JP2020125429A - タンパク質成形体の製造方法、タンパク質成形体の物性をコントロールする方法、及びタンパク質成形体の品質を評価する方法 - Google Patents
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Abstract
【課題】所望の物性のタンパク質成形体を簡便に製造できるタンパク質成形体の製造方法を提供すること。【解決手段】タンパク質を含むタンパク質成形体の製造方法であって、前記タンパク質を含む成形体前駆体のレクトアングラー型パッキング構造及びスタッガード型パッキング構造の合計含有量に対するスタッガード型パッキング構造の含有量の比を調整する調整工程を備える、タンパク質成形体の製造方法。【選択図】なし
Description
本発明は、タンパク質成形体の製造方法、タンパク質成形体の物性をコントロールする方法、及びタンパク質成形体の品質を評価する方法に関する。
近年、生分解性を有するタンパク質の素材化が、環境保全意識の高まり応じて盛んに研究されるようになってきている。例えば、非特許文献1には、シルク粉末又は羊毛粉末を加熱圧縮し樹脂化することでバイオプラスチックを得る方法が報告されている。特許文献1には、ポリペプチドを主成分として含み、応力及びタフネスが所定の範囲内である人造ポリペプチド繊維が開示されている。特許文献2には、天然クモ糸タンパク質、又は天然クモ糸タンパク質に由来するポリペプチドを含む組成物のモールド成形体が開示されている。
平井伸治、月刊機能材料誌、2014年6月、「廃棄物由来動物タンパク質を用いた環境調和型シルクおよび羊毛樹脂」
タンパク質成形体は、合成繊維、合成樹脂等の石油系材料からなる成形体とは異なって、生産及び加工に際して必要なエネルギーが小さいこと等から益々の需要が見込まれている。しかしながら、タンパク質成形体は、合成繊維、合成樹脂等のように物性(例えば、引張強度、曲げ強度、硬度等)をコントロールする手段についての知見が乏しく、それ故に、所望の物性を実現することが容易ではなかった。
本発明は、所望の物性のタンパク質成形体を簡便に製造できるタンパク質成形体の製造方法、タンパク質成形体の物性を制御する方法、及びタンパク質成形体の品質を評価する方法を提供することを目的とする。
本発明は以下の各発明に関する。
[1]
タンパク質を含むタンパク質成形体の製造方法であって、タンパク質を含む成形体前駆体のβシート構造におけるレクトアングラー型パッキング構造及びスタッガード型パッキング構造の合計含有量に対するスタッガード型パッキング構造の含有量の比を調整する調整工程を備える、タンパク質成形体の製造方法。
[2]
成形体前駆体が、繊維状であり、調整工程が、成形体前駆体の加熱及び/又は水との接触により行われる、[1]に記載のタンパク質成形体の製造方法。
[3]
成形体前駆体が、粉末状であり、調整工程が、成形体前駆体の加熱及び/又は加圧により行われる、[1]又は[2]に記載のタンパク質成形体の製造方法。
[4]
調整工程が、成形体前駆体を圧延して、式A:{(圧延前の成形体前駆体の厚さ−圧延後の成形体前駆体の厚さ)/圧延前の成形体前駆体の厚さ}で表される圧下率を調整することにより行われる、[1]〜[3]のいずれかに記載のタンパク質成形体の製造方法。
[5]
タンパク質を含むタンパク質成形体の製造方法であって、タンパク質成形体中のβシート構造におけるレクトアングラー型パッキング構造及びスタッガード型パッキング構造の合計含有量に対するスタッガード型パッキング構造の含有量の比を評価する評価工程を備える、タンパク質成形体の製造方法。
[6]
タンパク質成形体中のβシート構造におけるレクトアングラー型パッキング構造及びスタッガード型パッキング構造を構成するβシート構造が、逆平行βシート構造である、[1]〜[5]のいずれかに記載のタンパク質成形体の製造方法。
[7]
タンパク質成形体中のβシート構造におけるレクトアングラー型パッキング構造及びスタッガード型パッキング構造が、複数のアラニン残基からなるポリペプチド鎖により形成されている、[1]〜[6]のいずれかに記載のタンパク質成形体の製造方法。
[8]
レクトアングラー型パッキング構造及びスタッガード型パッキング構造の合計含有量に対するスタッガード型パッキング構造の含有量の比が、13C固体NMRスペクトルにおけるアラニン残基側鎖炭素原子のシグナル面積に基づいて決定される、[1]〜[7]のいずれかに記載のタンパク質成形体の製造方法。
[9]
タンパク質が、構造タンパク質である、[1]〜[8]のいずれかに記載のタンパク質成形体の製造方法。
[10]
構造タンパク質が、改変フィブロインである、[9]に記載のタンパク質成形体の製造方法。
[11]
タンパク質成形体の物性をコントロールする方法であって、タンパク質を含む成形体前駆体から、タンパク質成形体を製造する際に、成形体前駆体のβシート構造におけるレクトアングラー型パッキング構造及びスタッガード型パッキング構造の合計含有量に対するスタッガード型パッキング構造の含有量の比を調整する調整工程を備える、方法。
[12]
タンパク質成形体中のレクトアングラー型パッキング構造及びスタッガード型パッキング構造を構成するβシート構造が、逆平行βシート構造である、[11]に記載の方法。
[13]
タンパク質成形体中のβシート構造におけるレクトアングラー型パッキング構造及びスタッガード型パッキング構造が、複数のアラニン残基からなるポリペプチド鎖により形成されている、[11]又は[12]に記載の方法。
[14]
物性が、曲げ弾性率である、[11]〜[13]のいずれかに記載の方法。
[15]
タンパク質を含むタンパク質成形体の品質を評価する方法であって、13C固体NMRスペクトルにおいて、ケミカルシフト20.5±0.5ppmにピークを有する第1のシグナルの面積と、ケミカルシフト19.5±0.5ppm及び22.7±0.5ppmにピークを有する第2のシグナルの面積を測定し、式B:第2のシグナルの面積/(第1のシグナルの面積+第2のシグナルの面積)で表されるシグナル面積比を算出する工程を備える、方法。
[1]
タンパク質を含むタンパク質成形体の製造方法であって、タンパク質を含む成形体前駆体のβシート構造におけるレクトアングラー型パッキング構造及びスタッガード型パッキング構造の合計含有量に対するスタッガード型パッキング構造の含有量の比を調整する調整工程を備える、タンパク質成形体の製造方法。
[2]
成形体前駆体が、繊維状であり、調整工程が、成形体前駆体の加熱及び/又は水との接触により行われる、[1]に記載のタンパク質成形体の製造方法。
[3]
成形体前駆体が、粉末状であり、調整工程が、成形体前駆体の加熱及び/又は加圧により行われる、[1]又は[2]に記載のタンパク質成形体の製造方法。
[4]
調整工程が、成形体前駆体を圧延して、式A:{(圧延前の成形体前駆体の厚さ−圧延後の成形体前駆体の厚さ)/圧延前の成形体前駆体の厚さ}で表される圧下率を調整することにより行われる、[1]〜[3]のいずれかに記載のタンパク質成形体の製造方法。
[5]
タンパク質を含むタンパク質成形体の製造方法であって、タンパク質成形体中のβシート構造におけるレクトアングラー型パッキング構造及びスタッガード型パッキング構造の合計含有量に対するスタッガード型パッキング構造の含有量の比を評価する評価工程を備える、タンパク質成形体の製造方法。
[6]
タンパク質成形体中のβシート構造におけるレクトアングラー型パッキング構造及びスタッガード型パッキング構造を構成するβシート構造が、逆平行βシート構造である、[1]〜[5]のいずれかに記載のタンパク質成形体の製造方法。
[7]
タンパク質成形体中のβシート構造におけるレクトアングラー型パッキング構造及びスタッガード型パッキング構造が、複数のアラニン残基からなるポリペプチド鎖により形成されている、[1]〜[6]のいずれかに記載のタンパク質成形体の製造方法。
[8]
レクトアングラー型パッキング構造及びスタッガード型パッキング構造の合計含有量に対するスタッガード型パッキング構造の含有量の比が、13C固体NMRスペクトルにおけるアラニン残基側鎖炭素原子のシグナル面積に基づいて決定される、[1]〜[7]のいずれかに記載のタンパク質成形体の製造方法。
[9]
タンパク質が、構造タンパク質である、[1]〜[8]のいずれかに記載のタンパク質成形体の製造方法。
[10]
構造タンパク質が、改変フィブロインである、[9]に記載のタンパク質成形体の製造方法。
[11]
タンパク質成形体の物性をコントロールする方法であって、タンパク質を含む成形体前駆体から、タンパク質成形体を製造する際に、成形体前駆体のβシート構造におけるレクトアングラー型パッキング構造及びスタッガード型パッキング構造の合計含有量に対するスタッガード型パッキング構造の含有量の比を調整する調整工程を備える、方法。
[12]
タンパク質成形体中のレクトアングラー型パッキング構造及びスタッガード型パッキング構造を構成するβシート構造が、逆平行βシート構造である、[11]に記載の方法。
[13]
タンパク質成形体中のβシート構造におけるレクトアングラー型パッキング構造及びスタッガード型パッキング構造が、複数のアラニン残基からなるポリペプチド鎖により形成されている、[11]又は[12]に記載の方法。
[14]
物性が、曲げ弾性率である、[11]〜[13]のいずれかに記載の方法。
[15]
タンパク質を含むタンパク質成形体の品質を評価する方法であって、13C固体NMRスペクトルにおいて、ケミカルシフト20.5±0.5ppmにピークを有する第1のシグナルの面積と、ケミカルシフト19.5±0.5ppm及び22.7±0.5ppmにピークを有する第2のシグナルの面積を測定し、式B:第2のシグナルの面積/(第1のシグナルの面積+第2のシグナルの面積)で表されるシグナル面積比を算出する工程を備える、方法。
本発明によれば、所望の物性のタンパク質成形体を簡便に製造できるタンパク質成形体の製造方法、タンパク質成形体の物性を制御する方法、及びタンパク質成形体の品質を評価する方法を提供することができる。
以下、本発明の実施形態について詳細に説明する。ただし、本発明は以下の実施形態に限定されるものではない。
〔タンパク質成形体の製造方法〕
本実施形態に係るタンパク質成形体の製造方法は、タンパク質を含む成形体前駆体中に含まれるβシート構造において、レクトアングラー型パッキング構造及びスタッガード型パッキング構造の合計含有量に対するスタッガード型パッキング構造の含有量の比を調整する調整工程を備える。
本実施形態に係るタンパク質成形体の製造方法は、タンパク質を含む成形体前駆体中に含まれるβシート構造において、レクトアングラー型パッキング構造及びスタッガード型パッキング構造の合計含有量に対するスタッガード型パッキング構造の含有量の比を調整する調整工程を備える。
以下、レクトアングラー型パッキング構造の含有量を「C1」、スタッガード型パッキング構造の含有量を「C2」、レクトアングラー型パッキング構造及びスタッガード型パッキング構造の合計含有量に対するスタッガード型パッキング構造の含有量の比を、「C2/(C1+C2)」とも称する。
(タンパク質)
タンパク質は、レクトアングラー型パッキング構造及びスタッガード型パッキング構造が形成され得るタンパク質であれば特に制限されない。タンパク質としては、天然のタンパク質と組換えタンパク質(人造タンパク質)を挙げることができる。また、組換えタンパク質としては、工業規模での製造が可能な任意のタンパク質を挙げることができ、例えば、工業用に利用できるタンパク質、医療用に利用できるタンパク質、構造タンパク質等を挙げることができる。工業用又は医療用に利用できるタンパク質の具体例としては、酵素、制御タンパク質、受容体、ペプチドホルモン、サイトカイン、膜又は輸送タンパク質、予防接種に使用する抗原、ワクチン、抗原結合タンパク質、免疫刺激タンパク質、アレルゲン、完全長抗体又は抗体フラグメント若しくは誘導体を挙げることができる。構造タンパク質の具体例としては、スパイダーシルク(クモ糸)、カイコシルク、ケラチン、コラ−ゲン、エラスチン及びレシリン、並びにこれら由来のタンパク質等を挙げることができる。また、構造タンパク質は、例えば、後述する改変フィブロインであってよく、改変クモ糸フィブロインが好ましい。
タンパク質は、レクトアングラー型パッキング構造及びスタッガード型パッキング構造が形成され得るタンパク質であれば特に制限されない。タンパク質としては、天然のタンパク質と組換えタンパク質(人造タンパク質)を挙げることができる。また、組換えタンパク質としては、工業規模での製造が可能な任意のタンパク質を挙げることができ、例えば、工業用に利用できるタンパク質、医療用に利用できるタンパク質、構造タンパク質等を挙げることができる。工業用又は医療用に利用できるタンパク質の具体例としては、酵素、制御タンパク質、受容体、ペプチドホルモン、サイトカイン、膜又は輸送タンパク質、予防接種に使用する抗原、ワクチン、抗原結合タンパク質、免疫刺激タンパク質、アレルゲン、完全長抗体又は抗体フラグメント若しくは誘導体を挙げることができる。構造タンパク質の具体例としては、スパイダーシルク(クモ糸)、カイコシルク、ケラチン、コラ−ゲン、エラスチン及びレシリン、並びにこれら由来のタンパク質等を挙げることができる。また、構造タンパク質は、例えば、後述する改変フィブロインであってよく、改変クモ糸フィブロインが好ましい。
フィブロイン様タンパク質であるスパイダーシルクあるいはカイコシルク由来のタンパク質として、例えば、式1:[(A)nモチーフ−REP1]m、又は式2:[(A)nモチーフ−REP1]m−(A)nモチーフで表されるドメイン配列を含むタンパク質が挙げられる。フィブロインは、ドメイン配列のN末端側及びC末端側のいずれか一方又は両方に更にアミノ酸配列(N末端配列及びC末端配列)が付加されていてもよい。N末端配列及びC末端配列は、これに限定されるものではないが、典型的には、フィブロインに特徴的なアミノ酸モチーフの反復を有さない領域であり、100残基程度のアミノ酸からなる。
本明細書において「改変フィブロイン」とは、人為的に製造されたフィブロイン(人造フィブロイン)を意味する。改変フィブロインは、そのドメイン配列が、天然由来のフィブロインのアミノ酸配列とは異なるフィブロインであってもよく、天然由来のフィブロインのアミノ酸配列と同一であるフィブロインであってもよい。本明細書でいう「天然由来のフィブロイン1」もまた、式1:[(A)nモチーフ−REP1]m、又は式2:[(A)nモチーフ−REP1]−(A)nモチーフで表されるドメイン配列を含むタンパク質である。
「改変フィブロイン」は、天然由来のフィブロインのアミノ酸配列をそのまま利用したものであってもよく、天然由来のフィブロインのアミノ酸配列に依拠してそのアミノ酸配列を改変したもの(例えば、クローニングした天然由来のフィブロインの遺伝子配列を改変することによりアミノ酸配列を改変したもの)であってもよく、また天然由来のフィブロインに依らず人工的に設計及び合成したもの(例えば、設計したアミノ酸配列をコードする核酸を化学合成することにより所望のアミノ酸配列を有するもの)であってもよい。
本明細書において「ドメイン配列」とは、フィブロイン特有の結晶領域(典型的には、アミノ酸配列の(A)nモチーフに相当する。)と非晶領域(典型的には、アミノ酸配列のREPに相当する。)を生じるアミノ酸配列であり、式1:[(A)nモチーフ−REP1]m、又は式2:[(A)nモチーフ−REP1]m−(A)nモチーフで表されるアミノ酸配列を意味する。ここで、(A)nモチーフは、アラニン残基を主とするアミノ酸配列を示し、アミノ酸残基数は2〜27である。(A)nモチーフのアミノ酸残基数は、2〜20、4〜27、4〜20、8〜20、10〜20、4〜16、8〜16、又は10〜16の整数であってよい。また、(A)nモチーフ中の全アミノ酸残基数に対するアラニン残基数の割合は40%以上であればよく、60%以上、70%以上、80%以上、83%以上、85%以上、86%以上、90%以上、95%以上、又は100%(アラニン残基のみで構成されることを意味する。)であってもよい。ドメイン配列中に複数存在する(A)nモチーフは、少なくとも7つがアラニン残基のみで構成されてもよい。REPは2〜200アミノ酸残基から構成されるアミノ酸配列を示す。REPは、10〜200アミノ酸残基から構成されるアミノ酸配列であってもよい。mは2〜300の整数を示し、10〜300の整数であってもよい。複数存在する(A)nモチーフは、互いに同一のアミノ酸配列でもよく、異なるアミノ酸配列でもよい。複数存在するREPは、互いに同一のアミノ酸配列でもよく、異なるアミノ酸配列でもよい。
改変フィブロインの具体的な例として、クモの大瓶状腺で産生される大吐糸管しおり糸タンパク質に由来する改変フィブロイン(第1の改変フィブロイン)、グリシン残基の含有量が低減されたドメイン配列を有する改変フィブロイン(第2の改変フィブロイン)、(A)nモチーフの含有量が低減されたドメイン配列を有する改変フィブロイン(第3の改変フィブロイン)、グリシン残基の含有量、及び(A)nモチーフの含有量が低減された改変フィブロイン(第4の改変フィブロイン)、局所的に疎水性指標の大きい領域を含むドメイン配列を有する改変フィブロイン(第5の改変フィブロイン)、並びにグルタミン残基の含有量が低減されたドメイン配列を有する改変フィブロイン(第6の改変フィブロイン)が挙げられる。
第1の改変フィブロインとしては、式1:[(A)nモチーフ−REP]mで表されるドメイン配列を含むタンパク質が挙げられる。第1の改変フィブロインにおいて、(A)nモチーフのアミノ酸残基数は、3〜20の整数が好ましく、4〜20の整数がより好ましく、8〜20の整数が更に好ましく、10〜20の整数が更により好ましく、4〜16の整数が更によりまた好ましく、8〜16の整数が特に好ましく、10〜16の整数が最も好ましい。第1の改変フィブロインは、式1中、REPを構成するアミノ酸残基の数は、10〜200残基であることが好ましく、10〜150残基であることがより好ましく、20〜100残基であることが更に好ましく、20〜75残基であることが更により好ましい。第1の改変フィブロインは、式1:[(A)nモチーフ−REP]mで表されるアミノ酸配列中に含まれるグリシン残基、セリン残基及びアラニン残基の合計残基数がアミノ酸残基数全体に対して、40%以上であることが好ましく、60%以上であることがより好ましく、70%以上であることが更に好ましい。
第1の改変フィブロインは、式1:[(A)nモチーフ−REP]mで表されるアミノ酸配列の単位を含み、かつC末端配列が配列番号1〜3のいずれかに示されるアミノ酸配列又は配列番号1〜3のいずれかに示されるアミノ酸配列と90%以上の相同性を有するアミノ酸配列であるポリペプチドであってもよい。
配列番号1に示されるアミノ酸配列は、ADF3(GI:1263287、NCBI)のアミノ酸配列のC末端の50残基のアミノ酸からなるアミノ酸配列と同一であり、配列番号2に示されるアミノ酸配列は、配列番号1に示されるアミノ酸配列のC末端から20残基取り除いたアミノ酸配列と同一であり、配列番号3に示されるアミノ酸配列は、配列番号1に示されるアミノ酸配列のC末端から29残基取り除いたアミノ酸配列と同一である。
第1の改変フィブロインのより具体的な例として、(1−i)配列番号4(recombinant spider silk protein ADF3KaiLargeNRSH1)で示されるアミノ酸配列、又は(1−ii)配列番号4で示されるアミノ酸配列と90%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、改変フィブロインを挙げることができる。配列同一性は、95%以上であることが好ましい。
配列番号4で示されるアミノ酸配列は、N末端に開始コドン、His10タグ及びHRV3Cプロテアーゼ(Human rhinovirus 3Cプロテアーゼ)認識サイトからなるアミノ酸配列(配列番号5)を付加したADF3のアミノ酸配列において、第1〜13番目の反復領域をおよそ2倍になるように増やすとともに、翻訳が第1154番目アミノ酸残基で終止するように変異させたものである。配列番号4で示されるアミノ酸配列のC末端のアミノ酸配列は、配列番号3で示されるアミノ酸配列と同一である。
(1−i)の改変フィブロインは、配列番号4で示されるアミノ酸配列からなるものであってもよい。
第2の改変フィブロインは、そのドメイン配列が、天然由来のフィブロインと比較して、グリシン残基の含有量が低減されたアミノ酸配列を有する。第2の改変フィブロインは、天然由来のフィブロインと比較して、少なくともREP中の1又は複数のグリシン残基が別のアミノ酸残基に置換されたことに相当するアミノ酸配列を有するものということができる。
第2の改変フィブロインは、そのドメイン配列が、天然由来のフィブロインと比較して、REP中のGGX及びGPGXX(但し、Gはグリシン残基、Pはプロリン残基、Xはグリシン以外のアミノ酸残基を示す。)から選ばれる少なくとも一つのモチーフ配列において、少なくとも1又は複数の当該モチーフ配列中の1つのグリシン残基が別のアミノ酸残基に置換されたことに相当するアミノ酸配列を有するものであってもよい。
第2の改変フィブロインは、上述のグリシン残基が別のアミノ酸残基に置換されたモチーフ配列の割合が、全モチーフ配列に対して、10%以上であってもよい。
第2の改変フィブロインは、式1:[(A)nモチーフ−REP]mで表されるドメイン配列を含み、上記ドメイン配列から、最もC末端側に位置する(A)nモチーフから上記ドメイン配列のC末端までの配列を除いた配列中の全REPに含まれるXGX(但し、Xはグリシン以外のアミノ酸残基を示す。)からなるアミノ酸配列の総アミノ酸残基数をzとし、上記ドメイン配列から、最もC末端側に位置する(A)nモチーフから上記ドメイン配列のC末端までの配列を除いた配列中の総アミノ酸残基数をwとしたときに、z/wが30%以上、40%以上、50%以上又は50.9%以上であるアミノ酸配列を有するものであってもよい。(A)nモチーフ中の全アミノ酸残基数に対するアラニン残基数は83%以上であってよいが、86%以上であることが好ましく、90%以上であることがより好ましく、95%以上であることが更に好ましく、100%であること(アラニン残基のみで構成されることを意味する)が更により好ましい。
第2の改変フィブロインは、GGXモチーフの1つのグリシン残基を別のアミノ酸残基に置換することにより、XGXからなるアミノ酸配列の含有割合を高めたものであることが好ましい。第2の改変フィブロインは、ドメイン配列中のGGXからなるアミノ酸配列の含有割合が30%以下であることが好ましく、20%以下であることがより好ましく、10%以下であることが更に好ましく、6%以下であることが更により好ましく、4%以下であることが更によりまた好ましく、2%以下であることが特に好ましい。ドメイン配列中のGGXからなるアミノ酸配列の含有割合は、下記XGXからなるアミノ酸配列の含有割合(z/w)の算出方法と同様の方法で算出することができる。
z/wの算出方法を更に詳細に説明する。まず、式1:[(A)nモチーフ−REP]mで表されるドメイン配列を含むフィブロイン(改変フィブロイン又は天然由来のフィブロイン)において、ドメイン配列から、最もC末端側に位置する(A)nモチーフからドメイン配列のC末端までの配列を除いた配列に含まれる全てのREPから、XGXからなるアミノ酸配列を抽出する。XGXを構成するアミノ酸残基の総数がzである。例えば、XGXからなるアミノ酸配列が50個抽出された場合(重複はなし)、zは50×3=150である。また、例えば、XGXGXからなるアミノ酸配列の場合のように2つのXGXに含まれるX(中央のX)が存在する場合は、重複分を控除して計算する(XGXGXの場合は5アミノ酸残基である)。wは、ドメイン配列から、最もC末端側に位置する(A)nモチーフからドメイン配列のC末端までの配列を除いた配列に含まれる総アミノ酸残基数である。例えば、図1に示したドメイン配列の場合、wは4+50+4+100+4+10+4+20+4+30=230である(最もC末端側に位置する(A)nモチーフは除いている。)。次に、zをwで除すことによって、z/w(%)を算出することができる。
ここで、天然由来のフィブロインにおけるz/wについて説明する。まず、上述のように、NCBI GenBankにアミノ酸配列情報が登録されているフィブロインを例示した方法により確認したところ、663種類のフィブロイン(このうち、クモ類由来のフィブロインは415種類)が抽出された。抽出された全てのフィブロインのうち、式1:[(A)nモチーフ−REP]mで表されるドメイン配列を含み、フィブロイン中のGGXからなるアミノ酸配列の含有割合が6%以下である天然由来のフィブロインのアミノ酸配列から、上述の算出方法により、z/wを算出した。その結果を図2に示す。図2の横軸はz/w(%)を示し、縦軸は頻度を示す。図2から明らかなとおり、天然由来のフィブロインにおけるz/wは、いずれも50.9%未満である(最も高いもので、50.86%)。
第2の改変フィブロインにおいて、z/wは、50.9%以上であることが好ましく、56.1%以上であることがより好ましく、58.7%以上であることが更に好ましく、70%以上であることが更により好ましく、80%以上であることが更によりまた好ましい。z/wの上限に特に制限はないが、例えば、95%以下であってもよい。
第2の改変フィブロインは、例えば、クローニングした天然由来のフィブロインの遺伝子配列から、グリシン残基をコードする塩基配列の少なくとも一部を置換して別のアミノ酸残基をコードするように改変することにより得ることができる。このとき、改変するグリシン残基として、GGXモチーフ及びGPGXXモチーフにおける1つのグリシン残基を選択してもよいし、またz/wが50.9%以上になるように置換してもよい。また、例えば、天然由来のフィブロインのアミノ酸配列から上記態様を満たすアミノ酸配列を設計し、設計したアミノ酸配列をコードする核酸を化学合成することにより得ることもできる。いずれの場合においても、天然由来のフィブロインのアミノ酸配列からREP中のグリシン残基を別のアミノ酸残基に置換したことに相当する改変に加え、更に1又は複数のアミノ酸残基を置換、欠失、挿入及び/又は付加したことに相当するアミノ酸配列の改変を行ってもよい。
上記の別のアミノ酸残基としては、グリシン残基以外のアミノ酸残基であれば特に制限はないが、バリン(V)残基、ロイシン(L)残基、イソロイシン(I)残基、メチオニン(M)残基、プロリン(P)残基、フェニルアラニン(F)残基及びトリプトファン(W)残基等の疎水性アミノ酸残基、グルタミン(Q)残基、アスパラギン(N)残基、セリン(S)残基、リシン(K)残基及びグルタミン酸(E)残基等の親水性アミノ酸残基が好ましく、バリン(V)残基、ロイシン(L)残基、イソロイシン(I)残基、フェニルアラニン(F)残基及びグルタミン(Q)残基がより好ましく、グルタミン(Q)残基が更に好ましい。
第2の改変フィブロインのより具体的な例として、(2−i)配列番号6(Met−PRT380)、配列番号7(Met−PRT410)、配列番号8(Met−PRT525)若しくは配列番号9(Met−PRT799)で示されるアミノ酸配列、又は(2−ii)配列番号6、配列番号7、配列番号8若しくは配列番号9で示されるアミノ酸配列と90%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、改変フィブロインを挙げることができる。
(2−i)の改変フィブロインについて説明する。配列番号6で示されるアミノ酸配列は、天然由来のフィブロインに相当する配列番号10(Met−PRT313)で示されるアミノ酸配列のREP中の全てのGGXをGQXに置換したものである。配列番号7で示されるアミノ酸配列は、配列番号6で示されるアミノ酸配列から、N末端側からC末端側に向かって2つおきに(A)nモチーフを欠失させ、更にC末端配列の手前に[(A)nモチーフ−REP]を1つ挿入したものである。配列番号8で示されるアミノ酸配列は、配列番号7で示されるアミノ酸配列の各(A)nモチーフのC末端側に2つのアラニン残基を挿入し、更に一部のグルタミン(Q)残基をセリン(S)残基に置換し、配列番号7の分子量とほぼ同じとなるようにC末端側の一部のアミノ酸を欠失させたものである。配列番号9で示されるアミノ酸配列は、配列番号7で示されるアミノ酸配列中に存在する20個のドメイン配列の領域(但し、当該領域のC末端側の数アミノ酸残基が置換されている。)を4回繰り返した配列のC末端に所定のヒンジ配列とHisタグ配列が付加されたものである。
配列番号10で示されるアミノ酸配列(天然由来のフィブロインに相当)におけるz/wの値は、46.8%である。配列番号6で示されるアミノ酸配列、配列番号7で示されるアミノ酸配列、配列番号8で示されるアミノ酸配列、及び配列番号9で示されるアミノ酸配列におけるz/wの値は、それぞれ58.7%、70.1%、66.1%及び70.0%である。また、配列番号10、配列番号6、配列番号7、配列番号8及び配列番号9で示されるアミノ酸配列のギザ比率(後述する)1:1.8〜11.3におけるx/yの値は、それぞれ15.0%、15.0%、93.4%、92.7%及び89.8%である。
(2−i)の改変フィブロインは、配列番号6、配列番号7、配列番号8又は配列番号9で示されるアミノ酸配列からなるものであってもよい。
(2−ii)の改変フィブロインは、配列番号6、配列番号7、配列番号8又は配列番号9で示されるアミノ酸配列と90%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むものである。(2−ii)の改変フィブロインもまた、式1:[(A)nモチーフ−REP]mで表されるドメイン配列を含むタンパク質である。上記配列同一性は、95%以上であることが好ましい。
(2−ii)の改変フィブロインは、配列番号6、配列番号7、配列番号8又は配列番号9で示されるアミノ酸配列と90%以上の配列同一性を有し、かつREP中に含まれるXGX(但し、Xはグリシン以外のアミノ酸残基を示す。)からなるアミノ酸配列の総アミノ酸残基数をzとし、上記ドメイン配列中のREPの総アミノ酸残基数をwとしたときに、z/wが50.9%以上であることが好ましい。
第2の改変フィブロインは、N末端及びC末端のいずれか一方又は両方にタグ配列を含んでいてもよい。これにより、改変フィブロインの単離、固定化、検出及び可視化等が可能となる。
タグ配列として、例えば、他の分子との特異的親和性(結合性、アフィニティ)を利用したアフィニティタグを挙げることができる。アフィニティタグの具体例として、ヒスチジンタグ(Hisタグ)を挙げることができる。Hisタグは、ヒスチジン残基が4から10個程度並んだ短いペプチドで、ニッケル等の金属イオンと特異的に結合する性質があるため、金属キレートクロマトグラフィー(chelating metal chromatography)による改変フィブロインの単離に利用することができる。タグ配列の具体例として、例えば、配列番号11で示されるアミノ酸配列(Hisタグ配列及びヒンジ配列を含むアミノ酸配列)が挙げられる。
また、グルタチオンに特異的に結合するグルタチオン−S−トランスフェラーゼ(GST)、マルトースに特異的に結合するマルトース結合タンパク質(MBP)等のタグ配列を利用することもできる。
さらに、抗原抗体反応を利用した「エピトープタグ」を利用することもできる。抗原性を示すペプチド(エピトープ)をタグ配列として付加することにより、当該エピトープに対する抗体を結合させることができる。エピトープタグとして、HA(インフルエンザウイルスのヘマグルチニンのペプチド配列)タグ、mycタグ、FLAGタグ等を挙げることができる。エピトープタグを利用することにより、高い特異性で容易に改変フィブロインを精製することができる。
さらにタグ配列を特定のプロテアーゼで切り離せるようにしたものも使用することができる。当該タグ配列を介して吸着したタンパク質をプロテアーゼ処理することにより、タグ配列を切り離した改変フィブロインを回収することもできる。
タグ配列を含む改変フィブロインのより具体的な例として、(2−iii)配列番号12(PRT380)、配列番号13(PRT410)、配列番号14(PRT525)若しくは配列番号15(PRT799)で示されるアミノ酸配列、又は(2−iv)配列番号12、配列番号13、配列番号14若しくは配列番号15で示されるアミノ酸配列と90%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、改変フィブロインを挙げることができる。
配列番号16(PRT313)、配列番号12、配列番号13、配列番号14及び配列番号15で示されるアミノ酸配列は、それぞれ配列番号10、配列番号6、配列番号7、配列番号8及び配列番号9で示されるアミノ酸配列のN末端に配列番号11で示されるアミノ酸配列(Hisタグ配列及びヒンジ配列を含む)を付加したものである。
(2−iii)の改変フィブロインは、配列番号12、配列番号13、配列番号14又は配列番号15で示されるアミノ酸配列からなるものであってもよい。
(2−iv)の改変フィブロインは、配列番号12、配列番号13、配列番号14又は配列番号15で示されるアミノ酸配列と90%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むものである。(2−iv)の改変フィブロインもまた、式1:[(A)nモチーフ−REP]mで表されるドメイン配列を含むタンパク質である。上記配列同一性は、95%以上であることが好ましい。
(2−iv)の改変フィブロインは、配列番号12、配列番号13、配列番号14又は配列番号15で示されるアミノ酸配列と90%以上の配列同一性を有し、かつREP中に含まれるXGX(但し、Xはグリシン以外のアミノ酸残基を示す。)からなるアミノ酸配列の総アミノ酸残基数をzとし、上記ドメイン配列中のREPの総アミノ酸残基数をwとしたときに、z/wが50.9%以上であることが好ましい。
第2の改変フィブロインは、組換えタンパク質生産系において生産されたタンパク質を宿主の外部に放出するための分泌シグナルを含んでいてもよい。分泌シグナルの配列は、宿主の種類に応じて適宜設定することができる。
第3の改変フィブロインは、そのドメイン配列が、天然由来のフィブロインと比較して、(A)nモチーフの含有量が低減されたアミノ酸配列を有する。第3の改変フィブロインのドメイン配列は、天然由来のフィブロインと比較して、少なくとも1又は複数の(A)nモチーフが欠失したことに相当するアミノ酸配列を有するものということができる。
第3の改変フィブロインは、天然由来のフィブロインから(A)nモチーフを10〜40%欠失させたことに相当するアミノ酸配列を有するものであってもよい。
第3の改変フィブロインは、そのドメイン配列が、天然由来のフィブロインと比較して、少なくともN末端側からC末端側に向かって1〜3つの(A)nモチーフ毎に1つの(A)nモチーフが欠失したことに相当するアミノ酸配列を有するものであってもよい。
第3の改変フィブロインは、そのドメイン配列が、天然由来のフィブロインと比較して、少なくともN末端側からC末端側に向かって2つ連続した(A)nモチーフの欠失、及び1つの(A)nモチーフの欠失がこの順に繰り返されたことに相当するアミノ酸配列を有するものであってもよい。
第3の改変フィブロインは、そのドメイン配列が、少なくともN末端側からC末端側に向かって2つおきに(A)nモチーフが欠失したことに相当するアミノ酸配列を有するものであってもよい。
第3の改変フィブロインは、式1:[(A)nモチーフ−REP]mで表されるドメイン配列を含み、N末端側からC末端側に向かって、隣合う2つの[(A)nモチーフ−REP]ユニットのREPのアミノ酸残基数を順次比較して、アミノ酸残基数が少ないREPのアミノ酸残基数を1としたとき、他方のREPのアミノ酸残基数の比が1.8〜11.3となる隣合う2つの[(A)nモチーフ−REP]ユニットのアミノ酸残基数を足し合わせた合計値の最大値をxとし、ドメイン配列の総アミノ酸残基数をyとしたときに、x/yが20%以上、30%以上、40%以上又は50%以上であるアミノ酸配列を有するものであってもよい。(A)nモチーフ中の全アミノ酸残基数に対するアラニン残基数は83%以上であってよいが、86%以上であることが好ましく、90%以上であることがより好ましく、95%以上であることが更に好ましく、100%であること(アラニン残基のみで構成されることを意味する)が更により好ましい。
x/yの算出方法を図1を参照しながら更に詳細に説明する。図1には、改変フィブロインからN末端配列及びC末端配列を除いたドメイン配列を示す。当該ドメイン配列は、N末端側(左側)から(A)nモチーフ−第1のREP(50アミノ酸残基)−(A)nモチーフ−第2のREP(100アミノ酸残基)−(A)nモチーフ−第3のREP(10アミノ酸残基)−(A)nモチーフ−第4のREP(20アミノ酸残基)−(A)nモチーフ−第5のREP(30アミノ酸残基)−(A)nモチーフという配列を有する。
隣合う2つの[(A)nモチーフ−REP]ユニットは、重複がないように、N末端側からC末端側に向かって、順次選択する。このとき、選択されない[(A)nモチーフ−REP]ユニットが存在してもよい。図1には、パターン1(第1のREPと第2のREPの比較、及び第3のREPと第4のREPの比較)、パターン2(第1のREPと第2のREPの比較、及び第4のREPと第5のREPの比較)、パターン3(第2のREPと第3のREPの比較、及び第4のREPと第5のREPの比較)、パターン4(第1のREPと第2のREPの比較)を示した。なお、これ以外にも選択方法は存在する。
次に各パターンについて、選択した隣合う2つの[(A)nモチーフ−REP]ユニット中の各REPのアミノ酸残基数を比較する。比較は、よりアミノ酸残基数の少ない方を1としたときの、他方のアミノ酸残基数の比を求めることによって行う。例えば、第1のREP(50アミノ酸残基)と第2のREP(100アミノ酸残基)の比較の場合、よりアミノ酸残基数の少ない第1のREPを1としたとき、第2のREPのアミノ酸残基数の比は、100/50=2である。同様に、第4のREP(20アミノ酸残基)と第5のREP(30アミノ酸残基)の比較の場合、よりアミノ酸残基数の少ない第4のREPを1としたとき、第5のREPのアミノ酸残基数の比は、30/20=1.5である。
図1中、よりアミノ酸残基数の少ない方を1としたときに、他方のアミノ酸残基数の比が1.8〜11.3となる[(A)nモチーフ−REP]ユニットの組を実線で示した。本明細書中、この比をギザ比率と呼ぶ。よりアミノ酸残基数の少ない方を1としたときに、他方のアミノ酸残基数の比が1.8未満又は11.3超となる[(A)nモチーフ−REP]ユニットの組は破線で示した。
各パターンにおいて、実線で示した隣合う2つの[(A)nモチーフ−REP]ユニットの全てのアミノ酸残基数を足し合わせる(REPのみではなく、(A)nモチーフのアミノ酸残基数もである。)。そして、足し合わせた合計値を比較して、当該合計値が最大となるパターンの合計値(合計値の最大値)をxとする。図1に示した例では、パターン1の合計値が最大である。
次に、xをドメイン配列の総アミノ酸残基数yで除すことによって、x/y(%)を算出することができる。
第3の改変フィブロインにおいて、x/yは、50%以上であることが好ましく、60%以上であることがより好ましく、65%以上であることが更に好ましく、70%以上であることが更により好ましく、75%以上であることが更によりまた好ましく、80%以上であることが特に好ましい。x/yの上限に特に制限はなく、例えば、100%以下であってよい。ギザ比率が1:1.9〜11.3の場合には、x/yは89.6%以上であることが好ましく、ギザ比率が1:1.8〜3.4の場合には、x/yは77.1%以上であることが好ましく、ギザ比率が1:1.9〜8.4の場合には、x/yは75.9%以上であることが好ましく、ギザ比率が1:1.9〜4.1の場合には、x/yは64.2%以上であることが好ましい。
第3の改変フィブロインが、ドメイン配列中に複数存在する(A)nモチーフの少なくとも7つがアラニン残基のみで構成される改変フィブロインである場合、x/yは、46.4%以上であることが好ましく、50%以上であることがより好ましく、55%以上であることが更に好ましく、60%以上であることが更により好ましく、70%以上であることが更によりまた好ましく、80%以上であることが特に好ましい。x/yの上限に特に制限はなく、100%以下であればよい。
ここで、天然由来のフィブロインにおけるx/yについて説明する。まず、上述のように、NCBI GenBankにアミノ酸配列情報が登録されているフィブロインを例示した方法により確認したところ、663種類のフィブロイン(このうち、クモ類由来のフィブロインは415種類)が抽出された。抽出された全てのフィブロインのうち、式1:[(A)nモチーフ−REP]mで表されるドメイン配列で構成される天然由来のフィブロインのアミノ酸配列から、上述の算出方法により、x/yを算出した。ギザ比率が1:1.9〜4.1の場合の結果を図3に示す。
図3の横軸はx/y(%)を示し、縦軸は頻度を示す。図3から明らかなとおり、天然由来のフィブロインにおけるx/yは、いずれも64.2%未満である(最も高いもので、64.14%)。
第3の改変フィブロインは、例えば、クローニングした天然由来のフィブロインの遺伝子配列から、x/yが64.2%以上になるように(A)nモチーフをコードする配列の1又は複数を欠失させることにより得ることができる。また、例えば、天然由来のフィブロインのアミノ酸配列から、x/yが64.2%以上になるように1又は複数の(A)nモチーフが欠失したことに相当するアミノ酸配列を設計し、設計したアミノ酸配列をコードする核酸を化学合成することにより得ることもできる。いずれの場合においても、天然由来のフィブロインのアミノ酸配列から(A)nモチーフが欠失したことに相当する改変に加え、更に1又は複数のアミノ酸残基を置換、欠失、挿入及び/又は付加したことに相当するアミノ酸配列の改変を行ってもよい。
第3の改変フィブロインのより具体的な例として、(3−i)配列番号17(Met−PRT399)、配列番号7(Met−PRT410)、配列番号8(Met−PRT525)若しくは配列番号9(Met−PRT799)で示されるアミノ酸配列、又は(3−ii)配列番号17、配列番号7、配列番号8若しくは配列番号9で示されるアミノ酸配列と90%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、改変フィブロインを挙げることができる。
(3−i)の改変フィブロインについて説明する。配列番号17で示されるアミノ酸配列は、天然由来のフィブロインに相当する配列番号10(Met−PRT313)で示されるアミノ酸配列から、N末端側からC末端側に向かって2つおきに(A)nモチーフを欠失させ、更にC末端配列の手前に[(A)nモチーフ−REP]を1つ挿入したものである。配列番号7、配列番号8又は配列番号9で示されるアミノ酸配列は、第2の改変フィブロインで説明したとおりである。
配列番号10で示されるアミノ酸配列(天然由来のフィブロインに相当)のギザ比率1:1.8〜11.3におけるx/yの値は15.0%である。配列番号17で示されるアミノ酸配列、及び配列番号7で示されるアミノ酸配列におけるx/yの値は、いずれも93.4%である。配列番号8で示されるアミノ酸配列におけるx/yの値は、92.7%である。配列番号9で示されるアミノ酸配列におけるx/yの値は、89.8%である。配列番号10、配列番号17、配列番号7、配列番号8及び配列番号9で示されるアミノ酸配列におけるz/wの値は、それぞれ46.8%、56.2%、70.1%、66.1%及び70.0%である。
(3−i)の改変フィブロインは、配列番号17、配列番号7、配列番号8又は配列番号9で示されるアミノ酸配列からなるものであってもよい。
(3−ii)の改変フィブロインは、配列番号17、配列番号7、配列番号8又は配列番号9で示されるアミノ酸配列と90%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むものである。(3−ii)の改変フィブロインもまた、式1:[(A)nモチーフ−REP]mで表されるドメイン配列を含むタンパク質である。上記配列同一性は、95%以上であることが好ましい。
(3−ii)の改変フィブロインは、配列番号17、配列番号7、配列番号8又は配列番号9で示されるアミノ酸配列と90%以上の配列同一性を有し、かつN末端側からC末端側に向かって、隣合う2つの[(A)nモチーフ−REP]ユニットのREPのアミノ酸残基数を順次比較して、アミノ酸残基数が少ないREPのアミノ酸残基数を1としたとき、他方のREPのアミノ酸残基数の比が1.8〜11.3(ギザ比率が1:1.8〜11.3)となる隣合う2つの[(A)nモチーフ−REP]ユニットのアミノ酸残基数を足し合わせた合計値の最大値をxとし、ドメイン配列の総アミノ酸残基数をyとしたときに、x/yが64.2%以上であることが好ましい。
第3の改変フィブロインは、N末端及びC末端のいずれか一方又は両方に上述したタグ配列を含んでいてもよい。
タグ配列を含む改変フィブロインのより具体的な例として、(3−iii)配列番号18(PRT399)、配列番号13(PRT410)、配列番号14(PRT525)若しくは配列番号15(PRT799)で示されるアミノ酸配列、又は(3−iv)配列番号18、配列番号13、配列番号14若しくは配列番号15で示されるアミノ酸配列と90%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、改変フィブロインを挙げることができる。
配列番号18、配列番号13、配列番号14及び配列番号15で示されるアミノ酸配列は、それぞれ配列番号17、配列番号7、配列番号8及び配列番号9で示されるアミノ酸配列のN末端に配列番号11で示されるアミノ酸配列(Hisタグ配列及びヒンジ配列を含む)を付加したものである。
(3−iii)の改変フィブロインは、配列番号18、配列番号13、配列番号14又は配列番号15で示されるアミノ酸配列からなるものであってもよい。
(3−iv)の改変フィブロインは、配列番号18、配列番号13、配列番号14又は配列番号15で示されるアミノ酸配列と90%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むものである。(3−iv)の改変フィブロインもまた、式1:[(A)nモチーフ−REP]mで表されるドメイン配列を含むタンパク質である。上記配列同一性は、95%以上であることが好ましい。
(3−iv)の改変フィブロインは、配列番号18、配列番号13、配列番号14又は配列番号15で示されるアミノ酸配列と90%以上の配列同一性を有し、かつN末端側からC末端側に向かって、隣合う2つの[(A)nモチーフ−REP]ユニットのREPのアミノ酸残基数を順次比較して、アミノ酸残基数が少ないREPのアミノ酸残基数を1としたとき、他方のREPのアミノ酸残基数の比が1.8〜11.3となる隣合う2つの[(A)nモチーフ−REP]ユニットのアミノ酸残基数を足し合わせた合計値の最大値をxとし、ドメイン配列の総アミノ酸残基数をyとしたときに、x/yが64.2%以上であることが好ましい。
第3の改変フィブロインは、組換えタンパク質生産系において生産されたタンパク質を宿主の外部に放出するための分泌シグナルを含んでいてもよい。分泌シグナルの配列は、宿主の種類に応じて適宜設定することができる。
第4の改変フィブロインは、そのドメイン配列が、天然由来のフィブロインと比較して、(A)nモチーフの含有量が低減されたことに加え、グリシン残基の含有量が低減されたアミノ酸配列を有するものである。第4の改変フィブロインのドメイン配列は、天然由来のフィブロインと比較して、少なくとも1又は複数の(A)nモチーフが欠失したことに加え、更に少なくともREP中の1又は複数のグリシン残基が別のアミノ酸残基に置換されたことに相当するアミノ酸配列を有するものということができる。すなわち、第4の改変フィブロインは、上述した第2の改変フィブロインと、第3の改変フィブロインの特徴を併せ持つ改変フィブロインである。具体的な態様等は、第2の改変フィブロイン、及び第3の改変フィブロインで説明したとおりである。
第4の改変フィブロインのより具体的な例として、(4−i)配列番号7(Met−PRT410)、配列番号8(Met−PRT525)、配列番号9(Met−PRT799)、配列番号13(PRT410)、配列番号14(PRT525)若しくは配列番号15(PRT799)で示されるアミノ酸配列、又は(4−ii)配列番号7、配列番号8、配列番号9、配列番号13、配列番号14若しくは配列番号15で示されるアミノ酸配列と90%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、改変フィブロインを挙げることができる。配列番号7、配列番号8、配列番号9、配列番号13、配列番号14又は配列番号15で示されるアミノ酸配列を含む改変フィブロインの具体的な態様は上述のとおりである。
第5の改変フィブロインは、そのドメイン配列が、天然由来のフィブロインと比較して、REP中の1又は複数のアミノ酸残基が疎水性指標の大きいアミノ酸残基に置換されたこと、及び/又はREP中に1又は複数の疎水性指標の大きいアミノ酸残基が挿入されたことに相当する、局所的に疎水性指標の大きい領域を含むアミノ酸配列を有するものであってよい。
局所的に疎水性指標の大きい領域は、連続する2〜4アミノ酸残基で構成されていることが好ましい。
上述の疎水性指標の大きいアミノ酸残基は、イソロイシン(I)、バリン(V)、ロイシン(L)、フェニルアラニン(F)、システイン(C)、メチオニン(M)及びアラニン(A)から選ばれるアミノ酸残基であることがより好ましい。
第5の改変フィブロインは、天然由来のフィブロインと比較して、REP中の1又は複数のアミノ酸残基が疎水性指標の大きいアミノ酸残基に置換されたこと、及び/又はREP中に1又は複数の疎水性指標の大きいアミノ酸残基が挿入されたことに相当する改変に加え、更に、天然由来のフィブロインと比較して、1又は複数のアミノ酸残基を置換、欠失、挿入及び/又は付加したことに相当するアミノ酸配列の改変があってもよい。
第5の改変フィブロインは、例えば、クローニングした天然由来のフィブロインの遺伝子配列からREP中の1又は複数の親水性アミノ酸残基(例えば、疎水性指標がマイナスであるアミノ酸残基)を疎水性アミノ酸残基(例えば、疎水性指標がプラスであるアミノ酸残基)に置換すること、及び/又はREP中に1又は複数の疎水性アミノ酸残基を挿入することにより得ることができる。また、例えば、天然由来のフィブロインのアミノ酸配列からREP中の1又は複数の親水性アミノ酸残基を疎水性アミノ酸残基に置換したこと、及び/又はREP中に1又は複数の疎水性アミノ酸残基を挿入したことに相当するアミノ酸配列を設計し、設計したアミノ酸配列をコードする核酸を化学合成することにより得ることもできる。いずれの場合においても、天然由来のフィブロインのアミノ酸配列からREP中の1又は複数の親水性アミノ酸残基を疎水性アミノ酸残基に置換したこと、及び/又はREP中に1又は複数の疎水性アミノ酸残基を挿入したことに相当する改変に加え、更に1又は複数のアミノ酸残基を置換、欠失、挿入及び/又は付加したことに相当するアミノ酸配列の改変を行ってもよい。
第5の改変フィブロインは、式1:[(A)nモチーフ−REP]mで表されるドメイン配列を含み、最もC末端側に位置する(A)nモチーフから上記ドメイン配列のC末端までの配列を上記ドメイン配列から除いた配列に含まれる全てのREPにおいて、連続する4アミノ酸残基の疎水性指標の平均値が2.6以上となる領域に含まれるアミノ酸残基の総数をpとし、最もC末端側に位置する(A)nモチーフから上記ドメイン配列のC末端までの配列を上記ドメイン配列から除いた配列に含まれるアミノ酸残基の総数をqとしたときに、p/qが6.2%以上であるアミノ酸配列を有してもよい。
アミノ酸残基の疎水性指標については、公知の指標(Hydropathy index:Kyte J,&Doolittle R(1982)“A simple method for displaying the hydropathic character of a protein”,J.Mol.Biol.,157,pp.105−132)を使用する。具体的には、各アミノ酸の疎水性指標(ハイドロパシー・インデックス、以下「HI」とも記す。)は、下記表1に示すとおりである。
p/qの算出方法を更に詳細に説明する。算出には、式1:[(A)nモチーフ−REP]mで表されるドメイン配列から、最もC末端側に位置する(A)nモチーフからドメイン配列のC末端までの配列を除いた配列(以下、「配列A」とする)を用いる。まず、配列Aに含まれる全てのREPにおいて、連続する4アミノ酸残基の疎水性指標の平均値を算出する。疎水性指標の平均値は、連続する4アミノ酸残基に含まれる各アミノ酸残基のHIの総和を4(アミノ酸残基数)で除して求める。疎水性指標の平均値は、全ての連続する4アミノ酸残基について求める(各アミノ酸残基は、1〜4回平均値の算出に用いられる。)。次いで、連続する4アミノ酸残基の疎水性指標の平均値が2.6以上となる領域を特定する。あるアミノ酸残基が、複数の「疎水性指標の平均値が2.6以上となる連続する4アミノ酸残基」に該当する場合であっても、領域中には1アミノ酸残基として含まれることになる。そして、当該領域に含まれるアミノ酸残基の総数がpである。また、配列Aに含まれるアミノ酸残基の総数がqである。
例えば、「疎水性指標の平均値が2.6以上となる連続する4アミノ酸残基」が20カ所抽出された場合(重複はなし)、連続する4アミノ酸残基の疎水性指標の平均値が2.6以上となる領域には、連続する4アミノ酸残基(重複はなし)が20含まれることになり、pは20×4=80である。また、例えば、2つの「疎水性指標の平均値が2.6以上となる連続する4アミノ酸残基」が1アミノ酸残基だけ重複して存在する場合、連続する4アミノ酸残基の疎水性指標の平均値が2.6以上となる領域には、7アミノ酸残基含まれることになる(p=2×4−1=7。「−1」は重複分の控除である。)。例えば、図4に示したドメイン配列の場合、「疎水性指標の平均値が2.6以上となる連続する4アミノ酸残基」が重複せずに7つ存在するため、pは7×4=28となる。また、例えば、図4に示したドメイン配列の場合、qは4+50+4+40+4+10+4+20+4+30=170である(C末端側の最後に存在する(A)nモチーフは含めない)。次に、pをqで除すことによって、p/q(%)を算出することができる。図4の場合28/170=16.47%となる。
第5の改変フィブロインにおいて、p/qは、6.2%以上であることが好ましく、7%以上であることがより好ましく、10%以上であることが更に好ましく、20%以上であることが更により好ましく、30%以上であることが更によりまた好ましい。p/qの上限は、特に制限されないが、例えば、45%以下であってもよい。
第5の改変フィブロインは、例えば、クローニングした天然由来のフィブロインのアミノ酸配列を、上記のp/qの条件を満たすように、REP中の1又は複数の親水性アミノ酸残基(例えば、疎水性指標がマイナスであるアミノ酸残基)を疎水性アミノ酸残基(例えば、疎水性指標がプラスであるアミノ酸残基)に置換すること、及び/又はREP中に1又は複数の疎水性アミノ酸残基を挿入することにより、局所的に疎水性指標の大きい領域を含むアミノ酸配列に改変することにより得ることができる。また、例えば、天然由来のフィブロインのアミノ酸配列から上記のp/qの条件を満たすアミノ酸配列を設計し、設計したアミノ酸配列をコードする核酸を化学合成することにより得ることもできる。いずれの場合においても、天然由来のフィブロインと比較して、REP中の1又は複数のアミノ酸残基が疎水性指標の大きいアミノ酸残基に置換されたこと、及び/又はREP中に1又は複数の疎水性指標の大きいアミノ酸残基が挿入されたことに相当する改変に加え、更に1又は複数のアミノ酸残基を置換、欠失、挿入及び/又は付加したことに相当する改変を行ってもよい。
疎水性指標の大きいアミノ酸残基としては、特に制限はないが、イソロイシン(I)、バリン(V)、ロイシン(L)、フェニルアラニン(F)、システイン(C)、メチオニン(M)及びアラニン(A)が好ましく、バリン(V)、ロイシン(L)及びイソロイシン(I)がより好ましい。
第5の改変フィブロインのより具体的な例として、(5−i)配列番号19(Met−PRT720)、配列番号20(Met−PRT665)若しくは配列番号21(Met−PRT666)で示されるアミノ酸配列、又は(5−ii)配列番号19、配列番号20若しくは配列番号21で示されるアミノ酸配列と90%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、改変フィブロインを挙げることができる。
(5−i)の改変フィブロインについて説明する。配列番号19で示されるアミノ酸配列は、配列番号7(Met−PRT410)で示されるアミノ酸配列に対し、C末端側の端末のドメイン配列を除いて、REP一つ置きにそれぞれ3アミノ酸残基からなるアミノ酸配列(VLI)を2カ所挿入し、更に一部のグルタミン(Q)残基をセリン(S)残基に置換し、かつC末端側の一部のアミノ酸を欠失させたものである。配列番号20で示されるアミノ酸配列は、配列番号8(Met−PRT525)で示されるアミノ酸配列に対し、REP一つ置きにそれぞれ3アミノ酸残基からなるアミノ酸配列(VLI)を1カ所挿入したものである。配列番号21で示されるアミノ酸配列は、配列番号8で示されるアミノ酸配列に対し、REP一つ置きにそれぞれ3アミノ酸残基からなるアミノ酸配列(VLI)を2カ所挿入したものである。
(5−i)の改変フィブロインは、配列番号19、配列番号20又は配列番号21で示されるアミノ酸配列からなるものであってもよい。
(5−ii)の改変フィブロインは、配列番号19、配列番号20又は配列番号21で示されるアミノ酸配列と90%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むものである。(5−ii)の改変フィブロインもまた、式1:[(A)nモチーフ−REP]mで表されるドメイン配列を含むタンパク質である。上記配列同一性は、95%以上であることが好ましい。
(5−ii)の改変フィブロインは、配列番号19、配列番号20又は配列番号21で示されるアミノ酸配列と90%以上の配列同一性を有し、かつ最もC末端側に位置する(A)nモチーフからドメイン配列のC末端までの配列をドメイン配列から除いた配列に含まれる全てのREPにおいて、連続する4アミノ酸残基の疎水性指標の平均値が2.6以上となる領域に含まれるアミノ酸残基の総数をpとし、最もC末端側に位置する(A)nモチーフからドメイン配列のC末端までの配列をドメイン配列から除いた配列に含まれるアミノ酸残基の総数をqとしたときに、p/qが6.2%以上であることが好ましい。
第5の改変フィブロインは、N末端及びC末端のいずれか一方又は両方にタグ配列を含んでいてもよい。
タグ配列を含む改変フィブロインのより具体的な例として、(5−iii)配列番号22(PRT720)、配列番号23(PRT665)若しくは配列番号24(PRT666)で示されるアミノ酸配列、又は(5−iv)配列番号22、配列番号23若しくは配列番号24で示されるアミノ酸配列と90%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、改変フィブロインを挙げることができる。
配列番号22、配列番号23及び配列番号24で示されるアミノ酸配列は、それぞれ配列番号19、配列番号20及び配列番号21で示されるアミノ酸配列のN末端に配列番号11で示されるアミノ酸配列(Hisタグ配列及びヒンジ配列を含む)を付加したものである。
(5−iii)の改変フィブロインは、配列番号22、配列番号23又は配列番号24で示されるアミノ酸配列からなるものであってもよい。
(5−iv)の改変フィブロインは、配列番号22、配列番号23又は配列番号24で示されるアミノ酸配列と90%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むものである。(5−iv)の改変フィブロインもまた、式1:[(A)nモチーフ−REP]mで表されるドメイン配列を含むタンパク質である。上記配列同一性は、95%以上であることが好ましい。
(5−iv)の改変フィブロインは、配列番号22、配列番号23又は配列番号24で示されるアミノ酸配列と90%以上の配列同一性を有し、かつ最もC末端側に位置する(A)nモチーフからドメイン配列のC末端までの配列をドメイン配列から除いた配列に含まれる全てのREPにおいて、連続する4アミノ酸残基の疎水性指標の平均値が2.6以上となる領域に含まれるアミノ酸残基の総数をpとし、最もC末端側に位置する(A)nモチーフからドメイン配列のC末端までの配列をドメイン配列から除いた配列に含まれるアミノ酸残基の総数をqとしたときに、p/qが6.2%以上であることが好ましい。
第5の改変フィブロインは、組換えタンパク質生産系において生産されたタンパク質を宿主の外部に放出するための分泌シグナルを含んでいてもよい。分泌シグナルの配列は、宿主の種類に応じて適宜設定することができる。
第6の改変フィブロインは、天然由来のフィブロインと比較して、グルタミン残基の含有量が低減されたアミノ酸配列を有する。
第6の改変フィブロインは、REPのアミノ酸配列中に、GGXモチーフ及びGPGXXモチーフから選ばれる少なくとも一つのモチーフが含まれていることが好ましい。
第6の改変フィブロインが、REP中にGPGXXモチーフを含む場合、GPGXXモチーフ含有率は、通常1%以上であり、5%以上であってもよく、10%以上であるのが好ましい。GPGXXモチーフ含有率の上限に特に制限はなく、50%以下であってよく、30%以下であってもよい。
本明細書において、「GPGXXモチーフ含有率」は、以下の方法により算出される値である。
式1:[(A)nモチーフ−REP]m、又は式2:[(A)nモチーフ−REP]m−(A)nモチーフで表されるドメイン配列を含むフィブロイン(改変フィブロイン又は天然由来のフィブロイン)において、最もC末端側に位置する(A)nモチーフからドメイン配列のC末端までの配列をドメイン配列から除いた配列に含まれる全てのREPにおいて、その領域に含まれるGPGXXモチーフの個数の総数を3倍した数(即ち、GPGXXモチーフ中のG及びPの総数に相当)をsとし、最もC末端側に位置する(A)nモチーフからドメイン配列のC末端までの配列をドメイン配列から除き、更に(A)nモチーフを除いた全REPのアミノ酸残基の総数をtとしたときに、GPGXXモチーフ含有率はs/tとして算出される。
式1:[(A)nモチーフ−REP]m、又は式2:[(A)nモチーフ−REP]m−(A)nモチーフで表されるドメイン配列を含むフィブロイン(改変フィブロイン又は天然由来のフィブロイン)において、最もC末端側に位置する(A)nモチーフからドメイン配列のC末端までの配列をドメイン配列から除いた配列に含まれる全てのREPにおいて、その領域に含まれるGPGXXモチーフの個数の総数を3倍した数(即ち、GPGXXモチーフ中のG及びPの総数に相当)をsとし、最もC末端側に位置する(A)nモチーフからドメイン配列のC末端までの配列をドメイン配列から除き、更に(A)nモチーフを除いた全REPのアミノ酸残基の総数をtとしたときに、GPGXXモチーフ含有率はs/tとして算出される。
GPGXXモチーフ含有率の算出において、「最もC末端側に位置する(A)nモチーフからドメイン配列のC末端までの配列をドメイン配列から除いた配列」を対象としているのは、「最もC末端側に位置する(A)nモチーフからドメイン配列のC末端までの配列」(REPに相当する配列)には、フィブロインに特徴的な配列と相関性の低い配列が含まれることがあり、mが小さい場合(つまり、ドメイン配列が短い場合)、GPGXXモチーフ含有率の算出結果に影響するので、この影響を排除するためである。なお、REPのC末端に「GPGXXモチーフ」が位置する場合、「XX」が例えば「AA」の場合であっても、「GPGXXモチーフ」として扱う。
図5は、改変フィブロインのドメイン配列を示す模式図である。図5を参照しながらGPGXXモチーフ含有率の算出方法を具体的に説明する。まず、図5に示した改変フィブロインのドメイン配列(「[(A)nモチーフ−REP]m−(A)nモチーフ」タイプである。)では、全てのREPが「最もC末端側に位置する(A)nモチーフからドメイン配列のC末端までの配列をドメイン配列から除いた配列」(図5中、「領域A」で示した配列。)に含まれているため、sを算出するためのGPGXXモチーフの個数は7であり、sは7×3=21となる。同様に、全てのREPが「最もC末端側に位置する(A)nモチーフからドメイン配列のC末端までの配列をドメイン配列から除いた配列」(図5中、「領域A」で示した配列。)に含まれているため、当該配列から更に(A)nモチーフを除いた全REPのアミノ酸残基の総数tは50+40+10+20+30=150である。次に、sをtで除すことによって、s/t(%)を算出することができ、図5の改変フィブロインの場合21/150=14.0%となる。
第6の改変フィブロインは、グルタミン残基含有率が9%以下であることが好ましく、7%以下であることがより好ましく、4%以下であることが更に好ましく、0%であることが特に好ましい。
本明細書において、「グルタミン残基含有率」は、以下の方法により算出される値である。
式1:[(A)nモチーフ−REP]m、又は式2:[(A)nモチーフ−REP]m−(A)nモチーフで表されるドメイン配列を含むフィブロイン(改変フィブロイン又は天然由来のフィブロイン)において、最もC末端側に位置する(A)nモチーフからドメイン配列のC末端までの配列をドメイン配列から除いた配列(図5の「領域A」に相当する配列。)に含まれる全てのREPにおいて、その領域に含まれるグルタミン残基の総数をuとし、最もC末端側に位置する(A)nモチーフからドメイン配列のC末端までの配列をドメイン配列から除き、更に(A)nモチーフを除いた全REPのアミノ酸残基の総数をtとしたときに、グルタミン残基含有率はu/tとして算出される。グルタミン残基含有率の算出において、「最もC末端側に位置する(A)nモチーフからドメイン配列のC末端までの配列をドメイン配列から除いた配列」を対象としている理由は、上述した理由と同様である。
式1:[(A)nモチーフ−REP]m、又は式2:[(A)nモチーフ−REP]m−(A)nモチーフで表されるドメイン配列を含むフィブロイン(改変フィブロイン又は天然由来のフィブロイン)において、最もC末端側に位置する(A)nモチーフからドメイン配列のC末端までの配列をドメイン配列から除いた配列(図5の「領域A」に相当する配列。)に含まれる全てのREPにおいて、その領域に含まれるグルタミン残基の総数をuとし、最もC末端側に位置する(A)nモチーフからドメイン配列のC末端までの配列をドメイン配列から除き、更に(A)nモチーフを除いた全REPのアミノ酸残基の総数をtとしたときに、グルタミン残基含有率はu/tとして算出される。グルタミン残基含有率の算出において、「最もC末端側に位置する(A)nモチーフからドメイン配列のC末端までの配列をドメイン配列から除いた配列」を対象としている理由は、上述した理由と同様である。
第6の改変フィブロインは、そのドメイン配列が、天然由来のフィブロインと比較して、REP中の1又は複数のグルタミン残基を欠失したこと、又は他のアミノ酸残基に置換したことに相当するアミノ酸配列を有するものであってよい。
「他のアミノ酸残基」は、グルタミン残基以外のアミノ酸残基であればよいが、グルタミン残基よりも疎水性指標の大きいアミノ酸残基であることが好ましい。アミノ酸残基の疎水性指標は表1に示すとおりである。
表1に示すとおり、グルタミン残基よりも疎水性指標の大きいアミノ酸残基としては、イソロイシン(I)、バリン(V)、ロイシン(L)、フェニルアラニン(F)、システイン(C)、メチオニン(M)アラニン(A)、グリシン(G)、スレオニン(T)、セリン(S)、トリプトファン(W)、チロシン(Y)、プロリン(P)及びヒスチジン(H)から選ばれるアミノ酸残基を挙げることができる。これらの中でも、イソロイシン(I)、バリン(V)、ロイシン(L)、フェニルアラニン(F)、システイン(C)、メチオニン(M)及びアラニン(A)から選ばれるアミノ酸残基であることがより好ましく、イソロイシン(I)、バリン(V)、ロイシン(L)及びフェニルアラニン(F)から選ばれるアミノ酸残基であることが更に好ましい。
第6の改変フィブロインは、REPの疎水性度が、−0.8以上であることが好ましく、−0.7以上であることがより好ましく、0以上であることが更に好ましく、0.3以上であることが更により好ましく、0.4以上であることが特に好ましい。REPの疎水性度の上限に特に制限はなく、1.0以下であってよく、0.7以下であってもよい。
本明細書において、「REPの疎水性度」は、以下の方法により算出される値である。
式1:[(A)nモチーフ−REP]m、又は式2:[(A)nモチーフ−REP]m−(A)nモチーフで表されるドメイン配列を含むフィブロイン(改変フィブロイン又は天然由来のフィブロイン)において、最もC末端側に位置する(A)nモチーフからドメイン配列のC末端までの配列をドメイン配列から除いた配列(図5の「領域A」に相当する配列。)に含まれる全てのREPにおいて、その領域の各アミノ酸残基の疎水性指標の総和をvとし、最もC末端側に位置する(A)nモチーフからドメイン配列のC末端までの配列をドメイン配列から除き、更に(A)nモチーフを除いた全REPのアミノ酸残基の総数をtとしたときに、REPの疎水性度はv/tとして算出される。REPの疎水性度の算出において、「最もC末端側に位置する(A)nモチーフからドメイン配列のC末端までの配列をドメイン配列から除いた配列」を対象としている理由は、上述した理由と同様である。
式1:[(A)nモチーフ−REP]m、又は式2:[(A)nモチーフ−REP]m−(A)nモチーフで表されるドメイン配列を含むフィブロイン(改変フィブロイン又は天然由来のフィブロイン)において、最もC末端側に位置する(A)nモチーフからドメイン配列のC末端までの配列をドメイン配列から除いた配列(図5の「領域A」に相当する配列。)に含まれる全てのREPにおいて、その領域の各アミノ酸残基の疎水性指標の総和をvとし、最もC末端側に位置する(A)nモチーフからドメイン配列のC末端までの配列をドメイン配列から除き、更に(A)nモチーフを除いた全REPのアミノ酸残基の総数をtとしたときに、REPの疎水性度はv/tとして算出される。REPの疎水性度の算出において、「最もC末端側に位置する(A)nモチーフからドメイン配列のC末端までの配列をドメイン配列から除いた配列」を対象としている理由は、上述した理由と同様である。
第6の改変フィブロインは、そのドメイン配列が、天然由来のフィブロインと比較して、REP中の1又は複数のグルタミン残基を欠失したこと、及び/又はREP中の1又は複数のグルタミン残基を他のアミノ酸残基に置換したことに相当する改変に加え、更に1又は複数のアミノ酸残基を置換、欠失、挿入及び/又は付加したことに相当するアミノ酸配列の改変があってもよい。
第6の改変フィブロインは、例えば、クローニングした天然由来のフィブロインの遺伝子配列からREP中の1又は複数のグルタミン残基を欠失させること、及び/又はREP中の1又は複数のグルタミン残基を他のアミノ酸残基に置換することにより得ることができる。また、例えば、天然由来のフィブロインのアミノ酸配列からREP中の1又は複数のグルタミン残基を欠失したこと、及び/又はREP中の1又は複数のグルタミン残基を他のアミノ酸残基に置換したことに相当するアミノ酸配列を設計し、設計したアミノ酸配列をコードする核酸を化学合成することにより得ることもできる。
第6の改変フィブロインのより具体的な例として、(6−i)配列番号25(Met−PRT888)、配列番号26(Met−PRT965)、配列番号27(Met−PRT889)、配列番号28(Met−PRT916)、配列番号29(Met−PRT918)、配列番号30(Met−PRT699)、配列番号31(Met−PRT698)、配列番号32(Met−PRT966)、配列番号41(Met−PRT917)若しくは配列番号42(Met−PRT1028)で示されるアミノ酸配列を含む改変フィブロイン、又は(6−ii)配列番号25、配列番号26、配列番号27、配列番号28、配列番号29、配列番号30、配列番号31、配列番号32、配列番号41若しくは配列番号42で示されるアミノ酸配列と90%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む改変フィブロインを挙げることができる。
(6−i)の改変フィブロインについて説明する。配列番号25で示されるアミノ酸配列は、配列番号7で示されるアミノ酸配列(Met−PRT410)中のQQを全てVLに置換したものである。配列番号26で示されるアミノ酸配列は、配列番号7で示されるアミノ酸配列中のQQを全てTSに置換し、かつ残りのQをAに置換したものである。配列番号27で示されるアミノ酸配列は、配列番号7で示されるアミノ酸配列中のQQを全てVLに置換し、かつ残りのQをIに置換したものである。配列番号28で示されるアミノ酸配列は、配列番号7で示されるアミノ酸配列中のQQを全てVIに置換し、かつ残りのQをLに置換したものである。配列番号29で示されるアミノ酸配列は、配列番号7で示されるアミノ酸配列中のQQを全てVFに置換し、かつ残りのQをIに置換したものである。
配列番号30で示されるアミノ酸配列は、配列番号8で示されるアミノ酸配列(Met−PRT525)中のQQを全てVLに置換したものである。配列番号31で示されるアミノ酸配列は、配列番号8で示されるアミノ酸配列中のQQを全てVLに置換し、かつ残りのQをIに置換したものである。
配列番号32で示されるアミノ酸配列は、配列番号7で示されるアミノ酸配列(Met−PRT410)中に存在する20個のドメイン配列の領域を2回繰り返した配列中のQQを全てVFに置換し、かつ残りのQをIに置換したものである。
配列番号41で示されるアミノ酸配列(Met−PRT917)は、配列番号7で示されるアミノ酸配列中のQQを全てLIに置換し、かつ残りのQをVに置換したものである。配列番号42で示されるアミノ酸配列(Met−PRT1028)は、配列番号7で示されるアミノ酸配列中のQQを全てIFに置換し、かつ残りのQをTに置換したものである。
配列番号25、配列番号26、配列番号27、配列番号28、配列番号29、配列番号30、配列番号31、配列番号32、配列番号41及び配列番号42で示されるアミノ酸配列は、いずれもグルタミン残基含有率は9%以下である(表2)。
(6−i)の改変フィブロインは、配列番号25、配列番号26、配列番号27、配列番号28、配列番号29、配列番号30、配列番号31、配列番号32、配列番号41又は配列番号42で示されるアミノ酸配列からなるものであってもよい。
(6−ii)の改変フィブロインは、配列番号25、配列番号26、配列番号27、配列番号28、配列番号29、配列番号30、配列番号31、配列番号32、配列番号41又は配列番号42で示されるアミノ酸配列と90%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むものである。(6−ii)の改変フィブロインもまた、式1:[(A)nモチーフ−REP]m、又は式2:[(A)nモチーフ−REP]m−(A)nモチーフで表されるドメイン配列を含むタンパク質である。上記配列同一性は、95%以上であることが好ましい。
(6−ii)の改変フィブロインは、グルタミン残基含有率が9%以下であることが好ましい。また、(6−ii)の改変フィブロインは、GPGXXモチーフ含有率が10%以上であることが好ましい。
第6の改変フィブロインは、N末端及びC末端のいずれか一方又は両方にタグ配列を含んでいてもよい。これにより、改変フィブロインの単離、固定化、検出及び可視化等が可能となる。
タグ配列を含む改変フィブロインのより具体的な例として、(6−iii)配列番号33(PRT888)、配列番号34(PRT965)、配列番号35(PRT889)、配列番号36(PRT916)、配列番号37(PRT918)、配列番号38(PRT699)、配列番号39(PRT698)、配列番号40(PRT966)、配列番号43(PRT917)若しくは配列番号44(PRT1028)で示されるアミノ酸配列を含む改変フィブロイン、又は(6−iv)配列番号33、配列番号34、配列番号35、配列番号36、配列番号37、配列番号38、配列番号39、配列番号40、配列番号43若しくは配列番号44で示されるアミノ酸配列と90%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む改変フィブロインを挙げることができる。
配列番号33、配列番号34、配列番号35、配列番号36、配列番号37、配列番号38、配列番号39、配列番号40、配列番号43及び配列番号44で示されるアミノ酸配列は、それぞれ配列番号25、配列番号26、配列番号27、配列番号28、配列番号29、配列番号30、配列番号31、配列番号32、配列番号41及び配列番号42で示されるアミノ酸配列のN末端に配列番号11で示されるアミノ酸配列(Hisタグ配列及びヒンジ配列を含む)を付加したものである。N末端にタグ配列を付加しただけであるため、グルタミン残基含有率に変化はなく、配列番号33、配列番号34、配列番号35、配列番号36、配列番号37、配列番号38、配列番号39、配列番号40、配列番号43及び配列番号44で示されるアミノ酸配列は、いずれもグルタミン残基含有率が9%以下である(表3)。
(6−iii)の改変フィブロインは、配列番号33、配列番号34、配列番号35、配列番号36、配列番号37、配列番号38、配列番号39、配列番号40、配列番号43又は配列番号44で示されるアミノ酸配列からなるものであってもよい。
(6−iv)の改変フィブロインは、配列番号33、配列番号34、配列番号35、配列番号36、配列番号37、配列番号38、配列番号39、配列番号40、配列番号43又は配列番号44で示されるアミノ酸配列と90%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むものである。(6−iv)の改変フィブロインもまた、式1:[(A)nモチーフ−REP]m、又は式2:[(A)nモチーフ−REP]m−(A)nモチーフで表されるドメイン配列を含むタンパク質である。上記配列同一性は、95%以上であることが好ましい。
(6−iv)の改変フィブロインは、グルタミン残基含有率が9%以下であることが好ましい。また、(6−iv)の改変フィブロインは、GPGXXモチーフ含有率が10%以上であることが好ましい。
第6の改変フィブロインは、組換えタンパク質生産系において生産されたタンパク質を宿主の外部に放出するための分泌シグナルを含んでいてもよい。分泌シグナルの配列は、宿主の種類に応じて適宜設定することができる。
改変フィブロインは、第1の改変フィブロイン、第2の改変フィブロイン、第3の改変フィブロイン、第4の改変フィブロイン、第5の改変フィブロイン、及び第6の改変フィブロインが有する特徴のうち、少なくとも2つ以上の特徴を併せ持つ改変フィブロインであってもよい。
スパイダーシルクであって横糸タンパク質に由来のタンパク質としては、例えば、式3:[REP2]oで表されるドメイン配列を含むタンパク質(ここで、式3中、REP2はGly−Pro−Gly−Gly−Xから構成されるアミノ酸配列を示し、Xはアラニン(Ala)、セリン(Ser)、チロシン(Tyr)及びバリン(Val)からなる群から選ばれる一つのアミノ酸を示す。oは8〜300の整数を示す。)をあげることができる。スパイダーシルクはセリンやチロシンのような水酸基を有する構造を多く含むが、これら水酸基はエステルに変換されうる官能基としてあげられる。
具体的には配列番号47で示されるアミノ酸配列を含むタンパク質をあげることができる。配列番号47で示されるアミノ酸配列は、NCBIデータベースから入手したアメリカジョロウグモの鞭毛状絹タンパク質の部分的な配列(NCBIアクセッション番号:AAF36090、GI:7106224)のリピート部分及びモチーフに該当するN末端から1220残基目から1659残基目までのアミノ酸配列(PR1配列と記す。)と、NCBIデータベースから入手したアメリカジョロウグモの鞭毛状絹タンパク質の部分配列(NCBIアクセッション番号:AAC38847、GI:2833649)のC末端から816残基目から907残基目までのC末端アミノ酸配列を結合し、結合した配列のN末端に配列番号11で示されるアミノ酸配列(タグ配列及びヒンジ配列)が付加されたものである。
コラーゲン由来のタンパク質として、例えば、式4:[REP3]pで表されるドメイン配列を含むタンパク質(ここで、式4中、pは5〜300の整数を示す。REP3は、Gly一X一Yから構成されるアミノ酸配列を示し、X及びYはGly以外の任意のアミノ酸残基を示す。複数存在するREP3は、互いに同一のアミノ酸配列でもよく、異なるアミノ酸配列でもよい。)を挙げることができる。具体的には、配列番号48で示されるアミノ酸配列を含むタンパク質を挙げることができる。配列番号48で示されるアミノ酸配列は、NCBIデータベースから入手したヒトのコラーゲンタイプ4の部分的な配列(NCBIのGenBankのアクセッション番号:CAA56335.1、GI:3702452)のリピート部分及びモチーフに該当する301残基目から540残基目までのアミノ酸配列のN末端に配列番号11で示されるアミノ酸配列(タグ配列及びヒンジ配列)が付加されたものである。
レシリン由来のタンパク質として、例えば、式5:[REP4]qで表されるドメイン配列を含むタンパク質(ここで、式5中、qは4〜300の整数を示す。REP4はSer一J一J一Tyr一Gly一U−Proから構成されるアミノ酸配列を示す。Jは任意のアミノ酸残基を示し、特にAsp、Ser及びThrからなる群から選ばれるアミノ酸残基であることが好ましい。Uは任意のアミノ酸残基を示し、特にPro、Ala、Thr及びSerからなる群から選ばれるアミノ酸残基であることが好ましい。複数存在するREP4は、互いに同一のアミノ酸配列でもよく、異なるアミノ酸配列でもよい。)を挙げることができる。具体的には、配列番号49で示されるアミノ酸配列を含むタンパク質を挙げることができる。配列番号49で示されるアミノ酸配列は、レシリン(NCBIのGenBankのアクセッション番号NP 611157、Gl:24654243)のアミノ酸配列において、87残基目のThrをSerに置換し、かつ95残基目のAsnをAspに置換した配列の19残基目から321残基目までのアミノ酸配列のN末端に配列番号11で示されるアミノ酸配列(タグ配列及びヒンジ配列)が付加されたものである。
エラスチン由来のタンパク質として、例えば、NCBIのGenBankのアクセッション番号AAC98395(ヒト)、I47076(ヒツジ)、NP786966(ウシ)等のアミノ酸配列を有するタンパク質を挙げることができる。具体的には、配列番号50で示されるアミノ酸配列を含むタンパク質を挙げることができる。配列番号50で示されるアミノ酸配列は、NCBIのGenBankのアクセッション番号AAC98395のアミノ酸配列の121残基目から390残基目までのアミノ酸配列のN末端に配列番号11で示されるアミノ酸配列(タグ配列及びヒンジ配列)が付加されたものである。
ケラチン由来のタンパク質として、例えば、カプラ・ヒルクス(Capra hircus)のタイプIケラチン等を挙げることができる。具体的には、配列番号51で示されるアミノ酸配列(NCBIのGenBankのアクセッション番号ACY30466のアミノ酸配列)を含むタンパク質を挙げることができる。
(タンパク質の製造方法)
タンパク質は、例えば、当該タンパク質をコードする核酸配列と、当該核酸配列に作動可能に連結された1又は複数の調節配列とを有する発現ベクターで形質転換された宿主により、当該核酸を発現させることにより生産することができる。
タンパク質は、例えば、当該タンパク質をコードする核酸配列と、当該核酸配列に作動可能に連結された1又は複数の調節配列とを有する発現ベクターで形質転換された宿主により、当該核酸を発現させることにより生産することができる。
タンパク質をコードする遺伝子の製造方法は特に制限されない。例えば、天然の構造タンパク質をコードする遺伝子を利用して、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)などで増幅しクローニングする方法、又は、化学的な合成によって、遺伝子を製造することができる。遺伝子の化学的な合成方法も特に制限されず、例えば、NCBIのウェブデータベースなどより入手した構造タンパク質のアミノ酸配列情報をもとに、AKTA oligopilot plus 10/100(GEヘルスケア・ジャパン株式会社)などで自動合成したオリゴヌクレオチドをPCRなどで連結する方法によって遺伝子を化学的に合成することができる。この際に、タンパク質の精製や確認を容易にするため、上記のアミノ酸配列のN末端に開始コドン及びHis10タグからなるアミノ酸配列を付加したアミノ酸配列からなるタンパク質、をコードする遺伝子を合成してもよい。
調節配列は、宿主におけるタンパク質の発現を制御する配列(例えば、プロモーター、エンハンサー、リボソーム結合配列、転写終結配列等)であり、宿主の種類に応じて適宜選択することができる。プロモーターとして、宿主細胞中で機能し、組換えタンパク質を発現誘導可能な誘導性プロモーターを用いても良い。誘導性プロモーターは、誘導物質(発現誘導剤)の存在、リプレッサー分子の非存在、又は温度、浸透圧若しくはpH値の上昇若しくは低下等の物理的要因により、転写を制御できるプロモーターである。
発現ベクターの種類は、プラスミドベクター、ウイルスベクター、コスミドベクター、フォスミドベクター、人工染色体ベクター等、宿主の種類に応じて適宜選択することができる。発現ベクターとしては、宿主細胞において自立複製が可能、又は宿主の染色体中への組込みが可能で、タンパク質をコードする核酸を転写できる位置にプロモーターを含有しているものが好適に用いられる。
宿主として、原核生物、並びに酵母、糸状真菌、昆虫細胞、動物細胞及び植物細胞等の真核生物のいずれも好適に用いることができる。
原核生物の好ましい例として、エシェリヒア属、ブレビバチルス属、セラチア属、バチルス属、ミクロバクテリウム属、ブレビバクテリウム属、コリネバクテリウム属及びシュードモナス属等に属する細菌を挙げることができる。エシェリヒア属に属する微生物として、例えば、エシェリヒア・コリ等を挙げることができる。ブレビバチルス属に属する微生物として、例えば、ブレビバチルス・アグリ等を挙げることができる。セラチア属に属する微生物として、例えば、セラチア・リクエファシエンス等を挙げることができる。バチルス属に属する微生物として、例えば、バチルス・サチラス等を挙げることができる。ミクロバクテリウム属に属する微生物として、例えば、ミクロバクテリウム・アンモニアフィラム等を挙げることができる。ブレビバクテリウム属に属する微生物として、例えば、ブレビバクテリウム・ディバリカタム等を挙げることができる。コリネバクテリウム属に属する微生物として、例えば、コリネバクテリウム・アンモニアゲネス等を挙げることができる。シュードモナス(Pseudomonas)属に属する微生物として、例えば、シュードモナス・プチダ等を挙げることができる。
原核生物を宿主とする場合、組換えタンパク質をコードする核酸を導入するベクターとしては、例えば、pBTrp2(ベーリンガーマンハイム社製)、pGEX(Pharmacia社製)、pUC18、pBluescriptII、pSupex、pET22b、pCold、pUB110、pNCO2(特開2002−238569号公報)等を挙げることができる。
真核生物の宿主としては、例えば、酵母及び糸状真菌(カビ等)を挙げることができる。酵母としては、例えば、サッカロマイセス属、ピキア属、シゾサッカロマイセス属等に属する酵母を挙げることができる。糸状真菌としては、例えば、アスペルギルス属、ペニシリウム属、トリコデルマ(Trichoderma)属等に属する糸状真菌を挙げることができる。
真核生物を宿主とする場合、組換えタンパク質をコードする核酸を導入するベクターとしては、例えば、YEP13(ATCC37115)、YEp24(ATCC37051)等を挙げることができる。上記宿主細胞への発現ベクターの導入方法としては、上記宿主細胞へDNAを導入する方法であればいずれも用いることができる。例えば、カルシウムイオンを用いる方法〔Proc. Natl. Acad. Sci. USA,69,2110 (1972)〕、エレクトロポレーション法、スフェロプラスト法、プロトプラスト法、酢酸リチウム法、コンピテント法等を挙げることができる。
発現ベクターで形質転換された宿主による核酸の発現方法としては、直接発現のほか、モレキュラー・クローニング第2版に記載されている方法等に準じて、分泌生産、融合タンパク質発現等を行うことができる。
タンパク質は、例えば、発現ベクターで形質転換された宿主を培養培地中で培養し、培養培地中にタンパク質を生成蓄積させ、該培養培地から採取することにより製造することができる。宿主を培養培地中で培養する方法は、宿主の培養に通常用いられる方法に従って行うことができる。
宿主が、大腸菌等の原核生物又は酵母等の真核生物である場合、培養培地として、宿主が資化し得る炭素源、窒素源及び無機塩類等を含有し、宿主の培養を効率的に行える培地であれば天然培地、合成培地のいずれを用いてもよい。
炭素源としては、上記形質転換微生物が資化し得るものであればよく、例えば、グルコース、フラクトース、スクロース、及びこれらを含有する糖蜜、デンプン及びデンプン加水分解物等の炭水化物、酢酸及びプロピオン酸等の有機酸、並びにエタノール及びプロパノール等のアルコール類を用いることができる。窒素源としては、例えば、アンモニア、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、酢酸アンモニウム及びリン酸アンモニウム等の無機酸又は有機酸のアンモニウム塩、その他の含窒素化合物、並びにペプトン、肉エキス、酵母エキス、コーンスチープリカー、カゼイン加水分解物、大豆粕及び大豆粕加水分解物、各種発酵菌体及びその消化物を用いることができる。無機塩としては、例えば、リン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、硫酸銅及び炭酸カルシウムを用いることができる。
大腸菌等の原核生物又は酵母等の真核生物の培養は、例えば、振盪培養又は深部通気攪拌培養等の好気的条件下で行うことができる。培養温度は、例えば、15〜40℃である。培養時間は、通常16時間〜7日間である。培養中の培養培地のpHは3.0〜9.0に保持することが好ましい。培養培地のpHの調整は、無機酸、有機酸、アルカリ溶液、尿素、炭酸カルシウム及びアンモニア等を用いて行うことができる。
また、培養中必要に応じて、アンピシリン及びテトラサイクリン等の抗生物質を培養培地に添加してもよい。プロモーターとして誘導性のプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養するときには、必要に応じてインデューサーを培地に添加してもよい。例えば、lacプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養するときにはイソプロピル−β−D−チオガラクトピラノシド等を、trpプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養するときにはインドールアクリル酸等を培地に添加してもよい。
発現させたタンパク質の単離、精製は通常用いられている方法で行うことができる。例えば、当該タンパク質が、細胞内に溶解状態で発現した場合には、培養終了後、宿主細胞を遠心分離により回収し、水系緩衝液に懸濁した後、超音波破砕機、フレンチプレス、マントンガウリンホモゲナイザー及びダイノミル等により宿主細胞を破砕し、無細胞抽出液を得る。該無細胞抽出液を遠心分離することにより得られる上清から、タンパク質の単離精製に通常用いられている方法、すなわち、溶媒抽出法、硫安等による塩析法、脱塩法、有機溶媒による沈殿法、ジエチルアミノエチル(DEAE)−セファロース、DIAION HPA−75(三菱化成社製)等のレジンを用いた陰イオン交換クロマトグラフィー法、S−Sepharose FF(Pharmacia社製)等のレジンを用いた陽イオン交換クロマトグラフィー法、ブチルセファロース、フェニルセファロース等のレジンを用いた疎水性クロマトグラフィー法、分子篩を用いたゲルろ過法、アフィニティークロマトグラフィー法、クロマトフォーカシング法、等電点電気泳動等の電気泳動法等の方法を単独又は組み合わせて使用し、精製標品を得ることができる。
また、タンパク質が細胞内に不溶体を形成して発現した場合は、同様に宿主細胞を回収後、破砕し、遠心分離を行うことにより、沈殿画分として組換えタンパク質の不溶体を回収する。回収したタンパク質の不溶体は蛋白質変性剤で可溶化することができる。該操作の後、上記と同様の単離精製法によりタンパク質の精製標品を得ることができる。当該タンパク質が細胞外に分泌された場合には、培養上清から当該タンパク質を回収することができる。すなわち、培養物を遠心分離等の手法により処理することにより培養上清を取得し、該培養上清から、上記と同様の単離精製法を用いることにより、精製標品を得ることができる。
<調整工程>
調整工程では、タンパク質成形体前駆体のβシート構造におけるレクトアングラー型パッキング構造及びスタッガード型パッキング構造の合計含有量(C1+C2)に対するスタッガード型パッキング構造の含有量(C2)の比(C2/(C1+C2))を調整する。この調整工程を行うことで、上記の比(C2/(C1+C2)が所望の値とされたタンパク質成形体前駆体を得るようにしてもよく、或いは上記の比(C2/(C1+C2)が所望の値とされたタンパク質成形体を得るようにしてもよい。前者の場合は、上記の比(C2/(C1+C2)が所望の値とされたタンパク質成形体前駆体から、上記調整工程とは別個の工程を経て、目的とするタンパク質成形体が製造されることとなる。タンパク質成形体の形状としては、繊維、フィルム、多孔質体、モールド成形体等が挙げられる。
調整工程では、タンパク質成形体前駆体のβシート構造におけるレクトアングラー型パッキング構造及びスタッガード型パッキング構造の合計含有量(C1+C2)に対するスタッガード型パッキング構造の含有量(C2)の比(C2/(C1+C2))を調整する。この調整工程を行うことで、上記の比(C2/(C1+C2)が所望の値とされたタンパク質成形体前駆体を得るようにしてもよく、或いは上記の比(C2/(C1+C2)が所望の値とされたタンパク質成形体を得るようにしてもよい。前者の場合は、上記の比(C2/(C1+C2)が所望の値とされたタンパク質成形体前駆体から、上記調整工程とは別個の工程を経て、目的とするタンパク質成形体が製造されることとなる。タンパク質成形体の形状としては、繊維、フィルム、多孔質体、モールド成形体等が挙げられる。
「レクトアングラー型パッキング構造」は、複数積層されたβシート構造におけるパッキング構造の一形態であり、互いに隣り合う二つのβシート構造をそれぞれ構成するポリペプチド鎖が、βシート面に対して略垂直方向(βシートの積層方向)に対応配置されている構造を意味する。つまり、積層方向において隣り合うポリペプチド鎖が、積層方向視において、互いに間隔を隔てて重なるように位置している。レクトアングラー型パッキング構造を構成するβシート構造は、逆平行βシート構造であってもよく、平行βシート構造であってもよい。レクトアングラー型パッキング構造中の少なくとも一部のポリペプチド鎖は、複数個のアラニン残基からなるポリペプチド鎖(ポリアラニン鎖)であってよく、レクトアングラー型パッキング構造中の全部のポリペプチド鎖が、複数個のアラニン残基からなるポリペプチド鎖(ポリアラニン鎖)であってよい。すなわち、レクトアングラー型パッキング構造は、複数のアラニン残基からなるポリペプチド鎖により形成されていてよい。
図6Aは、レクトアングラー型パッキング構造の一例を示す(図6Aの出典:Angew,Chem.Int.Ed.Eng.,2012年,51巻,pp.1212−1215)。図6A中のa方向は、ポリペプチド鎖(主鎖)の一方の末端側から他方の末端側に向かう方向(主鎖に沿う方向)を示し、b方向は、a方向と直交し、かつ、βシート面に沿う方向を示し、c方向は、βシート構造の積層方向を示す。
図6Aでは、6個のアラニン残基からなるポリペプチド鎖(ポリアラニン鎖)で構成されるβシート構造が積層し、かつ、該ポリペプチド鎖が、βシート面に対して略垂直方向(図6A中のc方向)に互いに対応するように配置されている。図6Aにおいて示されるレクトアングラー構造は、6個のアラニン残基からなるポリペプチド鎖で形成されている。
「スタッガード型パッキング構造」は、複数積層されたβシート構造のパッキング構造のレクトアングラーパッキング構造とは別の形態であり、互いに隣り合う二つのβシート構造をそれぞれ構成するポリペプチド鎖のうち、一方のβシート構造のポリペプチド鎖が、他方のβシートのシート面方向に隣り合うポリペプチド鎖同士の間に、積層方向視において位置するように配置されている構造を意味する。つまり、積層方向において隣り合うポリペプチド鎖が、積層方向視において交互に位置している。スタッガード型パッキング構造を構成するβシートは、逆平行βシート構造であってもよく、平行βシート構造であってもよい。スタッガード型パッキング構造中の少なくとも一部のポリペプチド鎖は、複数個のアラニン残基からなるポリペプチド鎖(ポリアラニン鎖)であってよく、スタッガード型パッキング構造中の全部のポリペプチド鎖が、複数個のアラニン残基からなるポリペプチド鎖(ポリアラニン鎖)であってよい。すなわち、スタッガード型パッキング構造は、複数のアラニン残基からなるポリペプチド鎖により形成されていてよい。
図6Bは、スタッガード型パッキング構造の一例を示す(図6Bの出典:Angew,Chem.Int.Ed.Eng.,2012年,51巻,pp.1212−1215)。図6中のa方向は、ポリペプチド鎖(主鎖)の一方の末端側から、他方の末端側に向かう方向(主鎖に沿う方向)を示し、b方向は、a方向と直交し、かつ、βシート面に沿う方向を示し、c方向は、βシート構造の積層方向を示す。
図6Bでは、7個のアラニン残基からなるポリペプチド鎖(ポリアラニン鎖)で構成されるβシート構造が積層し、かつ、互いに隣り合うβシート構造のそれぞれのポリペプチド鎖が、積層方向視において交互に位置するように配置されている。図6Bにおいて示されるスタッガード型パッキング構造は、7個のアラニン残基からなるポリペプチド鎖で形成されている。
C2/(C1+C2)は、目的とするタンパク質成形体の用途等に応じて、適宜設定してよい。例えば、C2/(C1+C2)は、0.40以上、0.45以上、0.50以上、0.55以上、0.60以上、又は0.65以上、又は0.67以上となるように調整してもよい。例えば、C2/(C1+C2)は、0.95以下、0.90以下、0.85以下、0.80以下、0.75以下、又は0.70以下に調整してもよい。
C2/(C1+C2)は、13C固体NMRスペクトル分析等を用いて測定することができる。C2/(C1+C2)は、13C固体NMRスペクトルにおけるアラニン残基側鎖炭素原子のシグナル面積に基づいて決定されるものであることが好ましい。
13C固体NMRスペクトル分析によるC2/(C1+C2)の測定は、それぞれのパッキング構造に由来するアミノ酸残基側鎖のシグナルを分離し、分離したそれぞれのシグナルの面積を測定することにより、実施することができる。
レクトアングラー型パッキング構造及びスタッガード型パッキング構造が、アラニン残基からなるポリペプチド鎖(ポリアラニン鎖)で形成されている場合、例えば、次に示す13C固体NMRスペクトル分析法により、C2/(C1+C2)を算出することができる。
13C固体NMRスペクトルにおいて、20.5±0.5ppmにピークを有するシグナル(第1のシグナル)は、レクトアングラー型パッキング構造に存在するアラニン残基側鎖炭素原子(AlaCβ)に由来する。13C固体NMRスペクトルにおいて、19.5±0.5ppm及び22.7±0.5ppmそれぞれにピークを有するシグナル(第2のシグナル)は、スタッガード型パッキング構造に存在するアラニン側鎖炭素原子(AlaCβ)に由来する。まず、測定対象物の13C固体NMRスペクトルを測定する。測定した13C固体NMRスペクトルを第1のシグナルと第2のシグナルとに分離する。分離したそれぞれのシグナルの面積を測定する。第1のシグナルの面積S1は、レクトアングラー型パッキング構造の含有量(C1)と相関し、第2のシグナルの面積S2は、スタッガード型パッキング構造の含有量(C2)と相関する。測定したシグナルの面積から、式:S2/(S1+S2)により、C2/(C1+C2)を求める。
一般的に、13C固体NMRスペクトルにおけるアラニンメチル炭素ピークのケミカルシフトは、±0.5°の範囲内で誤差が生じ得るものである。ケミカルシフトの誤差は、ピークの幅が大きいかどうかに依存し、この場合はピークの幅が比較的に大きい。したがって、上記ケミカルシフトの値は±0.5°程度の範囲内の数値を包含するものとして理解されるべきである。
13C固体NMRスペクトルの測定は、具体的には、実施例に記載の方法で測定することができる。13C固体NMRスペクトルにおけるアラニン残基側鎖炭素原子(AlaCβ)は、Dipolar Dephasing法(例えば、J.Am.Chem.Soc.1983年、105巻、pp.6697−6704)を用いて好適に測定することができる。
レクトアングラー型パッキング構造及びスタッガード型パッキング構造が、アラニン残基からなるポリペプチド鎖(ポリアラニン鎖)で形成されている場合、例えば、粉末X線回折法により、C2/(C1+C2)を算出することができる可能性がある。
成形体前駆体の形状は特に限定されず、例えば、粉末状、フィルム状、繊維状(ファイバー状)、板状、塊状等であってよい。成形体前駆体としては、例えば、粉末状のタンパク質をそのまま用いることもできるし、タンパク質を公知の方法で成形したものを用いることもできる。本実施形態に係るタンパク質成形体の製造方法は、調整工程の前に、例えば、タンパク質を含む成形体前駆体を準備する準備工程を更に備えていてもよい。
板状、又は塊状の成形体前駆体は、例えば、タンパク質を含む組成物を加熱および加圧して得ることができる。具体的には、例えば、以下の操作が実施される。即ち、先ず、タンパク質を含む組成物(タンパク質のみ、或いは他の成分を含む)を加圧成形機の金型に導入した後、金型を加熱すると共に組成物に対して加圧する。所定の加圧下でタンパク質が所定の温度に達するまで加熱及び加圧を継続して、加熱及び加圧された組成物を得る。次いで、冷却器(例えばスポットクーラー)を用いて金型の温度を下降させ、組成物が所定の温度になったところで、内容物を取り出して成形体前駆体(モールド成形体)を得る。加熱は、80〜300℃で行うことが好ましく、100〜180℃がより好ましく、100〜130℃が更に好ましい。加圧は、5kN以上で行うことが好ましく、10kN以上がより好ましく、20kN以上が更に好ましい。また、所定の加熱加圧条件に達した後、その条件での処理を続ける時間(保温条件)は、0〜100分が好ましく、1〜50分がより好ましく、5〜30分が更に好ましい。
繊維状の成形体前駆体は、例えば、タンパク質及び溶媒を含有するタンパク質溶液を用いて、湿式紡糸、乾式紡糸、乾湿式紡糸等の公知の紡糸方法により紡糸して形成させることができる。フィルム状の成形体前駆体は、例えば、タンパク質及び溶媒を含有するタンパク質溶液の膜を形成し、形成された膜から溶媒を除去する方法により得られる。
調整工程は、例えば、成形体前駆体の形状に応じて、適宜選択して行うことができる。調整工程は、成形体前駆体の加熱、加圧、水との接触、圧延等の処理により行われてよい。上述した成形前駆体の処理は、組み合わせて実施されてもよい。すなわち、例えば、調整工程は、成形体前駆体の加熱及び加圧により行われてもよく、成形体前駆体の加熱及び水との接触により行われてもよい。調整工程が、成形体前駆体の加熱及び水との接触により行われる場合、例えば、成形体前駆体は、加熱した後に、水と接触させてもよく、水と接触させた後に加熱してもよく、水と接触させた状態で加熱してもよい。
調整工程が、成形体前駆体の加熱及び/又は水との接触により行われてよい。すなわち、成形体前駆体の加熱及び/又は水との接触により、C2/(C1+C2)を調整してよい。成形体前駆体が繊維状である場合、調整工程は、成形体前駆体の加熱及び/又は水との接触により行われることが好ましい。
成形体前駆体の加熱温度の下限は、例えば、50℃以上であってもよく、70℃以上であってもよく、100℃以上であってもよく、130℃以上であってもよく、160℃以上であってもよく、190℃℃以上であってよい。成形体前駆体の加熱温度の上限は、例えば、220℃以下であってもよく、200℃以下であってもよい。成形体前駆体の加熱時間(上記加熱温度に保持する時間)は、例えば、0.5時間以上3時間以下であってよく、1時間以上2時間以下であってよい。
成形体前駆体と水を接触させる方法としては、例えば、成形体前駆体を水中に浸漬する方法、成形体前駆体に対して水を常温で又は加温したスチーム等の状態で噴霧する方法、及び成形体前駆体を水蒸気が充満した高湿度環境下に暴露する方法等が挙げられる。
成形体前駆体に接触させる水の温度は、沸点未満であってよい。水の温度の下限値は、10℃以上、40℃以上、又は70℃以上であってよい。水の温度の上限値は90℃以下であってよい。成形体前駆体を水と接触させる場合、調整工程は、更に、成形体前駆体を水と接触させた後に、乾燥させることを含んでいてもよい。
調整工程は、成形体前駆体の加熱及び加圧により行われてよい。すなわち、成形体前駆体の加熱及び加圧により、C2/(C1+C2)を調整してよい。成形体前駆体が粉末状である場合、調整工程は、成形体前駆体の加熱及び加圧により行われることが好ましい。加熱は、50〜250℃で行うことが好ましく、80〜200℃がより好ましく、120〜160℃が更に好ましい。加圧は、5MPa以上で行うことが好ましく、10MPa以上がより好ましく、30MPa以上が更に好ましい。また、所定の加熱加圧条件に達した後、その条件での処理を続ける時間(保温条件)は、0〜15分が好ましく、1〜10分がより好ましく、3〜5分が更に好ましい。
調整工程は、成形体前駆体を圧延することにより行われてもよい。すなわち、成形体前駆体の圧延により、C2/(C1+C2)を調整してよい。成形体前駆体が、粉末状のタンパク質を加熱及び加圧して得られる加熱加圧体である場合、調整工程は、成形体前駆体を圧延することにより行われることが好ましい。
圧延は、たとえば延伸機を用いて実施することができる。この延伸機の構成は、特に限定はされないが、たとえば、2本の円筒状のロールを有する延伸機が用いられる。圧延工程では、たとえば2本のロールで成形体を挟み込んで圧力を加えつつ、2本のロールをそれぞれ回転させて送り出す。これにより、成形体の全体を圧縮延伸する。なお、延伸機は、2本のロールを用いた形態に限られず、圧縮延伸を行い得る他の形態の延伸機を用いてもよい。たとえば、平板状の基盤とロールとを備える延伸機を用い、基盤上に成形組成物を置き、その上からロールを転がしつつ押し当てることで、成形体前駆体を圧縮延伸してもよい。あるいは、平板状の上金型および下金型を備える延伸機を用い、上金型および下金型により成形体前駆体を挟み込んで圧力を加えることで、成形体前駆体を圧縮延伸してもよい。圧下率の設定は、2本のロールの場合と同様である。上の部材と下の部材の位置(間隔)が決められることで、成形体の圧下率が設定され得る。成形体前駆体の圧延は、加熱しつつ実施することもできるし、加熱することなく実施することもできる。成形体前駆体を圧延しながら加熱する場合、加熱延伸機が用いられ得る。圧延しながら加熱を行う場合、加熱は、80〜200℃で行うことが好ましく、100〜180℃がより好ましく、120〜160℃が更に好ましい。
成形体前駆体は、式A:{(圧延前の成形体前駆体の厚さ−圧延後の成形体前駆体の厚さ)/圧延前の成形体前駆体の厚さ}×100で表される圧下率(成形体の厚みの減少率)を制御することにより、レクトアングラー型パッキング構造及びスタッガード型パッキング構造の合計含有量に対するスタッガード型パッキング構造の含有量を調整してもよい。
例えば、成形体前駆体の圧延は、圧下率が10%以上、15%以上、20%以上、25%以上、30%以上、35%以上、40%以上、45%以上、50%以上、55%以上、又は60%以上となるように調整してもよい。例えば、成形体前駆体の圧延は、圧下率が90%以下、80%以下、70%以下、又は65%となるように調整してもよい。2本のロール(上ロールおよび下ロール)を有する圧延機を用いる場合には、これらのロールの位置(間隔)が決められることで、成形体の圧下率が設定され得る。
<評価工程>
本実施形態に係るタンパク質成形体の製造方法は、上述した調整工程の前及び/又は後に、成形体前駆体又はタンパク質成形体のレクトアングラー型パッキング構造及びスタッガード型パッキング構造の合計含有量に対するスタッガード型パッキング構造の含有量の比(C2/(C1+C2))を評価する工程を含んでいてもよい。
本実施形態に係るタンパク質成形体の製造方法は、上述した調整工程の前及び/又は後に、成形体前駆体又はタンパク質成形体のレクトアングラー型パッキング構造及びスタッガード型パッキング構造の合計含有量に対するスタッガード型パッキング構造の含有量の比(C2/(C1+C2))を評価する工程を含んでいてもよい。
本発明の他の実施形態として、タンパク質成形体のレクトアングラー型パッキング構造及びスタッガード型パッキング構造の合計含有量に対するスタッガード型パッキング構造の含有量の比(C2/(C1+C2))を評価する評価工程を備える、タンパク質成形体の製造方法が提供される。当該製造方法は、評価工程の前に、上述した調整工程を更に備えていてもよい。
評価工程は、例えば、C2/(C1+C2)を測定し、C2/(C1+C2)が基準値以上であると評価することを含んでいてもよい。C2/(C1+C2)の基準値は、例えば、0.40以上、0.45以上、0.50以上、0.55以上、0.60以上、0.65以上、又は0.67以上であってよい。C2/(C1+C2)の基準値は、例えば、0.95以下、0.90以下、0.85以下、0.80以下、0.75以下、又は0.70以下であってよい。
評価工程は、例えば、C2/(C1+C2)が基準値以上のタンパク質成形体を選別することを含んでいてもよい。
<タンパク質成形体の物性をコントロールする方法>
本実施形態に係るタンパク質成形体の物性をコントロールする方法は、タンパク質を含む成形体前駆体から、タンパク質成形体を製造する際に、成形体前駆体のレクトアングラー型パッキング構造及びスタッガード型パッキング構造の合計含有量に対するスタッガード型パッキング構造の含有量の比を調整する調整工程を備える。調整工程については、上述したとおりである。
本実施形態に係るタンパク質成形体の物性をコントロールする方法は、タンパク質を含む成形体前駆体から、タンパク質成形体を製造する際に、成形体前駆体のレクトアングラー型パッキング構造及びスタッガード型パッキング構造の合計含有量に対するスタッガード型パッキング構造の含有量の比を調整する調整工程を備える。調整工程については、上述したとおりである。
物性は、例えば、曲げ弾性率であってよく、引張強度であってよく、落下衝撃であってよい。曲げ弾性率は、後述する実施例に記載の曲げ試験により測定される。
<タンパク質成形体の品質を評価する方法>
本実施形態に係るタンパク質成形体の品質を評価する方法は、13C固体NMRスペクトルにおいて、ケミカルシフト20.5±0.5ppmにピークを有する第1のシグナルの面積と、ケミカルシフト19.5±0.5ppm及び22.7±0.5ppmにピークを有する第2のシグナルの面積を測定し、式B:第2のシグナルの面積/(第1のシグナルの面積+第2のシグナルの面積)で表されるシグナル面積比を算出する工程を備える。本実施形態に係る方法は、上記シグナル面積比を算出する工程を備えるため、タンパク質成形体の品質(例えば、物性)を簡便に評価することができる。本実施形態に係る方法によれば、曲げ弾性率、引張強度、落下衝撃といった物性を簡便に評価することができる。
本実施形態に係るタンパク質成形体の品質を評価する方法は、13C固体NMRスペクトルにおいて、ケミカルシフト20.5±0.5ppmにピークを有する第1のシグナルの面積と、ケミカルシフト19.5±0.5ppm及び22.7±0.5ppmにピークを有する第2のシグナルの面積を測定し、式B:第2のシグナルの面積/(第1のシグナルの面積+第2のシグナルの面積)で表されるシグナル面積比を算出する工程を備える。本実施形態に係る方法は、上記シグナル面積比を算出する工程を備えるため、タンパク質成形体の品質(例えば、物性)を簡便に評価することができる。本実施形態に係る方法によれば、曲げ弾性率、引張強度、落下衝撃といった物性を簡便に評価することができる。
第1のシグナルは、13C固体NMRスペクトルにおいて、ケミカルシフト20.5±0.5ppmにピークを有するシグナルであり、レクトアングラー型パッキング構造に存在するアラニン残基側鎖炭素原子(AlaCβ)に由来する。第2のシグナルは、13C固体NMRスペクトルにおいて、ケミカルシフト19.5±0.5ppm及び22.7±0.5ppmそれぞれにピークを有するシグナルであり、スタッガード型パッキング構造に存在するアラニン残基側鎖炭素原子(AlaCβ)に由来する。13C固体NMRスペクトルの測定方法及びAlaCβのシグナル面積を測定する方法は上述したとおりである。
本実施形態に係る方法は、算出されたシグナル面積比が基準値内であると判定する工程を備えていてよく、算出されたシグナル面積比が基準値内のタンパク質成形体を選別する工程を備えていてもよい。
シグナル面積比の基準値は、例えば、0.40以上、0.45以上、0.50以上、0.55以上、0.60以上、0.65以上、又は0.67以上であってよい。シグナル面積比の基準値は、例えば、0.95以下、0.90以下、0.85以下、0.80以下、0.75以下、又は0.70以下であってよい。
以下、実施例を挙げて本発明についてさらに具体的に説明する。ただし、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
〔改変クモ糸フィブロインの製造〕
(1)プラスミド発現株の作製
ネフィラ・クラビペス(Nephila clavipes)由来のフィブロイン(GenBankアクセッション番号:P46804.1、GI:1174415)の塩基配列及びアミノ酸配列に基づき、配列番号15で示されるアミノ酸配列を有する改変フィブロイン(以下、「PRT410」ともいう。)を設計した。配列番号15で示されるアミノ酸配列は、ネフィラ・クラビペス由来のフィブロインのアミノ酸配列に対して、生産性の向上を目的としてアミノ酸残基の置換、挿入及び欠失を施したアミノ酸配列と、そのN末端に付加された配列番号11で示されるアミノ酸配列(タグ配列及びヒンジ配列)とを有する。
(1)プラスミド発現株の作製
ネフィラ・クラビペス(Nephila clavipes)由来のフィブロイン(GenBankアクセッション番号:P46804.1、GI:1174415)の塩基配列及びアミノ酸配列に基づき、配列番号15で示されるアミノ酸配列を有する改変フィブロイン(以下、「PRT410」ともいう。)を設計した。配列番号15で示されるアミノ酸配列は、ネフィラ・クラビペス由来のフィブロインのアミノ酸配列に対して、生産性の向上を目的としてアミノ酸残基の置換、挿入及び欠失を施したアミノ酸配列と、そのN末端に付加された配列番号11で示されるアミノ酸配列(タグ配列及びヒンジ配列)とを有する。
PRT410をコードする核酸を合成した。この核酸の5’末端にNdeIサイトを付加し、この核酸の終止コドン下流にEcoRIサイトを付加した。核酸をクローニングベクター(pUC118)にクローニングした。その後、PRT410をコードする核酸をNdeI及びEcoRIで制限酵素処理して切り出した。切り出された核酸をタンパク質発現ベクターpET−22b(+)に組換えて発現ベクターを得た。
(2)タンパク質の発現
得られたpET22b(+)発現ベクターにより、大腸菌BLR(DE3)を形質転換した。形質転換された大腸菌を、アンピシリンを含む2mLのLB培地で15時間培養した。次いで、培養液を、アンピシリンを含む100mLの表4に示されるシード培養用培地に、OD600が0.005となるように添加した。培養液の温度を30℃に保ち、OD600が5になるまで、約15時間かけてフラスコ培養を行い、シード培養液を得た。
得られたpET22b(+)発現ベクターにより、大腸菌BLR(DE3)を形質転換した。形質転換された大腸菌を、アンピシリンを含む2mLのLB培地で15時間培養した。次いで、培養液を、アンピシリンを含む100mLの表4に示されるシード培養用培地に、OD600が0.005となるように添加した。培養液の温度を30℃に保ち、OD600が5になるまで、約15時間かけてフラスコ培養を行い、シード培養液を得た。
得られたシード培養液を、500mLの表5に示される生産培地を添加したジャーファーメンターに、OD600が0.05となるように添加した。培養液の温度を37℃に保ち、pH6.9で一定に制御して培養を行った。培養液中の溶存酸素濃度を、溶存酸素飽和濃度の20%に維持した。
生産培地中のグルコースが完全に消費された直後に、フィード液(グルコース455g/1L、Yeast Extract 120g/1L)を1mL/分の速度で添加した。添加後、培養液温度を37℃に保ち、pH6.9で一定に制御して培養を20時間継続した。培養液中の溶存酸素濃度を、溶存酸素飽和濃度の20%に維持した。
その後、培養液に対して、1Mのイソプロピル−β−チオガラクトピラノシド(IPTG)を、終濃度1mMになるよう添加し、目的のタンパク質を発現誘導した。IPTGを添加してから20時間経過した時点で、培養液を遠心分離し、菌体を回収した。IPTG添加前とIPTG添加後の培養液から調製した菌体を用いてSDS−PAGEを行い、IPTG添加に依存した目的とするクモ糸フィブロインサイズのバンドの出現により、目的とするクモ糸フィブロインの発現を確認した。
その後、培養液に対して、1Mのイソプロピル−β−チオガラクトピラノシド(IPTG)を、終濃度1mMになるよう添加し、目的のタンパク質を発現誘導した。IPTGを添加してから20時間経過した時点で、培養液を遠心分離し、菌体を回収した。IPTG添加前とIPTG添加後の培養液から調製した菌体を用いてSDS−PAGEを行い、IPTG添加に依存した目的とするクモ糸フィブロインサイズのバンドの出現により、目的とするクモ糸フィブロインの発現を確認した。
(3)タンパク質の精製
回収した菌体を20mM Tris−HCl緩衝液(pH7.4)で洗浄した。洗浄後の菌体を約1mMのPMSFを含む20mMTris−HCl緩衝液(pH7.4)に懸濁させ、高圧ホモジナイザー(GEA Niro Soavi社製)で細胞を破砕した。破砕した細胞を遠心分離し、沈殿物を得た。得られた沈殿物を、高純度になるまで20mM Tris−HCl緩衝液(pH7.4)で洗浄した。洗浄後の沈殿物を100mg/mLの濃度になるように8M グアニジン緩衝液(8Mグアニジン塩酸塩、10mMリン酸二水素ナトリウム、20mM NaCl、1mM Tris−HCl、pH7.0)中に懸濁させた。懸濁液を60℃で30分間、スターラーで撹拌することにより、沈殿物を溶解させた。溶解後、透析チューブ(三光純薬株式会社製のセルロースチューブ36/32)を用いて水で透析を行った。透析後に得られた白色の凝集タンパク質を遠心分離により回収た。回収した凝集タンパク質から凍結乾燥機で水分を除くことにより、改変クモ糸フィブロイン「PRT410」の凍結乾燥粉末を得た。
回収した菌体を20mM Tris−HCl緩衝液(pH7.4)で洗浄した。洗浄後の菌体を約1mMのPMSFを含む20mMTris−HCl緩衝液(pH7.4)に懸濁させ、高圧ホモジナイザー(GEA Niro Soavi社製)で細胞を破砕した。破砕した細胞を遠心分離し、沈殿物を得た。得られた沈殿物を、高純度になるまで20mM Tris−HCl緩衝液(pH7.4)で洗浄した。洗浄後の沈殿物を100mg/mLの濃度になるように8M グアニジン緩衝液(8Mグアニジン塩酸塩、10mMリン酸二水素ナトリウム、20mM NaCl、1mM Tris−HCl、pH7.0)中に懸濁させた。懸濁液を60℃で30分間、スターラーで撹拌することにより、沈殿物を溶解させた。溶解後、透析チューブ(三光純薬株式会社製のセルロースチューブ36/32)を用いて水で透析を行った。透析後に得られた白色の凝集タンパク質を遠心分離により回収た。回収した凝集タンパク質から凍結乾燥機で水分を除くことにより、改変クモ糸フィブロイン「PRT410」の凍結乾燥粉末を得た。
〔モールド成形体の作製〕
加圧成形機を用いて、上記粉末を加熱および加圧し、モールド成形体を得た。この加圧成形機の金型は、断面が35mm×15mmの長方形状の貫通孔を有する金型である。上記粉末を加圧成形機の金型の貫通孔内に導入し、金型を加熱するとともに、ハンドプレス機(商品名:NT−100H−V09、NPaシステム(株)製)を用いて、40kN(27.55MPa)の条件で加圧した。成形体の温度が130℃になったところで加熱を中止し、スポットクーラー(商品名:TS−25EP−1、トラスコ中山(株)製)で成形体を冷却し、成形体の温度が50℃になったところで成形体を金型から取り出した。これにより、35mm×15mm×3mmの直方体形状のモールド成形体を得た。続いて、手動式加熱延伸機(井元製作所(株)製、IMC−1989型)を用いて、モールド成形体を直接ロールに挟み込み、延伸させることにより、モールド成形体を圧延した。加熱ロールの表面温度は、180℃、ロール速度は50mm/分に設定した。
加圧成形機を用いて、上記粉末を加熱および加圧し、モールド成形体を得た。この加圧成形機の金型は、断面が35mm×15mmの長方形状の貫通孔を有する金型である。上記粉末を加圧成形機の金型の貫通孔内に導入し、金型を加熱するとともに、ハンドプレス機(商品名:NT−100H−V09、NPaシステム(株)製)を用いて、40kN(27.55MPa)の条件で加圧した。成形体の温度が130℃になったところで加熱を中止し、スポットクーラー(商品名:TS−25EP−1、トラスコ中山(株)製)で成形体を冷却し、成形体の温度が50℃になったところで成形体を金型から取り出した。これにより、35mm×15mm×3mmの直方体形状のモールド成形体を得た。続いて、手動式加熱延伸機(井元製作所(株)製、IMC−1989型)を用いて、モールド成形体を直接ロールに挟み込み、延伸させることにより、モールド成形体を圧延した。加熱ロールの表面温度は、180℃、ロール速度は50mm/分に設定した。
以上の操作により、圧延を実施しなかったサンプル1、圧下率を25%としたサンプル2、圧下率を40%としたサンプル3、及び圧下率を60%としたサンプル4を作製した。
〔13C固体NMRスペクトルの測定〕
13C固体NMRスペクトルは、以下の条件で測定した。
(測定条件)
使用装置:Avance400MHz(BRUKER社製)7mm−CPMASプローブ(BRUKER社製)
測定核:13C(100.6248425MHz)
測定温度:室温(22℃)
パルスモード:CPTOSS測定(スピニングサイドバンド消去法)
回転数:5000Hz
パルス繰り返し時間:60sec
コンタクトタイム:1msec
積算回数:2400回
基準物質:グリシン(外部基準:176.03ppm)
13C固体NMRスペクトルは、以下の条件で測定した。
(測定条件)
使用装置:Avance400MHz(BRUKER社製)7mm−CPMASプローブ(BRUKER社製)
測定核:13C(100.6248425MHz)
測定温度:室温(22℃)
パルスモード:CPTOSS測定(スピニングサイドバンド消去法)
回転数:5000Hz
パルス繰り返し時間:60sec
コンタクトタイム:1msec
積算回数:2400回
基準物質:グリシン(外部基準:176.03ppm)
13C固体NMRスペクトル測定データをガウス関数によるフィッテイング(Microsoft Excel(マイクロソフト社、登録商標)及びそのアドインソフト「ソルバー」(商品名)を使用)によりレクトアングラー型パッキング構造部分とスタッガード型パッキング構造部分とアモルファス部分とにピーク分離して、それぞれの曲線を作成した。アモルファス部分は非晶領域に含まれるアラニン残基側鎖の炭素原子を示す。
レクトアングラー型パッキング構造及びスタッガード型パッキング構造の合成関数は、それぞれ結晶シグナルに合わせて作成した(レクトアングラー型パッキング構造:2個のガウス関数による合成関数、スタッガード型パッキング構造:3個のガウス関数による合成関数、アモルファス部分:1個のガウス関数)。13C固体NMRスペクトル測定データとのフィッティングに際しては、測定データに合うように、半値幅等を調整した。
図6〜10に13C固体NMRスペクトルの測定結果を示す。図6〜10中、実線は各サンプルの実測データであり、破線は各サンプルの実測データの半値幅等の調整によりフィッティングを行ったものであり、二点鎖線はレクトアングラー型パッキング構造におけるアラニン残基の側鎖メチル基(AlaCβ)を示すピークであり、一点鎖線がスタッガード型パッキング構造におけるアラニン残基の側鎖メチル基(AlaCβ)を示すピークである。点線は、レクトアングラー型パッキング構造及びスタッガード型パッキング構造が存在しないアモルファス部分におけるアラニン残基の側鎖メチル基(AlaCβ)を示すピークである。
図6〜10に13C固体NMRスペクトルの測定結果を示す。図6〜10中、実線は各サンプルの実測データであり、破線は各サンプルの実測データの半値幅等の調整によりフィッティングを行ったものであり、二点鎖線はレクトアングラー型パッキング構造におけるアラニン残基の側鎖メチル基(AlaCβ)を示すピークであり、一点鎖線がスタッガード型パッキング構造におけるアラニン残基の側鎖メチル基(AlaCβ)を示すピークである。点線は、レクトアングラー型パッキング構造及びスタッガード型パッキング構造が存在しないアモルファス部分におけるアラニン残基の側鎖メチル基(AlaCβ)を示すピークである。
レクトアングラー型パッキング構造及びスタッガード型パッキング構造の含有量の比は、ピーク分離図におけるそれぞれの曲線を数値積分して得られた積分値の比として求めた。
レクトアングラー型パッキング構造及びスタッガード型パッキング構造の合計含有量に対するスタッガード型パッキング構造の含有量の比は、圧延を実施しなかったサンプル1では、0.48であり(図7)、圧下率を25%としたサンプル2では0.65であり(図8)、圧下率を40%としたサンプル3では0.67であり(図9)、圧下率を60%としたサンプル4では0.69であった(図10)。
〔曲げ試験〕
上記のように作製した各成形体のサンプルに対し、卓上形精密万能試験機((株)島津製作所製、オートグラフAGS−X)を用いて三点曲げ試験を行った。使用したロードセルは50kNであり、支点間距離は27mm、測定速度は1mm/分とした。
上記のように作製した各成形体のサンプルに対し、卓上形精密万能試験機((株)島津製作所製、オートグラフAGS−X)を用いて三点曲げ試験を行った。使用したロードセルは50kNであり、支点間距離は27mm、測定速度は1mm/分とした。
曲げ弾性率は、圧延を実施しなかったサンプル1(圧下率0%)では71.4MPa、圧下率を25%としたサンプル2では110.5MPa、圧下率を40%としたサンプル3では126.8MPa、圧下率を60%としたサンプル4では163.8MPaであった。
Claims (15)
- タンパク質を含むタンパク質成形体の製造方法であって、
前記タンパク質を含む成形体前駆体のβシート構造におけるレクトアングラー型パッキング構造及びスタッガード型パッキング構造の合計含有量に対するスタッガード型パッキング構造の含有量の比を調整する調整工程を備える、タンパク質成形体の製造方法。 - 前記成形体前駆体が、繊維状であり、
前記調整工程が、前記成形体前駆体の加熱及び/又は水との接触により行われる、請求項1に記載のタンパク質成形体の製造方法。 - 前記成形体前駆体が、粉末状であり、
前記調整工程が、前記成形体前駆体の加熱及び/又は加圧により行われる、請求項1又は2に記載のタンパク質成形体の製造方法。 - 前記調整工程が、前記成形体前駆体を圧延して、式A:{(圧延前の成形体前駆体の厚さ−圧延後の成形体前駆体の厚さ)/圧延前の成形体前駆体の厚さ}で表される圧下率を調整することにより行われる、請求項1〜3のいずれか一項に記載のタンパク質成形体の製造方法。
- タンパク質を含むタンパク質成形体の製造方法であって、
前記タンパク質成形体のβシート構造におけるレクトアングラー型パッキング構造及びスタッガード型パッキング構造の合計含有量に対するスタッガード型パッキング構造の含有量の比を評価する評価工程を備える、タンパク質成形体の製造方法。 - 前記タンパク質成形体中の前記レクトアングラー型パッキング構造及び前記スタッガード型パッキング構造を構成するβシート構造が、逆平行βシート構造である、請求項1〜5のいずれか一項に記載のタンパク質成形体の製造方法。
- 前記タンパク質成形体中の前記レクトアングラー型パッキング構造及び前記スタッガード型パッキング構造が、複数のアラニン残基からなるポリペプチド鎖により形成されている、請求項1〜6のいずれか一項に記載のタンパク質成形体の製造方法。
- 前記レクトアングラー型パッキング構造及び前記スタッガード型パッキング構造の合計含有量に対する前記スタッガード型パッキング構造の含有量の比が、13C固体NMRスペクトルにおけるアラニン残基側鎖炭素原子のシグナル面積に基づいて決定される、請求項1〜7のいずれか一項に記載のタンパク質成形体の製造方法。
- 前記タンパク質が、構造タンパク質である、請求項1〜8のいずれか一項に記載のタンパク質成形体の製造方法。
- 前記構造タンパク質が、改変フィブロインである、請求項9に記載のタンパク質成形体の製造方法。
- タンパク質成形体の物性をコントロールする方法であって、
タンパク質を含む成形体前駆体から、タンパク質成形体を製造する際に、前記成形体前駆体のレクトアングラー型パッキング構造及びスタッガード型パッキング構造の合計含有量に対するスタッガード型パッキング構造の含有量の比を調整する調整工程を備える、方法。 - 前記タンパク質成形体中の前記レクトアングラー型パッキング構造及び前記スタッガード型パッキング構造を構成するβシート構造が、逆平行βシート構造である、請求項11に記載の方法。
- 前記タンパク質成形体中の前記レクトアングラー型パッキング構造及び前記スタッガード型パッキング構造が、複数のアラニン残基からなるポリペプチド鎖により形成されている、請求項11又は12に記載の方法。
- 前記物性が、曲げ弾性率である、請求項11〜13のいずれか一項に記載の方法。
- タンパク質を含むタンパク質成形体の品質を評価する方法であって、
13C固体NMRスペクトルにおいて、ケミカルシフト20.5±0.5ppmにピークを有する第1のシグナルの面積と、ケミカルシフト19.5±0.5ppm及び22.7±0.5ppmにピークを有する第2のシグナルの面積を測定し、式B:第2のシグナルの面積/(第1のシグナルの面積+第2のシグナルの面積)で表されるシグナル面積比を算出する工程を備える、方法。
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Date | Code | Title | Description |
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A521 | Written amendment |
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