JPS63198986A - シヤトルベクタ− - Google Patents
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
（産業上の利用分野）
本発明は、大ＰＩＩＩＮ及び枯草菌において複製、更に
は、遺伝子を発現し得るシャトルベクターに関するもの
である。 （従来の技術） バシラス属細菌は古くから植々の菌体外酵素の生産菌と
して工業的に利用されている。最近の遺伝子操作技術の
進歩にともなって、これらの薗外体酵素（アミラーゼ、
グロテアーゼ、ぺ二シリナーゼ等）の遺伝子がクローン
化され、そのプロモーターおよびシグナルペプチドをコ
ードするＤＭＡ領域の下流に有用蛋白質の構造遺伝子を
連結して、枯草菌（Ｂａａｉｌｌｕ８吐Ｊエヒ１８）に
導入することによって有用蛋白質′を菌体外に分泌する
ことが可能な分泌ベクターが構築されている。具体的に
はバシラス・アイクリ中ロンα、の生産〔ジーン（Ｇｏ
ｎｅ）柱、−２２？（７９ｒｊ）］、パシラス・ズブチ
リス（Ｂ、ｓｕユｂｔ１１ｔｓ）のα−アミラーゼ遺伝
子を利用したマウスインターフェロンβの生産〔ジーン
（Ｇｅｎｅ）３≦、／７？（／りｒ−ｒ）〕、バシラス
・アミロリキファシエンスの中性グロテアーゼ遺伝子を
利用したヒトインターフェロンβの生産〔ジャーナルオ
プバイオテノロジー（Ｊ、 ｎ１ｃｔｔａｈｎｏ１−
）ゐりＪ−ｊＦ弘（／デ／ｊ）） パシラス・アζロ
リ中７アシエンスｌの中性およびアルカリ性グロテアー
ゼ遺伝子を利用したスタフィロコッカス０オーレ９ス（
８ｔａｐｈｙｌｏｏｏｏｏｕｓ ａｕｒｅｕｇ ）の蛋
白質入の生産〔ジャーナルオプパクテリオロジ（Ｊ、Ｂ
ａＱｔｅＦｌｏｌｍ）乙４１．ｒＪり（ｌデ／４））、
およびパシラス・リケニホルミス（Ｂ、 ｌｉｏｈｅｎ
−１ｆｏｒｍｉｓ ）のベニシリナーゼ遺伝子を利用し
たヒトインシュリンの生産〔ニスチャン等（ａ。 ａｈａｎｇｓｒ： ａｌ ）、−１−レキュｊ−／ａ−
３ンクアンドジーンレギュレーションインパシライ（Ｍ
ｏ１ｅｃｕｌａｒ Ｏｌｏｎｉｎｇ ａｎｄ ｇ＠Ｉｎ
１３ ｒｅｇｕｌａｔｌｏｎｉｎ Ｂａｃｉｌｌｉ）、
アカデミツクプレス（ムｃａａｓｍ１ａｐｒｅｓｓ ）
、ニューヨーク（Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）、ｐｐ、／！り（
／りｒλ）〕などが報告されている＠しかしながら、プ
ラスイドベクターは、コンピテント細胞による形質転換
法を用いると、／が〜／θ１形質転換菌／μｇ ＤＭＡ
という低率でしか枯草菌中に導入できない。この原因は
、枯草菌中にＤＭＡが取シ込まれる時に直線状−木調の
みが取シ込まれるので、プラスミドが、その存在形態の
大多数を占めるモノマー状態の場合には細胞内に取〕込
まれてから環状構造に戻れず、菌体内に合成開始に必要
なプライマーもないので複製が起こらなｈことに起因し
ている。 〔モノキュラージエネラルジエネテイツクス（Ｍｏ１．
Ｇｅｎ、Ｇｏｎｅｔ、）乙／／、４ｔＪ４ｔ（／／ｒ／
）〕。 一方、プラスミドの存在形態として少数認められるダイ
マーやトリマー状態などの場合は相補鎖がλ本人れば環
状復元ができるので複製できる。しかし、上述のように
枯草菌ベクターと異種遺伝子等をリガーゼによって連結
し、その反応液をそのまま用いて形質転換を行なう場合
は、ダイマー以上のプラスミドが生成する可能性は低い
ので、形質転換の効率はさらに悪くなる。 したがって大腸菌と枯草菌の両方で複製可能なシャトル
ベクターを作成して、異種遺伝子をシャトルベクターに
連結し、まず大腸菌で形質転換を行な込、得られたプラ
スミドを枯草菌中に導入して発現させれば、上述の欠点
が解消できる。つま〕、大腸菌は形質転換効率が良りの
で、プラスミドの構築が容易である上に、ｒｅａＦ！＋
の大腸蓮よシブラスミドを調製すると、ダイマーやトリ
１−状態のものができやすく、枯草菌への導入も容易に
なる。さらに、枯草醜ベクターは一般に低コピープラス
ミドなので枯草菌でのプラスミドのｉｌ＃は容易でなか
りたが、大腸菌プラスミドｐＢＲＪＪ−のような多コピ
ープラスミドの複製起点を用いて、シャトルベクター會
作成すれば大ＨＩ菌からプラスミドも大量に調製できる
利点もある。 このようなシャトルベクターの例としては、大腸菌プラ
スミドル１３ＲＪＪコ〔ズブチリス７、ジｘ−ｅジーｍ
（Ｓｕｔ６ユ１ｆｆｅ、 Ｊ、Ｇ、）コールドスフリン
グハーバシンポジウム（ａｏｌ（１日ｐｒｉｎｇＩＩａ
ｒｂｏｒ ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ ）４ｔｊ 、７７−９
０（／９７り）〕とｄｔａｐｈ７１０００００ｕａ ａ
ｕ！”ｅｕａのプラスミドｐＱ／９４１〔プロシーディ
ングナシ冒ナルアカデミ−サイｘ ンス＄ −ｘス−ｚ
−（Ｐｒｏａ、Ｎａｔｌａムａａｄ。 ８ａ１． Ｕ Ｂム）乙４ｔ、／６１θ−／ｊＪＪ（／
り７２）ｌｋ連結したシャトルベクターｐ Ｂ Ｖ ｊ
ｊ ［Ｐｌａｓｍｉｄ４．／？Ｊ−４０／（／９１／
）］、大腸菌プラスＺドｐ１７０デ〔ジーン（Ｇｏｎｅ
） ／ ？ ＊コＪ？−コ４？（／ｙｒａ）］ とス
タフィロコッカス・オーレワスのプラスミドｐｏ／り４
ｔを連結したシャトルベクターｐＫＭ４ｔ ［ジーｙ（
Ｇｅｎｅ）Ｊ？、Ｊ／（／？／４ｔ）］ および大腸
菌プ９ スｔ ）” １；ＩＡＯＹＯ／ｌクク〔ジャー
ナルオプバクテリオ四シース（８ｔ＋ｒａｐｔｏｏｏａ
ａｕｓ ｆａａａａｌｉａ）のプラスミドｐＡＭα／〔
プロシーデイングオプナシ冒ナルアカテξイーサイエン
スニーニス−ニーＰｒＯｃ−Ｍａｕ１．ムａａａ、 １
ｉｔａｉ ａ Ｕ日ムヱ２．／りλ０−７２コ４ｔ（／
テアｊ）ｆｆｔ一連結したシャトルベクターｐＨＹ＃≦
Ｏ〔ジーン（Ｇｅｎｅ）Ｊ、２．／コター／３ダ（／？
ｒｌ ］等が報告されている。 （発明が解決しようとする問題点） しかしながら、上述の様なシャトルベクターの開発は、
未だ十分とはいえず、そこで、本発明者等は、大腸菌と
枯草菌において複製、更には、有用な構造遺伝子奮発現
し得る新規なシャトルベクターを提供すべく鋭意検討し
た。 （問題点を解決するための手段） 本発明者らはエシエリヒア・コリ（Ｅａａｈｅｒｉ−ｃ
ｈｉａ ｏｏｌｉ ）のプラスオドの複製開始点を含む
複製必須領域と、パシラス・ナラ） −（Ｂａａｉｌ−
１ｕａ ｎａｔｔｏ ）のプラスミドの複製開始点を含
む複製必須領域をもち１両宿主で選択可能な薬剤耐性！
−カーとして枯草菌由来のトリメトプリム耐性遺伝子を
もつベクターが、上述の様なシャトルベクターとして有
効に使用し得ることを杢 知得し、本発明を完成するに、／ｌりた。即ち、本発明
の要旨は、エシエリヒア・コリ（Ｋａｃｈｅｒｌ−ｏｈ
ｉａ ｃｏｌｉ ）のプラスミド及びバシラス・ナラ）
−（Ｂａａ４１ｕｓ ｎａｚｔｏ ）のプラスミド由
来の複製必須領域と、パシラス（Ｂａｃｉｌｌｕａ ）
属菌のプラスミド由来のトリメトプリム耐性遺伝子を有
することを特徴とするシャトルベクターに存する。 以下本発明を説明するに、本発明のシャトルベクターは
、ニジエリビア・コリ（以下「１ｏｏ１ｉＪと略す。）
のプラスミドとバシラス・ナットーの（以下「Ｂ、 ｎ
ａｔ；ｔｏ Ｊと略す。）プラスミド由来の複製必須領
域、及び、パシラス属菌のプラスミド由来のトリメトプ
リム耐性遺伝子（以下ｒＴ ！！ｊ ｐ ’Ｊと略す。 ）を有するが、大腸菌は、トリメトプリムに対して７０
Ｊｇ ｇ ／ ｓｄ ｔで自然耐性を示し、形質転換
を行なうために１１００ａ／−という高濃度のトリメト
プリムを必要とするので、更に、王、凹プラスミド由来
の薬剤耐性遺伝子、例えに、アンビシリン耐性遺伝子（
以下「ムｍｐｒＪと略す。）を組込んでおくと好ましい
。 本発明の複製必須領域は、少くともＩｆｆ、 ｏｏｌｌ
及びＢ、 ｎａ’ｃｔｏのプラスミド由来の複製開始点
（ｏｒｉ）を含み、複製機能を損わない程度の任意の塩
基配列を含んでいてもよい。 １、６０１１のプラスオドとしては１例えは、ｐＢＲＪ
２コ〔ジーン（Ｇｅｎｅ）λ、ｔｚ（ｉデ２７）〕、ｐ
ムｏ”ｒａ ｔｅａ （ジャーナルオプバクテリオロジ
ー（Ｊ、Ｂａ０ｔ・ｒｉｏｌ、）乙Ｊ４ｔ、／／４ｔ／
（／り２ｒ）〕、ｐＭＢデ〔毎レキエラーメカニズムイ
ンザコントロールオプジーンエクスプレツション（Ｍｏ
ｌｅｃｕｌａｒ Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ ｉｎ ｔ；ｈ
ｅ ０ｏｎｔｒｏｌ ｏｆＧｏｎ＠Ｘｘｐｒａａａ１ｏ
ｎ ）、ｘｏｌ−ＵＯＬＡ シンボジツムオプモレｄ
Ｐエラーセルバイオロジー（８ｙｍｐ、Ｍｏｂ、Ｇａ１
ｌ Ｂｌｏｌ、）Ｖ、４ｔ７／（／？り４）】等が挙げ
られる。これらの内、Ａｍｐｒｔ″有するｐＢＲＪコλ
が好適である。 ｊＬｎａｔｔｏのプラスミドとしては、例えば、ｐｌｏ
ｄ（ジャーナル オブ パクテリオロジー（Ｊ。 ｎａｏｔ＠ｒｔｏｘ、） ／互Ａ、−〇（／？／ｄ））
、ｐτＩＩ／Ｊ〔ジーｙ（Ｇ＠ｎｅ）ヱ０．／Ｊ／（／
り１０）〕、ｐＬ８１０１ ［モレｄＰエラー ジエネ
ラルジエネテイツクス（Ｍｏｌａｏ、ｇａｎ、Ｇｅｎ＠
ｔ、）／４７．Ｊｄり（ｌり７？））等が挙げられる。 また、７ ｍ ｐ ｒを含むＢａｃｉｌｌｕｓ属薗のプ
ラスオドとしては、例えば、ｐ Ｍ ０４、ｐＴＬ／Ｊ
、ｐＴＬｔｏ（ジーン（Ｇｏｎｅ）１０． ／Ｊ／（／
？１０））等が挙げられる。 本発明においては、複製必須領域と共にＴｍｐ’を含む
ｐ菫Ｏｄが好適に使用で龜る。 尚、ｐＭＱぶは、特開昭４／−コｌ−ダ００号公報に記
載されている方法に従い、ｔず、プラスミドＤＴＩＪｊ
／Ｊ （ジーン（Ｇ＠ｎ・）１０．／３／（／り１０）
：カレント トピックス イン マイクロバイオレジ−
アンド イムノロジー（ＯｕＨｒ、τｏｐ ｍ Ｍｌｏ
ｒＯｂＬ ＯＸ ＩＩＩｍｍｕｎｏｌ、）ヱ４． ／
（／１ＪｒＪ） ３＠ ８６６ ＲＸ 及びＢｇｌ
ｌで二重消化し、小さい１ａｏＡＩ−シ已鳳断片を分離
しておく。一方、プラスミド１）ｌＴ、２コ（昭和１？
年度日本農芸化学会大会講演要旨集−ム−／り、第７図
参照。）のＢｇｌ １部位に、ｐＢＲＪココ由来のｐＨ
Ｂ／（４，コｋｂ）（ジャーナルオプ バイオケミスト
リー（Ｊ、Ｂｉｏａｈｅｍ、）４ヱ４クク−４／コ（１
５Ｆ／／））の１．１ ｋｌｌ Ｂｇｌ ｌ断片□ｓｕ
遺伝子を含む。）を挿入し、枯草菌ＭＸ／／λを形質転
換し、形質転換体よル、大きい方のコｏニーからプラス
ミドを得、このプラスミドをＢｇｌｌで処理してｐｌＴ
Ｊ−よ）コピー数の増大したｐｌＴコλべｚ／、ｒｈｂ
）を得、つぎにこのプラス２ドｐＫＴコ−２／ｌ−ム」
■及びハリで消化し、小さいシｚｏＲ１−Ｂｇｌ Ｎ断
片を得る。そして、この断片と上記プラスξドｐＴＬ／
Ｊ由来のｌ ｔ３ ｏｌｔ）−シ已鳳断片をＴＲＩ）ｍ
ｌムリガーゼで連結し、得られる組み換えプラスミドに
ょシ枯草＠ Ｍｘ／／Ｊをトリメトプリム耐性に形質転
換し、形質転換株よ）プラスミドｐｒｏぶ（ｊ、ａａｋ
ｂ）を得ることができる。 本発明のシャトルベクターは、複製必須領域及び７ ｍ
ｐ １″を含むＤＩム断片を上述の夫々のプラスミド
から適宜制限Ｂｇｌ素等で切シ出すか、＊ＩＡは、それ
らと相同な塩基配列となるよりに化学合成して得、それ
らを常法に従い結合することによって得られる。 上記本発明のシャトルベクターに、バシラス属菌で機能
し得るプロモーター領域、リボソーム結合部位（ＢＤ配
列）、翻訳開始コドン、翻訳終結コドン、更には、パシ
ラス・ズブチリス。 パシラスφアずロリ！２７アシエンス由来のα−アンラ
ーゼ、中性およびアルカリ性のプロテアーゼ遺伝子【カ
レント トピックス インマイクロパイオロジ アンド
イムノロジー（０ｕｒｒ＠ｎｔＴＤｐｉＱａ ｉｎ
ＭｉＯｒｏｂｌｏｌｏｇ７ ａｎａ Ｘｍｍｕ
ｎＯ１Ｇｇ７）イＪｌ／θＪ（／りｔ０］等のシグナル
ペプチドをコート釘るＤｌｆＡ配列、制限酵素切断部位
等を組込むことによりて、大腸菌及び枯草２のいずれに
かｉでも有用な構造遺伝子を発現し得る、所謂、シャト
ル発現ベクター及びシャトル発現分泌ベクターを得る仁
とができる。 その際、８Ｄ配列及び制限酵素切断部位をＴｍマ の下
流に組込むならば、目的とする構造遺伝子をこれらの制
限酵素を利用して、その下流に組込むことができ、大腸
菌および枯草菌両者で発現可能なポリシス）ａン状遺伝
子構造を有する直接発現型のシャトルベクターが得られ
るので好ましい。 上記本発明のシャトルベクターを１用い、常法に従い、
大腸菌ＨＢ／ ０ ／ （Ｆ！−、ｈｓＬ Ｂ−２０、
Ｊ−。 ｍＢ−、ｒ８ＱムＢ、 ａｒｇ ／４ｔ、 ｐｒｏ ＆
２ 、１ａ６Ｙ／ 、 ｇａｌｌｃＪｒｐａ ＬＪｏ（
８♂） ＃ ｘｙｌ−ｚ−、ｍｔｘ −／ 、 ５ｕｐ
ｌ＃＠。 Ｊ−）（ジーン（Ｇｏｎｅ） ２ 、りｊ（／り”）］
ｓ枯草菌ＭＹ／／Ｊ（１ｅｕＢ／ 、 ａｒｇ／ｊ
、 ｔｈｒｊ 、 ｒｅａｌｍ 。 自賛）〔ジーン（Ｇ＠ｎｇ）乙Ｏｊ／Ｉ／（／り１０）
〕等を形質転換し、得られる形質転換体を培饗すること
によって、本発明のシャトルベクターに組込んだ目的の
構造遺伝子を発現させることができる。 （発明の効果） 本発明のシャトルベクターは、大ｉｓおよび＃１草薗の
＾ずれにおいても良好にａ裂、更には、発現する。 （実施例） 以下に実施例を挙げて更に具体的に本発明を説明するが
、本発明はその要旨を越えない＠Ｌ以下の実施例によっ
て限定されるものではない。 なお、以下の実施例における操作は、特に記載する場合
を除き次の方法により念。 〔■〕〔制限酵素によるＤＩムの切断と回収コ制限酵素
による切断用緩衝液は、下記のものを用い九。また切断
条件は、一単位／μｇ］）Ｍムの制限酵素を用い、３７
℃、４０分間処理する。 次いで、Ｔｌ１ｉ緩衝液（１０ｍＭのトリス塩＠ｌ ｐ
Ｈｒ、０及び／ ｍＭのＩＣＤＴムからなる）で飽和し
光フェノールで７回抽出し、エーテルでフェノールを除
き、−倍容のエタノールｆ加えて一一〇℃で３０分間放
置した後、遠心分離してＤＮＡを回収する。 （１）低塩濃度緩衝液 ／６ｍＭのトリス塩酸（ｐＨ７，４ｔ）、１０ｍＭの硫
酸マグネシウム及び／ｍＭのジチオスレイトールからな
る。ｋｐｎ １部位での切断はこれによった。 （２） 中塩濃度緩衝液 ｊ ＯｍＭの１ｉａ０１．１０ｍＭのトリス塩酸（ｐＨ
７，ａ）、１０ｍＭの硫酸マグネシウム及び／ｍＭの９
チオスレイトールからなる。 五ａ”１ｓＡａｔｌ及びｘ１ｎａ曹 部位の切断はこれ
によった。 （３） 高塩濃度緩衝液 ７００ ｍＭのＭａｉｌ、ｊ ＯｍＭのトリス塩酸（ｐ
ｌｉ７．４ｔ）及び１０ｍＭの硫ａｌ−ｆグネシウムか
らなる。Ｌｉ！・Ｌじｌｓ Ｋ６ｏＲＩ、Ｐａｔｌ及び
ＢａｍＨＸ 部位の切断はこれによった。 （４） 制限酵素ａｍａ Ｉ用緩衝液２０ ｍＭの”
３ｒ ％／ ＯｍＭのトリス塩酸（ｐａｒ、Ｏ）、１０
ｍＭの硫酸マグネシウム及び、／ｍＭのジチオスレイト
ールからなる。 〔Ｉ〕〔大腸菌（ｍ、凹） ｌｌＢ１０／及び枯草菌（
Ｊｉ、！１ｕｂｔ４１１ｇ） Ｍｘ／／ＪからのＤｌの
調製】口） を品詞製法（ｍｘｎｉ ｐｒｅｐ法）〔ニ
エクレイツク アシツズ リサーチ（Ｍｕａｌｅｉａ
ＡａｌｓＲ釦ｈ）７巻、１１１３〜７５１３頁、（ｌり
？？）〕大腸菌ＨＢ１０／および枯草＠ Ｍ工／／λを
宿主とし、／ｄのＬＢ−グロス〔ｉａｇのペプトン、Ｊ
ｌのイースト・エキス、！−５７の１ｇ＋＆’ ｌ ／
ｌ−ｓ ｐＨ’、’ ｓ （薬剤耐性プラスミドの場
合は薬剤をふくむ）〕ヲ用いて一夜間培養し、遠心分離
して集菌した菌体を、１００μｍの溶液ム（７０ｍＭの
グルコース、１０ｍＭのＩＤτム、Ｊ ｊ ｍＭのトリ
ス塩酸（ｐｌｉ ？、０ ）及びリゾチームコｗＩＩ／
−からなる）に懸濁し、室温で３０分間放置する。 次いで、氷水中で一２００μｍの溶液Ｂ（／Ｘの５ｐａ
（ドデシル硫酸ナトリウム）を含む０．コ麗のＮａＯＨ
］ ｆ加えて約１分間振盪し溶菌し、ＤＭＡの変性を行
い、 ｉｚ。 ａｌの３Ｍ酢酸ソーダ溶液□ｌｌ４ｔ、ｒ）を加え１時
間水冷後、遠心分離し、上清に冷エタノールを加え、−
２０℃に冷却して遠心分離し、沈殿を集める。 沈殿を、溶液０（７６ｍＭのトリス塩酸及び０．７Ｍの
酢酸ソーダからなる）に溶解し、不溶物を除去後、冷エ
タノールを加え、沈殿するＤＭＡを洗浄し、減圧下乾燥
し一２０℃で保存する。 （２）大量調製法 １００−のＸＪＢ−プロス（薬剤耐性プラスミドの場合
は薬剤をふくむ）に大腸菌ＨＢ１０／および枯草菌ＭＩ
／／Ｊを植菌し、−夜間培養し、集菌後コーのＢＴＸＢ
緩衝液（Ｔ］ｎ！ｉ緩衝液（／ ００ ｍＭ Ｔｒｉｍ
−！Ｉｏｌ（ｐａｒ）、 ／Ｍ Ｍａｉｌ、 ／ ０
０ｍＭＩＤ丁Ａ）に、Ｊｊｊ％サッカロースを添加した
もの〕に懸濁し、ダ岬のリゾチームを添加して３０分間
水冷中に放置する。次いで４を−の／ ｊｉｇ Ｂ Ｄ
Ｂ を含ム０．ＪＭ ＭａＯＩＩ ０）ｆａＲｋ加え
て、１分間、振とうし、溶菌して、 ＤＭＡの変性を行
い、Ｊ−の３Ｍ酢酸ソーダ溶液（）！Ｉ４ｔ、／）を加
え、６０分間水冷後、遠心分離し、上清に冷エタノール
を加え、−一〇℃に冷却し、遠心分離して、沈殿を集め
る。 沈殿１ｋＪｄＴＩＭＢに溶解し、ｊａｔの！ｑ／ＩＩｇ
リボヌクレアーゼを加え、３７℃で３０分間振とうした
後に、２．１ ｊ ｐの塩化セシウムと４ｔ０μｔの！
μＩ／−の臭化エチジツムを添加する。得られた懸濁液
を ３４０．０ＯＯＸＩで一夜間、超遠心分離し、プラスミ
ドに相当するバンドを注射器を用いて回収する。ｌ−ブ
タノールで臭化エチジウムを抽出した後、２００倍容０
θ、７×！！０〔６７ｍＭクエン酸ナトリウム （ｐ”）％および／ ｊ ｍＭ Ｍａｉｌ ］と／ｍＭ
１１１）ＴＡを含む溶液に対して一夜間透析したものを
使用する。 １ （ＴＬ［Ａポリメラーゼによる平滑末端調製法
］粘着末端を持つＤＭＡを３０−のＴ４をＤＭＡポリメ
ラーゼ用緩衝液（、（７ｍＭ）リス塩酸（１）Ｈｒ、ｒ
）、４．７ ｍＭ Ｍｇ０ｌ、、／ ｔ、ｄ ｍＭ硫
酸アンそ二９ム、１０ｍＭ２−メルカプトエタノール、
イ、７ａＭ ＥＤＴム、３３μＭｊｌＡ’ｒＰ−ｔｌＯ
ＴＰ−４０’ｒＰ−１１ＴＴＰからなる）に溶解し、Ｔ
４をＤＭＡポリメラーゼｆ１０単位／＃ｇＤｌｉＡ 加
え、３７℃で３０分間処理し、ＴＩＣ緩衝液で飽和した
フェノールでＤＮＡを抽出処理した後、エーテルでフェ
ノールを除き、冷エタノールを加え一一σ℃に冷却し、
遠心分離によシ、沈殿したＤＮＡを回収する。 ■（Ｔ４をＤＭＡリガーゼによる連結〕連結する一個の
Ｉ）ＭＡ断片は、７ムｇ／／θμｌになるように、連結
用緩衝液［ｄ ｄ ｍＭのトリス塩ａ！１（ｐＨ７，７
）、４ ｍ ｔ ｍ Ｍの塩化マグネシウム、１０ｍＭ
のジチオスレイトールからなる。］に溶解し、４ｊ”
Ｃでｉｏ分間処理した後、４ｔ’Ｃで４６μＭのムＴＰ
（アデノシントリ７オスフエート）を加え、更に’ｒ４
をリガーゼ會、粘着末端の場合は０．／単位／μｇ Ｄ
ＮＡ％また平滑末端の場合は７単位／ｊＡｇＤＭムにな
るように加えてダ℃で／ｒ時間反応させた後、６ｌ℃で
７０分間処理する。 Ｖ（１） （大腸菌の形質転換（アドバンスト バク
チリアル ジエネテイックス（ＡｌｖａｎｃｅｄＢａａ
ｔｅｒｉａｌ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ） （／９１１）
：をにトスプリング ハーバ−ニューヨーク（Ｏｏｌｄ
ｓｐｒａｎｇ Ｍａｙｏｒ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ ） ］
４−のＬＢ−ブロスに、大腸菌１ｉＢ１０／を植菌し、
−夜間培養して集菌し、０．３ｍｌのＪ ＯｍＭ塩化カ
ルシツム溶液に懸濁し氷冷する。この菌液０・ｌ−及び
０．／−の０．７Ｍトリス塩ｆｆ１（ｐＨ７・コ）にＤ
ｌｆＡを溶解し、水冷後、７７℃で一分間熱処理し、ｌ
−のＬＢ−プロスを加え３２℃で一２０分間培養する。 得られた薗懸濁液Ｏ・／ｄをアンビシリン４ｔｏμｇ／
ｓｇ、トリメトプリム１００μｇ／−を含むＬＢ寒天培
地で一夜間培養し、形質転換株を得る。 （２） 〔枯草菌の形質転換（ジャーナル オプパクテ
リオロジ−（Ｔｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂａｏｔ＠ｒｌｏ
ｌ−ｏｇｙ）／／ ７４ｔ／（／り６／）】８ｐＨ１
ｉｉ１６ｎ の最小培地（へ１１ン酸二カリウム、０．
ｔ ３ｇリン酸−力す９ム、 ０．．２％硫硫酸アンモ
リ９ム０．７％クエン酸ナトリワム、ｏ、ｏａｘ硫酸マ
グネジツム、０．！Ｓグルコース）に０．０λ２カザ電
ノ酸及び、！０μｓ／ｄＬ ｈリプトファンを添加し
た培地λｄを用いて対数増殖期終了後約７時間培養し、
更にとの悪濁液ｔ” ８ｐｉｔＬｇｅｎ の最小培地に
Ｏ１θ／Ｘカザ建ノ酸！μｇ／ｄ−一トリプトファンを
添加した培地で７０培に薄め、培養を続ける。通常２０
分培養で；ンビテント状態になシ、この細胞を用いて形
質転換を行った。すなわちこの菌液０．１−にＤｌｉＡ
溶液ｏ、ｉ ｒａｔ ｖｋ加より ”℃で１時間振とり
後、ＬＢ−ブロスλ−を添加し、更にＪり℃で７時間培
養する。得られた薗懸濁液をトリメトプリム、１′μｇ
／−を含むＬＢ寒天培地で３７℃、−夜間培養して形質
転換株を得る。 ■ 【合成りＮＡリンカ−のリン酸化】ＤＮＡの化学合
成はアプライド バイオシステム（ムｐｐＨｅｌ Ｂｉ
ｏａｙｓｔｓｍ ）社のモデル（Ｍｏａｅｌ）！１０１
Ｊ ｖ５ム ディーエヌーエー シンセサイザー（
Ｑｏｌｍｎ ＤＮＡ ｓｙｎｔｈｅｓｉｇｅｒ）を用い
て、ホスファイト法による同相合成によって合成した。 この合成りＭＡは、末端にリン酸基が付いていないので
、下記方法によ、９Ｔ４ｔキナーゼでリン酸化を行った
。 ｊｎｍｏｌの合成りＮＡリンカ−を、（ｉ（／ ｎ１の
／＜７！ＩＩＭ）リス塩酸ＣｐＨり、７）及び／ＪｍＭ
の塩化マグネシウムに溶解し、４０℃テ１０ｍＭの一一
メルカブトエタノールを加えた後、３．２℃で一〇ｍＷ
ｉのＡＴＰを加え、更に１０単位のＴ４を中ナーゼを添
加して３２℃でＪ。 分間処理した後、−２０℃で保存する。 ■ 〔合成りＭＡ！Ｊンカーの平滑末端への連結〕平滑
末端のＤＩム断片（／、Ｊ ｐ ｍｏ１末端）と上記■
でリン酸化した合成り［１ンカー（／ ００ ｐｍｏ１
末端）を連結用緩衝液［ｄｄｍＭのトリス塩酸（ｐｌ！
７．７）、４・４ｍＭ の塩化マグネシウム、１０ｍＭ
のジチオスレイトール−からなる］に溶解し、ｌ単位の
Ｔダリガーゼを加え、グ℃で／ｒ時間反応後、Ｔｌ＠衝
液で飽和したフェノールでＤｌｌｌＡを抽出し、エーテ
ルでフェノールを除去後、エタノール沈廠でＤＮＡを回
収する。 ■ 〔プラスミドＤＩＪＡのバクチリアルアルカリフォ
スファターゼ（ＢＡＰ）処理 プラスミドＤＮＡの自己連結を阻止するため、プラスミ
ドＤＮＡの制限酵素部位とＤＩム断片との連結に先だっ
て、プラスミドＤＮＡ（／ Ｏｐｍｏ１！末端）をコｏ
ｏ μｘのＢＡＰ緩衝液［／θｍＭのトリス塩ｓ＜ｐ
ｍｒ−の及びθ、ハ１の！ＩＤＴムからなる］に溶解し
、／θＯ単位のＢＡアを加え、４℃℃で７時間反応後、
ＴＩ緩衝液で飽和したフェノールで抽出兜理し、エーテ
ルでフェノールを除去し、エタノ−、ル沈殿によシブラ
スミドＤ１１Ａを回収する。 ■ 〔アクリルアミトグルからのＤＭＡの抽出〕ゲルは
縦／７．、横／７ｃｍ、厚さｌａＩの大きさでアクリル
アイドの濃度が４ｔ３のものを用いる。泳動終了後−２
＃ｇ／−の臭化エチジクムで一〇分染色し、紫外線ラン
プを用いて、必要なバンドを滅菌したナイフで切シ出す
。 シリコーンで被膜し、滅菌したガラス棒で細かくすシつ
ぶす。ゲル溶出液（ｔｏθｍＭ酢酸アンモニワム、１０
ｍＭ酢酸マグネシウム、／ ｍＭＩ！ＤＴＡ、 ０．／
９ｇ ＢＤＢ ） ４ｔＯ６ｇ加えて、３２℃で一夜
間振とうした後、遠心分離し、上清をＴＩ緩衝液で飽和
したフェノールでＤＭＡを抽出し、エーテルで７エノー
ル管除去後、エタノール沈殿でＤＮＡを回収する。 Ｘ （／−ラクタマーゼ活性の測定法］β−ラクタマ
ーゼの活性測定はヨク素比色法を適用し九Ｃ蛋白質、核
酸、酵素−ｊ、 ｊ？／（／り７♂）〕。培養上清を０
．７Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７，０）で希釈し
、酵素試料とする。 中試験管にＯ・７Ｍリン酸ナナトリ９ム緩偏液 ｐＨ７
，０） 、２．７ ｍ、酵素試料Ｏ１！―を加え３０℃
で５分間加温する。 基質濃度コη／−のベンジルペニシリンカリクム塩（明
治Ｓ茶）を含むθ、！―のリン酸緩衝液を加えよく混合
し適尚時間（−〜６０分）３０℃でインキエベートする
。ヨウ素試液（！−中ｆｃａワ素分子Ｘ、 を４ｔＯ
ａｎｏ１含む。）ｊ−を反応液に加え、よく混合し酵素
反応を停止する。 ヨウ素試液は以下のよりに調製する。ヨウ素保存液（１
！＋９素カリウム１ｏＯ１′を蒸留水７０−に溶解しこ
れにヨウ素−０，３Ｊ ？＋−加え、蒸留水を加えて総
量！００１１ｄとしたもの。）を酢酸緩衝液（無水酢酸
ナトリクムｔｏｌを蒸留水約！００−に溶解し、氷酢酸
を加えｐＨ４１，０に調整後蒸留水を加えて−２とする
）で−４倍に希釈したものを使用する。 室温で７０分間放置後クりット光電光度計で吸光度（Ｉ
Ｃ１ｅｔｔ； ｕｎｉｔ）ｋ測定する。得られた吸光度
をＫｕ（サンプル）とする。この時の使用波長は、ｊ
４１０ ｎｍを用いる。 ブランクムは、ＷＩツ素試液！ｗｔ、ＯＪＭリン酸緩衝
液Ｊ−１蒸留水Ｏ０！−を加え直ちに吸光度を測定しＩ
Ｃｕ（ブランクＡ）とする。 ブランクＢは、酵素試薬を：Ｉ１７素試液添加後に加え
る以外は同様な操作で吸光度を測定しＫｕ（ブランクＢ
）とする。 酵素試料液のβ−ラクタマーゼ活性（ｕｎｉｔ／−）は
下の式から計算する。 ＦＷ４ｔ、！７．Ｔ＝＋反応時間Ｃ＋）、ｖｗｒｍ素試
料液量（−） ／ ｕｎｉｔは基質／ＡＩ！！１０１の
β−ラクタム環を１分間、３０℃で加水分解する酵素活
性を示す。 累 〔β−ガラクトシダーゼ活性の測定（ジャーナル
オブ バクテリオロジ−（Ｊ、 Ｂａｇｔｅｒｉｏｌ乙
乙ｌ、コθ（／りを−）〕 培養液！Ｉｌ１ｇｔ分取し遠心分離によシ集菌する。集
画時の濁度を波長４ ｏ ｏ ｎｍで測定しておく（ム
４００）。その細胞沈殿物Ｋ ｊ、ｊ ｄの２−緩衝ｆ
ｉ（４０ｍＭリン酸第二ナトリウム、４ｔＯｍＭ リン
酸第−ナトリウム、１０ｒｎＭ塩化カリウム、１ｍＭ硫
酸硫酸マグネシムタム ＯｍＭメルカプトメタノール、
／ ｍＭ Ｐ１ａＢ’ＩＰｐＨ７，のに懸濁する。これ
に３滴のトルエンを加え直ちに７０秒間かくはんし細胞
膜を粉砕して基質が細胞質内に拡散できるようにする。 その後３２℃で４ｔＯ分間保温しトルエンを揮発させる
。この液に２−緩衝液（ｐ！！７．０を加え適当に希釈
し酵素反応試料とする。 この試料１・１ＩＩＡ１ヲ中試験管に入れ、Ｊ？”Ｃで
！分間加温する。これに基質液（４ｔＷＩｆ／Ｎｔの濃
度になるよ５ ｊｃ Ｏ，／ Ｍリン酸ナトリウム緩衝
液で０−ニトロフェニル−β−Ｄ−ガラクトシダーゼを
溶層したもの）を０．６−加え一ガラクトシダーゼが基
質に作用し試料が黄色に発色してから／Ｍ炭酸ナトリウ
ムをｏ、ｒこの反応層を２分間遠心分離し上清く対して
吸光度を測定する。この時の波長は４ｔ２０ｍｍ ’に
用いる。 酵素試料液のβ−ガラクトシダーゼ活性（Ｍｚｌｌ・ｒ
ｕｎｌｔ）は下の式から算出する。 ｔ：反応時間粉） （ｔｓ−を）Ｖ ：反応に使用した培養液量（ｄ）ａ ：希釈度 ■ 〔部位特異的変異誘起（バイオテクノロジー （Ｂ
ｌｏｔａａｈｒｏｌｏｇｙ）Ｊ、ｔｉｔ、／１ｒａ））
プラスミドＤＮＡを薬剤耐性を獲得するのに必要な領域
の中に認識部位の存在する制限酵素で消化しアルカリ７
オスフアターゼ処理しておく。得られるＤＭＡを断片ｌ
とする。 一方部位特異的変異を行ないたい領域を含む断片を取シ
のぞ（為に同じプラスミドｌ）Ｍムをその領域ｔはさむ
適当な二ケ所の制限酵素認識部位で切断し、アクリルア
ギトグル電気泳動によシグルからその領域を含まない。 太き一方の断片を抽出精製する。 得られるＤＮＡを断片ｌとする。 更に部位特異的変異をほどこした配列を含む数十塩基配
列から成るオリゴヌクレオチド！ １化学合成によ）作成し、ＴμＤＭＡキナーゼによ）末
端ｔリン酸化したものを＃４裂する。 等量（０，Ｊｔｔｇ）の断片１１断片■及びその１００
倍からｊ００倍相当の過剰な合成オリゴヌクレオチドを
含む混合液（！×ポリメラーゼーリガーゼ緩衝液〔！θ
θｍＭ塩化ナトリヮム、ＪＪ、ｊｍＭ）リス塩酸（ｐｌ
！７．７）ｇｔＯｍＭａＩｌ化マグネシクム、１ｍＭβ
−メルカプトエタノール】／コμｍを含み、蒸留水で最
終容量ｓａ、ｒμｍにする。）ｔ″詞製る。 この混合液を１００℃の湯浴で３分間保温する。辷れに
よ）混合液中に含まれる断片Ｉ及び断片厘の相補鎖が分
離して一本鎖となる。 変性を生じ九混合液をただちに３０℃で３゜分間保温し
更にダ℃でＪθ分間保温後氷の上に移行する。 との徐冷の過程で一本鎖に浸った断片ｌ及び断片国が再
生しそれぞれ元の二本鎖に戻っ虎もの、新しく一本鎖断
片１と一本鎖断片１によシ開環屋二本鎖を形成したもの
（断片璽）を含む混合物を形成する。 この混合液／１．４μλを採取しこれに２・１ｍＭのダ
種のジオ中ジヌクレオチド基質液（（ＩＮＴＰ） ＜ｔ
、０４ｍ、／／７ｍＭ ＡＴＰ ４＜ １１Ｋｇ％Ｄ
ＭＡポリメラーゼエ大フラグメント（クレノー７晩保温
する。この灰石によ）断片響の開＃、ｆｆｉＤＭＡに合
成オリゴヌクレオチドがプライマーとして働き、ＤＮＡ
ポリメラーゼｌえフラグメント（クレノー７ラグメント
）が変異したい領域をうめあわせることによシ閉環温Ｄ
ＮＡを形成する。これを用いて大ＩｋＷ１を形質転換し
、上記の部位特興的変Ａ紛起ｌによシ新しく導入された
制限酵素部位金持つプラスミド全スクリーニングしてく
る。 更にもう一度とのプラスミドを用いて大腸菌への形質転
換を行ない同様の方法を繰返虜し変異プラスミドを精製
する。 実施例１ 【枯草百−大腸薗シャトルベクターｐＭＢＬ
Ｉの作成（第２図参照）】 トリメトプリム耐性遺伝子を保持した枯草菌プラスミド
ｐｒｏ ｔ ２μＩｉをＰｓｔ ｌで切断しτダリガ
ーゼで連結した。得られた組換えプラスミドを用いて活
写＠ＭＺ／／λ株（ｙ６（Ｈ］ＩｆＱ” 、シミムｒａ
ｒｇ／ｊ−ｔｂｒｊ−ｒＭ−ｍＭ−）（Ｇｏｎｅ、／ｄ
、／Ｊ／。 （／り♂Ｏ）アグリカルチエラル バイオロジカル ケ
ミストリー： （Ａ＠ｒｔｓＢ１ｏ１．ａｈａｍ、）
ｊｏ、コｒ４ｔｔ（／デｒ≦））をトリメトプリム耐性
に形質転換し、形質転換株よシ、！ｌ１ｎｌ ＩＩ切断
部位を７ケ所のみ保持した小型化プラスミドｐＮＱＡＯ
／（４ｔ・／ｋｔ＋）を得た。このプラスミドｐＮＯｊ
（７／／μｇをＡａ′ｒ、１ で消化し、バクチリアル
アルカリフォスファターゼ（ＢＡＰ）で３′末端のリン
酸を除去し、この断片と、大腸菌のプラスミドｐＢＲｊ
λコ／μｆＩ（コールド スフリング バー／（−シン
ポジウム（（１０１（１８ｐｒｉｎｇ Ｈａｒｏｏｒ
Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ）シり首ムポリメラーゼで平滑末端
化し、更にｐｖｕ ｌ消化して得られる大腸菌の複製必
須領域とアンビシリン耐性遺伝子を含む一、Ｊ ｋ）の
断片とをＴ（＜リガーゼを用いて連結した。得られた組
換えプラスミドを用いて大腸菌ＨＢ１０／（Ｆ−、ｈａ
ｄ ＢＡＤ 、 ｒＢ−、ｍＢ−、ｒｅｏＡＢ、 ａｒ
ａ−／＠ 。 ｐｒｏＡＪ 、 ｌ！ＬＯＹ／、 ｇａｌＩｃＪ、 ｒ
ｓｐＴ、＋、２７（ａｍ’）、 ！７１−ｊ＠ユ駐、／
、μ究Ｅダ私５）（ジーン（Ｇｅｎ・）ミ テ！（ｌり
７２））をアンビシリン及びトリメトプリム耐性に形質
転換し形質転換株よシブラスきドｐＮＢ？也４．Ｊ ｋ
ｂ）を得た。 更にこの組換えプラスミドｐＭＢ９ ／μｇｔ、］１ｉ
ａｏＲｌ及びｘｔｎａ鳳で消化し、バクテリアアルカリ
ホフ７アターゼ（ＢＡＰ）で処理し、ｐｒ。 ｌりのマルチクローニング部位の１００Ｒ１−ＨＬｎｄ
■断片Ｌ−／（ｊコ１）Ｘｌ） （ジー７ （Ｇａｎｇ
） Ｊ ｊ１０！−／／Ｗ（／り／７）、第μ図参照）
を押入し大腸菌ＨＢ１０／ を形質転換し形質転換株よ
〕プラスミドｐＭ！ＩＩ、／（ム事ｋｂ）を得九。ｐＭ
ＢＬ ／は大腸菌、枯草菌の複製起点を含む複製に必須
な領域及びトリメトプリム、アンビシリン耐性遺伝子を
保持してお〕表７に示したような効率で、大腸菌ではト
リメトプリム耐性及びアンビシリン耐性に、枯草菌では
、トリメトプリム耐性に形質転換できる。又、ｐＭＢＸ
ａ／はマルチクローニング部位中の１ａＯＲＩ、＄１鰭
１．肪１．具吸Ｉ。 ！ｍａｌ 、Ｂａｍ１ｉｌ ＊！ｂａｌ 、ｇａｌｌ
、８ｐｈｌ 、ｌ１ｉｎｄ鳳 は唯一の切断部位でＴｏ
シ、目的遺伝子のクローニングに利用できる。 実施例−〔直接発現型訃よび分泌型のシャトルベクター
の作成（第３図参照）〕 ｐＮＢＬ ／を利用して、トリメトプリム耐性遺伝子の
下流に、翻訳の開始に必須なリボソーム結合部位（８Ｄ
領域）と読み出しのムＴＧコドン又はムＴＧコドンにひ
きつづいてシグナルペプチド領域を有し、さらにその下
流に適当な制限酵素部位及び大腸菌リボプロティンのタ
ーミネータ−（ｌｐｐｊ’） ｋ導入したトリメトプリ
ム耐性遺伝子のプロモーターを用いるポリミストロン状
遺伝子構造を有する発現ベクターを作製した。 ’！ｆｐＸＭ璽ムＩ（エキスペリメンタル マニビュレ
ーシ目ン オブ ジーン エキスプレッション（” Ｅ
ｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｍａｎｉｐｕ：ＬａｗヱＯｎ
Ｏｆ Ｇｒａｎａ ＸＸｐ−ｒｅａａｌｏｎ
’ ）、ｐ、λｊ（／ツ１り、アカデミツク プレス（
Ａａａｄｅｍｉａ ｐｒｅｓｓ）Ｍ、Ｙｍ ； Ｉｆｉ
ＭＢｏジャーナル（Ｊｏｕｒｎａｌ） Ｊ −ダ３２
（／り／４ｔ）；バイオテクノロジー（Ｂｉｏｔｅｏｈ
ｎｏｘｏｇｙ）Ｊ、Ｊ’／ （／９♂４ｔ））ｔａｇを
五と１で切断し、Ｔ４ｔＤＩムポリメラーゼ処理ｔ’行
ｔｎ、更にＨｌｎｌ ｌ 消化して、アクリルアきトグ
ル電気泳動後、ゲルから１ｐｐのターミネータ−（ｌｐ
ｐｊ’）を含む２θθ塩基対のＤＭＡ断片を精製し・ｌ
ｌ１ｎＬ Ｉ及びＰｖｕ ｌで消化し、さらにアルカリ
ホスファターゼ処理したプラスミドｐＢＲ３２２にＴ４
ｔリガーゼを用いて連結した。得られた組換えプラスミ
ドで大腸菌ＨＢ１０／をアンビシリン耐性に形質転換し
、形質転換株よシｐＬｐ ］ （ｊ・／ｋｂ）を得た。 このｐＬｐｌ ／μＩをＢａｍＢＸ消化し、 Ｔｌ（
ＤＮムポリメラーゼ処理後、Ｔ４ｔＩ）１１リカー４’
テ再連結し、大腸１１ｉ ＨＢ１０／の形質転換を行い
、１ｐｐターξネーター（１ｐｐＪ’）中（７）４３ａ
ｍＨ工切断部位を除去したプラスミドｐＬｐ ＩＩを得
た。ｐＬｐ ｌをｎ１ｎａ扉及びＳｃａ ｌで消化し、
１ｐｐのターミネータ−（１ｍ）Ｅ）ｊ＃）を含むｘ４
ｔｏＯ塩基対のＤＭＡ断片をアクリルアミドグルよル精
刺した。 同様にシャトルベクターｐＭＢＬ／もＨｌｎａ ｌ及び
ＢＱａ ｌで消化し、５ｔｏｏ塩基対のＤＮＡ断片を精
製した。この両断片をＴ４ｔＤＭＡ！Ｊガーゼで連結後
大腸薗ＨＢ１０／ｆアンビシリン及びトリメトプリム耐
性に形質転換し、形質転換株からｐＮＢＬｊのマルチク
ローニング部位のＨ１ｒｌｄｌ切断部位の下流に１ｐｐ
のターミネータ−（ｌｐｐｊつの挿入されたプラスミド
ｐＮＢＬ−２（に・Ｏｋり ）が得られた。 更に、このプラスミドｐＭＢＬＪ ／μｇを１０ｏＲ
１及びＨｌｎｄｊで消化し、マルチクローニング部位を
除去してこの部位にそれぞれ第ダ図に示し光合成りＮム
のｌ！ａｏＲ１−ＨＬｎ６鳳断片Ｌ−Ｊ（Ｊｒｂｐ）又
は断片Ｌ−４ｔ（／Ｊ７ｂｐ）を７４ｔ１）Ｍムリガー
ゼで連結した。 得られた組換えプラスミドで大腸菌ＨＢ１０／を形質転
換し、アンビシリン及びトリメトプリム耐性株よシそれ
ぞれプラスミドｐＮＢＬＪ（４０ｋｂ）及びｐＮＢＬ４
ｔ（を２ｋｂ ）が得られた。すなわち、ｐＮＢＬｊは
トリメトプリム耐性遺伝子の下流にある！！！ｇｏＪ［
部位の直後に枯草菌の翻訳の開始に必須なリボソーム結
合部位（１３Ｄ配列−この配列は大腸菌でも機能する）
（ジャーナルオブ バイオロジカル ケミストリー（Ｊ
ｏｕｒｎａｌ ｏｆＢｉｏｌｏｇｉｏａｌ Ｃｈｅｍ
ｉｓｔｒｙ）２７ｔ 、／／コｒ３（／り１１ ））と
読みだしのメチオニンコドンｉ’ｒＧ’ｌ有しておフ、
更にその前後にＢｇｌｊｌ＊ＪＣｐｚＪ、ａｎａｌ ５
Ｈ１ｎａ■の切断部位があり、Ｈ１ｎｄｌ切断部位用し
て目的遺伝子をムＴＧコドンとの読み取）枠を合わせて
連結すれば、上記のトリメトプリム耐性遺伝子のプロモ
ーターから転写が開始されてポリミストロン状でｍ Ｒ
Ｍムが合成され、合成りＭＡＬ−ｊのリボソーム結合部
位にリボソームが結合し、読みだしのムＴＧからタンパ
ク合成が開始される。とシわけｐＭＢＬ［ｔ”Ｋｐｎｌ
で消化し、Ｔ４ｔＤＩムポリメラーゼ処理して、第２ア
ミノ酸コドンからはじまる目的タンパク質の構造遺伝子
を連結すると、読み出しのメチオニンのみが付加された
形で目的タンパク質が合成される。 このｐＭＢＬｊ を用いれば枯草菌及び大腸菌の両宿主
において目的タンパク質を、細胞内に生産させることが
可能である。 一方、ｐＷＢＬ４ｔはトリメトプリム耐性遺伝子下流の
１ｃＱＲ１切断部位の直後にリボソーム結合部位、３７
個のアミノ酸からなるパシラス・ミ アミロリキファシエンスのα−アＩラーゼのシグナルペ
プチド領域及びＢａｍ１！１．８ａｌｌ。 Ｐｓｉｌ及びａｔｎａ＠部位、さらに１ｐｐのターミネ
ータ−（ｌｐｊ’）が存在している。 従って、上記の制限酵素切断部位を利用してシグナルペ
プチド領域に読み取シ粋をあわせて目的遺伝子を結合す
れば、目的タンパク質を枯草菌では培地中に、大腸菌で
はべりプラズム領域へ分泌させることができる。 更にｐ Ｎ Ｂ Ｌ ４ｔを利用しα−アミラーゼシグ
ナルペプチド領域の直後に余分なアミノ酸配列を介さず
直接第２アミノＷ１コドンからはじまる目的タンパクの
構造遺伝子を導入できるように直接発現型に改良した分
泌可能な発現ベクターｐＮＢＬｊを作成した。このベク
ターはα−アミラーゼシグナルペプチドの切断部位と推
定される３１番目の五ｌａコドンの直後に（？ ＥＩ
Ｂ Ｂ、レター（Ｌｅｔｔ、）ＪＯθ、／ｒ（／９♂６
））部位特異的変興手法を利用してＫｐｎ １部位を導
入したものである。 まず、 ｐｍｉＢＬ％ ／μｇｉ８ｃａｌで消化しアル
カリホスファターゼ処ａｔし友ものを得これを断片１と
した。 又％ｐＮｓｒ、ｒ４ｔｉｔｓｇ をＨｔｎａ＊及びＭＯ
ＯＲＩで消化しそのｔ、ｉ Ｋｌ）ｐの大きい方の断片
をアクリルアミドゲルから抽出精製し、これを断片層と
した。 第３図に示した化学合成りＭＡ断片Ｖ （４ｔ７Φ）ｊ
Ｏｐｍｏｌ ｋリン酸化した後、これと断片１％断片
■それぞれ０．３μｙｒ混合し、１００℃から徐冷した
。この操作によル断片ｌと断片■で各々相補鎖分離が生
じ更にこれらの一本鎖になった断片ｌと断片ｎから新し
く二本鎖となった断片層が得られた。 ＤＮＡポリメラーゼ工大７ラグメント（クレノーフラグ
メント）を作用させ断片１のＢ６ｏＲ］からｎｔｎａｌ
の／３４を塩基対の間隔を片鎖を部屋にＤＮＡ断片Ｖを
プライマーとして伸長反応を行なわせ、Ｔ４ｔＤＭムリ
ガーゼにより連結した。 これを用いて大腸菌ＪＩＢ１０／ｆアンビシリン及びト
リメトプリム耐性に形質転換し形質転換株よｊ）Ｋｐｎ
ｌの切断部位を保有するプラスミドｐＮＢＬｊ（６−コ
ｋｂ）を得虎。ｐ Ｎ Ｂ Ｌ ｊはｐＭＢＬグと同様
に枯草菌の翻訳の開始に必須なリボソーム結合部位と３
／個のアきノ酸から成るバシルス・アミロリ中ファシェ
ンスのα−テア２ラーゼシグナル領域を持ち、更にその
下流に新しくＫｐｎｌ、ＢａｍＨｌ、８ａ１１．Ｐａｔ
；ｌ及びａｔｎａ 璽の切断部位が存在している（第Ｚ
図Ｌ−１参照）。 従って、Ｋｐｎｌで消化し、Ｔ＠ＤＭＡポリメラーゼ処
理して第２アミノ酸コドンからはじまる目的タンパク質
の構造遺伝子を連結すると合成されるタンパク質は、３
７７番目シグナルペプチド切断部位の直後に目的タンパ
ク質が連結された形になっているのでシグナルペプチド
を利用して分泌され、しかも余分のアミノ酸が付加して
いない形で菌体外生産が期待できる。 実施例Ｊ ［ｐＨＢＬ４１を用い九β−ラクタマーゼ
の枯草菌での発現及び分泌（第５ 図参照）］ 大腸菌由来のβ−ラクタマーゼを分易生産させるなめに
β−ラクタマーゼ遺伝子を保有した分泌ベクターｐＮＬ
＜ｔ／ｌ−以下のように作製し九。 シャトルベクターｐＮＢＬ４ｔのα−ア建クラーゼペプ
チド領域直後のＢａｍＲ１切断部位に読みとシ枠が合う
ようにβ−ラクタマーゼ遺伝子を導入した。化学合成ペ
プチドＬ４ｔを持つｐ ＆ｉ Ｂ Ｘａ ４’／μｇを
シーＩＩｌ消化しＴ４ｔＤＮＡポリメラーゼによシ平清
末端化し、さらにアルカリホスファターゼ処理したもの
に、β−ラクタマーゼ遺伝子を保持しているｐＫＴＨ７
４ｔ（ジャーナル オプバイオクミストリ−（Ｊ、 Ｂ
ｉｏａｈｅｍ、） ９ ！ 、 １７（／り♂４ｔ））
ｚμ、９’１ｊ−Ｒｉユｄ■で切断しＴダＤ１ｉＡポリ
メラーゼによシ平滑末端化した１４ｔｏｏ塩基対のβ−
ラクタマーゼ遺伝子を含む断片をＴ４ｔＤ？１７ＬＩＪ
ガーゼを用いて連結した。得られた組換えプラスミドを
用−て大腸菌ＨＢ１０／をトリメトプリム及びアンビシ
リン耐性に形質転換し、形質転換株よシｐ’ＮＬ４ｔ／
（り、≦ｋｂ）を得九。 さらにこの組み換え体プラスミド金大腸菌ＨＢ１０／か
ら単離精製し、枯草菌Ｍｘ／／−をトリメトプリム耐性
に形質転換した。このｐＮＬ４ｔ／は、トリメトプリム
耐性遺伝子の下流にｓｎ配列とα−アミラーゼ由来のシ
グナルペプチド領域及び大Ｍｉ菌由来のβ−ラクタマー
ゼ構造遺伝子が読み取り枠を合わせて連結されている。 これによって上流にあるトリメトプリム耐性遺伝子のプ
ロ倚−ターから転写が開始さ九るとポリミストロン状遺
伝子構造を有するｍＲＮｋが合成される。化学合成しｆ
ｉ８Ｄ配列ｆ：認識して翻訳が開始されることによって
β−ラクタマーゼが合成できる。 更にこの翼末端側にシグナルペプチドを有するので培地
への分泌も期待できる。この為、ｐＮＬ４ｔ／を有する
枯草菌Ｍ工／／２形質転換株をｒＪＢブロースに／、１
２μ７７／−のトリメトプリムを含む培地で液体培養し
、経時的に培養液を分取しその上清を用いて、β−ラク
タマーゼの活性を測定した。第３図に示すように、コン
トロールであるｐＭＢＬ４１の活性はほとんどないのに
対し、 ｐＮＬ４ｔ／の場合は、約１時間培饗後に最高 ｉ値７・７ ｕｎｌｔ； ／ｗｉｋ示した。その後活性
が低下しているが、これは菌体外に分泌されたβ−ラク
タマーゼがプロテアーゼの作用によ〕活性が低下したと
考えられる。 実施例ダ （ｐＮＢＬＪ を用いたβ−ガラクトシダー
ゼの枯草菌および大腸菌での発現 （第７図参照）〕 大腸菌由来のβ−ガラクトシダーゼを菌体内生産させる
ためにβ−ガラクトシダーゼ遺伝子を保有した発現ベク
ターＰＭＺＪ／を以下のように作製シた。シャトルベク
ターｐＭＢＬＪの読みだしＡＴＧの直後のＫｐｎ ｌ切
断部位に読みとシ枠が合うようにβ−ガラクトシダーゼ
遺伝子を導入した。 β−ガラクトシダーゼ構造遺伝子を保持しているｐ８に
１０Δ≦（ジャーナル オブ バクテリオロジ−（Ｊｏ
ｕｍａｌｏｆ ＪｉａＯｔｅＰｉ０１０ｇ７） ／ ４
４４／ｐ−２ｏ−−２ｔ＜ｉり／４））／＃ｌｌをＢａ
１ｌ で切断し、ｐｖｏｒマルチクローニング部位の
１ｃＯＲ１からｇｉｎ（Ｌ璽の断片の両端をＴ４ｔＤＮ
Ａポリメラーゼで平滑末端化したものを、Ｔ４ｔＤＭム
リガーゼを用いて挿入し、大腸菌ＨＢ１０／ を形質転
換し形質転換株よ〕プラスミドｐ８ＫＭ／（乙、λ）を
得た。 このプラスミドは、！ｃｏｊｔｌ、シ１１及び初２旧切
断によってβ−ガラクトシダーゼ遺伝子を含む断片を得
ることが可能である。 ｐｊｉＩＣＭ／（ｄ、Ｊ）をＢｈｍＨｉで消化しＴ：４
ｔＤＭＡポリメラーゼで平滑末端化しβ−ガラクトシダ
ーゼ遺伝子を含むＪＪＯＯ塩基対のＤＭＡ断片をアクリ
ルアミドゲルよシ精製した。 一方、ｐＭＢＬ ＪをＩＣｐｎ ｌ消化しＴ４ｔＤＭム
ポリメラーゼで平滑末端化しなものとＤＭＡ断片をτ４
ｔＤＮムリガーゼで連結しβ−ガラクトシダーゼ遺伝子
欠損変異大腸菌Ｍ Ｏ／ ０６ ／ （ｒｚ−ｍｚ”□
２ □ Ｂｕｐ６．ａｒａＤ／ＪＰ、Δ（ａｒａ １ｅｕ）？
Ｊｒｒ７ ΔｌＬａＸ７＃ｇａｌＵ ｇａｌＫ ｓ
ｔｒム）（ジャーナル オプ モレキュラー バイオロ
ジー（Ｊ、 Ｍｏ１． Ｂ１１１） ／ ３１ 、 ／
７ター２０７（Ｉりｒｏ））をアンビシリン及びトリメ
トプリム耐性に形質転換し形質転換株よ〕プラスミドｐ
ＮＺＪ／ｆ得た。さらにこの組み換え体プラスミドを大
腸菌ＭＱ１０１ｓ／から単離精製し、これを枯草菌Ｖ工
ｌ／コをトリメトプリム耐性に形質転換しな。このｐＮ
ＺＪ／はトリメトプリム耐性遺伝子の下流に８Ｄ配列と
読みだしムＴＧコドン及び大腸菌由来のβ−ガラクトシ
ダーゼ構造遺伝子が読みとシ枠を合わせて連結されてい
る。 この日り配列は、大腸菌でも機能するので両宿主中にお
いて、β−ガラクトシダーゼを産生ずることができる。 これをβ−ガラクトシダーゼの活性を指標に調べた。ｐ
ＨＢ Ｘｓ Ｊ及びｐＭＺＪ／を有する大腸菌ＭＯ１
０４／又は枯草菌ＭＸ／／−形質転換株″ｆｒ：ＸＪＢ
−ブロースに１００μｌ／−のトリメトプリム、ダＯμ
ｍ１／−のアンビシリン又は／、０１１７７／１１１１
のトリメトプリムを含む培地でそれぞれ液体培養し／コ
時間、／１時間後に培養液ＩＯ−を採取し集菌した菌体
を対象に活性を測定した。 表２に示すように大腸＠ＭＯＩＯ≦７においてはｐＭＢ
ＬＪがほとんど活性を示さないのに対し、ｐＮＺｊ／は
高い活性を有しｌ一時間及び／ｒ時間後も同様な活性値
を示し活性が維持されていた。 一方、枯草菌ＭＸＩ／コにおいても表−に示すように同
様の傾向がみられ、活性が認められた。 この結果から枯草菌、大腸直両宿主においてβ−ガラク
トシダーゼが細胞内に産生されることが確認できた。 表λ
は、遺伝子を発現し得るシャトルベクターに関するもの
である。 （従来の技術） バシラス属細菌は古くから植々の菌体外酵素の生産菌と
して工業的に利用されている。最近の遺伝子操作技術の
進歩にともなって、これらの薗外体酵素（アミラーゼ、
グロテアーゼ、ぺ二シリナーゼ等）の遺伝子がクローン
化され、そのプロモーターおよびシグナルペプチドをコ
ードするＤＭＡ領域の下流に有用蛋白質の構造遺伝子を
連結して、枯草菌（Ｂａａｉｌｌｕ８吐Ｊエヒ１８）に
導入することによって有用蛋白質′を菌体外に分泌する
ことが可能な分泌ベクターが構築されている。具体的に
はバシラス・アイクリ中ロンα、の生産〔ジーン（Ｇｏ
ｎｅ）柱、−２２？（７９ｒｊ）］、パシラス・ズブチ
リス（Ｂ、ｓｕユｂｔ１１ｔｓ）のα−アミラーゼ遺伝
子を利用したマウスインターフェロンβの生産〔ジーン
（Ｇｅｎｅ）３≦、／７？（／りｒ−ｒ）〕、バシラス
・アミロリキファシエンスの中性グロテアーゼ遺伝子を
利用したヒトインターフェロンβの生産〔ジャーナルオ
プバイオテノロジー（Ｊ、 ｎ１ｃｔｔａｈｎｏ１−
）ゐりＪ−ｊＦ弘（／デ／ｊ）） パシラス・アζロ
リ中７アシエンスｌの中性およびアルカリ性グロテアー
ゼ遺伝子を利用したスタフィロコッカス０オーレ９ス（
８ｔａｐｈｙｌｏｏｏｏｏｕｓ ａｕｒｅｕｇ ）の蛋
白質入の生産〔ジャーナルオプパクテリオロジ（Ｊ、Ｂ
ａＱｔｅＦｌｏｌｍ）乙４１．ｒＪり（ｌデ／４））、
およびパシラス・リケニホルミス（Ｂ、 ｌｉｏｈｅｎ
−１ｆｏｒｍｉｓ ）のベニシリナーゼ遺伝子を利用し
たヒトインシュリンの生産〔ニスチャン等（ａ。 ａｈａｎｇｓｒ： ａｌ ）、−１−レキュｊ−／ａ−
３ンクアンドジーンレギュレーションインパシライ（Ｍ
ｏ１ｅｃｕｌａｒ Ｏｌｏｎｉｎｇ ａｎｄ ｇ＠Ｉｎ
１３ ｒｅｇｕｌａｔｌｏｎｉｎ Ｂａｃｉｌｌｉ）、
アカデミツクプレス（ムｃａａｓｍ１ａｐｒｅｓｓ ）
、ニューヨーク（Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）、ｐｐ、／！り（
／りｒλ）〕などが報告されている＠しかしながら、プ
ラスイドベクターは、コンピテント細胞による形質転換
法を用いると、／が〜／θ１形質転換菌／μｇ ＤＭＡ
という低率でしか枯草菌中に導入できない。この原因は
、枯草菌中にＤＭＡが取シ込まれる時に直線状−木調の
みが取シ込まれるので、プラスミドが、その存在形態の
大多数を占めるモノマー状態の場合には細胞内に取〕込
まれてから環状構造に戻れず、菌体内に合成開始に必要
なプライマーもないので複製が起こらなｈことに起因し
ている。 〔モノキュラージエネラルジエネテイツクス（Ｍｏ１．
Ｇｅｎ、Ｇｏｎｅｔ、）乙／／、４ｔＪ４ｔ（／／ｒ／
）〕。 一方、プラスミドの存在形態として少数認められるダイ
マーやトリマー状態などの場合は相補鎖がλ本人れば環
状復元ができるので複製できる。しかし、上述のように
枯草菌ベクターと異種遺伝子等をリガーゼによって連結
し、その反応液をそのまま用いて形質転換を行なう場合
は、ダイマー以上のプラスミドが生成する可能性は低い
ので、形質転換の効率はさらに悪くなる。 したがって大腸菌と枯草菌の両方で複製可能なシャトル
ベクターを作成して、異種遺伝子をシャトルベクターに
連結し、まず大腸菌で形質転換を行な込、得られたプラ
スミドを枯草菌中に導入して発現させれば、上述の欠点
が解消できる。つま〕、大腸菌は形質転換効率が良りの
で、プラスミドの構築が容易である上に、ｒｅａＦ！＋
の大腸蓮よシブラスミドを調製すると、ダイマーやトリ
１−状態のものができやすく、枯草菌への導入も容易に
なる。さらに、枯草醜ベクターは一般に低コピープラス
ミドなので枯草菌でのプラスミドのｉｌ＃は容易でなか
りたが、大腸菌プラスミドｐＢＲＪＪ−のような多コピ
ープラスミドの複製起点を用いて、シャトルベクター會
作成すれば大ＨＩ菌からプラスミドも大量に調製できる
利点もある。 このようなシャトルベクターの例としては、大腸菌プラ
スミドル１３ＲＪＪコ〔ズブチリス７、ジｘ−ｅジーｍ
（Ｓｕｔ６ユ１ｆｆｅ、 Ｊ、Ｇ、）コールドスフリン
グハーバシンポジウム（ａｏｌ（１日ｐｒｉｎｇＩＩａ
ｒｂｏｒ ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ ）４ｔｊ 、７７−９
０（／９７り）〕とｄｔａｐｈ７１０００００ｕａ ａ
ｕ！”ｅｕａのプラスミドｐＱ／９４１〔プロシーディ
ングナシ冒ナルアカデミ−サイｘ ンス＄ −ｘス−ｚ
−（Ｐｒｏａ、Ｎａｔｌａムａａｄ。 ８ａ１． Ｕ Ｂム）乙４ｔ、／６１θ−／ｊＪＪ（／
り７２）ｌｋ連結したシャトルベクターｐ Ｂ Ｖ ｊ
ｊ ［Ｐｌａｓｍｉｄ４．／？Ｊ−４０／（／９１／
）］、大腸菌プラスＺドｐ１７０デ〔ジーン（Ｇｏｎｅ
） ／ ？ ＊コＪ？−コ４？（／ｙｒａ）］ とス
タフィロコッカス・オーレワスのプラスミドｐｏ／り４
ｔを連結したシャトルベクターｐＫＭ４ｔ ［ジーｙ（
Ｇｅｎｅ）Ｊ？、Ｊ／（／？／４ｔ）］ および大腸
菌プ９ スｔ ）” １；ＩＡＯＹＯ／ｌクク〔ジャー
ナルオプバクテリオ四シース（８ｔ＋ｒａｐｔｏｏｏａ
ａｕｓ ｆａａａａｌｉａ）のプラスミドｐＡＭα／〔
プロシーデイングオプナシ冒ナルアカテξイーサイエン
スニーニス−ニーＰｒＯｃ−Ｍａｕ１．ムａａａ、 １
ｉｔａｉ ａ Ｕ日ムヱ２．／りλ０−７２コ４ｔ（／
テアｊ）ｆｆｔ一連結したシャトルベクターｐＨＹ＃≦
Ｏ〔ジーン（Ｇｅｎｅ）Ｊ、２．／コター／３ダ（／？
ｒｌ ］等が報告されている。 （発明が解決しようとする問題点） しかしながら、上述の様なシャトルベクターの開発は、
未だ十分とはいえず、そこで、本発明者等は、大腸菌と
枯草菌において複製、更には、有用な構造遺伝子奮発現
し得る新規なシャトルベクターを提供すべく鋭意検討し
た。 （問題点を解決するための手段） 本発明者らはエシエリヒア・コリ（Ｅａａｈｅｒｉ−ｃ
ｈｉａ ｏｏｌｉ ）のプラスオドの複製開始点を含む
複製必須領域と、パシラス・ナラ） −（Ｂａａｉｌ−
１ｕａ ｎａｔｔｏ ）のプラスミドの複製開始点を含
む複製必須領域をもち１両宿主で選択可能な薬剤耐性！
−カーとして枯草菌由来のトリメトプリム耐性遺伝子を
もつベクターが、上述の様なシャトルベクターとして有
効に使用し得ることを杢 知得し、本発明を完成するに、／ｌりた。即ち、本発明
の要旨は、エシエリヒア・コリ（Ｋａｃｈｅｒｌ−ｏｈ
ｉａ ｃｏｌｉ ）のプラスミド及びバシラス・ナラ）
−（Ｂａａ４１ｕｓ ｎａｚｔｏ ）のプラスミド由
来の複製必須領域と、パシラス（Ｂａｃｉｌｌｕａ ）
属菌のプラスミド由来のトリメトプリム耐性遺伝子を有
することを特徴とするシャトルベクターに存する。 以下本発明を説明するに、本発明のシャトルベクターは
、ニジエリビア・コリ（以下「１ｏｏ１ｉＪと略す。）
のプラスミドとバシラス・ナットーの（以下「Ｂ、 ｎ
ａｔ；ｔｏ Ｊと略す。）プラスミド由来の複製必須領
域、及び、パシラス属菌のプラスミド由来のトリメトプ
リム耐性遺伝子（以下ｒＴ ！！ｊ ｐ ’Ｊと略す。 ）を有するが、大腸菌は、トリメトプリムに対して７０
Ｊｇ ｇ ／ ｓｄ ｔで自然耐性を示し、形質転換
を行なうために１１００ａ／−という高濃度のトリメト
プリムを必要とするので、更に、王、凹プラスミド由来
の薬剤耐性遺伝子、例えに、アンビシリン耐性遺伝子（
以下「ムｍｐｒＪと略す。）を組込んでおくと好ましい
。 本発明の複製必須領域は、少くともＩｆｆ、 ｏｏｌｌ
及びＢ、 ｎａ’ｃｔｏのプラスミド由来の複製開始点
（ｏｒｉ）を含み、複製機能を損わない程度の任意の塩
基配列を含んでいてもよい。 １、６０１１のプラスオドとしては１例えは、ｐＢＲＪ
２コ〔ジーン（Ｇｅｎｅ）λ、ｔｚ（ｉデ２７）〕、ｐ
ムｏ”ｒａ ｔｅａ （ジャーナルオプバクテリオロジ
ー（Ｊ、Ｂａ０ｔ・ｒｉｏｌ、）乙Ｊ４ｔ、／／４ｔ／
（／り２ｒ）〕、ｐＭＢデ〔毎レキエラーメカニズムイ
ンザコントロールオプジーンエクスプレツション（Ｍｏ
ｌｅｃｕｌａｒ Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ ｉｎ ｔ；ｈ
ｅ ０ｏｎｔｒｏｌ ｏｆＧｏｎ＠Ｘｘｐｒａａａ１ｏ
ｎ ）、ｘｏｌ−ＵＯＬＡ シンボジツムオプモレｄ
Ｐエラーセルバイオロジー（８ｙｍｐ、Ｍｏｂ、Ｇａ１
ｌ Ｂｌｏｌ、）Ｖ、４ｔ７／（／？り４）】等が挙げ
られる。これらの内、Ａｍｐｒｔ″有するｐＢＲＪコλ
が好適である。 ｊＬｎａｔｔｏのプラスミドとしては、例えば、ｐｌｏ
ｄ（ジャーナル オブ パクテリオロジー（Ｊ。 ｎａｏｔ＠ｒｔｏｘ、） ／互Ａ、−〇（／？／ｄ））
、ｐτＩＩ／Ｊ〔ジーｙ（Ｇ＠ｎｅ）ヱ０．／Ｊ／（／
り１０）〕、ｐＬ８１０１ ［モレｄＰエラー ジエネ
ラルジエネテイツクス（Ｍｏｌａｏ、ｇａｎ、Ｇｅｎ＠
ｔ、）／４７．Ｊｄり（ｌり７？））等が挙げられる。 また、７ ｍ ｐ ｒを含むＢａｃｉｌｌｕｓ属薗のプ
ラスオドとしては、例えば、ｐ Ｍ ０４、ｐＴＬ／Ｊ
、ｐＴＬｔｏ（ジーン（Ｇｏｎｅ）１０． ／Ｊ／（／
？１０））等が挙げられる。 本発明においては、複製必須領域と共にＴｍｐ’を含む
ｐ菫Ｏｄが好適に使用で龜る。 尚、ｐＭＱぶは、特開昭４／−コｌ−ダ００号公報に記
載されている方法に従い、ｔず、プラスミドＤＴＩＪｊ
／Ｊ （ジーン（Ｇ＠ｎ・）１０．／３／（／り１０）
：カレント トピックス イン マイクロバイオレジ−
アンド イムノロジー（ＯｕＨｒ、τｏｐ ｍ Ｍｌｏ
ｒＯｂＬ ＯＸ ＩＩＩｍｍｕｎｏｌ、）ヱ４． ／
（／１ＪｒＪ） ３＠ ８６６ ＲＸ 及びＢｇｌ
ｌで二重消化し、小さい１ａｏＡＩ−シ已鳳断片を分離
しておく。一方、プラスミド１）ｌＴ、２コ（昭和１？
年度日本農芸化学会大会講演要旨集−ム−／り、第７図
参照。）のＢｇｌ １部位に、ｐＢＲＪココ由来のｐＨ
Ｂ／（４，コｋｂ）（ジャーナルオプ バイオケミスト
リー（Ｊ、Ｂｉｏａｈｅｍ、）４ヱ４クク−４／コ（１
５Ｆ／／））の１．１ ｋｌｌ Ｂｇｌ ｌ断片□ｓｕ
遺伝子を含む。）を挿入し、枯草菌ＭＸ／／λを形質転
換し、形質転換体よル、大きい方のコｏニーからプラス
ミドを得、このプラスミドをＢｇｌｌで処理してｐｌＴ
Ｊ−よ）コピー数の増大したｐｌＴコλべｚ／、ｒｈｂ
）を得、つぎにこのプラス２ドｐＫＴコ−２／ｌ−ム」
■及びハリで消化し、小さいシｚｏＲ１−Ｂｇｌ Ｎ断
片を得る。そして、この断片と上記プラスξドｐＴＬ／
Ｊ由来のｌ ｔ３ ｏｌｔ）−シ已鳳断片をＴＲＩ）ｍ
ｌムリガーゼで連結し、得られる組み換えプラスミドに
ょシ枯草＠ Ｍｘ／／Ｊをトリメトプリム耐性に形質転
換し、形質転換株よ）プラスミドｐｒｏぶ（ｊ、ａａｋ
ｂ）を得ることができる。 本発明のシャトルベクターは、複製必須領域及び７ ｍ
ｐ １″を含むＤＩム断片を上述の夫々のプラスミド
から適宜制限Ｂｇｌ素等で切シ出すか、＊ＩＡは、それ
らと相同な塩基配列となるよりに化学合成して得、それ
らを常法に従い結合することによって得られる。 上記本発明のシャトルベクターに、バシラス属菌で機能
し得るプロモーター領域、リボソーム結合部位（ＢＤ配
列）、翻訳開始コドン、翻訳終結コドン、更には、パシ
ラス・ズブチリス。 パシラスφアずロリ！２７アシエンス由来のα−アンラ
ーゼ、中性およびアルカリ性のプロテアーゼ遺伝子【カ
レント トピックス インマイクロパイオロジ アンド
イムノロジー（０ｕｒｒ＠ｎｔＴＤｐｉＱａ ｉｎ
ＭｉＯｒｏｂｌｏｌｏｇ７ ａｎａ Ｘｍｍｕ
ｎＯ１Ｇｇ７）イＪｌ／θＪ（／りｔ０］等のシグナル
ペプチドをコート釘るＤｌｆＡ配列、制限酵素切断部位
等を組込むことによりて、大腸菌及び枯草２のいずれに
かｉでも有用な構造遺伝子を発現し得る、所謂、シャト
ル発現ベクター及びシャトル発現分泌ベクターを得る仁
とができる。 その際、８Ｄ配列及び制限酵素切断部位をＴｍマ の下
流に組込むならば、目的とする構造遺伝子をこれらの制
限酵素を利用して、その下流に組込むことができ、大腸
菌および枯草菌両者で発現可能なポリシス）ａン状遺伝
子構造を有する直接発現型のシャトルベクターが得られ
るので好ましい。 上記本発明のシャトルベクターを１用い、常法に従い、
大腸菌ＨＢ／ ０ ／ （Ｆ！−、ｈｓＬ Ｂ−２０、
Ｊ−。 ｍＢ−、ｒ８ＱムＢ、 ａｒｇ ／４ｔ、 ｐｒｏ ＆
２ 、１ａ６Ｙ／ 、 ｇａｌｌｃＪｒｐａ ＬＪｏ（
８♂） ＃ ｘｙｌ−ｚ−、ｍｔｘ −／ 、 ５ｕｐ
ｌ＃＠。 Ｊ−）（ジーン（Ｇｏｎｅ） ２ 、りｊ（／り”）］
ｓ枯草菌ＭＹ／／Ｊ（１ｅｕＢ／ 、 ａｒｇ／ｊ
、 ｔｈｒｊ 、 ｒｅａｌｍ 。 自賛）〔ジーン（Ｇ＠ｎｇ）乙Ｏｊ／Ｉ／（／り１０）
〕等を形質転換し、得られる形質転換体を培饗すること
によって、本発明のシャトルベクターに組込んだ目的の
構造遺伝子を発現させることができる。 （発明の効果） 本発明のシャトルベクターは、大ｉｓおよび＃１草薗の
＾ずれにおいても良好にａ裂、更には、発現する。 （実施例） 以下に実施例を挙げて更に具体的に本発明を説明するが
、本発明はその要旨を越えない＠Ｌ以下の実施例によっ
て限定されるものではない。 なお、以下の実施例における操作は、特に記載する場合
を除き次の方法により念。 〔■〕〔制限酵素によるＤＩムの切断と回収コ制限酵素
による切断用緩衝液は、下記のものを用い九。また切断
条件は、一単位／μｇ］）Ｍムの制限酵素を用い、３７
℃、４０分間処理する。 次いで、Ｔｌ１ｉ緩衝液（１０ｍＭのトリス塩＠ｌ ｐ
Ｈｒ、０及び／ ｍＭのＩＣＤＴムからなる）で飽和し
光フェノールで７回抽出し、エーテルでフェノールを除
き、−倍容のエタノールｆ加えて一一〇℃で３０分間放
置した後、遠心分離してＤＮＡを回収する。 （１）低塩濃度緩衝液 ／６ｍＭのトリス塩酸（ｐＨ７，４ｔ）、１０ｍＭの硫
酸マグネシウム及び／ｍＭのジチオスレイトールからな
る。ｋｐｎ １部位での切断はこれによった。 （２） 中塩濃度緩衝液 ｊ ＯｍＭの１ｉａ０１．１０ｍＭのトリス塩酸（ｐＨ
７，ａ）、１０ｍＭの硫酸マグネシウム及び／ｍＭの９
チオスレイトールからなる。 五ａ”１ｓＡａｔｌ及びｘ１ｎａ曹 部位の切断はこれ
によった。 （３） 高塩濃度緩衝液 ７００ ｍＭのＭａｉｌ、ｊ ＯｍＭのトリス塩酸（ｐ
ｌｉ７．４ｔ）及び１０ｍＭの硫ａｌ−ｆグネシウムか
らなる。Ｌｉ！・Ｌじｌｓ Ｋ６ｏＲＩ、Ｐａｔｌ及び
ＢａｍＨＸ 部位の切断はこれによった。 （４） 制限酵素ａｍａ Ｉ用緩衝液２０ ｍＭの”
３ｒ ％／ ＯｍＭのトリス塩酸（ｐａｒ、Ｏ）、１０
ｍＭの硫酸マグネシウム及び、／ｍＭのジチオスレイト
ールからなる。 〔Ｉ〕〔大腸菌（ｍ、凹） ｌｌＢ１０／及び枯草菌（
Ｊｉ、！１ｕｂｔ４１１ｇ） Ｍｘ／／ＪからのＤｌの
調製】口） を品詞製法（ｍｘｎｉ ｐｒｅｐ法）〔ニ
エクレイツク アシツズ リサーチ（Ｍｕａｌｅｉａ
ＡａｌｓＲ釦ｈ）７巻、１１１３〜７５１３頁、（ｌり
？？）〕大腸菌ＨＢ１０／および枯草＠ Ｍ工／／λを
宿主とし、／ｄのＬＢ−グロス〔ｉａｇのペプトン、Ｊ
ｌのイースト・エキス、！−５７の１ｇ＋＆’ ｌ ／
ｌ−ｓ ｐＨ’、’ ｓ （薬剤耐性プラスミドの場
合は薬剤をふくむ）〕ヲ用いて一夜間培養し、遠心分離
して集菌した菌体を、１００μｍの溶液ム（７０ｍＭの
グルコース、１０ｍＭのＩＤτム、Ｊ ｊ ｍＭのトリ
ス塩酸（ｐｌｉ ？、０ ）及びリゾチームコｗＩＩ／
−からなる）に懸濁し、室温で３０分間放置する。 次いで、氷水中で一２００μｍの溶液Ｂ（／Ｘの５ｐａ
（ドデシル硫酸ナトリウム）を含む０．コ麗のＮａＯＨ
］ ｆ加えて約１分間振盪し溶菌し、ＤＭＡの変性を行
い、 ｉｚ。 ａｌの３Ｍ酢酸ソーダ溶液□ｌｌ４ｔ、ｒ）を加え１時
間水冷後、遠心分離し、上清に冷エタノールを加え、−
２０℃に冷却して遠心分離し、沈殿を集める。 沈殿を、溶液０（７６ｍＭのトリス塩酸及び０．７Ｍの
酢酸ソーダからなる）に溶解し、不溶物を除去後、冷エ
タノールを加え、沈殿するＤＭＡを洗浄し、減圧下乾燥
し一２０℃で保存する。 （２）大量調製法 １００−のＸＪＢ−プロス（薬剤耐性プラスミドの場合
は薬剤をふくむ）に大腸菌ＨＢ１０／および枯草菌ＭＩ
／／Ｊを植菌し、−夜間培養し、集菌後コーのＢＴＸＢ
緩衝液（Ｔ］ｎ！ｉ緩衝液（／ ００ ｍＭ Ｔｒｉｍ
−！Ｉｏｌ（ｐａｒ）、 ／Ｍ Ｍａｉｌ、 ／ ０
０ｍＭＩＤ丁Ａ）に、Ｊｊｊ％サッカロースを添加した
もの〕に懸濁し、ダ岬のリゾチームを添加して３０分間
水冷中に放置する。次いで４を−の／ ｊｉｇ Ｂ Ｄ
Ｂ を含ム０．ＪＭ ＭａＯＩＩ ０）ｆａＲｋ加え
て、１分間、振とうし、溶菌して、 ＤＭＡの変性を行
い、Ｊ−の３Ｍ酢酸ソーダ溶液（）！Ｉ４ｔ、／）を加
え、６０分間水冷後、遠心分離し、上清に冷エタノール
を加え、−一〇℃に冷却し、遠心分離して、沈殿を集め
る。 沈殿１ｋＪｄＴＩＭＢに溶解し、ｊａｔの！ｑ／ＩＩｇ
リボヌクレアーゼを加え、３７℃で３０分間振とうした
後に、２．１ ｊ ｐの塩化セシウムと４ｔ０μｔの！
μＩ／−の臭化エチジツムを添加する。得られた懸濁液
を ３４０．０ＯＯＸＩで一夜間、超遠心分離し、プラスミ
ドに相当するバンドを注射器を用いて回収する。ｌ−ブ
タノールで臭化エチジウムを抽出した後、２００倍容０
θ、７×！！０〔６７ｍＭクエン酸ナトリウム （ｐ”）％および／ ｊ ｍＭ Ｍａｉｌ ］と／ｍＭ
１１１）ＴＡを含む溶液に対して一夜間透析したものを
使用する。 １ （ＴＬ［Ａポリメラーゼによる平滑末端調製法
］粘着末端を持つＤＭＡを３０−のＴ４をＤＭＡポリメ
ラーゼ用緩衝液（、（７ｍＭ）リス塩酸（１）Ｈｒ、ｒ
）、４．７ ｍＭ Ｍｇ０ｌ、、／ ｔ、ｄ ｍＭ硫
酸アンそ二９ム、１０ｍＭ２−メルカプトエタノール、
イ、７ａＭ ＥＤＴム、３３μＭｊｌＡ’ｒＰ−ｔｌＯ
ＴＰ−４０’ｒＰ−１１ＴＴＰからなる）に溶解し、Ｔ
４をＤＭＡポリメラーゼｆ１０単位／＃ｇＤｌｉＡ 加
え、３７℃で３０分間処理し、ＴＩＣ緩衝液で飽和した
フェノールでＤＮＡを抽出処理した後、エーテルでフェ
ノールを除き、冷エタノールを加え一一σ℃に冷却し、
遠心分離によシ、沈殿したＤＮＡを回収する。 ■（Ｔ４をＤＭＡリガーゼによる連結〕連結する一個の
Ｉ）ＭＡ断片は、７ムｇ／／θμｌになるように、連結
用緩衝液［ｄ ｄ ｍＭのトリス塩ａ！１（ｐＨ７，７
）、４ ｍ ｔ ｍ Ｍの塩化マグネシウム、１０ｍＭ
のジチオスレイトールからなる。］に溶解し、４ｊ”
Ｃでｉｏ分間処理した後、４ｔ’Ｃで４６μＭのムＴＰ
（アデノシントリ７オスフエート）を加え、更に’ｒ４
をリガーゼ會、粘着末端の場合は０．／単位／μｇ Ｄ
ＮＡ％また平滑末端の場合は７単位／ｊＡｇＤＭムにな
るように加えてダ℃で／ｒ時間反応させた後、６ｌ℃で
７０分間処理する。 Ｖ（１） （大腸菌の形質転換（アドバンスト バク
チリアル ジエネテイックス（ＡｌｖａｎｃｅｄＢａａ
ｔｅｒｉａｌ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ） （／９１１）
：をにトスプリング ハーバ−ニューヨーク（Ｏｏｌｄ
ｓｐｒａｎｇ Ｍａｙｏｒ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ ） ］
４−のＬＢ−ブロスに、大腸菌１ｉＢ１０／を植菌し、
−夜間培養して集菌し、０．３ｍｌのＪ ＯｍＭ塩化カ
ルシツム溶液に懸濁し氷冷する。この菌液０・ｌ−及び
０．／−の０．７Ｍトリス塩ｆｆ１（ｐＨ７・コ）にＤ
ｌｆＡを溶解し、水冷後、７７℃で一分間熱処理し、ｌ
−のＬＢ−プロスを加え３２℃で一２０分間培養する。 得られた薗懸濁液Ｏ・／ｄをアンビシリン４ｔｏμｇ／
ｓｇ、トリメトプリム１００μｇ／−を含むＬＢ寒天培
地で一夜間培養し、形質転換株を得る。 （２） 〔枯草菌の形質転換（ジャーナル オプパクテ
リオロジ−（Ｔｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂａｏｔ＠ｒｌｏ
ｌ−ｏｇｙ）／／ ７４ｔ／（／り６／）】８ｐＨ１
ｉｉ１６ｎ の最小培地（へ１１ン酸二カリウム、０．
ｔ ３ｇリン酸−力す９ム、 ０．．２％硫硫酸アンモ
リ９ム０．７％クエン酸ナトリワム、ｏ、ｏａｘ硫酸マ
グネジツム、０．！Ｓグルコース）に０．０λ２カザ電
ノ酸及び、！０μｓ／ｄＬ ｈリプトファンを添加し
た培地λｄを用いて対数増殖期終了後約７時間培養し、
更にとの悪濁液ｔ” ８ｐｉｔＬｇｅｎ の最小培地に
Ｏ１θ／Ｘカザ建ノ酸！μｇ／ｄ−一トリプトファンを
添加した培地で７０培に薄め、培養を続ける。通常２０
分培養で；ンビテント状態になシ、この細胞を用いて形
質転換を行った。すなわちこの菌液０．１−にＤｌｉＡ
溶液ｏ、ｉ ｒａｔ ｖｋ加より ”℃で１時間振とり
後、ＬＢ−ブロスλ−を添加し、更にＪり℃で７時間培
養する。得られた薗懸濁液をトリメトプリム、１′μｇ
／−を含むＬＢ寒天培地で３７℃、−夜間培養して形質
転換株を得る。 ■ 【合成りＮＡリンカ−のリン酸化】ＤＮＡの化学合
成はアプライド バイオシステム（ムｐｐＨｅｌ Ｂｉ
ｏａｙｓｔｓｍ ）社のモデル（Ｍｏａｅｌ）！１０１
Ｊ ｖ５ム ディーエヌーエー シンセサイザー（
Ｑｏｌｍｎ ＤＮＡ ｓｙｎｔｈｅｓｉｇｅｒ）を用い
て、ホスファイト法による同相合成によって合成した。 この合成りＭＡは、末端にリン酸基が付いていないので
、下記方法によ、９Ｔ４ｔキナーゼでリン酸化を行った
。 ｊｎｍｏｌの合成りＮＡリンカ−を、（ｉ（／ ｎ１の
／＜７！ＩＩＭ）リス塩酸ＣｐＨり、７）及び／ＪｍＭ
の塩化マグネシウムに溶解し、４０℃テ１０ｍＭの一一
メルカブトエタノールを加えた後、３．２℃で一〇ｍＷ
ｉのＡＴＰを加え、更に１０単位のＴ４を中ナーゼを添
加して３２℃でＪ。 分間処理した後、−２０℃で保存する。 ■ 〔合成りＭＡ！Ｊンカーの平滑末端への連結〕平滑
末端のＤＩム断片（／、Ｊ ｐ ｍｏ１末端）と上記■
でリン酸化した合成り［１ンカー（／ ００ ｐｍｏ１
末端）を連結用緩衝液［ｄｄｍＭのトリス塩酸（ｐｌ！
７．７）、４・４ｍＭ の塩化マグネシウム、１０ｍＭ
のジチオスレイトール−からなる］に溶解し、ｌ単位の
Ｔダリガーゼを加え、グ℃で／ｒ時間反応後、Ｔｌ＠衝
液で飽和したフェノールでＤｌｌｌＡを抽出し、エーテ
ルでフェノールを除去後、エタノール沈廠でＤＮＡを回
収する。 ■ 〔プラスミドＤＩＪＡのバクチリアルアルカリフォ
スファターゼ（ＢＡＰ）処理 プラスミドＤＮＡの自己連結を阻止するため、プラスミ
ドＤＮＡの制限酵素部位とＤＩム断片との連結に先だっ
て、プラスミドＤＮＡ（／ Ｏｐｍｏ１！末端）をコｏ
ｏ μｘのＢＡＰ緩衝液［／θｍＭのトリス塩ｓ＜ｐ
ｍｒ−の及びθ、ハ１の！ＩＤＴムからなる］に溶解し
、／θＯ単位のＢＡアを加え、４℃℃で７時間反応後、
ＴＩ緩衝液で飽和したフェノールで抽出兜理し、エーテ
ルでフェノールを除去し、エタノ−、ル沈殿によシブラ
スミドＤ１１Ａを回収する。 ■ 〔アクリルアミトグルからのＤＭＡの抽出〕ゲルは
縦／７．、横／７ｃｍ、厚さｌａＩの大きさでアクリル
アイドの濃度が４ｔ３のものを用いる。泳動終了後−２
＃ｇ／−の臭化エチジクムで一〇分染色し、紫外線ラン
プを用いて、必要なバンドを滅菌したナイフで切シ出す
。 シリコーンで被膜し、滅菌したガラス棒で細かくすシつ
ぶす。ゲル溶出液（ｔｏθｍＭ酢酸アンモニワム、１０
ｍＭ酢酸マグネシウム、／ ｍＭＩ！ＤＴＡ、 ０．／
９ｇ ＢＤＢ ） ４ｔＯ６ｇ加えて、３２℃で一夜
間振とうした後、遠心分離し、上清をＴＩ緩衝液で飽和
したフェノールでＤＭＡを抽出し、エーテルで７エノー
ル管除去後、エタノール沈殿でＤＮＡを回収する。 Ｘ （／−ラクタマーゼ活性の測定法］β−ラクタマ
ーゼの活性測定はヨク素比色法を適用し九Ｃ蛋白質、核
酸、酵素−ｊ、 ｊ？／（／り７♂）〕。培養上清を０
．７Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７，０）で希釈し
、酵素試料とする。 中試験管にＯ・７Ｍリン酸ナナトリ９ム緩偏液 ｐＨ７
，０） 、２．７ ｍ、酵素試料Ｏ１！―を加え３０℃
で５分間加温する。 基質濃度コη／−のベンジルペニシリンカリクム塩（明
治Ｓ茶）を含むθ、！―のリン酸緩衝液を加えよく混合
し適尚時間（−〜６０分）３０℃でインキエベートする
。ヨウ素試液（！−中ｆｃａワ素分子Ｘ、 を４ｔＯ
ａｎｏ１含む。）ｊ−を反応液に加え、よく混合し酵素
反応を停止する。 ヨウ素試液は以下のよりに調製する。ヨウ素保存液（１
！＋９素カリウム１ｏＯ１′を蒸留水７０−に溶解しこ
れにヨウ素−０，３Ｊ ？＋−加え、蒸留水を加えて総
量！００１１ｄとしたもの。）を酢酸緩衝液（無水酢酸
ナトリクムｔｏｌを蒸留水約！００−に溶解し、氷酢酸
を加えｐＨ４１，０に調整後蒸留水を加えて−２とする
）で−４倍に希釈したものを使用する。 室温で７０分間放置後クりット光電光度計で吸光度（Ｉ
Ｃ１ｅｔｔ； ｕｎｉｔ）ｋ測定する。得られた吸光度
をＫｕ（サンプル）とする。この時の使用波長は、ｊ
４１０ ｎｍを用いる。 ブランクムは、ＷＩツ素試液！ｗｔ、ＯＪＭリン酸緩衝
液Ｊ−１蒸留水Ｏ０！−を加え直ちに吸光度を測定しＩ
Ｃｕ（ブランクＡ）とする。 ブランクＢは、酵素試薬を：Ｉ１７素試液添加後に加え
る以外は同様な操作で吸光度を測定しＫｕ（ブランクＢ
）とする。 酵素試料液のβ−ラクタマーゼ活性（ｕｎｉｔ／−）は
下の式から計算する。 ＦＷ４ｔ、！７．Ｔ＝＋反応時間Ｃ＋）、ｖｗｒｍ素試
料液量（−） ／ ｕｎｉｔは基質／ＡＩ！！１０１の
β−ラクタム環を１分間、３０℃で加水分解する酵素活
性を示す。 累 〔β−ガラクトシダーゼ活性の測定（ジャーナル
オブ バクテリオロジ−（Ｊ、 Ｂａｇｔｅｒｉｏｌ乙
乙ｌ、コθ（／りを−）〕 培養液！Ｉｌ１ｇｔ分取し遠心分離によシ集菌する。集
画時の濁度を波長４ ｏ ｏ ｎｍで測定しておく（ム
４００）。その細胞沈殿物Ｋ ｊ、ｊ ｄの２−緩衝ｆ
ｉ（４０ｍＭリン酸第二ナトリウム、４ｔＯｍＭ リン
酸第−ナトリウム、１０ｒｎＭ塩化カリウム、１ｍＭ硫
酸硫酸マグネシムタム ＯｍＭメルカプトメタノール、
／ ｍＭ Ｐ１ａＢ’ＩＰｐＨ７，のに懸濁する。これ
に３滴のトルエンを加え直ちに７０秒間かくはんし細胞
膜を粉砕して基質が細胞質内に拡散できるようにする。 その後３２℃で４ｔＯ分間保温しトルエンを揮発させる
。この液に２−緩衝液（ｐ！！７．０を加え適当に希釈
し酵素反応試料とする。 この試料１・１ＩＩＡ１ヲ中試験管に入れ、Ｊ？”Ｃで
！分間加温する。これに基質液（４ｔＷＩｆ／Ｎｔの濃
度になるよ５ ｊｃ Ｏ，／ Ｍリン酸ナトリウム緩衝
液で０−ニトロフェニル−β−Ｄ−ガラクトシダーゼを
溶層したもの）を０．６−加え一ガラクトシダーゼが基
質に作用し試料が黄色に発色してから／Ｍ炭酸ナトリウ
ムをｏ、ｒこの反応層を２分間遠心分離し上清く対して
吸光度を測定する。この時の波長は４ｔ２０ｍｍ ’に
用いる。 酵素試料液のβ−ガラクトシダーゼ活性（Ｍｚｌｌ・ｒ
ｕｎｌｔ）は下の式から算出する。 ｔ：反応時間粉） （ｔｓ−を）Ｖ ：反応に使用した培養液量（ｄ）ａ ：希釈度 ■ 〔部位特異的変異誘起（バイオテクノロジー （Ｂ
ｌｏｔａａｈｒｏｌｏｇｙ）Ｊ、ｔｉｔ、／１ｒａ））
プラスミドＤＮＡを薬剤耐性を獲得するのに必要な領域
の中に認識部位の存在する制限酵素で消化しアルカリ７
オスフアターゼ処理しておく。得られるＤＭＡを断片ｌ
とする。 一方部位特異的変異を行ないたい領域を含む断片を取シ
のぞ（為に同じプラスミドｌ）Ｍムをその領域ｔはさむ
適当な二ケ所の制限酵素認識部位で切断し、アクリルア
ギトグル電気泳動によシグルからその領域を含まない。 太き一方の断片を抽出精製する。 得られるＤＮＡを断片ｌとする。 更に部位特異的変異をほどこした配列を含む数十塩基配
列から成るオリゴヌクレオチド！ １化学合成によ）作成し、ＴμＤＭＡキナーゼによ）末
端ｔリン酸化したものを＃４裂する。 等量（０，Ｊｔｔｇ）の断片１１断片■及びその１００
倍からｊ００倍相当の過剰な合成オリゴヌクレオチドを
含む混合液（！×ポリメラーゼーリガーゼ緩衝液〔！θ
θｍＭ塩化ナトリヮム、ＪＪ、ｊｍＭ）リス塩酸（ｐｌ
！７．７）ｇｔＯｍＭａＩｌ化マグネシクム、１ｍＭβ
−メルカプトエタノール】／コμｍを含み、蒸留水で最
終容量ｓａ、ｒμｍにする。）ｔ″詞製る。 この混合液を１００℃の湯浴で３分間保温する。辷れに
よ）混合液中に含まれる断片Ｉ及び断片厘の相補鎖が分
離して一本鎖となる。 変性を生じ九混合液をただちに３０℃で３゜分間保温し
更にダ℃でＪθ分間保温後氷の上に移行する。 との徐冷の過程で一本鎖に浸った断片ｌ及び断片国が再
生しそれぞれ元の二本鎖に戻っ虎もの、新しく一本鎖断
片１と一本鎖断片１によシ開環屋二本鎖を形成したもの
（断片璽）を含む混合物を形成する。 この混合液／１．４μλを採取しこれに２・１ｍＭのダ
種のジオ中ジヌクレオチド基質液（（ＩＮＴＰ） ＜ｔ
、０４ｍ、／／７ｍＭ ＡＴＰ ４＜ １１Ｋｇ％Ｄ
ＭＡポリメラーゼエ大フラグメント（クレノー７晩保温
する。この灰石によ）断片響の開＃、ｆｆｉＤＭＡに合
成オリゴヌクレオチドがプライマーとして働き、ＤＮＡ
ポリメラーゼｌえフラグメント（クレノー７ラグメント
）が変異したい領域をうめあわせることによシ閉環温Ｄ
ＮＡを形成する。これを用いて大ＩｋＷ１を形質転換し
、上記の部位特興的変Ａ紛起ｌによシ新しく導入された
制限酵素部位金持つプラスミド全スクリーニングしてく
る。 更にもう一度とのプラスミドを用いて大腸菌への形質転
換を行ない同様の方法を繰返虜し変異プラスミドを精製
する。 実施例１ 【枯草百−大腸薗シャトルベクターｐＭＢＬ
Ｉの作成（第２図参照）】 トリメトプリム耐性遺伝子を保持した枯草菌プラスミド
ｐｒｏ ｔ ２μＩｉをＰｓｔ ｌで切断しτダリガ
ーゼで連結した。得られた組換えプラスミドを用いて活
写＠ＭＺ／／λ株（ｙ６（Ｈ］ＩｆＱ” 、シミムｒａ
ｒｇ／ｊ−ｔｂｒｊ−ｒＭ−ｍＭ−）（Ｇｏｎｅ、／ｄ
、／Ｊ／。 （／り♂Ｏ）アグリカルチエラル バイオロジカル ケ
ミストリー： （Ａ＠ｒｔｓＢ１ｏ１．ａｈａｍ、）
ｊｏ、コｒ４ｔｔ（／デｒ≦））をトリメトプリム耐性
に形質転換し、形質転換株よシ、！ｌ１ｎｌ ＩＩ切断
部位を７ケ所のみ保持した小型化プラスミドｐＮＱＡＯ
／（４ｔ・／ｋｔ＋）を得た。このプラスミドｐＮＯｊ
（７／／μｇをＡａ′ｒ、１ で消化し、バクチリアル
アルカリフォスファターゼ（ＢＡＰ）で３′末端のリン
酸を除去し、この断片と、大腸菌のプラスミドｐＢＲｊ
λコ／μｆＩ（コールド スフリング バー／（−シン
ポジウム（（１０１（１８ｐｒｉｎｇ Ｈａｒｏｏｒ
Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ）シり首ムポリメラーゼで平滑末端
化し、更にｐｖｕ ｌ消化して得られる大腸菌の複製必
須領域とアンビシリン耐性遺伝子を含む一、Ｊ ｋ）の
断片とをＴ（＜リガーゼを用いて連結した。得られた組
換えプラスミドを用いて大腸菌ＨＢ１０／（Ｆ−、ｈａ
ｄ ＢＡＤ 、 ｒＢ−、ｍＢ−、ｒｅｏＡＢ、 ａｒ
ａ−／＠ 。 ｐｒｏＡＪ 、 ｌ！ＬＯＹ／、 ｇａｌＩｃＪ、 ｒ
ｓｐＴ、＋、２７（ａｍ’）、 ！７１−ｊ＠ユ駐、／
、μ究Ｅダ私５）（ジーン（Ｇｅｎ・）ミ テ！（ｌり
７２））をアンビシリン及びトリメトプリム耐性に形質
転換し形質転換株よシブラスきドｐＮＢ？也４．Ｊ ｋ
ｂ）を得た。 更にこの組換えプラスミドｐＭＢ９ ／μｇｔ、］１ｉ
ａｏＲｌ及びｘｔｎａ鳳で消化し、バクテリアアルカリ
ホフ７アターゼ（ＢＡＰ）で処理し、ｐｒ。 ｌりのマルチクローニング部位の１００Ｒ１−ＨＬｎｄ
■断片Ｌ−／（ｊコ１）Ｘｌ） （ジー７ （Ｇａｎｇ
） Ｊ ｊ１０！−／／Ｗ（／り／７）、第μ図参照）
を押入し大腸菌ＨＢ１０／ を形質転換し形質転換株よ
〕プラスミドｐＭ！ＩＩ、／（ム事ｋｂ）を得九。ｐＭ
ＢＬ ／は大腸菌、枯草菌の複製起点を含む複製に必須
な領域及びトリメトプリム、アンビシリン耐性遺伝子を
保持してお〕表７に示したような効率で、大腸菌ではト
リメトプリム耐性及びアンビシリン耐性に、枯草菌では
、トリメトプリム耐性に形質転換できる。又、ｐＭＢＸ
ａ／はマルチクローニング部位中の１ａＯＲＩ、＄１鰭
１．肪１．具吸Ｉ。 ！ｍａｌ 、Ｂａｍ１ｉｌ ＊！ｂａｌ 、ｇａｌｌ
、８ｐｈｌ 、ｌ１ｉｎｄ鳳 は唯一の切断部位でＴｏ
シ、目的遺伝子のクローニングに利用できる。 実施例−〔直接発現型訃よび分泌型のシャトルベクター
の作成（第３図参照）〕 ｐＮＢＬ ／を利用して、トリメトプリム耐性遺伝子の
下流に、翻訳の開始に必須なリボソーム結合部位（８Ｄ
領域）と読み出しのムＴＧコドン又はムＴＧコドンにひ
きつづいてシグナルペプチド領域を有し、さらにその下
流に適当な制限酵素部位及び大腸菌リボプロティンのタ
ーミネータ−（ｌｐｐｊ’） ｋ導入したトリメトプリ
ム耐性遺伝子のプロモーターを用いるポリミストロン状
遺伝子構造を有する発現ベクターを作製した。 ’！ｆｐＸＭ璽ムＩ（エキスペリメンタル マニビュレ
ーシ目ン オブ ジーン エキスプレッション（” Ｅ
ｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｍａｎｉｐｕ：ＬａｗヱＯｎ
Ｏｆ Ｇｒａｎａ ＸＸｐ−ｒｅａａｌｏｎ
’ ）、ｐ、λｊ（／ツ１り、アカデミツク プレス（
Ａａａｄｅｍｉａ ｐｒｅｓｓ）Ｍ、Ｙｍ ； Ｉｆｉ
ＭＢｏジャーナル（Ｊｏｕｒｎａｌ） Ｊ −ダ３２
（／り／４ｔ）；バイオテクノロジー（Ｂｉｏｔｅｏｈ
ｎｏｘｏｇｙ）Ｊ、Ｊ’／ （／９♂４ｔ））ｔａｇを
五と１で切断し、Ｔ４ｔＤＩムポリメラーゼ処理ｔ’行
ｔｎ、更にＨｌｎｌ ｌ 消化して、アクリルアきトグ
ル電気泳動後、ゲルから１ｐｐのターミネータ−（ｌｐ
ｐｊ’）を含む２θθ塩基対のＤＭＡ断片を精製し・ｌ
ｌ１ｎＬ Ｉ及びＰｖｕ ｌで消化し、さらにアルカリ
ホスファターゼ処理したプラスミドｐＢＲ３２２にＴ４
ｔリガーゼを用いて連結した。得られた組換えプラスミ
ドで大腸菌ＨＢ１０／をアンビシリン耐性に形質転換し
、形質転換株よシｐＬｐ ］ （ｊ・／ｋｂ）を得た。 このｐＬｐｌ ／μＩをＢａｍＢＸ消化し、 Ｔｌ（
ＤＮムポリメラーゼ処理後、Ｔ４ｔＩ）１１リカー４’
テ再連結し、大腸１１ｉ ＨＢ１０／の形質転換を行い
、１ｐｐターξネーター（１ｐｐＪ’）中（７）４３ａ
ｍＨ工切断部位を除去したプラスミドｐＬｐ ＩＩを得
た。ｐＬｐ ｌをｎ１ｎａ扉及びＳｃａ ｌで消化し、
１ｐｐのターミネータ−（１ｍ）Ｅ）ｊ＃）を含むｘ４
ｔｏＯ塩基対のＤＭＡ断片をアクリルアミドグルよル精
刺した。 同様にシャトルベクターｐＭＢＬ／もＨｌｎａ ｌ及び
ＢＱａ ｌで消化し、５ｔｏｏ塩基対のＤＮＡ断片を精
製した。この両断片をＴ４ｔＤＭＡ！Ｊガーゼで連結後
大腸薗ＨＢ１０／ｆアンビシリン及びトリメトプリム耐
性に形質転換し、形質転換株からｐＮＢＬｊのマルチク
ローニング部位のＨ１ｒｌｄｌ切断部位の下流に１ｐｐ
のターミネータ−（ｌｐｐｊつの挿入されたプラスミド
ｐＮＢＬ−２（に・Ｏｋり ）が得られた。 更に、このプラスミドｐＭＢＬＪ ／μｇを１０ｏＲ
１及びＨｌｎｄｊで消化し、マルチクローニング部位を
除去してこの部位にそれぞれ第ダ図に示し光合成りＮム
のｌ！ａｏＲ１−ＨＬｎ６鳳断片Ｌ−Ｊ（Ｊｒｂｐ）又
は断片Ｌ−４ｔ（／Ｊ７ｂｐ）を７４ｔ１）Ｍムリガー
ゼで連結した。 得られた組換えプラスミドで大腸菌ＨＢ１０／を形質転
換し、アンビシリン及びトリメトプリム耐性株よシそれ
ぞれプラスミドｐＮＢＬＪ（４０ｋｂ）及びｐＮＢＬ４
ｔ（を２ｋｂ ）が得られた。すなわち、ｐＮＢＬｊは
トリメトプリム耐性遺伝子の下流にある！！！ｇｏＪ［
部位の直後に枯草菌の翻訳の開始に必須なリボソーム結
合部位（１３Ｄ配列−この配列は大腸菌でも機能する）
（ジャーナルオブ バイオロジカル ケミストリー（Ｊ
ｏｕｒｎａｌ ｏｆＢｉｏｌｏｇｉｏａｌ Ｃｈｅｍ
ｉｓｔｒｙ）２７ｔ 、／／コｒ３（／り１１ ））と
読みだしのメチオニンコドンｉ’ｒＧ’ｌ有しておフ、
更にその前後にＢｇｌｊｌ＊ＪＣｐｚＪ、ａｎａｌ ５
Ｈ１ｎａ■の切断部位があり、Ｈ１ｎｄｌ切断部位用し
て目的遺伝子をムＴＧコドンとの読み取）枠を合わせて
連結すれば、上記のトリメトプリム耐性遺伝子のプロモ
ーターから転写が開始されてポリミストロン状でｍ Ｒ
Ｍムが合成され、合成りＭＡＬ−ｊのリボソーム結合部
位にリボソームが結合し、読みだしのムＴＧからタンパ
ク合成が開始される。とシわけｐＭＢＬ［ｔ”Ｋｐｎｌ
で消化し、Ｔ４ｔＤＩムポリメラーゼ処理して、第２ア
ミノ酸コドンからはじまる目的タンパク質の構造遺伝子
を連結すると、読み出しのメチオニンのみが付加された
形で目的タンパク質が合成される。 このｐＭＢＬｊ を用いれば枯草菌及び大腸菌の両宿主
において目的タンパク質を、細胞内に生産させることが
可能である。 一方、ｐＷＢＬ４ｔはトリメトプリム耐性遺伝子下流の
１ｃＱＲ１切断部位の直後にリボソーム結合部位、３７
個のアミノ酸からなるパシラス・ミ アミロリキファシエンスのα−アＩラーゼのシグナルペ
プチド領域及びＢａｍ１！１．８ａｌｌ。 Ｐｓｉｌ及びａｔｎａ＠部位、さらに１ｐｐのターミネ
ータ−（ｌｐｊ’）が存在している。 従って、上記の制限酵素切断部位を利用してシグナルペ
プチド領域に読み取シ粋をあわせて目的遺伝子を結合す
れば、目的タンパク質を枯草菌では培地中に、大腸菌で
はべりプラズム領域へ分泌させることができる。 更にｐ Ｎ Ｂ Ｌ ４ｔを利用しα−アミラーゼシグ
ナルペプチド領域の直後に余分なアミノ酸配列を介さず
直接第２アミノＷ１コドンからはじまる目的タンパクの
構造遺伝子を導入できるように直接発現型に改良した分
泌可能な発現ベクターｐＮＢＬｊを作成した。このベク
ターはα−アミラーゼシグナルペプチドの切断部位と推
定される３１番目の五ｌａコドンの直後に（？ ＥＩ
Ｂ Ｂ、レター（Ｌｅｔｔ、）ＪＯθ、／ｒ（／９♂６
））部位特異的変興手法を利用してＫｐｎ １部位を導
入したものである。 まず、 ｐｍｉＢＬ％ ／μｇｉ８ｃａｌで消化しアル
カリホスファターゼ処ａｔし友ものを得これを断片１と
した。 又％ｐＮｓｒ、ｒ４ｔｉｔｓｇ をＨｔｎａ＊及びＭＯ
ＯＲＩで消化しそのｔ、ｉ Ｋｌ）ｐの大きい方の断片
をアクリルアミドゲルから抽出精製し、これを断片層と
した。 第３図に示した化学合成りＭＡ断片Ｖ （４ｔ７Φ）ｊ
Ｏｐｍｏｌ ｋリン酸化した後、これと断片１％断片
■それぞれ０．３μｙｒ混合し、１００℃から徐冷した
。この操作によル断片ｌと断片■で各々相補鎖分離が生
じ更にこれらの一本鎖になった断片ｌと断片ｎから新し
く二本鎖となった断片層が得られた。 ＤＮＡポリメラーゼ工大７ラグメント（クレノーフラグ
メント）を作用させ断片１のＢ６ｏＲ］からｎｔｎａｌ
の／３４を塩基対の間隔を片鎖を部屋にＤＮＡ断片Ｖを
プライマーとして伸長反応を行なわせ、Ｔ４ｔＤＭムリ
ガーゼにより連結した。 これを用いて大腸菌ＪＩＢ１０／ｆアンビシリン及びト
リメトプリム耐性に形質転換し形質転換株よｊ）Ｋｐｎ
ｌの切断部位を保有するプラスミドｐＮＢＬｊ（６−コ
ｋｂ）を得虎。ｐ Ｎ Ｂ Ｌ ｊはｐＭＢＬグと同様
に枯草菌の翻訳の開始に必須なリボソーム結合部位と３
／個のアきノ酸から成るバシルス・アミロリ中ファシェ
ンスのα−テア２ラーゼシグナル領域を持ち、更にその
下流に新しくＫｐｎｌ、ＢａｍＨｌ、８ａ１１．Ｐａｔ
；ｌ及びａｔｎａ 璽の切断部位が存在している（第Ｚ
図Ｌ−１参照）。 従って、Ｋｐｎｌで消化し、Ｔ＠ＤＭＡポリメラーゼ処
理して第２アミノ酸コドンからはじまる目的タンパク質
の構造遺伝子を連結すると合成されるタンパク質は、３
７７番目シグナルペプチド切断部位の直後に目的タンパ
ク質が連結された形になっているのでシグナルペプチド
を利用して分泌され、しかも余分のアミノ酸が付加して
いない形で菌体外生産が期待できる。 実施例Ｊ ［ｐＨＢＬ４１を用い九β−ラクタマーゼ
の枯草菌での発現及び分泌（第５ 図参照）］ 大腸菌由来のβ−ラクタマーゼを分易生産させるなめに
β−ラクタマーゼ遺伝子を保有した分泌ベクターｐＮＬ
＜ｔ／ｌ−以下のように作製し九。 シャトルベクターｐＮＢＬ４ｔのα−ア建クラーゼペプ
チド領域直後のＢａｍＲ１切断部位に読みとシ枠が合う
ようにβ−ラクタマーゼ遺伝子を導入した。化学合成ペ
プチドＬ４ｔを持つｐ ＆ｉ Ｂ Ｘａ ４’／μｇを
シーＩＩｌ消化しＴ４ｔＤＮＡポリメラーゼによシ平清
末端化し、さらにアルカリホスファターゼ処理したもの
に、β−ラクタマーゼ遺伝子を保持しているｐＫＴＨ７
４ｔ（ジャーナル オプバイオクミストリ−（Ｊ、 Ｂ
ｉｏａｈｅｍ、） ９ ！ 、 １７（／り♂４ｔ））
ｚμ、９’１ｊ−Ｒｉユｄ■で切断しＴダＤ１ｉＡポリ
メラーゼによシ平滑末端化した１４ｔｏｏ塩基対のβ−
ラクタマーゼ遺伝子を含む断片をＴ４ｔＤ？１７ＬＩＪ
ガーゼを用いて連結した。得られた組換えプラスミドを
用−て大腸菌ＨＢ１０／をトリメトプリム及びアンビシ
リン耐性に形質転換し、形質転換株よシｐ’ＮＬ４ｔ／
（り、≦ｋｂ）を得九。 さらにこの組み換え体プラスミド金大腸菌ＨＢ１０／か
ら単離精製し、枯草菌Ｍｘ／／−をトリメトプリム耐性
に形質転換した。このｐＮＬ４ｔ／は、トリメトプリム
耐性遺伝子の下流にｓｎ配列とα−アミラーゼ由来のシ
グナルペプチド領域及び大Ｍｉ菌由来のβ−ラクタマー
ゼ構造遺伝子が読み取り枠を合わせて連結されている。 これによって上流にあるトリメトプリム耐性遺伝子のプ
ロ倚−ターから転写が開始さ九るとポリミストロン状遺
伝子構造を有するｍＲＮｋが合成される。化学合成しｆ
ｉ８Ｄ配列ｆ：認識して翻訳が開始されることによって
β−ラクタマーゼが合成できる。 更にこの翼末端側にシグナルペプチドを有するので培地
への分泌も期待できる。この為、ｐＮＬ４ｔ／を有する
枯草菌Ｍ工／／２形質転換株をｒＪＢブロースに／、１
２μ７７／−のトリメトプリムを含む培地で液体培養し
、経時的に培養液を分取しその上清を用いて、β−ラク
タマーゼの活性を測定した。第３図に示すように、コン
トロールであるｐＭＢＬ４１の活性はほとんどないのに
対し、 ｐＮＬ４ｔ／の場合は、約１時間培饗後に最高 ｉ値７・７ ｕｎｌｔ； ／ｗｉｋ示した。その後活性
が低下しているが、これは菌体外に分泌されたβ−ラク
タマーゼがプロテアーゼの作用によ〕活性が低下したと
考えられる。 実施例ダ （ｐＮＢＬＪ を用いたβ−ガラクトシダー
ゼの枯草菌および大腸菌での発現 （第７図参照）〕 大腸菌由来のβ−ガラクトシダーゼを菌体内生産させる
ためにβ−ガラクトシダーゼ遺伝子を保有した発現ベク
ターＰＭＺＪ／を以下のように作製シた。シャトルベク
ターｐＭＢＬＪの読みだしＡＴＧの直後のＫｐｎ ｌ切
断部位に読みとシ枠が合うようにβ−ガラクトシダーゼ
遺伝子を導入した。 β−ガラクトシダーゼ構造遺伝子を保持しているｐ８に
１０Δ≦（ジャーナル オブ バクテリオロジ−（Ｊｏ
ｕｍａｌｏｆ ＪｉａＯｔｅＰｉ０１０ｇ７） ／ ４
４４／ｐ−２ｏ−−２ｔ＜ｉり／４））／＃ｌｌをＢａ
１ｌ で切断し、ｐｖｏｒマルチクローニング部位の
１ｃＯＲ１からｇｉｎ（Ｌ璽の断片の両端をＴ４ｔＤＮ
Ａポリメラーゼで平滑末端化したものを、Ｔ４ｔＤＭム
リガーゼを用いて挿入し、大腸菌ＨＢ１０／ を形質転
換し形質転換株よ〕プラスミドｐ８ＫＭ／（乙、λ）を
得た。 このプラスミドは、！ｃｏｊｔｌ、シ１１及び初２旧切
断によってβ−ガラクトシダーゼ遺伝子を含む断片を得
ることが可能である。 ｐｊｉＩＣＭ／（ｄ、Ｊ）をＢｈｍＨｉで消化しＴ：４
ｔＤＭＡポリメラーゼで平滑末端化しβ−ガラクトシダ
ーゼ遺伝子を含むＪＪＯＯ塩基対のＤＭＡ断片をアクリ
ルアミドゲルよシ精製した。 一方、ｐＭＢＬ ＪをＩＣｐｎ ｌ消化しＴ４ｔＤＭム
ポリメラーゼで平滑末端化しなものとＤＭＡ断片をτ４
ｔＤＮムリガーゼで連結しβ−ガラクトシダーゼ遺伝子
欠損変異大腸菌Ｍ Ｏ／ ０６ ／ （ｒｚ−ｍｚ”□
２ □ Ｂｕｐ６．ａｒａＤ／ＪＰ、Δ（ａｒａ １ｅｕ）？
Ｊｒｒ７ ΔｌＬａＸ７＃ｇａｌＵ ｇａｌＫ ｓ
ｔｒム）（ジャーナル オプ モレキュラー バイオロ
ジー（Ｊ、 Ｍｏ１． Ｂ１１１） ／ ３１ 、 ／
７ター２０７（Ｉりｒｏ））をアンビシリン及びトリメ
トプリム耐性に形質転換し形質転換株よ〕プラスミドｐ
ＮＺＪ／ｆ得た。さらにこの組み換え体プラスミドを大
腸菌ＭＱ１０１ｓ／から単離精製し、これを枯草菌Ｖ工
ｌ／コをトリメトプリム耐性に形質転換しな。このｐＮ
ＺＪ／はトリメトプリム耐性遺伝子の下流に８Ｄ配列と
読みだしムＴＧコドン及び大腸菌由来のβ−ガラクトシ
ダーゼ構造遺伝子が読みとシ枠を合わせて連結されてい
る。 この日り配列は、大腸菌でも機能するので両宿主中にお
いて、β−ガラクトシダーゼを産生ずることができる。 これをβ−ガラクトシダーゼの活性を指標に調べた。ｐ
ＨＢ Ｘｓ Ｊ及びｐＭＺＪ／を有する大腸菌ＭＯ１
０４／又は枯草菌ＭＸ／／−形質転換株″ｆｒ：ＸＪＢ
−ブロースに１００μｌ／−のトリメトプリム、ダＯμ
ｍ１／−のアンビシリン又は／、０１１７７／１１１１
のトリメトプリムを含む培地でそれぞれ液体培養し／コ
時間、／１時間後に培養液ＩＯ−を採取し集菌した菌体
を対象に活性を測定した。 表２に示すように大腸＠ＭＯＩＯ≦７においてはｐＭＢ
ＬＪがほとんど活性を示さないのに対し、ｐＮＺｊ／は
高い活性を有しｌ一時間及び／ｒ時間後も同様な活性値
を示し活性が維持されていた。 一方、枯草菌ＭＸＩ／コにおいても表−に示すように同
様の傾向がみられ、活性が認められた。 この結果から枯草菌、大腸直両宿主においてβ−ガラク
トシダーゼが細胞内に産生されることが確認できた。 表λ
第７図は、プラスミドｐＫＴＪコの概略図を表わす。図
中、０ｒｉＢｉｊｐＴＬ／コ由来の枯草菌の複製開始必
須領域を表わし、０ｒｉＩｌｆはｐＢＲｌ−２由来の大
腸菌の複製開始必須領域を表わし、ム、Ｂ、０は夫々大
腸菌トリプトファン合成酵素遺伝子群ｔｌ”ｐ Ａ、
Ｂ、 Ｏを表わす。 第２図、３図、３図、７図は、夫々、実施例／、λ、３
、タ の本発明のシャトル発現ベクターの作製工程の概
略図である。 第ダ図は、夫々実施例／、Ｊで使用し′ｆ！−Ｌ−／、
Ｊ、 ４ｔ、 ｊ 部分の塩基配列を示す図である。 第１図は、β−ラクタマーゼ遺伝子を保持する発現ベク
ターの経時的酵素活性曲線図である。 図中でムは、培養増殖を示す。
中、０ｒｉＢｉｊｐＴＬ／コ由来の枯草菌の複製開始必
須領域を表わし、０ｒｉＩｌｆはｐＢＲｌ−２由来の大
腸菌の複製開始必須領域を表わし、ム、Ｂ、０は夫々大
腸菌トリプトファン合成酵素遺伝子群ｔｌ”ｐ Ａ、
Ｂ、 Ｏを表わす。 第２図、３図、３図、７図は、夫々、実施例／、λ、３
、タ の本発明のシャトル発現ベクターの作製工程の概
略図である。 第ダ図は、夫々実施例／、Ｊで使用し′ｆ！−Ｌ−／、
Ｊ、 ４ｔ、 ｊ 部分の塩基配列を示す図である。 第１図は、β−ラクタマーゼ遺伝子を保持する発現ベク
ターの経時的酵素活性曲線図である。 図中でムは、培養増殖を示す。
Claims (8)
- （１）エシエリヒア・コリ（￥Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ
￥ ￥ｃｏｌｉ￥）のプラスミド及びバシラス・ナット
ー（￥Ｂａｃｉｌｌｕｓ￥ ￥ｎａｔｔｏ￥）のプラス
ミド由来の複製必須領域と、バシラス（￥Ｂａｃｉｌｌ
ｕｓ￥）属菌のプラスミド由来のトリメトプリム耐性遺
伝子を有することを特徴とするシャトルベクター。 - （２）エシエリヒア・コリのプラスミド由来の薬剤耐性
遺伝子を含むことを特徴とする特許請求の範囲第１項記
載のシャトルベクター。 - （３）薬剤耐性遺伝子が、アンビシリン耐性遺伝子であ
ることを特徴とする特許請求の範囲第２項記載のシャト
ルベクター。 - （４）エシエリヒア・コリのプラスミドが、ｐＢＲ３２
２であることを特徴とする特許請求の範囲第１項記載の
シャトルベクター。 - （５）バシラス・ナットーのプラスミドが、ｐＮＣ６で
あることを特徴とする特許請求の範囲第１項記載のシャ
トルベクター。 - （６）バシラス属菌のプラスミド由来のプロモーター領
域を含むことを特徴とする特許請求の範囲第１項記載の
シャトルベクター。 - （７）プロモーター領域の下流に、リボソーム結合部位
及び翻訳開始コドンを含むことを特徴とする特許請求の
範囲第６項記載のシャトルベクター。 - （８）翻訳開始コドンの下流に、シグナルペプチドをコ
ードする遺伝子を含むことを特徴とする特許請求の範囲
第７項記載のシャトルベクター。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP62032739A JPS63198986A (ja) | 1987-02-16 | 1987-02-16 | シヤトルベクタ− |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP62032739A JPS63198986A (ja) | 1987-02-16 | 1987-02-16 | シヤトルベクタ− |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS63198986A true JPS63198986A (ja) | 1988-08-17 |
Family
ID=12367203
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP62032739A Pending JPS63198986A (ja) | 1987-02-16 | 1987-02-16 | シヤトルベクタ− |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS63198986A (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2002064800A1 (fr) * | 2001-02-14 | 2002-08-22 | Higeta Shoyu Co., Ltd. | Vecteur plasmide navette entre escherichia coli et brevibacillus |
-
1987
- 1987-02-16 JP JP62032739A patent/JPS63198986A/ja active Pending
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2002064800A1 (fr) * | 2001-02-14 | 2002-08-22 | Higeta Shoyu Co., Ltd. | Vecteur plasmide navette entre escherichia coli et brevibacillus |
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