-四氢喹喔啉基、十氢萘基或四氢萘基，其中连接的基团或点在所述脂肪族环上。
术语“芳基”或“ar-”单独或作为较大基团的一部分使用时，例如“芳烷基”、“芳烷氧基”或“芳氧基烷基”，指C6至C14芳香烃，包含1至3个环，其均被任选地取代。芳基包括但不限于苯基、萘基和蒽基。
在本申请中使用的术语“芳香化合物”指具有任选取代的单环、双环或三环基团的化合物，所述单环、双环或三环基团具有0-6个，优选地0-4个环杂原子和在环阵列中具有6、10或14个共用的π电子的化合物。因此，术语“芳香化合物”包括具有芳基和/或杂芳基的化合物。
虽然本文详细描述并说明了优选实施方式，对相关领域技术人员来说显而易见的是，可以在不背离本发明精神的情况下进行各种修改、增加、替换等，因此，认为这些修改、增加、替换等都涵盖于所附权利要求书中所限定的本发明的范围之内。此外，对于未说明的范围，本领域普通技术人员将理解的是，可对本文所描述和说明的各实施方式中的任一个进行进一步修改，以并入在本文所述的任何其他实施方式中示出的特征。
通过下述的实施例对本申请进行了进一步的解释，不应认为其构成了限制。实施例仅是解释性的，并且其并非旨在以任何方式对本申请所述的任何方面进行限制。下述实施例并非以任何方式限制本发明。
实施例
下述实施例解释了本发明的一些实施方式和方面。相关领域的技术人员将理解可以在不改变本发明精神和范围的前提下进行各种修改、增加、替换等，并且此类修改和改变包括在由下文中所附的权利要求所定义的本发明的范围内。下述实施例并非以任何方式限制本发明。
实施例1：在丝纤蛋白生物材料中包封油的示例性方法以及由所述方法得到的组合物
尽管已提出将多种材料用于不同应用的包封中，例如食品、化妆品和药品应用，但是丝纤蛋白由于其具有一系列独特的化学和物理性质使其成为特别引人注目的包封材料。丝纤蛋白是一种从家蚕(Bombyx mori)的茧中纯化得到的生物来源的蛋白聚合物，其经过了FDA批准、可食用(等，2007；Hanawa等，1995)、无毒性并且相对廉价(Qian等，1996)。丝显示出理想的机械性质、生物相容性(和Scheibel,2010；Meinel等，2005；Panilaitis等，2003)以及其通过蛋白水解酶生物降解为无毒产物(Wang等，2008a；Horan等，2005)。此前对将丝纤蛋白用于化妆品、食品和化学工业进行了讨论(Bayraktar等，2005)，最近讨论将其作为组织工程的支架(Wang等，2006，Altman等，2003)以及用于控制释放的药物运载体(Numata和Kaplan,2010；Pritchard等，2011；Wenk等，2011)。
尽管其他包封方法需要的工艺条件可能会导致精细化合物降解和/或损害最终产物的安全性(如暴露于高热或使用毒性交联化学药品(Liu等，1996；Qian等，1997；Demura等，1989；Lu等，2010))，但是能够使用温和的、常温的、水性工艺条件制备稳定的丝生物材料(Numata和Kaplan,2010；Pritchard和Kaplan,2011)。特别地，在常温常压的干燥过程中丝能够自组装成薄膜(Hofmann等，2006)，并且已使用超声制备得到的物理交联的富含β片层的丝水凝胶(Wang等，2008b)。
与很多生物来源的蛋白不同，丝对于温度、pH和湿度的改变是天然稳定的(Kuzuhara等，1987；Omenetto和Kaplan,2010)，并且其在机械上是牢固的(Altman等，2003)。由于其独特的嵌段共聚物结构(由较大的疏水性结构域和较小的亲水性间隔组成)，使得丝自组装成由更为柔性的亲水性间隔所分隔的有序的纳米级晶体结构域(β-片层)，其为所掺入的蛋白和小分子提供了稳定的环境(Lu等，2009)。例如，已对在丝生物材料中包封广泛的水溶性化合物和蛋白(包括酶和生长因子)进行了讨论(Numata和Kaplan；Pritchard等，2011；Wenk等，2011；Pritchard等，2012)。然而，我们尚未见到对在丝生物材料中对将油作为活性剂的分散相或溶剂的包封的讨论。
示例性的油在丝溶液中的微乳(O/W乳剂)
将负载油红O的葵花油溶液与丝溶液人工混合(轻柔振荡约10分钟)以生产水包油(O/W)型稳定的乳剂(图2A)。使用不同丝浓度(例如～2％、～4％和～6％(w/v))以及油与丝的体积比为1:1、1:2和1:4制备葵花油在丝中的乳剂，并且在将其在～4℃下贮存至少约48小时后，在在丝乳剂中的任意油均未观察到相分离，而相比之下葵花油与蒸馏水1:1、1:2和1:4的混合物几乎完全相分离。
在超声前，含油红O的葵花油与～7％(w/v)水性丝溶液以～1:3(v/v)的油丝比混合形成的乳剂显示出的平均液滴直径为419.5±126.9μm。对所述O/W乳剂进行轻柔超声(例如振幅10％持续5秒钟)使得其平均油颗粒直径降至小于25μm(图2B中的图像为使用ImageJ对两百个颗粒样品进行检测的结果，其显示出的平均直径为24.6±11.4μm(但是没有将大量直径小于10μm的颗粒包括在该平均值之内，因为使用ImageJ无法对其进行准确的检测)。利用超声制备的加入了油红O的葵花油在丝中的微乳如图2B所示。当丝蛋白存在于连续的水相中时利用超声生产的微米级的油滴是稳定的，并且在干燥过程中的丝薄膜自组装过程中(图3A-3B)或在超声后在丝水凝胶网络自组装过程中(图4B)其能够保持。
在油分散进入所述丝溶液后，例如通过超声，可以按照对丝溶液(不含油)的处理方式对该稳定的乳剂进行处理以形成不同形式的丝制品，例如如在本领域中所讨论的(参见例如Omenetto和Kaplan,2010；Kim等，2010；Pritchard等，2012；Hofmann等，2006；Tsorias等，2012)。例如，可以将所述油/丝乳剂浇铸成薄膜，迅速溶解的薄膜、负载用于生物传感和诊断的试剂的薄膜以及用于药物递送的持续释放的薄膜。TGA分析显示与仅为丝的情况相比，负载油微粒的丝薄膜的热稳定性略有降低(数据未列出)。然而，即使当所述丝溶液中含有油微粒时，丝自主装形成薄膜也发生在特氟龙涂覆的模具和图样化的模具上，例如全息图模具(图3A-3B)。在丝薄膜中存在微米级油滴使得所述薄膜不透明(而非透明)，在溶液中的油含量越高最终得到的薄膜的不透明度越强(图3A-3B)。
所述薄膜通过在常温常压的条件下干燥过夜进行自组装(在干燥后不需要任何进一步的处理)，并且在暴露于水性介质(例如蒸馏水和磷酸盐缓冲液)时其能够复溶，这表明在暴露于水性介质后其能够释放所掺入的油微粒。或者，可以利用β-片层诱导处理例如水退火或水蒸气退火对所述薄膜进行进一步的处理以增加丝网络中β-片层的含量，从而使得所述丝薄膜成为水不溶性的，如此前对仅由丝浇铸的薄膜的讨论(Jin等，2005)。
通过将经超声处理的丝滴加至油浴中生产丝颗粒
因为油微乳在水性丝溶液中是稳定的(O/W乳剂)并且不会干扰丝基质的组装，接下来试图寻找一种温和的、水性工艺以便在油浴中生产稳定的丝颗粒，以使得这两种成分最终能够整合成用于微包封的O/W/O乳剂。在可调的时间框架下超声能够诱导丝的物理交联(Wang等，2008b；美国专利号8,187,616，其内容通过引用整体并入本申请)。由于在溶胶-凝胶转变起始与凝胶化最终发生之间的这种可控的延迟，将经超声处理的仍处于溶液状态的丝加入油浴或混悬于自稳定油包水乳剂中后，其在不需要热或化学处理的条件下就能够完成物理交联(与其他用于制备蛋白微球的基于乳剂的工艺不同)。通过下述工艺生产稳定的、物理交联的丝球状颗粒(例如丝大尺寸球状颗粒)，例如通过将与含有模型水溶性小分子化合物(例如阿霉素或食用色素)的蒸馏水溶液混合的脱胶30分钟的～6-7％的丝溶液用振幅15％下的超声处理约30-45秒，并将经超声处理的丝-药物混合物加入葵花油浴中。在油浴中，水性丝液滴保持球形构象直至凝胶化完成(图4C)。图4A显示了在凝胶化完成前在油浴中经超声的丝溶液，并且图4D显示了在油浴中孵育过夜后的相同丝液滴：一旦丝网络交联完成，所述丝液滴由半透明(图4A)转化成不透明，并且当将其从油浴中取出后其仍保持球形形状(图4D)。
然后将超声诱导的负载油红O的葵花油在丝中的微乳滴加至油浴中(图4B)，其相应地生产含有混悬于其中的精细的微米级油颗粒的交联的丝球状颗粒，结果得到红色的最终的丝大颗粒(图4E)。通过在周围环境条件下将物理交联的丝大颗粒通过干燥过夜脱水生产更小的、致密的、球状颗粒(负载油的颗粒见图4F和负载水溶性染料的颗粒见图5B)。
挤出样工艺的特征为能够精确控制粒径和负载的组分，因为其可以将受控体积的已知组分移取至油浴中。图5A显示了通过将不同体积尺寸液滴(例如从100μL降至1μL)的经超声的丝溶液(经超声处理后负载阿霉素)移取至葵花油浴中生产的丝水凝胶大颗粒。通过移取10μL或50μL经超声的丝溶液(经超声处理后负载食用色素)生产的微粒和当将水凝胶大颗粒在环境条件下脱水过夜得到的更致密的、更坚固的、更小的颗粒如图5B所示。
在干燥前，由10μL负载染料的经超声的丝溶液制备的丝水凝胶微球的平均直径为约2.8±0.2mm，在干燥后其降至1.9±0.3mm。在干燥前，由50μL负载染料的经超声的丝溶液制备的丝水凝胶微球的平均直径为约4.6±0.1mm，在干燥后其降至2.3±0.1mm。使用超声将丝分散进入油中(W/O乳剂)以生产更小的丝微粒(平均体积小于1μL)(图5C-5D)。在一些实施方式中，可以使用微流体采用上文所述的方法生产甚至更小的、更严格控制的丝颗粒(将丝超声，随后滴加至油浴)，已针对其他生物材料微粒对此进行了描述(Chu等，2007；Tan和Takeuchi,2007；Ren等，2010)。
除了改变尺寸和负载以外，还可以通过交联后处理对这些物理交联的丝颗粒进行进一步的操作。例如，所述交联的丝颗粒可以(1)保持在有弹性的、水合的凝胶状态，(2)脱水以生产致密的、硬化的基质(图4F和图5B)或(3)冷冻干燥以生产干燥的、多孔的、海绵样材料(Kluge等，2010)。这些不同的球状丝颗粒(其均使用温和的和食品安全的工艺生产)具有广泛的材料性质和尺寸，适用于多种多样的潜在应用。
来源于O/W/O乳剂的包封油的丝微粒
根据乳化的微米级油滴在水性丝溶液中的稳定化以及经超声的丝在油浴中形成大尺寸的水凝胶颗粒，使用类型为O1/W/O2的双重乳剂制备微粒，其中O1是待包封的目的油(例如本实施例中的负载油红O的葵花油)，W是水性溶胶-凝胶丝溶液(例如通过超声丝溶液生产)，并且O2是丝颗粒分散于其中的油浴(例如葵花油浴)。对包含水相的丝溶液进行超声以使得其保持在溶液相足够长的时间以进行双重乳化，然后完成交联，从而包封内部油相(表示这一工艺的流程图如图1所示)。丝还作为天然乳剂稳定剂，阻止内部油相(负载目的试剂)的分离以及将试剂吸出至连续的油相中。使用光学显微镜检测由经超声的具有不同丝成分的丝并经超声处理制备的O/W/O乳剂的形态，通过测定外部油浴在518nm处的吸光度评估丝包封基质的扩散度(指示剂油红O从丝颗粒的内部油相扩散进入外部连续的油相)。
使用经～60分钟脱胶的再生丝纤蛋白溶液制备的O/W/O乳剂如图6A-6B所示。在水相中使用较高浓度的水性丝溶液(例如～6％w/v)能够生产油滴混悬于整个丝球中的分散液(将这种包封构型称为微球，也称为基质系统(Kuang等，2010))(图6A)。使用较低浓度的水性丝溶液(例如～3％w/v)制备所述乳剂能够得到微囊构型(也称为储库系统(Kuang等，2010))，其中在各颗粒中均含有被丝囊所围绕的一个较大的脂质液滴。这表明丝的浓度能够部分影响包封油的微粒的形态。不希望受到理论的束缚，丝的粘度增加和/或蛋白浓度增加(例如～6％(w/v))可能能够阻止各液滴聚集成在较低丝浓度(例如～3％(w/v))的O/W/O乳剂中观察到的单一核液滴。
增加超声强度能够加速丝凝胶化过程(Wang等，2008)。不希望受到理论的束缚，增加超声的振幅和/或持续时间能够增加丝溶液的粘度。丝溶液的粘度可能会影响丝作为包封材料的颗粒的形态和/或渗透性。使用脱胶30分钟的～6％(w/v)的丝生产的O/W/O乳剂的典型图像如图7A-7D所示。与具有较低粘度的丝乳剂相比(例如使用脱胶～60min的丝溶液)，所述丝颗粒较少为球形且油包封似乎是不规则的。当超声强度增加时(例如～10％持续～15秒，见图7A-7B，对比～15％和持续～15秒，见图7C-7D)，所得到的丝颗粒甚至是更长的和不规则的。不希望受到理论的束缚，缩短的脱胶时间结合增加的超声强度可能导致过早交联，阻碍了在乳剂中的丝掺入内部油滴和/或形成球形构象。
在丝微囊制备过程中，材料组分和/或包封基质材料的扩散性能够部分地决定核试剂的保留程度(Gharsallaoui等，2007)。在高溶液粘度时，外部油相(例如葵花油浴)在518nm处的吸光度(油红O的含量的指示剂)降低，表明丝囊对内部油相中的油红O的渗透性可能随着双重乳剂中丝溶液粘度的增加而降低(并且随后在内部相所负载的试剂“损失”)。与普通蒸馏水的水相相比，未经超声的丝能够减少内部油相中负载的试剂(例如油红O)流向外部油相造成的损失(图8A)。当丝浓度保持恒定且超声处理保持恒定时，油红O流向外部油相的损失随着脱胶时间的缩短(丝溶液粘度的增加)而减少(图8B)。类似地，当丝溶液的浓度和脱胶时间保持恒定(～6％(w/v)，脱胶时间为～30分钟，见图8C；以及～6％(w/v)，脱胶时间为～60分钟，见图8D)但超声强度增加时(例如通过改变振幅或持续时间或这两者)，油红O的损失逐渐减少(例外是对于～6％(w/v)脱胶时间～30分钟的丝而言，对未超声丝溶液与振幅～15％超声～15秒的丝溶液进行比较后，未显示出油红O损失的改变，这可能是由于这种超声处理未显著增加粘度导致的)。
使用不含丝的蒸馏水作为水相制备的O/W/O乳剂中使用葵花油浴作为连续的外部油相在518nm显示出最高的吸光度(0.442±0.014)，表明油红O出现了最大程度的损失，其从内部油囊进入了连续的油相。在使用60分钟和30分钟脱胶时间制备的未经超声的水性丝纤蛋白溶液作为水相的O/W/O乳剂中连续的油相在518nm处的吸光度值分别为0.12±0.001和0.076±0.001。在水相中丝的存在使得扩散进入油相的油红O减少(与仅使用水作为水相相比)(图8A)，表明丝包封能够为油红O扩散进入外部油相提供屏障。丝溶液粘度的增加(例如通过使用更短的脱胶时间增加丝溶液中丝的片段长度)能够进一步增加试剂在内部油核中的保留(图8B)。除了丝的处理参数以外，还能够通过超声处理和水相中丝溶液的浓度(w/v)控制油红O在内部油核中的保留(图8C-8D，表1)。此外，丝O/W/O乳剂的形态表明在水层中的丝组装成为围绕内部油相的囊：丝“皮肤”的褶皱和起皱是明显的(图9A-9B)。
表1：在使用包含暴露于不同超声处理(处理持续时间和振幅)的具有不同性质(例如脱胶持续时间和丝浓度)的水性丝溶液作为水相的O/W/O乳剂中外部油相在518nm处的吸光度
本申请所述的用于制备包封油的丝生物材料的温和的、食品安全的、水性方法能够用于多种应用中，例如在需要保护、稳定和/或控制释放的食品或药物产品中。很多化疗药物、类固醇、激素和抗生素/抗真菌剂是油溶性的且不具有较高的水溶性，因此目前需要与制剂添加剂如聚氧乙烯蓖麻油(cremaphor)或乙醇一并给予，其在患者中具有副作用。
在一个实施方式中，发明人证明了包封葵花油不仅代表了仅包封脂质的能力(其能够从包封的稳定作用中获益)，而且还模拟了使用脂质作为溶剂的情况，可以将疏水性物质如挥发性芳香化合物(例如但不限于调味剂和香料)以及亲脂性维生素和药物溶解在其中进行贮存和递送(Gharsallaoui等，2007)。本申请所述的包封系统能够用于控释/药物递送方面的应用。考虑到包封工艺具有温和、无毒性、食品安全的性质(例如可以在常温和常压下制备薄膜和球，生产稳定的乳剂不需要二次乳化剂或化学交联剂)，本申请所述的工艺能够用于贮存和递送能够溶解在油中的任意试剂，例如但不限于调味剂、香料、食品添加剂、油和油溶性化合物。使用丝包油微乳制备的丝薄膜还能够用于将油溶性诊断试剂如指示剂染料整合至基于诊断性丝薄膜的平台中。
在一些实施方式中，可以将本申请所述的包封油的丝组合物用于例如制药工业，食品和消费品工业，向食品和消费品工业销售材料或配料(例如香料、食品添加剂或调味剂)的供应商，维生素、补充剂和益生菌剂的生产厂商；以及用于在发展中国家递送营养补充剂、维生素等，在这些国家中冷藏限于解决营养缺乏。
除了在食品、化妆品、消费品和药物方面的应用以外，与简单的蛋白水凝胶相比，油在整个蛋白网络中稳定的分散体可能更好地生理学代表具有较高脂质含量的模型组织，如脑。
示例性的材料和方法
材料。家蚕蚕茧的丝购自Tajima Shoji Co.,LTD(Sumiyoshicho,Naka-ku,Yokohama,Japan)。葵花油、阿霉素和油红O购自Sigma Aldrich(St.Louis,MO)。柠檬烯购自Firmenich(Newark,New Jersey)。
丝溶液和材料的制备。根据此前的描述(Sofia等，2001)，从家蚕的蚕茧中制备丝纤蛋白溶液。简言之，将蚕茧在0.02M Na2CO3的溶液中煮沸30min或60min并洗涤，然后在环境条件下干燥过夜。在60℃下将干燥的丝纤蛋白溶于9.3M的水性LiBr溶液中2-4小时，得到20％(w/v)的溶液。然后使用Slide-a-Lyzer透析盒(MWCO 3,500,Pierce ThermoScientific Inc.,Rockford,IL)通过将所述溶液对蒸馏水透析2.5天以将LiBr从丝中除去。通过从已知体积的溶液样品中蒸发水并使用分析天平称重来确定丝纤蛋白的浓度。在使用前将丝溶液贮存在4-7℃。
丝薄膜的浇铸。根据此前的描述浇铸丝薄膜(Hofmann等，2006)。简言之，将丝溶液加入特氟龙涂覆的模具或图样化的模具中，然后在环境条件下干燥过夜。将油以不同油：丝体积比加入到所需浓度的丝溶液中，使用Branson Digital Sonifier 450在例如振幅为～10-15％的条件下超声例如～5秒，然后再根据所描述的进行加样和浇铸以制备负载油的丝薄膜。
超声诱导丝的凝胶化。根据此前在Wang等，2008b和美国专利号8,187,616中的描述进行超声诱导的凝胶化。例如，使用Branson Digital Sonifier 450在振幅为～10-15％的条件下将所需浓度的且使用目的脱胶持续时间制备的丝溶液超声处理不同时间(在整个结果章节中丝浓度、脱胶持续时间以及超声振幅和持续时间的不同条件是给定的)。如上文所述使用经超声或未经超声的丝制备乳剂。
热重分析。使用热重分析(TGA)(TA Instruments Q500)测定由1％w/v的丝纤蛋白溶液组装的丝薄膜的重量变化情况。在氮气氛下使用50mL/min的气流获得TGA曲线。首先通过以2℃/min的速率将样品由25℃加热至600℃进行分析。记录丝薄膜的重量损失，将其作为温度的函数。
实施例2：由丝包油微乳制备的薄膜——溶解及其应用
在室温和环境条件下将丝薄膜浇铸并干燥过夜，未对所述丝薄膜进行附加的β-片层诱导处理，其能够在暴露于水环境后如浸入缓冲液中(图10)或当将其与湿润的组织例如脑组织接触时迅速溶解，根据此前对安装在可溶的丝薄膜基材上的超薄电子器件的描述(Kim等，2010)：当应用于脑组织柔软的、弯曲的表面时，这些图样化的薄膜显示出自发保持其形状的包绕。当将膜浸入～37℃的缓冲液时负载染料的膜迅速溶解并且将染料从所述膜中释放(图10)。在暴露于37℃的磷酸盐缓冲液(PBS)15分钟内，负载活性剂(例如每0.2mm2薄膜含～0.5、0.25或0.125mg腺苷)的可溶的丝薄膜释放大部分药物负载(约80％)(数据未列出)。
将负载油的丝薄膜暴露于蒸馏水或磷酸盐缓冲液后重新溶解，所述负载油的丝薄膜通过在温度和压力的环境条件下干燥过夜自组装，从而释放掺入其中的油和在所述油中携带的任意试剂(如果有的话)。负载油微液滴的水溶性丝薄膜暴露于水性介质后重新溶解的能力表明包封油的丝组合物不仅能够用作贮存平台，例如针对油溶性活性剂如治疗剂和营养素，还能够用于化妆品和食品工业中，其中在一些实施方式中，本申请所述的组合物可以包含光学图样，例如但不限于全息图、晕彩和反射图样。例如一旦应用于舌上或颊内时，含有负载调味剂油微乳的丝薄膜能够溶解并释放所包封的调味剂。类似地，如果应用于略微潮湿的皮肤上时，负载香料的未经处理的丝薄膜能够重新溶解。丝薄膜的图样能够进一步增强消费者的用户体验。在丝中负载香料的油的微乳展示了将图样化原型的示例(图3A-3B和图11A-11B)。例如，可以在全息图模具、具有晕彩表面的塑料薄片或反射图样化的硅酮模具上浇铸油-丝微乳，并且所得到的基于丝的材料能够保持光学性质(例如全息图、晕彩、光反射)。
由于可以在干燥后对薄膜进行处理以使得丝纤蛋白交联，在某些实施方式中，可以使用与本申请所述的类似的方法将油溶性化合物(例如与在诊断装置中使用的那些相关的)整合至上文所述的丝平台中以用于诊断应用。
实施例3：水凝胶丝球(“丝珠”)-负载及其应用
此前已有对具有可控尺寸的可调水凝胶丝球的描述。这些交联的“丝珠”可以由丝包油或负载水溶性化合物的微乳制备。可以通过使用控制所述球的尺寸/直径和/或任选地进行交联后处理扩展本申请所述的丝组合物的功能。例如，使用含不同比例食用色素的水凝胶丝珠证明了所述球具有受控的负载(图12)。由于该制备方法涉及将丝溶液挤出至油浴中并且所述溶液的体积和组分是受控的，在油相和/或丝相中负载的试剂的包封效率能够达到100％(与其他微包封方法不同，在其他微包封方法中在处理过程中通常会造成化合物损失)。由负载食用色素的丝水凝胶球原型证明了对负载的控制程度和效率均较高。
由于这些丝水凝胶珠是稳定但柔软的，因而其能够用于例如食品产品(例如相当于木薯粉珠)、珍珠奶茶和维生素(例如油溶性/水不溶性维生素和营养补充剂如鱼油、β-胡萝卜素和维生素E)。包封于丝水凝胶珠中的药物可以作为吞咽困难患者的替代给药形式。使用丝代替食品产品和药品递送形式中的明胶能够为减少与使用哺乳动物来源的材料相关的病原体传递问题带来益处。由于丝水凝胶是生物相容性的并且能够促进所包封细胞的存活(Wang等，2008)，这些水凝胶珠还能够用于含有益生菌的产品。此外，丝组合物还能够改善贮存期间的稳定性(例如益生菌产品目前通常需要冷藏保存)，并且在暴露于胃内的恶劣环境期间其能够提供至少某种程度的保护，增加益生菌进一步沿着胃肠道到达其发挥作用的靶点的可能性。
参考文献
Altman GH,Horan RL,Lu H,Moreau J,Martin I,Richmond JC,Kaplan DL.Silk matrix fortissue engineered anterior cruciate ligaments.Biomaterials 2002；23:4131–4141.
Arshady R.Albumin microspheres and microcapsules:methodology of manufacturing techniques.J Control Release 1990；14:111-131.
R,Venskutonis PR,Dewettinck K,VerhéR.Properties of oregano(Origanumvulgare L.),citronella(Cymbopogon nardus G.)and marjoram(Majorana hortensis L.)flavorsencapsulated into milk protein-based matrices.Food Research International.2006；39:413–425.
Bayraktar O,Malay O,Y,Batigün A.Silk fibroin as a novel coating material forcontrolled release of theophylline.Eur J Pharm Biopharm 2005；60:373–381.
Berthier DL,Schmidt I,Fieber W,Schatz C,Furrer A,Wong K,Lecommandoux S.Controlledrelease of volatile fragrance molecules from PEO-b-PPO-b-PEO block copolymer micelles inethanol-water mixtures.Langmuir 2010；26:7953–7961.
Chourpa I,Ducel V,Richard J,Dubois P,Boury F.Conformational modifications of a gliadinand globulin proteins upon complex coacervates formation with gum Arabic as studied byRaman microspectroscopy.Biomacromolecules 2006；7:2616–2623.
Chu L-Y,Utada AS,Shah RK,Kim J-W,Weitz DA.Controllable monodisperse multipleemulsions.Angew Chem Int Ed 2007；46:8970–8974.
Desobry SA,Netto FM,Labuza TP.Comparison of spray-drying,drum-drying and freeze-dryingforβ-carotene encapsulation and preservation.Journal of Food Science 1997；62:1158-1162.
Diab T,Pritchard EM,Uhrig BE,Boerckel JD,Kaplan DL,Guldberg RE.A silk hydrogel-baseddelivery system of bone morphogenetic protein for the treatment of large bone defects.J MechBehav Biomed Mater.In press
Dickinson E.Double emulsions stabilized by food biopolymers.Food Biophysics 2011；6:1–11.
Edris A,B.Encapsulation of orange oil in a spray dried double emulsion.Nahrung2001；45:133-137.
Elzoghby AO,Samy WM,Elgindyoghby NA,Samy WM,Elgindy NA.Albumin-basednanoparticles as potential controlled release drug delivery systems.J Control Release2012；157:168–182.
Esposito E,Cortesi R,Nastruzzi C.Gelatin microspheres:influence of preparation parametersand thermal treatment on chemico-physical and biopharmaceutical properties.Biomaterials1996；17:2009-2020.
Gharsallaoui A,Roudaut G,Chambin O,Voilley A,Saurel R.Applications of spray-drying inmicroencapsulation of food ingredients:An overview.Food Research International2007；40:1107–1121.
Gibbs BF,Kermasha S,Alli I,Mulligan CN.Encapsulation in the food industry:a review.Int JFood Sci Nutr 1999；50:213-224.
Gouin S.Microencapsulation:industrial appraisal of existing technologies and trends.Trends inFood Sci Technol 2004；15:330–347.
Hanawa T,Watanabe A,Tsuchiya T,Ikoma R,Hidaka M,Sugihara M.New oral dosage formfor elderly patients.II.release behavior of benfotiamine from silk fibroin gel.Chem Pharm Bull1995；43:872-876.
Hofmann S,Wong Po Foo CT,Rossetti F,Textor M,Vunjak-Novakovic G,Kaplan DL,MerkleHP,Meinel L.Silk fibroin as an organic polymer for controlled drug delivery.J Control Release2006；111:219–227.
Horan RL,Antle K,Collette AL,Wang Y,Huang J,Moreau JE,Volloch V,Kaplan DL,AltmanGH.In vitro degradation of silk fibroin.Biomaterials 2005；26:3385–3393
Imsombut T,Srisuwan Y,Srihanam P,Baimark Y.Genipin-cross-linked silk fibroinmicrospheres prepared by the simple water-in-oil emulsion solvent diffusion method.PowderTechnol 2010；203:603-608.
Ishii A,Furukawa M,Matsushima A,Kodera Y,Yamada A,Kanai H,Inada Y.Alteration ofproperties of natural pigments by conjugation with fibroin or polyethylene glycol.Dyes andPigments 1995；27:211-217.
Jayakrishnan A,Knepp WA,Goldberg EP.Casein microspheres:preparation and evaluation as acarrier for controlled drug delivery.International Journal of Pharmaceutics 1994；106:221-228.
Jin H-J,Park J,Karageorgiou V,Kim UJ,Valluzzi R,Cebe P,Kaplan DL.Water-insoluble silkfilms with reducedβ-sheet content.Adv Funct Mater 2005；15:1241–1247.
Jun-xia X,Hai-yan Y,Jian Y.Microencapsulation of sweet orange oil by complex coacervationwith soybean protein isolate/gum Arabic.Food Chemistry 2011；125:1267–1272.
Kanakdande D,Bhosale R,Singhal RS.Stability of cumin oleoresin microencapsulated indifferent combination of gum arabic,maltodextrin and modified starch.Carbohydrate Polymers2007；67:536–541.
Kim D-H,Viventi J,Amsden JJ,Xiao J,Vigeland L,Kim Y-S,Blanco JA,Panilaitis B,Frechette ES,Contreras D,Kaplan DL,Omenetto FG,Huang Y,Hwang K-C,.Zakin MR,Litt B,Rogers JA.Dissolvable films of silk fibroin for ultrathin,conformal bio-integrated electronics.
Nat Mater 2010；9:511-517.
Kluge JA,Rosiello NC,Leisk GG,Kaplan DL,Dorfmann AL.The consolidation behavior of silkhydrogels.J Mech Behav Biomed Mater 2010；3:278-89.
Kuang SS,Oliveira JC,Crean AM.Microencapsulation as a tool for incorporating bioactiveingredients into food.Crit Rev Food Sci Nutr 2010；50:951-968.
A,Scheibel T.Silk-based materials for biomedical applications.Biotechnol ApplBiochem 2010；55:155–167.
Madene A,Jacquot M,Scher J,Desobry S.Flavour encapsulation and controlled release–areview.Int J Food Sci Technol 2006；41:1–21.
Matsumoto A,Chen J,Collette AL,Kim U-J,Altman GH,Cebe P,Kaplan DL.Mechanisms ofsilk fibroin sol-gel transitions.J Phys Chem B 2006；110:21630-21638.
Meinel L,Hofmann S,Karageorgiou V,Kirker-Head C,McCool J,Gronowicz G,Zichner L,Langer R,Vunjak-Novakovic,Kaplan DL.The inflammatory responses of silk films in vitro andin vivo.Biomaterials 2005；26:147-155.
Numata K,Kaplan DL.Silk-based delivery systems of bioactive molecules.Adv Drug Deliv Rev.2010；62:1497-1508.
Omenetto FG,Kaplan DL.New opportunities for an ancient material.Science2010；329:528-531.
Ouali L,Léon G,Normand V,Johnsen H,Dyrli A,Schmid R,Benczedi D.Mechanism ofrelease from hydrolyzed vinyl acetate nanoparticles:thermogravimetric method.Polym Adv Technol 2006；17:45–52.
Panilaitis B,Altman G,Chen J,Jin HJ,Karageorgiou V,Kaplan,DL.Macrophage responses tosilk.Biomaterials 2003；24:3079–3085.
Pritchard EM,Dennis PB,Omenetto F,Naik RR,Kaplan DL.Physical and chemical aspects ofstabilization of compounds in silk.Biopolymers 2012.97:479–498.
Pritchard EM,Kaplan,DL.Silk fibroin biomaterials for controlled release drug delivery.ExpertOpin Drug Deliv 2011；8:1-15.
Qian J,Liu Y,Liu H,Yu T,Deng J.An amperometric new methylene blue N-mediating sensorfor hydrogen peroxide based on regenerated silk fibroin as an immobilization matrix forperoxidase.Anal Biochem 1996；236:208-214.
Ren P-W,Ju X-J,Xie R,Chu L-Y.Monodisperse alginate microcapsules with oil core generatedfrom a microfluidic device.Journal of Colloid and Interface Science 2010；343:392–395.
Sofia S,McCarthy MB,Gronowicz G,Kaplan DL.Functionalized silk-based biomaterials forbone formation.J Biomed Mater Res 2001；54:139-148.
Sohail A,Turner MS,Coombes A,Bostrom T,Bhandari B.Survivability of probioticsencapsulated in alginate gel microbeads using a novel impinging aerosols method.Int J FoodMicrobiol 2011；145:162–168.
Tan W-H,Takeuchi S.Monodisperse alginate hydrogel microbeads for cell encapsulation.AdvMater 2007；19:2696–2701.
Wang X,Kluge JA,Leisk GG,Kaplan DL.Sonication-induced gelation of silk fibroin for cellencapsulation.Biomaterials 2008b；29:1054–1064.
Wang Y,Kim H-J,Vunjak-Novakovic G,Kaplan DL.Stem cell-based tissue engineering withsilk biomaterials.Biomaterials 2006；27:6064-6082.
Wang Y,Rudym DD,Walsh A,Abrahamsen L,Kim HJ,Kim HS.In vivo degradation ofthree-dimensional silk fibroin scaffolds.Biomaterials 2008a；29:3415-3428.
Wenk E,Merkle HP,Meinel L.Silk fibroin as a vehicle for drug delivery applications.J ControlRelease 2011；150:128-141.
Wray LS,Hu X,Schmidt D,Kaplan DL.Effect of processing on silk-based biomaterials:reproducibility and biocompatibility.J Biomed Mater Res B Appl Biomater2011；99:89-101.Zhang X,Reagan MR,Kaplan DL.Electrospun silk biomaterial scaffolds forregenerative medicine.Adv Drug Deliv Rev 2009；61:988-1006.
在说明书和实施例中标识出的所有专利和其他出版物均出于所有目的明确地通过引用并入本申请。这些出版物均以其在本申请的申请日之前公开的内容单独提供。这方面的任何内容均不应被解释为发明人承认由于在先的发明或任何其他原因使得其没有资格在先提出此类申请。根据日期的所有声明或根据这些文件内容的所有陈述均是基于申请人能够获得的信息并且不构成任何对这些文件的日期或内容正确性的承认。
虽然本文详细描述并说明了优选实施方式，对相关领域技术人员来说显而易见的是，可以在不背离本发明精神的情况下进行各种修改、增加、替换等，并且因此将这些纳入下述权利要求所定义的本发明的保护范围内。而且，对于没有实际指明的程度，本领域的普通技术人员能够理解本申请所述和所列出的不同实施方式中的任意一个可以进行进一步的修改以并入本申请所述的任意其他实施方式中的特征。

Claims (159)

1.一种丝颗粒，所述丝颗粒包含至少两个不相混溶的相，第一不相混溶的相包含基于丝的材料并且第二不相混溶的相包含活性剂，其中所述第一不相混溶的相包封所述第二不相混溶的相并且所述第二不相混溶的相不包括脂质体。
2.根据权利要求1所述的丝颗粒，其中所述第二不相混溶的相包含脂质成分。
3.根据权利要求2所述的丝颗粒，其中所述脂质成分包含油。
4.根据权利要求1-3中任意一项所述的丝颗粒，其中所述第二不相混溶的相形成单一隔室。
5.根据权利要求1-3中任意一项所述的丝颗粒，其中所述第二不相混溶的相形成多个隔室。
6.根据权利要求4或5所述的丝颗粒，其中所述单一或多个隔室的尺寸范围为从约1nm至约1000μm，或者从约5nm至约500μm。
7.根据权利要求1-6中任意一项所述的丝颗粒，其中在所述第二不相混溶的相中存在的所述活性剂包含疏水性或亲脂性分子。
8.根据权利要求7所述的丝颗粒，其中所述疏水性或亲脂性分子包含治疗剂、营养剂、化妆剂、染色剂、益生菌剂、染料、芳香族化合物、脂肪族化合物(例如烷烃、烯烃、炔烃、环烷烃、环烯烃和环炔烃)、小分子或其任意组合。
9.根据权利要求1-8中任意一项所述的丝颗粒，其中所述基于丝的材料包含添加剂。
10.根据权利要求9所述的丝颗粒，其中所述添加剂选自下组：生物相容性聚合物；增塑剂(例如甘油)；刺激应答剂；活性剂、有机或无机小分子；糖类；寡糖；多糖；生物大分子，例如肽、蛋白以及肽类似物和衍生物；拟肽；抗体及其抗原结合片段；核酸；核酸类似物和衍生物；糖原或其他糖；免疫原；抗原；由生物材料如细菌、植物、真菌或动物细胞制备的提取物；动物组织；天然存在的或合成的组合物；及其任意组合。
11.根据权利要求9或10所述的丝颗粒，其中所述添加剂以颗粒(例如纳米颗粒或微粒，包括等离子体颗粒)、纤维、管、粉末或其任意组合形式存在。
12.根据权利要求9-11中任意一项所述的丝颗粒，其中所述添加剂包含丝材料，例如丝颗粒、丝纤维、微米尺寸的丝纤维、未经加工的丝纤维及其任意组合。
13.根据权利要求1-12中任意一项所述的丝颗粒，其中所述第二不相混溶的相包封第三不相混溶的相。
14.根据权利要求1-13中任意一项所述的丝颗粒，其中所述基于丝的材料以水凝胶形式存在。
15.根据权利要求1-14中任意一项所述的丝颗粒，其中所述基于丝的材料以干燥状态或冻干形式存在。
16.根据权利要求15所述的丝颗粒，其中所述冻干的丝基质是多孔的。
17.根据权利要求1-16中任意一项所述的丝颗粒，其中在所述第一不相混溶的相中的所述基于丝的材料在水溶液中是可溶的。
18.根据权利要求1-17中任意一项所述的丝颗粒，其中将在所述基于丝的材料中β-片层的含量调整为足以使得所述基于丝的材料在水溶液中对抗溶解的量。
19.根据权利要求1-18中任意一项所述的丝颗粒，其中所述丝颗粒的尺寸范围为从约10nm至约10mm，或者从约50nm至约5mm。
20.一种组合物，所述组合物包含包封于基于丝的材料中的多个脂质隔室。
21.根据权利要求20所述的组合物，其中所述脂质隔室的尺寸范围为从约1nm至约1000μm，或者从约5nm至约500μm。
22.根据权利要求20或21所述的组合物，其中所述脂质隔室与所述基于丝的材料的体积比的范围为从约1000:1至约1:1000、从约500:1至约1:500或者从约100:1至约1:100。
23.根据权利要求20-22中任意一项所述的组合物，其中所述基于丝的材料以选自下组的形式存在：薄膜、薄片、凝胶或水凝胶、网状物、垫、无纺垫、织物、支架、管、板或块、纤维、颗粒、粉末、三维结构、植入物、泡沫或海绵、针、冻干材料、多孔材料、无孔材料及其任意组合。
24.根据权利要求20-23中任意一项所述的组合物，其中所述基于丝的材料包含薄膜。
25.根据权利要求20-24中任意一项所述的组合物，其中所述基于丝的材料包含支架。
26.根据权利要求20-25中任意一项所述的组合物，其中所述基于丝的材料包含光学图样。
27.根据权利要求26所述的组合物，其中所述光学图样包括提供了光学功能的全息图或图样阵列。
28.根据权利要求20-27中任意一项所述的组合物，其中所述脂质隔室还包含活性剂。
29.根据权利要求20-28中任意一项所述的组合物，其中所述活性剂包含疏水性或亲脂性分子。
30.根据权利要求29所述的组合物，其中所述疏水性或亲脂性分子包含治疗剂、营养剂、化妆剂、染色剂、益生菌剂、染料、芳香族化合物、脂肪族化合物(例如烷烃、烯烃、炔烃、环烷烃、环烯烃和环炔烃)、小分子或其任意组合。
31.根据权利要求20-30中任意一项所述的组合物，其中所述基于丝的材料包含添加剂。
32.根据权利要求31所述的组合物，其中所述添加剂选自下组：生物相容性聚合物；增塑剂(例如甘油)；刺激应答剂；有机或无机小分子；糖类；寡糖；多糖；生物大分子，例如肽、蛋白以及肽类似物和衍生物；拟肽；抗体及其抗原结合片段；核酸；核酸类似物和衍生物；糖原或其他糖；免疫原；抗原；由生物材料如细菌、植物、真菌或动物细胞制备的提取物；动物组织；天然存在的或合成的组合物；及其任意组合。
33.根据权利要求31或32所述的组合物，其中所述添加剂以选自下组的形式存在：颗粒、纤维、管、薄膜、凝胶、网状物、垫、无纺垫、粉末及其任意组合。
34.根据权利要求31-33中任意一项所述的组合物，其中所述添加剂包含丝材料，例如丝颗粒、丝纤维、微米尺寸的丝纤维、未经加工的丝纤维及其任意组合。
35.一种组合物，所述组合物包含权利要求1-19中任意一项所述的丝颗粒的集合。
36.根据权利要求35所述的组合物，其中所述组合物是乳剂、胶体、乳膏、凝胶、洗剂、糊剂、软膏、搽剂、香膏、液体、固体、薄膜、薄片、织物、网状物、海绵、气雾剂、粉末、支架或其任意组合。
37.根据权利要求35或36所述的组合物，其中将所述组合物制剂以供在药物产品中使用。
38.根据权利要求35或36所述的组合物，其中将所述组合物制剂以供在化妆品产品中使用。
39.根据权利要求35或36所述的组合物，其中将所述组合物制剂以供在个人护理产品中使用。
40.根据权利要求35或36所述的组合物，其中将所述组合物制剂以供在食品产品中使用。
41.一种贮存稳定的组合物，所述组合物包含根据权利要求1-19中任意一项所述的丝颗粒或者权利要求20-40中任意一项所述的组合物，其中存在于所述丝颗粒的第二不相混溶的相中的所述活性剂，或者存在于所述脂质成分中的疏水性或亲脂性分子在所述组合物(a)经过至少一个冻融循环，或者(b)在约为室温或高于室温的温度下保持至少约24小时，或者(c)经过(a)和(b)两者后保持其原始生物活性的至少约30％。
42.根据权利要求41所述的组合物，其中所述组合物保持在暴露于光照条件下。
43.根据权利要求41或42所述的组合物，其中所述组合物保持在相对湿度至少约10％的条件下。
44.根据权利要求41-43中任意一项所述的组合物，其中所述丝颗粒或所述组合物的基于丝的材料处于干燥状态。
45.一种生产丝颗粒的方法，所述方法包括：
a.提供分散在处于溶胶-凝胶转变的丝溶液(在这种情况下，所述丝溶液保持在可混合状态)中的非水性液滴的乳剂；和
b.将预先确定体积的所述乳剂与非水相接触，以使得所述丝溶液在所述非水相中形成在其中包封至少一个非水性液滴的丝颗粒。
46.根据权利要求45所述的方法，其中所述溶胶-凝胶转变持续约至少1小时，或者至少约2小时。
47.根据权利要求45或46所述的方法，其中所述丝溶液的溶胶-凝胶转变由超声诱导。
48.根据权利要求47所述的方法，其中所述超声以振幅约5％至约20％，或者约10％至约15％进行。
49.根据权利要求47或48所述的方法，其中所述超声持续时间为从约15秒至约60秒，或者从约30秒至约45秒。
50.根据权利要求45-49中任意一项所述的方法，其中所述丝溶液的浓度为约1％(w/v)至约15％(w/v)，或者约2％(w/v)至约7％(w/v)。
51.根据权利要求45-50中任意一项所述的方法，其中所述方法还包括将活性剂加入处于溶胶-凝胶转变的所述丝纤蛋白溶液中。
52.根据权利要求45-51中任意一项所述的方法，其中所述非水性液滴还包含疏水性或亲脂性分子。
53.根据权利要求52所述的方法，其中所述疏水性或亲脂性分子包含治疗剂、营养剂、化妆剂、染色剂、益生菌剂、染料、芳香族化合物、脂肪族化合物(例如烷烃、烯烃、炔烃、环烷烃、环烯烃和环炔烃)、小分子或其任意组合。
54.根据权利要求45-53中任意一项所述的方法，其中所述乳剂通过将非水性、不相混溶的相加入所述丝溶液中，从而形成分散于所述丝溶液中的所述非水性液滴而生产。
55.根据权利要求45-54中任意一项所述的方法，其中所述乳剂预先确定的体积基本上对应于所述丝颗粒所需的尺寸。
56.根据权利要求45-55中任意一项所述的方法，所述方法还包括从所述非水相中分离所述丝颗粒。
57.根据权利要求45-56中任意一项所述的方法，其中所述方法还包括对所述丝颗粒进行后处理。
58.根据权利要求57所述的方法，其中所述后处理还诱导在所述颗粒的丝纤蛋白中的构象改变。
59.根据权利要求58所述的方法，其中所述诱导构象改变包括冻干或冷冻干燥、水退火、水蒸气退火、醇浸没、超声、剪切应力、电凝胶化、pH降低、盐加入、空气干燥、电纺丝、延展中的一种或多种或其任意组合。
60.根据权利要求57-59中任意一项所述的方法，其中所述后处理包括将所述丝颗粒冷冻干燥。
61.一种方法，所述方法包括下述步骤：保持组合物，其中所述组合物包含包封于基于丝的材料中的至少一个脂质隔室和分散于所述至少一个脂质隔室中的至少一种活性剂，并且其中所述活性剂在所述组合物(a)经过至少一个冻融循环，或者(b)在约为室温或高于室温的温度下保持至少约24小时，或者(c)经过(a)和(b)两者后保持其原始生物活性的至少约30％。
62.根据权利要求61所述的方法，其中所述组合物保持至少约1个月。
63.一种方法，所述方法包括下述步骤：保持组合物，其中所述组合物包含包封于基于丝的材料中的至少一个脂质隔室和分散于所述至少一个脂质隔室中的至少一种活性剂，并且其中所述基于丝的材料对所述至少一种活性剂是可渗透的以使得所述活性剂通过所述基于丝的材料以预先确定的速率释放进入周围的环境中。
64.根据权利要求63所述的方法，其中通过调整所述基于丝的材料中丝纤蛋白β-片层构象的含量、所述基于丝的材料的孔隙度或其组合控制所述预先确定的速率。
65.根据权利要求63或64所述的方法，其中所述组合物保持在约为室温的条件下。
66.根据权利要求61-65中任意一项所述的方法，其中所述组合物是乳剂、胶体、乳膏、凝胶、洗剂、糊剂、软膏、搽剂、香膏、液体、固体、薄膜、薄片、织物、网状物、海绵、气雾剂、粉末或其任意组合。
67.根据权利要求61-66中任意一项所述的方法，其中所述组合物是冻干的。
68.根据权利要求61-67中任意一项所述的方法，其中所述组合物保持在约37℃或更高的温度下。
69.根据权利要求61-68中任意一项所述的方法，其中所述组合物保持在暴露于光照的条件下。
70.根据权利要求61-69中任意一项所述的方法，其中所述组合物保持在相对湿度至少约10％的条件下。
71.根据权利要求61-70中任意一项所述的方法，其中所述活性剂包含疏水性或亲脂性活性剂。
72.根据权利要求71所述的方法，其中所述疏水性或亲脂性分子包含治疗剂、营养剂、化妆剂、染色剂、益生菌剂、染料、芳香族化合物、脂肪族化合物(例如烷烃、烯烃、炔烃、环烷烃、环烯烃和环炔烃)或其任意组合。
73.根据权利要求61-72中任意一项所述的方法，其中所述基于丝的材料包含添加剂。
74.根据权利要求73所述的方法，其中所述添加剂选自下组：生物相容性聚合物；增塑剂(例如甘油)；刺激应答剂；有机或无机小分子；糖类；寡糖；多糖；生物大分子，例如肽、蛋白以及肽类似物和衍生物；拟肽；抗体及其抗原结合片段；核酸；核酸类似物和衍生物；糖原或其他糖；免疫原；抗原；由生物材料如细菌、植物、真菌或动物细胞制备的提取物；动物组织；天然存在的或合成的组合物；及其任意组合。
75.根据权利要求73或74所述的方法，其中所述添加剂以选自下组的形式存在：颗粒、纤维、管、薄膜、凝胶、网状物、垫、无纺垫、粉末及其任意组合。
76.根据权利要求73-75中任意一项所述的方法，其中所述添加剂包含丝材料，例如丝颗粒、丝纤维、微米尺寸的丝纤维、未经加工的丝纤维或其任意组合。
77.一种递送活性剂的方法，所述方法包括应用或给予对象组合物，所述组合物包含基于丝的材料，所述基于丝的材料包封在其中含有活性剂的至少一个脂质隔室，所述基于丝的材料对所述活性剂是可渗透的以使得在将所述组合物应用于或给予所述对象后所述活性剂通过所述基于丝的材料以预先确定的速率释放。
78.根据权利要求77所述的方法，其中所述活性剂被释放进入周围的环境中。
79.根据权利要求77或78所述的方法，其中所述活性剂被释放至所述对象的至少一个靶细胞。
80.根据权利要求77-79中任意一项所述的方法，其中所述活性剂包括疏水性或亲脂性活性剂。
81.根据权利要求80所述的方法，其中所述疏水性或亲脂性分子包含治疗剂、营养剂、化妆剂、染色剂、益生菌剂、染料、芳香族化合物、脂肪族化合物(例如烷烃、烯烃、炔烃、环烷烃、环烯烃和环炔烃)或其任意组合。
82.根据权利要求77-81中任意一项所述的方法，其中所述基于丝的材料包含添加剂。
83.根据权利要求77-82中任意一项所述的方法，其中所述组合物局部应用于或给予所述对象。
84.根据权利要求83所述的方法，其中所述组合物应用于所述对象的皮肤上。
85.根据权利要求77-82中任意一项所述的方法，其中所述组合物口服应用于或给予所述对象。
86.一种丝颗粒，所述丝颗粒包含至少两个不相混溶的相，第一不相混溶的相包含基于丝的材料并且第二不相混溶的相包含活性剂，其中所述第一不相混溶的相包封所述第二不相混溶的相并且所述第二不相混溶的相不包括脂质体。
87.根据权利要求86所述的丝颗粒，其中所述第二不相混溶的相包含脂质成分。
88.根据权利要求87所述的丝颗粒，其中所述脂质成分包含油。
89.根据权利要求86-88中任意一项所述的丝颗粒，其中所述第二不相混溶的相形成单一隔室。
90.根据权利要求86-89中任意一项所述的丝颗粒，其中所述第二不相混溶的相形成多个隔室。
91.根据权利要求89或90所述的丝颗粒，其中所述单一或多个隔室的尺寸范围为从约1μm至约1000μm，或者从约10μm至约500μm。
92.根据权利要求86-91中任意一项所述的丝颗粒，其中在所述第二不相混溶的相中存在的所述活性剂包含疏水性或亲脂性分子。
93.根据权利要求92所述的丝颗粒，其中所述疏水性或亲脂性分子包含治疗剂、营养剂、化妆剂、染色剂、益生菌剂、染料、芳香族化合物、脂肪族化合物(例如烷烃、烯烃、炔烃、环烷烃、环烯烃和环炔烃)或其任意组合。
94.根据权利要求86-93中任意一项所述的丝颗粒，其中所述基于丝的材料包含添加剂。
95.根据权利要求94所述的丝颗粒，其中所述添加剂包含生物聚合物、活性剂、等离子体颗粒、甘油及其任意组合。
96.根据权利要求86-95中任意一项所述的丝颗粒，其中所述第二不相混溶的相包封第三不相混溶的相。
97.根据权利要求86-96中任意一项所述的丝颗粒，其中所述基于丝的材料以水凝胶形式存在。
98.根据权利要求86-96中任意一项所述的丝颗粒，其中所述基于丝的材料以干燥状态或冻干形式存在。
99.根据权利要求98所述的丝颗粒，其中所述冻干的丝基质是多孔的。
100.根据权利要求86-99中任意一项所述的丝颗粒，其中在所述第一不相混溶的相中的所述基于丝的材料在水溶液中是可溶的。
101.根据权利要求86-99中任意一项所述的丝颗粒，其中将在所述基于丝的材料中β-片层的含量调整为足以使得所述基于丝的材料在水溶液中对抗溶解的量。
102.根据权利要求86-101中任意一项所述的丝颗粒，其中所述丝颗粒的尺寸范围为从约0.1mm至约10mm，或者从约0.5mm至约5mm。
103.一种组合物，所述组合物包含包封于基于丝的材料中的多个脂质隔室。
104.根据权利要求103所述的组合物，其中所述脂质隔室的尺寸范围为从约1μm至约1000μm，或者从约10μm至约500μm。
105.根据权利要求103或104所述的组合物，其中所述脂质隔室与所述基于丝的材料的体积比的范围为从约1:1至约1:1000、从约1:5至约1:500或者从约1:10至约1:100。
106.根据权利要求103-105中任意一项所述的组合物，其中所述基于丝的材料包含薄膜。
107.根据权利要求106所述的组合物，其中所述基于丝的材料包含光学图样。
108.根据权利要求107所述的组合物，其中所述光学图样包括提供了光学功能的全息图或图样阵列。
109.根据权利要求103-108中任意一项所述的组合物，其中所述基于丝的材料包含支架。
110.根据权利要求103-109中任意一项所述的组合物，其中所述脂质隔室还包含活性剂。
111.根据权利要求110所述的组合物，其中所述活性剂包含疏水性或亲脂性分子。
112.根据权利要求111所述的组合物，其中所述疏水性或亲脂性分子包含治疗剂、营养剂、化妆剂、染色剂、益生菌剂、染料、芳香族化合物、脂肪族化合物(例如烷烃、烯烃、炔烃、环烷烃、环烯烃和环炔烃)或其任意组合。
113.根据权利要求103-112中任意一项所述的组合物，其中所述基于丝的材料包含添加剂。
114.根据权利要求113所述的组合物，其中所述添加剂包含生物聚合物、活性剂、等离子体颗粒、甘油及其任意组合。
115.一种组合物，所述组合物包含权利要求86-102中任意一项所述的丝颗粒的集合。
116.根据权利要求115所述的组合物，其中所述组合物是乳剂、胶体、乳膏、凝胶、洗剂、糊剂、软膏、搽剂、香膏、液体、固体、薄膜、薄片、织物、网状物、海绵、气雾剂、粉末或其任意组合。
117.根据权利要求115或116所述的组合物，其中将所述组合物制剂以供在药物产品中使用。
118.根据权利要求115或116所述的组合物，其中将所述组合物制剂以供在化妆品产品中使用。
119.根据权利要求115或116所述的组合物，其中将所述组合物制剂以供在食品产品中使用。
120.一种贮存稳定的组合物，所述组合物包含权利要求86-102中任意一项所述的丝颗粒或者权利要求103-119中任意一项所述的组合物，其中存在于所述丝颗粒的第二不相混溶的相中的所述活性剂，或者存在于所述脂质成分中的疏水性或亲脂性分子在所述组合物(a)经过至少一个冻融循环，或者(b)在约为室温或高于室温的温度下保持至少约24小时，或者(c)经过(a)和(b)两者后保持其原始生物活性的至少约30％。
121.根据权利要求120所述的组合物，其中所述组合物保持在暴露于光照的条件下。
122.根据权利要求120或121所述的组合物，其中所述组合物保持在相对湿度至少约10％的条件下。
123.根据权利要求120-122中任意一项所述的组合物，其中所述交联的丝基质处于干燥状态。
124.一种生产丝颗粒的方法，所述方法包括：
a.提供或获得分散在处于溶胶-凝胶转变的丝溶液(在这种情况下，所述丝溶液保持在可混合状态)中的非水性液滴的乳剂；和
b.将预先确定体积的所述乳剂与非水相接触，以使得所述丝溶液包封至少一个非水性液滴和凝胶以形成分散于所述非水相中的丝颗粒。
125.根据权利要求124所述的方法，其中所述溶胶-凝胶转变持续约至少1小时，或者至少约2小时。
126.根据权利要求124或125所述的方法，其中所述丝溶液溶胶-凝胶转变由超声诱导。
127.根据权利要求126所述的方法，其中所述超声以振幅约5％至约20％，或者约10％至约15％进行。
128.根据权利要求126或127所述的方法，其中所述超声持续从约15秒至约60秒，或者从约30秒至约45秒。
129.根据权利要求124-128所述的方法，其中所述丝溶液的浓度为约1％(w/v)至约15％(w/v)，或者约2％(w/v)至约7％(w/v)。
130.根据权利要求124-129中任意一项所述的方法，其所述方法还包括将活性剂加入处于溶胶-凝胶转变的所述丝纤蛋白溶液中。
131.根据权利要求124-130中任意一项所述的方法，其中所述非水性液滴还包含疏水性或亲脂性分子。
132.根据权利要求131所述的方法，其中所述疏水性或亲脂性分子包含治疗剂、营养剂、化妆剂、染色剂、益生菌剂、染料、芳香族化合物、脂肪族化合物(例如烷烃、烯烃、炔烃、环烷烃、环烯烃和环炔烃)或其任意组合。
133.根据权利要求123-132中任意一项所述的方法，其中所述乳剂通过将非水性、不相混溶的相加入所述丝溶液中，从而形成分散于所述丝溶液中的所述非水性液滴而生产。
134.根据权利要求124-133中任意一项所述的方法，其中所述乳剂预先确定的体积对应于所述丝颗粒所需的尺寸。
135.根据权利要求124-134中任意一项所述的方法，所述方法还包括从所述非水相中分离所述丝颗粒。
136.根据权利要求124-135中任意一项所述的方法，所述方法还包括将所述丝颗粒冷冻干燥。
137.一种方法，所述方法包括下述步骤：保持组合物，其中所述组合物包含包封于基于丝的材料中的至少一个脂质隔室和分布于所述至少一个脂质隔室中的至少一种活性剂，并且其中所述活性剂在所述组合物(a)经过至少一个冻融循环，或者(b)在约为室温或高于室温的温度下保持至少约24小时，或者(c)经过(a)和(b)两者后保持其原始生物活性的至少约30％。
138.根据权利要求137所述的方法，其中所述组合物保持至少约1个月。
139.一种方法，所述方法包括下述步骤：保持组合物，其中所述组合物包含包封于基于丝的材料中的至少一个脂质隔室和分布于所述至少一个脂质隔室中的至少一种活性剂，并且其中所述基于丝的材料对所述至少一种活性剂是可渗透的以使得所述活性剂通过所述基于丝的材料以预先确定的速率释放进入周围的环境中。
140.根据权利要求139所述的方法，其中通过调整所述基于丝的材料中丝纤蛋白β-片层构象的含量、所述基于丝的材料的孔隙度或其组合控制所述预先确定的速率。
141.根据权利要求139或140所述的方法，其中所述组合物保持在约为室温的条件下。
142.根据权利要求137-141中任意一项所述的方法，其中所述组合物是乳剂、胶体、乳膏、凝胶、洗剂、糊剂、软膏、搽剂、香膏、液体、固体、薄膜、薄片、织物、网状物、海绵、气雾剂、粉末或其任意组合。
143.根据权利要求137-142中任意一项所述的方法，其中所述组合物是冻干的。
144.根据权利要求137-143中任意一项所述的方法，其中所述组合物保持在约37℃或更高的温度下。
145.根据权利要求137-144中任意一项所述的方法，其中所述组合物保持在暴露于光照条件下。
146.根据权利要求137-145中任意一项所述的方法，其中所述组合物保持在相对湿度至少约10％的条件下。
147.根据权利要求137-146中任意一项所述的方法，其中所述活性剂包括疏水性或亲脂性活性剂。
148.根据权利要求147所述的方法，其中所述疏水性或亲脂性分子包含治疗剂、营养剂、化妆剂、染色剂、益生菌剂、染料、芳香族化合物、脂肪族化合物(例如烷烃、烯烃、炔烃、环烷烃、环烯烃和环炔烃)或其任意组合。
149.根据权利要求137-148中任意一项所述的方法，其中所述基于丝的材料包含添加剂。
150.根据权利要求149所述的方法，其中所述添加剂包含生物聚合物、活性剂、等离子体颗粒、甘油及其任意组合。
151.一种递送活性剂的方法，所述方法包括应用或给予对象组合物，所述组合物包含基于丝的材料，所述基于丝的材料包封在其中含有活性剂的至少一个脂质隔室，所述基于丝的材料对所述活性剂是可渗透的以使得在将所述组合物应用于或给予所述对象后所述活性剂通过所述基于丝的材料以预先确定的速率释放。
152.根据权利要求151所述的方法，其中所述活性剂被释放进入周围的环境中。
153.根据权利要求151或152所述的方法，其中所述活性剂被释放至所述对象的至少一个靶细胞。
154.根据权利要求151-153中任意一项所述的方法，其中所述活性剂包含疏水性或亲脂性活性剂。
155.根据权利要求154所述的方法，其中所述疏水性或亲脂性分子包含治疗剂、营养剂、化妆剂、染色剂、益生菌剂、染料、芳香族化合物、脂肪族化合物(例如烷烃、烯烃、炔烃、环烷烃、环烯烃和环炔烃)或其任意组合。
156.根据权利要求151-155中任意一项所述的方法，其中所述基于丝的材料包含添加剂。
157.根据权利要求156所述的方法，其中所述添加剂包含生物聚合物、活性剂、等离子体颗粒、甘油及其任意组合。
158.根据权利要求151-157中任意一项所述的方法，其中所述组合物局部或口服应用于或给予所述对象。
159.根据权利要求151-158中任意一项所述的方法，其中所述组合物应用于所述对象的皮肤上。
CN201380047460.3A 2012-07-13 2013-07-15 在丝纤蛋白生物材料中对不相混溶的相的包封 Pending CN104684540A (zh)

Applications Claiming Priority (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201261671336P 2012-07-13 2012-07-13
US61/671,336 2012-07-13
US201361791185P 2013-03-15 2013-03-15
US61/791,185 2013-03-15
PCT/US2013/050529 WO2014012105A1 (en) 2012-07-13 2013-07-15 Encapsulation of immiscible phases in silk fibroin biomaterials

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN104684540A true CN104684540A (zh) 2015-06-03

Family

ID=49916590

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201380047460.3A Pending CN104684540A (zh) 2012-07-13 2013-07-15 在丝纤蛋白生物材料中对不相混溶的相的包封

Country Status (7)

Country Link
US (1) US20150202304A1 (zh)
EP (1) EP2872115A4 (zh)
JP (2) JP2015530361A (zh)
CN (1) CN104684540A (zh)
BR (1) BR112015000739A2 (zh)
MX (1) MX2015000554A (zh)
WO (1) WO2014012105A1 (zh)

Cited By (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108192731A (zh) * 2018-03-26 2018-06-22 上海应用技术大学 一种甜橙香精-丝素蛋白微胶囊及制备方法
CN108479650A (zh) * 2018-03-26 2018-09-04 上海应用技术大学 一种桂花香精-丝素蛋白微胶囊及制备方法
CN108699260A (zh) * 2016-01-29 2018-10-23 国立研究开发法人理化学研究所 成形体及其制造方法、以及使成形体的结晶度提高的方法
CN108778354A (zh) * 2016-04-13 2018-11-09 印度医学研究理事会 用于骨-软组织固定应用的纳米工程化的生物可吸收聚合物复合材料
CN109891009A (zh) * 2016-06-23 2019-06-14 香港大学 用于制造微纤维、线和丝的腔-微纤维、方法和装置
CN110662531A (zh) * 2017-05-26 2020-01-07 达科他生物技术有限责任公司 用于益生菌受控输送的稳定组合物及其生产方法
CN113493936A (zh) * 2020-03-19 2021-10-12 立肯诺(上海)新材料科技有限公司 一种含珍珠中药的防红疹再生纤维素纤维及其制备方法
CN115243568A (zh) * 2019-09-12 2022-10-25 努利希尔有限公司 受控释放的核-壳粒子及包含其的悬浮液
US11964049B2 (en) 2022-03-18 2024-04-23 Nulixir Inc. Water soluble compositions and methods of making the same

Families Citing this family (20)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2513838C1 (ru) * 2013-02-21 2014-04-20 Общество с ограниченной ответственностью "ДЖИ-Групп" Гистоэквивалент-биопластический материал
US11802270B2 (en) 2014-08-07 2023-10-31 Tufts University Microphysiologic methods and compositions
GB201415681D0 (en) * 2014-09-04 2014-10-22 Cambridge Entpr Ltd And President And Fellows Of Harvard College Protien Capsules
GB201415679D0 (en) * 2014-09-04 2014-10-22 Cambridge Entpr Ltd And University Of Sheffield The Silk Protien Structures
KR20170099920A (ko) 2014-12-02 2017-09-01 실크 테라퓨틱스, 인코퍼레이티드 실크 성능 의류와 제품들 및 이의 제조 방법
CN104984359A (zh) * 2015-05-28 2015-10-21 杭州优玛达生物科技有限公司 生物膜、具有生物膜性的闭合结构或细胞区室作为疫苗载体或免疫调节剂的应用
BR112018000699B1 (pt) 2015-07-14 2023-10-17 Silk Therapeutics, Inc Artigo e método para revestir um material
EP3144058A1 (en) * 2015-09-16 2017-03-22 Calyxia Method for preparing microcapsules by double emulsion
JP6959482B2 (ja) * 2016-01-29 2021-11-02 国立研究開発法人理化学研究所 成形体及びその製造方法、並びに成形体のタフネスを向上させる方法
EP3442503B1 (en) * 2016-04-12 2023-03-15 Capsular Technologies Pty Ltd. Injectable composition for delivery of a biologically active agent
US11331019B2 (en) 2017-08-07 2022-05-17 The Research Foundation For The State University Of New York Nanoparticle sensor having a nanofibrous membrane scaffold
CN111712514A (zh) 2017-09-27 2020-09-25 自然进化公司 丝涂布织物和产品及其制备方法
US11419947B2 (en) 2017-10-30 2022-08-23 Massachusetts Institute Of Technology Layer-by-layer nanoparticles for cytokine therapy in cancer treatment
TWI691531B (zh) * 2019-02-11 2020-04-21 南臺學校財團法人南臺科技大學 蠶絲蛋白膜的製造方法
WO2022220827A1 (en) * 2021-04-14 2022-10-20 Cambridge Crops, Inc. Silk packaging applications
WO2023097310A1 (en) * 2021-11-29 2023-06-01 Massachusetts Institute Of Technology Tunable structure of biodegradable silk-based microcapsules for soluble and insoluble payload delivery
CN114099646B (zh) * 2021-12-01 2024-02-06 江苏奥普莱医疗用品有限公司 一种可重复使用的具有缓释胶原蛋白的脂质体混悬液及其制备方法
CN114351449B (zh) * 2022-01-25 2023-09-15 江苏丰裕纺织科技有限公司 一种防霉布料及其制备方法
WO2023170158A1 (en) 2022-03-08 2023-09-14 Xampla Limited Biodegradable microcapsules and method for their preparation
CN114656680B (zh) * 2022-03-31 2023-03-21 安徽工程大学 一种超弹性丝素蛋白微-纳米杂化纤维气凝胶及其制备方法与应用

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101309676A (zh) * 2005-08-01 2008-11-19 慕尼黑技术大学 生产蜘蛛丝蛋白的纳米胶囊和微胶囊的方法
US20100028451A1 (en) * 2006-09-26 2010-02-04 Trustees Of Tufts College Silk microspheres for encapsulation and controlled release

Family Cites Families (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB9606188D0 (en) * 1996-03-23 1996-05-29 Danbiosyst Uk Pollysaccharide microspheres for the pulmonary delivery of drugs
US20050147690A1 (en) * 1998-09-25 2005-07-07 Masters David B. Biocompatible protein particles, particle devices and methods thereof
FR2808703B1 (fr) * 2000-05-09 2002-08-02 Centre Nat Rech Scient Procede de preparation d'une emulsion double monodisperse
EP1275370A1 (en) * 2001-07-13 2003-01-15 Johnson and Johnson GmbH Products comprising a sheet and a lipid and aqueous phase
US20080292693A1 (en) * 2007-05-21 2008-11-27 Sones Scott F Composition and method for treating digestive system disorders
CN101772348B (zh) * 2007-05-29 2014-07-16 塔夫茨大学信托人 利用超声处理使丝纤蛋白凝胶化的方法
CA2774643A1 (en) * 2009-09-29 2011-04-07 Trustees Of Tufts College Silk nanospheres and microspheres and methods of making same
WO2014093270A1 (en) * 2012-12-10 2014-06-19 Virginia Commonwealth University Tropism modified cancer terminator virus (ad.5/3 ctv;ad.5/3-ctv-m7)

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101309676A (zh) * 2005-08-01 2008-11-19 慕尼黑技术大学 生产蜘蛛丝蛋白的纳米胶囊和微胶囊的方法
US20100028451A1 (en) * 2006-09-26 2010-02-04 Trustees Of Tufts College Silk microspheres for encapsulation and controlled release

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
BINGCAN CHEN，等: "Improvement of physicochemical stabilities of emulsions containing oil droplets coated by non-globular protein–beet pectin complex membranes", 《FOOD RESEARCH INTERNATIONAL》 *

Cited By (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108699260A (zh) * 2016-01-29 2018-10-23 国立研究开发法人理化学研究所 成形体及其制造方法、以及使成形体的结晶度提高的方法
CN108778354A (zh) * 2016-04-13 2018-11-09 印度医学研究理事会 用于骨-软组织固定应用的纳米工程化的生物可吸收聚合物复合材料
CN109891009A (zh) * 2016-06-23 2019-06-14 香港大学 用于制造微纤维、线和丝的腔-微纤维、方法和装置
CN110662531A (zh) * 2017-05-26 2020-01-07 达科他生物技术有限责任公司 用于益生菌受控输送的稳定组合物及其生产方法
CN108479650B (zh) * 2018-03-26 2021-02-23 上海应用技术大学 一种桂花香精-丝素蛋白微胶囊及制备方法
CN108479650A (zh) * 2018-03-26 2018-09-04 上海应用技术大学 一种桂花香精-丝素蛋白微胶囊及制备方法
CN108192731A (zh) * 2018-03-26 2018-06-22 上海应用技术大学 一种甜橙香精-丝素蛋白微胶囊及制备方法
CN108192731B (zh) * 2018-03-26 2021-06-11 上海应用技术大学 一种甜橙香精-丝素蛋白微胶囊及制备方法
CN115243568A (zh) * 2019-09-12 2022-10-25 努利希尔有限公司 受控释放的核-壳粒子及包含其的悬浮液
CN115243568B (zh) * 2019-09-12 2023-10-17 努利希尔有限公司 受控释放的核-壳粒子及包含其的悬浮液
US11793753B2 (en) 2019-09-12 2023-10-24 Nulixir Inc. Methods and systems for forming layered solid particles
CN113493936A (zh) * 2020-03-19 2021-10-12 立肯诺(上海)新材料科技有限公司 一种含珍珠中药的防红疹再生纤维素纤维及其制备方法
US11964049B2 (en) 2022-03-18 2024-04-23 Nulixir Inc. Water soluble compositions and methods of making the same

Also Published As

Publication number Publication date
WO2014012105A1 (en) 2014-01-16
EP2872115A4 (en) 2016-04-06
US20150202304A1 (en) 2015-07-23
BR112015000739A2 (pt) 2017-06-27
MX2015000554A (es) 2015-09-28
JP2018184474A (ja) 2018-11-22
JP2015530361A (ja) 2015-10-15
EP2872115A1 (en) 2015-05-20

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN104684540A (zh) 在丝纤蛋白生物材料中对不相混溶的相的包封
CN104822366B (zh) 在丝纤蛋白生物材料中香料和/或调味剂的包封
AU2020203213B2 (en) Pharmaceutical nanoparticles showing improved mucosal transport
Desai et al. Chitosan: A potential biopolymer in drug delivery and biomedical applications
US10688026B2 (en) Buffered microencapsulated compositions and methods
CN101917979B (zh) 包含外壁壳的制剂
WO2019236525A1 (en) Silk-based product formulations and methods of use
US20150079012A1 (en) Silk fibroin-based personal care compositions
CN104870179A (zh) 缓冲微囊组合物及方法
N Mengatto et al. Recent advances in chitosan films for controlled release of drugs
CN103607998A (zh) 壳多糖和活性成分复合物的制备方法及由此获得的复合物
Gad et al. Doxycycline hydrochloride-metronidazole solid lipid microparticles gels for treatment of periodontitis: Development, in-vitro and in-vivo clinical evaluation
KR20140000784A (ko) 피부흡수 촉진용 양친매성 트리블록 공중합체, 이의 제조방법 및 이를 함유하는 화장료 조성물
Al-Hatamleh et al. Applications of alginate-based nanomaterials in enhancing the therapeutic effects of bee products
CN103751148A (zh) 一种以双亲性聚氨酯为载体的具有靶向和缓释作用的抗肿瘤药物纳米微球及其制备方法
CN105163739A (zh) 组合物及饮食
AU2019236137A1 (en) Buffered microencapsulated compositions and methods
KR20190060516A (ko) 마이크로 니들 및 이의 제조 방법
CN108912349A (zh) 聚乳酸微球及其制备方法与在药物缓释中的应用
Sahu et al. Utility of nanomaterials in wound management
CN105131302B (zh) 一种时间与温度双重敏感的可降解聚合物水凝胶及其制备方法
KR101771483B1 (ko) 루테인의 용출률 및 안정성이 개선된 이중층 구조의 고분자 캡슐, 이의 제조방법 및 이를 함유하는 안과질환 예방 또는 치료용 약제학적 조성물
Abdullayev Medical and health applications of halloysite nanotubes
Kanchana Formulation, Characterization and Evaluation of Nystatin Nanosponge GEL For the Treatment of Candidiasis
Léber Formulation and investigation of innovative drug delivery systems for the treatment of periodontitis

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
EXSB Decision made by sipo to initiate substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
RJ01 Rejection of invention patent application after publication

Application publication date: 20150603

RJ01 Rejection of invention patent application after publication