JPH03139283A - Ｄｔａ遺伝子及びその利用法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は、Ｄ−スレオニンアルドラーゼ（以下、ＤＴＡ
と略す）の合成に関与する遺伝情報を担うＤＮＡ、その
ＤＮＡとベクターＤＮＡとよりなる組換え体ＤＮＡ、そ
の組換え体ＤＮＡを保有せしめた形質転換体、及び該形
質転換体を利用したＤＴＡの製造法並び１；Ｄ−スレオ
ニンの製造法に関する。

本発明は、バイオインダストリーの産業分野に関連した
もので、特に医薬、農薬等の合成原料として有用なり一
スレオニンの製造分野に関する。

〔従来技術及び発明が解決しようとする課題］Ｄ−アミ
ノ酸の研究が進むに従って、Ｄ−アミノ酸は抗生物質、
酵素阻害剤、除草剤等の各種医薬、農薬、その他の各種
の生理活性物質の合成原料として有用であることが明ら
かにされ、その大ｆｆｌ製造法が求められてきた。

従来し一アミノ酸及びＤ−アミノ酸それぞれの製造は、
ＤＬ−アミノ酸から繁雑な方法でもってラセミ体を光学
分割して製造することが一般的であった。

しかし、そのような方法は、不必要な他方のアミノ酸を
製造すると共にそれを光学分割しなければならないとい
う著しい不利な点を有していた。

このような点を解決するものとして、本発明者らは、自
然界を広く検索した結果Ｄ−スレオニンアルドラーゼ（
ＤＴＡ）を見出す（特公昭６４−１１２７９号）と共に
、その酵素を使用すればグリシンとアセトアルデヒドな
どのアルデヒド化合物から選択的にＤ−スレオニンなど
の０体のβ−オキシアミノ酸を製造することができるこ
とを見出した（特開昭５８−１１６６９０号）。

このようなりＴＡを使用したＤ−β−オキシアミノ酸を
効率よく製造するためには、大量のＤＴＡを安価に取得
することが必要であった。従来この酵素を大量に効率よ
く得るために、高生産菌株を土壌などから得る試みが広
範囲になされたり、あるいは既存の生産株の人工突然変
異によって育種改良することがなされてきたが、満足の
いく結果が得られていなかった。

さらにまた、従来の自然界に存在するＤＴＡ生産菌は、
同時にＬ−７０スレオニンアルドラーゼ活性をかなりの
程度示すため、グリシンとアルデヒド類からＤ−β−オ
キシアミノ酸類を製造しようとする場合、Ｌ−アローβ
−オキシアミノ酸の副生を避ける六のにＬ−アロスレオ
ニンアルドラーゼを選択的に不活性化したり、ＤＴＡ活
性から分離するという大変繁雑な操作を必要とするとい
う問題もあった。

（問題点を解決するための手段） このような状況のもとで、本発明者らは、鋭意研究を１
テった結果、微生物よりＤＴＡ産生遺伝子を含むＤＮＡ
を単離することに成功すると共に、そのＤ　Ｎ　Ａを利
用して遺伝子操作を加えて構築された組換え体ＤＮＡで
微生物を形質転換させることに成功し、更にこのような
手法によりＤＴＡの生産性を大幅に向上せしめると共に
Ｄ−スレオニンの生産性をも大幅に改善せしめうろこと
を見い出し、本発明を完成するに至った。

即ち、本発明は、Ｄ−スレオニンアルドラーゼの合成に
関与する遺伝情報を担うＤＮＡを提供することに関する
。

また、本発明は、Ｄ−スレオニンアルドラーゼの合成に
関与する遺伝子情報を担うＤＮＡとベクターＤＮＡとを
結合せしめてなる紺換え体ＤＮＡを提供することに間す
る。

更にまた、本発明は、Ｄ−スレオニンアルドラーゼの合
成に関与する遺伝子情報を担うＤＮＡとベクターＤＮＡ
とを結合せしめてなる組換え体ＤＮＡを保有せしめてな
る形質転換体を提供することにも間する。

本発明は、上記のようにして得られた形質転換体を利用
することにも関する。

即ち、本発明は、上記形質転換体中のＤＴＡの合成に関
与する遺伝情報を担うＤＮＡを、該形質転換体中で発現
させて、ＤＴＡを製造することにも関する。

また、本発明は、上記形質転換体をそのまま利用して、
生物学的にＤ−スレオニンまたはその誘導体を製造する
ことにも関する。

更に、本発明は、上記形質転ＩｆＡ体中のＤＴＡの合成
に関与する遺伝情報を担うＤＮＡを、該形質転換体中で
発現させて、その結果得られた組換えＤＴＡを用いて酵
素学的にＤ−スレオニンまたはその誘導体を製造するこ
とにも関する。

以下、更に詳細に本発明を説明する。

本発明のＤ−スレオニンアルドラーゼの合成に関与する
遺伝情報を担うＤＮＡとしては、例えばキサントモナス
属細菌から得られたものが挙げられる。このキサントモ
ナス属細菌としてはＤＴＡ産生キサントモナス属細苗株
であれは特に限定されないが、特に好ましいものとして
はキサントモナス・オリゼーＩＡＭ１６５７をあげるこ
とができる。

また、このＤＮＡは、以下に詳細に説明するようにして
取得されるが、それが−旦単離取得されたならば、慣用
方法に従ってそのＤＮＡ中の塩基配列の大部分あるいは
一部分を利用して、それをプローブとして用いて、他の
生物を検索して、その生物の保有する遺伝子のうちに、
ＤＴＡの合成に関与する遺伝情報を担うものを見つけ出
し、次にそのようにして同定された遺伝子を遺伝子組喚
え技術の手法を応用して切り出して、それを大量に得、
それをこのキサントモナス属細菌に由来するものと同様
に用いることは、当業者であれば容易に理解しうるとこ
ろのものである。

したがって、本発明のＤ−スレオニンアルドラーゼの合
成に関与する遺伝情報を担うＤＮＡ源としては、キサン
トモナス属細菌のみでなく、上記したような手法の適用
できるダラム陰性あるいは陽性細菌であってＤＴＡをコ
ードする遺伝子を有するものがあげられる。この他にも
、ＤＴＡ３ｊｉ伝子を有するものであれば、動物、植物
、下等生物、高等生物の区別なく利用することが可能で
ある。

ＤＴＡ遺伝子源として好ましい微生物としてはキサント
モナス属、アリスロバクター属、シュードモナス属ある
いは、アルカリゲネス属に属するものがあげられる。こ
のようなものの代表的なものとしてはキサントモナス・
オリゼーＩＡＭ１６５７、アルカリゲネス・ハエ力リス
ＩＦＯ１２６６９゜シュードモナスＤＫ−２微工研菌寄
第６２００号及びアリスロバクターＤＫ−１９微工研菌
寄第６２０１号をあげることができる。

また、本発明のＤ−スレオニンアルドラーゼの合成に関
与する遺伝情報を担うＤＮＡとしては、Ｄ−スレオニン
アルドラーゼをコードしている遺伝子の部分であるＤＮ
Ａあるいは、そのＤ−スレオニンアルドラーゼをコード
している遺伝子の部分に加えて、その遺伝子を生体内で
発現させるのに重要な役割を担う制御領域、例えば、読
み取りの開始部位あるいは終止部位などを含有している
ＤＮＡが含まれる。またそのようなりＮＡとしては、そ
の相補鎖のＤＮＡも包含されるほか、その機能をそこな
わない範囲でその塩基を置換したものもあげられる。こ
のような塩基の改変は、当該分野において知られた方法
を適用して行うことができ、例えば相当するアミノ酸を
コードする遺伝暗号の縮重を利用したもの、生物の遺伝
暗号の利用率を考慮した変換あるいはＤＴＡの機能に悪
影響を及ぼさないようなアミノ酸配列の変換のための塩
基の置換、付加または欠失処理などがあげられる。

更にまた、このような改変のうちには、ＤＴＡの活性中
心のみを保存し、その他の部分を大幅に変化させるよう
にそのＤＮＡの配列及び長さを変えることも含まれる。

したがって、本発明のＤ−スレオニンアルドラーゼの合
成に関与する遺伝情報を担うＤＮＡとしては、以上のよ
うな改変を施したものすべてが使用できることは当業者
であれば容易に理解しうるところのものである。

以上のような事情に鑑み、本発明のＤ−スレオニンアル
ドラーゼの合成に関与する遺伝情報を担うＤＮＡは、本
発明の思想を実質的に利用して得られ、本発明のＤＮＡ
と実質的に同一の機能を有するものすべてを含有するも
のである。

次にキサントモナス属細菌由来のＤＴＡ産生遺伝子を含
むＤＮＡを例にあげて、組換えＤＴＡの製造法及びその
利用について説明する。

（１）　　ＤＴＡ生産性キサントモナス属細菌より染色
体ＤＮＡを抽出し、制限酵素で切断する。染色体ＤＮＡ
の抽出は、）Ｍａｒｍｕｒ法（Ｊ、Ｍａｒｍｕｒ、Ｊ、
Ｍｏ１Ｂｉｏ１．．３．　２＋ＩＮ！９６１１．）など
の通常用イラれティる方法で行うことが出来る。

ここで使用しろるキサントモナス属細菌としては、具体
的にはキサントモナス・オリゼーＩＡＭ１６５７あるい
はその変異株があげられる。

またその染色体ＤＮＡの抽出は、培養して得られた菌体
をリゾチームあるいはプロテナーゼで処理し、フェノー
ルで抽出すること等によりなされる。このようにして抽
出されたＤＮＡは適当な制限酵素で切断される。

切断に用いる制限酵素としては、染色体ＤＮＡを適当に
切断でき、かつ本目的に使用するベクターの開裂に用い
ることができる制限＃素であればいずれも使用可能であ
る。この除用いる制限酵素によって目的遺伝子の内部が
切断されることを避けるために、低活性の制限酵素でＤ
ＮＡを部分的に分解し、目的遺伝子を完全に含むような
適当な大きさのＤＮＡ断片を得ることが望ましい。

このようにして得られたＤＮＡ断片はショ糖密度勾配遠
心法、アガロースゲル又は、アクリルアミドゲル等を用
いたゲル電気泳動法あるいはＲＰＣ−５レジン等を用い
たカラムクロマトグラフィー法によって精製されること
ができる。

本発明の場合特にショ糖密度勾配遠心法が好適に使用さ
れ、その５−１０Ｋｂの画分が好適に組換え体ＤＮＡの
作成に用いることができる。

（２）　ベクターＤＮＡを制限酵素で切断・開裂させる
。ベクターＤＮＡの開裂は、ベクターＤＮＡに適当な制
限酵素を十分作用させることにより行う。

二二で使用される制限＃素は、上記（１）において使用
した制限＃ｇ素を考慮して決めることができるが、必ず
しも同一である必要はない。それは下記（３）において
記載するように、各ＤＮＡの末端部を必要に応じて修飾
することができるからである。このような方法としては
、公知の方法を適宜組み合わせて用いることができる。

しかしながら、その制限＃素は、上記（１）において使
用したものと同一のものを用いると便利であり、好まし
い結果が得られる。

ここで使用しろるベクターＤＮＡとしては、通常の公知
の宿主−ベクター系として知られているものの中から選
んで用いることができる。このようなベクターＤＮＡと
しては、各宿主細胞中で自律複製可能なものであれば制
限なく使用でき例えば、宿主細胞として大腸菌を用いる
場合、大腸菌に一１２株（ＥＫ）用によく知られた発現
ベクターがあげられる。このようなものの代表例とじて
は、　ｐＭＢ９．　　ｐＢＲ３１３，ｐＢＲ３２２，ｐ
１３Ｒ３２４，ｐＢＲ３２５，λｇｔＷＥＳ　　・　λ
Ｂ。

λｇｔＺＪｖｉｒ−λＢ、　　Ｃｈ　ａ　ｒ　ｏ　ｎフ
ァージ。

コスミドベクター　ランナウェイ・プラスミドベクター
などがあげられるほか、１ａｃＵＶ５．ｔｒｐプロモー
ター　外膜リポタンパク遺伝子（ｕｐｐ）、タンパク合
成の延長因子ＥＦ−Ｔｕ遺伝子（ｔｕｆＢ）、ｒｅｃＡ
遺伝子のプロモーターコリシンＥ１遺伝子のプロモータ
ー　および＾ファージ初期遺伝子群プロモーター（ＰＬ
）などを単独であるいはそれらの任意のものを組み合わ
せたもので制御されたプラスミドベクターがあげられる
。このようなプラスミドベクターのうち特に好ましいも
のとしてはｐＢＲ３２２、ｐＢＲ３２８などがあげられ
る。

また、ここで使用されるベクターＤＮＡとして広宿主域
接合伝達プラスミドとして知られたものを用いると、直
接に宿主細胞としてキサントモナス属細菌、シュードモ
ナス属細菌、アルカリゲネス属細菌などを用いることが
できる。このようなベクターＤＮＡとしては、ｐＲＫ２
０１３などのヘルパープラスミドと共に用いられるｐＲ
Ｋ２９０、ｐＲＫ２９０からλＣＯ５で修飾されたコス
ミド、ｐＳａ及びｐＲ８Ｆ１０１０を母体とするコスミ
ト、ｐＲ３Ｆ１０１０から誘導された各種ｐＫＴ系にプ
ラスミド、ｐＲ３００Ｂから誘導されたｐｌＲＬ２ある
いはｐＴＢ７０．及びｐＴｓ１０３６なとがあげられる
。このようなベクターＤＮＡとして特に好ましいものと
してはｐ　ＲＫ　２０１３をヘルパープラスミドとして
用いたｐ　ＲＫ　２９０があげられる。

また、キサントモナス属細菌を宿主細胞として用いる場
合、キサントモナス属細菌内で自律複製しうろことが知
られ、さらにはキサントモナス属細菌を形質転換させう
ろことが知られたベクターＤＮＡも使用することができ
、このようなベクターＤＮＡのうち特に選択マーカーと
してクロラムフェニコール耐性によって選別しろるよう
な性質を有するものがあげられる。このようなものとし
て、特に好ましいものとしては大腸菌のベクターＤＮＡ
から改良されたものがあげられる。この代表的なものと
してはｐＢＲ３２８，ｐＢＲ３２５などがあげられる。

さらにまた、ここで使用されるベクターＤＮＡとしては
、宿主細胞として、例えばアセトバクター属細菌、シュ
ードモナス属細菌、グルコノバクタ−属細菌、アゾトバ
クタ−属細菌、リゾビウム属細菌、アルカリゲネス属細
菌、クレプシエラ属細菌、サルモネラ属細菌及びセラチ
ア属細菌から選ばれるものにおいて用いられるものがあ
げられるが、好ましくはこのうち特に遺伝子組換えにお
いて広く一般に用いられるものがあげられる。これら宿
主細胞において用いられるベクターＤＮＡとしては公知
のもののなかから適宜選択して使用することができる。

以上、ここで使用されるベクターＤＮＡは、その宿主細
胞中で自律複製できるものであれば、特に制約はないし
、また単に目的とする遺伝子をクローン化するためのみ
であれば格別の制限なく、公知のものを用いることがで
きる。このようにして用いられるベクターＤＮＡは、一
種以上の宿主間に適用できる広宿主域接合伝達性プラス
ミドが便利に使用しろる。

また、ここで使用されるベクターＤＮＡは、選別のため
のマーカー等、遺伝子組換えにおいて要求される通常知
られた機能を有することはもちろんである。

（３）　ベクターＤＮＡの開裂部位に上記（１）で得た
ＤＮＡ断片を組み込み、閉環した組換え体ＤＮＡをつく
る。ベクターＤＮＡの開裂部位にＤＮＡ断片を組み込む
には、大腸菌のＤＮＡリガーゼ、Ｔ４ＤＮＡリガーゼの
様な連結酵素を作用させるなどの通常の方法を用いるこ
とが出来る。この際、ベクターＤＮＡの分子内環化によ
る組換え効率の低下を避けるために、あらかじめＣＩＰ
（Ｃａｌｆ　１ｎｔｅｓｔｉｎｅ　ａｌｋａｌｉｎｅ　
ｐｈｏｉｐｈａｔａｓｅ）、ＢＡＰ　（Ｂａｃｔａｒｉ
ｉｌ　ａｌｋａｌｉｎｅ　ｐｈｏｓｐｈｍｔａｓａ）な
どのアルカリ性フォスファターゼにより開裂ベクターＤ
ＮＡ末端の脱リン酸処理を行うことが好ましい。

また、ベクターＤＮＡ及び上記（１）で得たＤＮＡの末
端部が、その相互の結合に不適な場合は、公知の方法で
適当に核酸塩基を付加したり、あるいは消化して除いた
り、あるいは平滑末端とするなどの方法により修飾して
から、そのベクターＤＮＡ及び上記（１）で得たＤＮＡ
の連結を行うことができる。

（４）　組換え体ＤＮＡを宿主細胞に移入し、遺伝子ラ
イブラリーを作製する。組換え体ＤＮＡの宿主への移入
は、接合や形質転換など、用いる宿主−ベクター系に適
した方法を選択することが出来る。

ここで使用しろる宿主細胞としては、通常の遺伝子組換
え技術において、遺伝子のクローニングのために使用さ
れるものであれば特に制限なく使用できるが、特に好適
な宿主細胞としては大腸菌があげられる。

この他にここで使用することのできる宿主細胞としては
キサントモナス属細菌、アセトバクター属細菌、シュー
ドモナス属細菌、グルコノバクタ−属細菌、アゾトバク
タ−属細菌、リゾビウム属細菌、アルカリゲネス属細菌
、クレプシエラ属細菌、サルモネラ属細面及びセラチア
属細菌から選ばれたものがあげられるが、好ましくはこ
のうち特に遺伝子組換において用いられるものがあげら
れる。

これらの宿主細胞のうち、特に大腸菌及びキサントモナ
ス属細菌が好ましい。ここで使用される大腸菌としては
、例えば、Ｃ６００株、ＨＢＩＯＩ株なとがあげられる
。

ここで使用されるキサントモナス属細菌としては、例え
ば、キサントモナスシトリ−ＴＦＯ３３１１、キサント
モナス・キャンペストリスｐＶキャンペストリスＮＩＡ
ＥＳ１０７６などがあげられる。

ＤＴＡの遺伝子ライブラリーを作製するにあたって特に
好ましいのは大腸菌であり、例えば、０６００株が特に
好ましい。

（５）　遺伝子ライブラリーを作製し、目的の組換え体
ＤＮＡを保有する細胞を分離する。上記（４）の操作で
得られる細胞株の中で目的の組換え体ＤＮＡを保有する
ものはごくわずかであるのて、その中から目的の細胞株
を選択する。宿主が目的の辿換え体ＤＮＡを獲得しても
宿主の表現型には変化は現れないので、目的の細胞を分
離するためには、まず上記（４）の操作で得られるプラ
スミドを保有した細胞株のライブラリーを作製し、ＤＴ
Ａ活性を指標にスクリーニングを行う。ライブラリーを
構築するに必要な細胞株の数は、染色体ＤＮＡの大きさ
とベクターに挿入されたＤ　Ｎ　Ａ断片の大きさから計
算することが出来る。上記（４）の操作で得られるプラ
スミドを保有した細胞株の選別は選択マーカーを利用し
て通常の方法を適用して行うことができる。

次に、各培養細胞株のＤ−スレオニン分解活性を指標に
ＤＴＡ活性を調べることにより、目的の組換え体ＤＮＡ
を保有する株を選択することができる。

（６）　目的の組換え体ＤＮＡを保有する細胞株から目
的のＤＮＡ断片を単離する。常法に従い目的の組換え体
ＤＮＡを保有する細胞から目的の組換えＤＮＡを抽出す
る。得られた組換えＤＮＡを、連結に用いた制限酵素な
との適当な制限酵素でベクターＤＮＡから切断し、アカ
ロースゲル電電泳動なとの方法で所望のＤＴＡの合成に
関与する遺伝情棗を担うＤＮＡを分離することが出来る
６（７）　　ＤＴＡの合成に関与する遺伝情報を担うＤ
ＮＡの解析を行う。上記（６）で得られたＤＴＡの合成
に関与する遺伝情報を担うＤＮＡについて適当な制限酵
素を作用させ、制限酵素地図を作製する。また、そのＤ
ＮＡの塩基配列は適当な制限酵素によって作られたＤＮ
Ａ断片に、良く知られたＤＮＡ塩基配列決定法を適用し
て決めることができる。このような方法のうちには、サ
ブクローン化法による手法が含まれていることはもちろ
んである。上記ＤＮＡ断片のＤＮＡ塩基配列の決定法と
しては、Ｍａｘａｍ−Ｇｉ　１ｂｅｒｔ法、ジデオキシ
・シーフェンス法、ジデオキシ・チエイン・ターミネー
ション法等があげられる。

上記（６）のようにして単離され、構造解析されたＤＮ
Ａは、そこにＤＴＡの合成に関与する遺伝子以外の領域
が保有、されている場合、様々な方法でＤＴＡの合成に
不必要な領域を欠失させることができる。このような方
法としては、ＢＡＬ３１ヌクレアーゼやエキソヌクレア
ーゼ■にょる欠失法、制限酵素切断サイトを利用した組
換え法などがあげられる。

上記（６）で得られたＤＮＡのうち、特にキサントモナ
ス・オリゼーＩＡＭ１６５７より得られたものは、次の
特徴を有している。

（ｍｌ　　該ＤＮＡ断片は、分子の長さが約３．５キロ
ベースのデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）である（ｂ）　　
該ＤＮＡ断片の両端は、制限酵素ＳｍａｌとＢ　ｇ　Ｉ
　ＩＩによって生じる平滑および粘着性末端である。

（ｃｌ　　該ＤＮＡ断片は、下記制限ｎ素に対し、次の
切断感受性を有する。

ＢａｍＨＩ　　ＯＥｃｏＴ２２Ｉ　　ＩＢｇｌロ　　Ｏ
５ａｌＩ　　　　　２ Ｓｍａｌ　　　ＯＨｉｎｄｌｌｌ　　　　０ＥｃｏＲＩ
　　Ｉ　　　　ＰｓｔＩ　　　　　０Ｘｂａｌ　　　Ｏ
５ｃａｌ　　　　　Ｏ前にも説明したとおり、現在の遺
伝子操作技術では、制限酵素切断部位をなくしたり、他
の制限酵素切断部位に変更したりするなど、ＤＮＡ断片
の一部を変更することは容易である。従って、そのよう
に一部を変更したＤＮＡ断片であっても、ＤＴＡ活性を
示すポリペプチドの産生を担う遺伝子を含むＤＮＡ断片
であれば、全て本発明に含まれることは明白である。

（８）　以上のようにクローン化されたＤＴＡの合成に
関与する遺伝情報を担うＤＮＡは、適当な手段を施して
単離され、次に適当なベクターＤＮＡに再び組み込むこ
とにより、宿主細胞に再び導入することができる。

このクローン化されたＤＴＡの合成に関与する遺伝情報
を担うＤＮＡの単離法としては、制限酵素で純化された
組換え体ＤＮＡを処理した後、得られたＤＮＡ断片混合
物をアガロース等を用いたゲル電気泳動法、フェノール
抽出法、エタノール沈澱法等の遺伝子組換え技術のうち
で通常用いられる方法を適宜使用して濃縮、精製する方
法があげられる。

また、本発明の上記ＤＴＡの合成に関与する遺伝情報を
担うＤＮＡを宿主細胞に導入し、そしてそれをその導入
された宿主細胞内で発現させるために用いられるベクタ
ーＤＮＡとしては、適当な宿主細胞内で、ＤＴＡ遺伝子
を発現できるものであれば特に制限なく使用しろる。

このようなベクターＤＮＡとしては上記ＤＴＡの合成に
関与する遺伝情報を担うＤＮＡを組み込むことのできる
ものであり、そしてそうして組換えたベクターＤＮＡで
宿主細胞を形質転換できるものであり、そしてそうして
得られた組換え宿主細胞内で上記導入されたＤＴＡの合
成に関与する遺伝情報を担うＤＮＡの発現ができるもの
であれば特に限定されず、如何なるものも使用すること
ができる。

このようなベクターＤＮＡとしては、宿主細胞中で自律
複製可能であり、さらに組換え宿主細胞のみを選別でき
るような適当な選択マーカーなどが付与されたものがあ
げられる。さらにまた、このようなベクターＤＮＡは公
知のベクターＤＮＡ等から当業者が容易に製造しうるよ
うなものであってもよい。

このようなベクターＤＮＡとしては、例えばブラスミト
ヘクター、ファージベクター、コスミドベクター、シャ
トルベクター、ランナウェイベクターから選ばれたもの
があげられる。

さらに、このようなベクターＤＮＡは、１ａｃＵＶ５プ
ロモーター、ｔｒｐプロモーター、ｌｐｐプロモーター
、ｔｕｆＢプロモーター、ｒｅｃＡプロモーター、ＰＬ
プロモーター等の制御因子を適宜付与されたものであっ
てもよい。このような形質発現などに係わる因子等を導
入するためには遺云子組換え技術の分野でよく知られた
方法を適宜選択して適用することにより行うことができ
る。　さらにまた、ここで使用することのできるベクタ
ーＤＮＡとしては、上記（２〉で詳細に記載したものの
中からも選んで使用することができる。　ここで使用す
ることのできるベクターＤＮＡの代表的なものは、宿主
細胞によっても異なるが、ｐ［３Ｒ３２８（Ｍｕｒｏｏ
ｌ（ａ、ｅｔａｌ。

、、１．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、、１６９（７）、４４０
６　（１９８７）　）、ｐＲＫ２０１３なとのヘルパー
プラスミドと共に用いられるｐ　Ｒ！（２９０（Ｇ、Ｄ
ｉｔｔａｌｅｔ　　ａｌ、＋Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ　１．Ａ
ｃａｄ、Ｓｃ　ｉ、、ＵＳＡ、７７　（１２）、７３４
７−７３５１　（１９８０））などがあげられる。

上記ベクターＤＮＡに、上記ＤＴＡの合成に関与する遺
伝情報を担うＤＮＡを組み込むには、まず、上記ベクタ
ーＤＮＡを適当な制限酵素を作用させ、得られたベクタ
ーＤＮＡ断片を、上記ＤＴＡの合成に関与する遺伝情報
を担うＤＮＡ断片とを混合し、これにＤＮＡリガーゼを
作用させることによりなしうる。このようにして得られ
た■換え体ＤＮＡは次に適当な宿主細胞の中に導入され
る。

上記ＤＮＡリガーゼとしては、当該分野で公知のものを
使用できるが、例えば、大腸菌ＤＮＮクリガーゼＴ４Ｄ
ＮＡリガーゼなどがあげられる。

上記ベクター断片と上記ＤＴＡ合成遺伝子のＤＮＡ断片
とのライゲーシミンにあっては、必要に応じ当該分野で
知られたリンカ−付与、プラントエンド化等の処理を加
えることもできる。

さらに、ここで使用することのできる宿主細胞としては
、適当な発現ベクターに上記ＤＴＡ遺伝子を組み込み、
こうして得られた組換えベクターでもって形質転換され
て、ＤＴＡ遺伝子を発現させることが出来るようなもの
であれば、特に制限なく使用することができる。このよ
うな宿主細胞としては、本発明の目的に沿ってＤＴＡ遺
伝子の発現を達成しうる限り、ダラム陰性菌あるいはダ
ラム陽性菌の区別なく、さらには、下等細胞あるいは高
等細胞の区別なく、動物由来細胞であろうと植物由来細
胞であろうと使用できる。

また、ここで使用することのできる宿主細胞としては、
上記（４）で詳細に記載された宿主細胞から選ばれて用
いられることもできる。

ここで使用することのできる宿主細胞としては、本発明
のＤＴＡの合成に関与する遺伝情報を担うＤＮＡの発現
が達成されうるものがあげられ、このような宿主細胞と
しては、大腸菌、キサントモナス属細菌、アセトバクタ
ー属細菌、シュードモナス属Ｗｉｌｌグルコノバクタ−
属細菌、アゾトバクター属細菌、リゾヒウム属細菌、ア
ルカリゲネス属細菌、クレプシエラ属細菌、サルモネラ
属細菌及びセラチア属細菌から選ばれたものがあげられ
る。

ここで使用することの好ましい宿主細胞としては、例え
ば大腸菌及びキサントモナス属細菌があげられる。

ここで使用することのできる特に好ましい宿主細胞とし
ては、大腸菌、例えは大腸菌に−１２、好ましくは大１
１ｉ菌Ｃ６００株があげられる。

ここで使用することのできる特に好ましい細胞としては
、キサントモナス属細菌があげられ、６１１えはキサン
トモナス・シトリ−ＩＦＯ３３１１あるいはキサントモ
ナス・キャンペストリスｐＶキャンペストリスＮＩＡＥ
Ｓ１０７Ｂが好適に使用できる。

上記組換え体ＤＮＡを用いて上記宿主細胞を形質転換な
どをするにあたっては、ＤＮＡ組換え技術において広く
知られた方法を適用して行うことができる。

このような方法としては、宿主細胞をコンペテント（ｃ
ｏｍｐｅｔｅｎｔ）状態にして形質転換用緩衝液中で組
換え体ＤＮＡと混合する、ヘルパー・プラスミドを用い
て接合伝達により移入するなとの方？去があげられる。

このようにして冴られたＤＴＡを高度に産生する能力を
有する形質転１築体の一つであるキサントモナスφシト
リ−ＩＦＯ３３１１（ｐＤＴ６４Ｂ）は工業技術院微生
物工業技術研究所に、微工研菌寄第１０９７９号（ＦＥ
ＲＭ　　Ｐ−１０９７９）として寄託されている。

（９）　本発明により得られたＤＴＡ産生形質転換体は
、それを栄養培地中に培養して得た培養物をそのまま、
あるいは培養物中からＤＴＡを単離して、Ｄ−スレオニ
ンあるいはその誘導体の合成に用いることができる。

ｆａｌＤＴＡ産生形質転換体は、適当な栄養培地中で培
養することにより、それを大量に得ることができる。こ
の場合ＤＴＡの産生を最大にするような通常の知られた
操作を施すことができる。このような方法としては、例
えば、大腸菌であれば、ｔａｃ、ｔｒｐ、１ａｃＵＶ５
などの強力なプロモーターの支配下にＤＴＡ遺伝子を挿
入するか、塩基置換や既知の組換え手法によってプロモ
ーター構造を変化させるなどの方法があげられる。大腸
菌以外の他の宿主−ベクター系においても、この様な手
法が利用できることは言うまでもない。

まず、形質転換体は培地に炭素源としてはグルコース、
グリセロール、部寄等の糖類あるいは酢酸、リンゴ酸等
の有機酸など、窒素源としては硫酸アンモニウム、塩化
アンモニウム、尿素など、有機栄養源として酵母エキス
、ペプトン、肉エキス、コーンステイープリカーなど、
無機イオンとしてマグネシウム、鉄、マンガン、カリウ
ム、リン酸塩などを含むと共に適当な選択用の栄養素を
添加あるいは欠いた培地中で培養後に、上記ＤＴＡの発
現及び産生量増大をもたらす手法を加えればよい。

（ｂｌ大量に培養して得たＤＴＡ産生形質転換生物の生
物体及びその培養液よりＤＴＡを単離精製処理する。

本発明においては生物体あるいはその培養液よりのＤＴ
Ａの単離精製にあたっては特公昭６４−１１２７９号に
記載の方法と類似の方法が使用できるほか、その産生量
が非常に高いことがらより簡便な方法が利用できる。こ
のような方法を行うには、まず、生物体を機械的方法、
ｎ素処理方法、自己溶解法、超音波処理法などの方法に
よって破壊し、粗抽出液を得、ついでこれを硫酸アンモ
ニウム、リン酸ナトリウムなどの塩析剤あるいはアセト
ン又はエタノールなどの溶媒による蛋白質沈澱法、電気
泳動法、ゲル濾過法あるいは分子ふるいクロマトグラフ
ィー法、限外濾過法、逆相クロマトグラフィー法、高速
液体クロマトグラフィー法、イオン交換クロマトグラフ
ィー？！、アフィニテイクロマトグラフィー法、吸着ク
ロマトグラフィー法、などの方法を単独あるいは適宜組
み合わせて用いて精製することにより行うことができる
。

これらの各方法は公知方法から選んで用いることができ
る。

キサントモナス・シトリ−ＩＦＯ３３１１（ｐＤＴ６４
８）より得られた酵素標品についてその理化学的性質の
測定結果を以下に示す。

■　作用および基質特異性 本酵素はＤ−スレオニンおよびＤ−アロスレオニンを分
解してグリシンとアセトアルデヒドを生成する。一方、
Ｌ−スレオニンおよびＬ−アロスレオニンにはまったく
作用しない。

■　至適ｐｉｔ Ｄ−スレオニンを基質として各ｐｌ＋において３゜”Ｃ
ｒ１０分間反応させ、生成したアルデヒドを定量したと
ころ、本酵素の至適ｐ■は７〜９にあった。

尚、用いた緩衝液はｐ［１４〜７゜５までは０，１Ｍリ
ン酸緩衝液、ｐＨ７〜９までは０７１　Ｍ　トリス−Ｈ
Ｃ１緩衝液及びｐＨ９〜１１までは０．１Ｍ炭酸ソ−ダ
緩衝液である。

■　安定ｐ■範囲 酵素溶液を各ｐｍにおいて３０゛Ｃで１時間加熱後、溶
液中の残存活性を測定したところ、本酵素の安定りＩＩ
範囲は６〜９にあった。尚、用いた緩衝液はｐ１１４〜
７，５までは０．ＩＭリン！１！緩衝液、ｐＨ７〜９ま
では０．１　Ｍ　トリス−ＨＣｌ緩衝液及びｐ［９〜１
１までは０．１Ｍ炭酸ソーダ緩衝液である。

■　力価の測定法 酵素含有液０．１ｍｌを１００ＪＪ　ｍｏｌｅのＤ−ス
レオニンを含有するｐＨ８□０の０，１Ｍトリス−塩酸
緩衝液０．９ｍｌに加え、３０°Ｃで１０分間加熱して
生成したアセトアルデヒドをＰａＺ法［Ａｒｃｈ、　Ｂ
ｉｎｃｈｅｓ、　！ｌｉｏｐｈ７ｇ、　、　Ｖｏｌ、　
］０９．１’５４８（１９１ｔ５）　］によって定量し
て求めた。尚、１分間に１μｍ０１ｅのＤ−スレオニン
を分解する酵素活性をＩＵとした。

■　作用適温の範囲 Ｄ−スレオニンを基質としてｐＨ８，０の０．１Ｍトリ
ス−塩ｆｉ緩衝液を用い、各温度で１０分間反応させ、
生成したアセトアルデヒドを測定したところ、本＃ＩＩ
素の至適温度は４０〜５０℃にあった。

■　熱安定性 ｐｉｅ、ｏの０．１Ｍ）リスー塩Ｍ緩衝液に溶解した＃
素溶液を各温度で１時間加熱後、溶液中の残存活性を測
定したところ、本酵素の安定温度は４０℃以下であった
。

■　ＰＲ，温度などによる失活の条件 本酵素はｐＨ５以下、ｐＨ１１以上、および温度７０°
Ｃ以上では１時間で失活する。

■　阻害、活性化及び安定化 本酵素はメルカプトエタノール、亜＠酸ナトリウム、亜
硫酸水素ナトリウム、ジチオスレイトール、Ｍｎ”　　
　Ｃｏ２°　　Ｆｅ”　　Ｍｇ”によッテ活性化され安
定化される。一方、Ａ　ｇ　Ｉ″　Ｃｕ　２゜Ｈｇ”　
　Ｚｎ”　　Ｐｄ”、ヒドロキシルアミン、ｐ−クロル
マーキュリ−安息香酸によって阻害される。

■　補酵素 本ｖＩ素の補酵素はピリドキサール−５°−リン酸であ
る。

ｌｅｔ　こうして得られた組換えＤＴＡは特開昭５８−
１１６６９０号に記載されたようにしてグリシンとアセ
トアルデヒドなどのアルデヒド化合物からＤ−スレオニ
ンなどのＤ体のβ−オキシアミノ酸を製造する際に、従
来自然界に見出されている非組換え微生物のＤＴＡと同
様にして用いることができるが、本発明によれば大量か
つ高純度でそのＤＴＡを製造し得るものであることから
、目的Ｄ−スレオニン類をより良好に製造しうる。

また、従来自然界に見出されているＤＴＡ生産性微生物
では、Ｌ−アロスレオニンアルドラーゼをも同時に産生
じているために、グリシンとアルデヒド類からＤ−β−
オキシアミノ酸類を製造しようとする場合、Ｌ−７０−
β−オキシアミノ酸の副生を避けるために、Ｌ−アロス
レオニンアルドラーゼを分離するか選択的に不活性化さ
せることが必要であった。本発明の形質転換微生物では
、ＤＴＡのみを大量に製造することができるので、Ｄ−
スレオニン類を製造する際に、宿主の産生ずるＬ−アロ
スレオニンアルドラーゼ活性を除去するという繁雑な操
作をはぶく事ができる。

こうして製造された、Ｄ−スレオニンなどのＤ体のβ−
オキシアミノ酸は通常の方法で単Ｗ１精製することがで
きる。

この方法で用いられるアルデヒド化合物としては一般式
Ｒ−ＣＨＯ（式中Ｒは水素原子、置換又は）Ｉ−置換の
脂肪族基、脂環式基、芳香族基、又は複索環式基を表す
）で示されるアルデヒド化合物があげられる。

脂肪族アルデヒド及び置換脂肪族アルデヒドの代表的な
ものとしては、ホルムアルデヒド、アセトアルデヒド、
プロピオンアルデヒド、ブチルアルデヒド、ラウリルア
ルデヒド、クロロアセトアルデヒド、フロロアセトアル
デヒド、ニトロアセトアルデヒド、β−クロロアセトア
ルデヒド、エトキシアセトアルデヒドなどがあげられ、
好ましくは炭素数２０以下の直鎖または分枝鎖アルキル
のアルデヒドであって、任意に塩素、臭素、ヨード、弗
素などのハロゲン、ニトロ、アルコキシ暴などで置換さ
れていてよいアルデヒドがあげられる。

脂環式アルデヒドの代表的なものとしては、シクロペン
チルアルデヒド、シクロペンテニルアルデヒド、シクロ
ヘキシルアルデヒド、シクロへキセニルアルデヒド、シ
クロへキシルアセトアルデヒド、シクロへキシルアセト
アルデヒドなどがあげられる。

芳香族アルデヒドの代表的なものとしては、ベンズアル
デヒド、フロロベンズアルデヒド、クロロベンズアルデ
ヒド、ブロモベンズアルデヒド、ニトロベンズアルデヒ
ド、ヒドロキシニトロベンズアルデヒド、メトキシベン
ズアルデヒド、フロロメトキシベンズアルデヒド、トル
アルデヒド、ト、リフロロトルアルデヒド、フェニルア
セトアルデヒドなどがあげられる。この芳香族アルデヒ
ドは、その芳香環に任意に複数個であってよいハロゲン
、ニトロ、ヒドロキシ、アルコキシ、アルキルなどの置
換基を有してよい。

複素環式アルデヒドの代表的なものとしては、２−チオ
フェンアルデヒド、ブロモ−２−チオフェンアルデヒド
、４−フォルミルイミダゾール、４−メチル−５−フォ
ルミルイミダゾールなどがあげられる。複素環式アルデ
ヒドとしては、異種原子としてＯ，Ｎ、　　Ｓから選ば
れた原子を含有する複素環を有するアルデヒドがあげら
れる。

また、Ｄ−スレオニン類の単離精製法としては、好まし
くは活性炭やイオン交換樹脂等を使用する方法があげら
れる。

また、本反応においては補酵素としてピリドキサール−
５°−リン酸を反応系に加えると、酵素活性がより高ま
るなどしてより良好な結果が得られる。

好適なピリドキサール−５゛−リン酸の添加量としては
１０−１〜１０−Ｓの範囲があげられるが、適宜最適な
結果が得られるように実験により決めることができる。

本方法において、アルデヒド化合物の使用量は酵素活性
を著しく阻害しない程度であげればよい。

その好ましい置としては０．０５〜０．２モル／ｌ程度
である。

本方法ｌ二おけるグリシンの使用量はアルデヒド化合物
と等モル程度でよいが、グリシンの反応率を高めるには
アルデヒド化合物をより少なくするのが好ましい。

また、反応温度は１０〜７０℃、好ましくは２０〜５０
１Ｃである。反応時のｐ［ｌは６〜９．５、好ましくは
７〜８に維持する。本反応はバッチ方式で行ってもよく
、連続方式で行ってもよい。

更に、本反応は任意の時間だけ反応を行わせることによ
ってなしうるが、好適には１〜５０時間、より好ましく
は５〜３０時間反応を行うのがよい。

反応終了後は、適宜濃縮、遠心分離、濾過などの処理を
施して、懸濁物等を除去してから、イオン交換樹脂処理
、晶析等で精製し、必要に応じ活性炭などで脱色処理す
ることにより、目的り一β−ヒドロキシアミノ酸を得る
ことができる。

本方法で使用される酵素は、酵素活性を発揮しろる形態
であればよく、必ずしも単離されたものに限定されない
。また該酵素は、半精製品でもよく粗抽出液、さらには
培！！物、生物体、凍結乾燥生物体、アセトン乾燥生物
体、あるいはそれら生物体の磨砕物等であってもよい。

さらにそれは、酵素自体あるいは生物体のまま公知の手
段で固定化されて用いられてもよい。

本方法で使用される酵素は、天然のＤＴＡのペプチド配
列と一致するもののみに限定されず、遺伝子変換及び遺
伝子組換えの手法で得られるＤＴＡ活性を示すものを言
うものと解すべきである。

従って、本方法で使用できる組換えＤＴＡは、天然のＤ
ＴＡのペプチド配列中のアミノ酸の欠損したもの、ある
いはそのペプチド配列中のアミノ酸が他のアミノ酸で置
き換えられたものをも包含する。

ｆｄｌＤＴＡ産生形質転換体をグリシン及びアルデヒド
化合物を含有する栄養培地中で適当な条件下に培養せし
めることにより、Ｄ−β−ヒドロキシアミノ酸を培地中
に蓄積せしめる。こうして得られたＤ−スレオニンまた
はその誘導体は常法（ごあるいは上記方法（Ｃ）に記載
したような方法に従って単ＭｆＳ製することができる・ この方法を行うにあたっては、適宜その培養条件及び基
質濃度を設定して、最高の結果が得られるようにするこ
とができる。

また、アルデヒド化合物としては、上記（Ｃ）に記載の
ようなアルデヒド化合物を使用することができる。

以下、本発明を実施例により詳細に説明するが、本発明
はこれに限定されるものではない。

実施例 実施例　１ 以下、キサントモナス・オリゼーＩＡＭ１６５７をＤＮ
Ａ供与体として用い、該菌株のＤＴＡ産生遺伝子を大腸
菌の宿主、ベクター系を利用してクローニングした例を
具体的に示す。

染色体ＤＮＡの調製はＭａｒｍｕｒ法を一部改良して行
った。即ち、ＤＮＡ供与体であるキサントモナス・オリ
ゼーＩＡＭ１６５７を１００ｍ１のＬＢ培地（１％ポリ
ペプトン、０．５％１ｉＩｅエキス、０．５％ＮａＣ１
；　　ｐｌ！７．０）で３時間培養し、培養液から菌体
を果菌した後、ＴＥ緩衝液（１０ｍＸトリス（ヒドロキ
シルメチル）アミノメタン（以下トリスと略すＬｉｒｒ
＋Ｍエチレンジアミン四酢酸二ナトリウム（以下ＥＤＴ
Ａと略す）；　　ｐ［１８，０）で洗浄した。

１２ｍ１のりゾチーム溶液（５０ｍＭグルコース。

２５　ｍ）ｌ）リス、　　１０ｍＭＥＤＴＡ、　　４ｍ
ｇ／ｍｌリゾチームｉ　　ｐＨ８，０）に懸濁した後、
３７°Ｃで６０分間反応させた。１２，５％のドデシル
硫酸ナトリウム（以下ＳＤＳと略す）水溶液１ｍｌを添
加して穏やかに混合し、次いで１０ｍ１のフェノール／
クロロホルム（４：　　１）混合溶媒で処理した後、１
５．ＯＯＯｒｐｍで２０分間遠心して除蛋白を行った。

この抽出操作を３〜４回、界面に沈澱がなくなるまで繰
り返し、０．２ｍｌのＲＮａｓｅ溶液（１ｍｇ／ｍｌ）
で処理した佳さらに一回イテつた。次いで、エタノール
を静かに加え、ガラス棒を用いて、初め緩やかに、次第
に急速に撹はんしながら粗ＤＮＡを巻き付けた。ガラス
棒を壁に押し付けて余分のエタノールを除去した後、９
ｍｌの０．１ｘＳＳＣ（０，Ｏ１５ＭＮａＣＪ　Ｏ，０
０１５Ｍクエン酸ナトリウム）に−晩かけて溶解した。

　１０ｘＳＳＣ（１，５ＭＮａＣ１，０，１５Ｍクエン
酸ナトリウム）を１ｍ１ｉ加し、５．４ｍｌのイソプロ
ピルアルコールを徐々に遡上しながらＤＮＡをガラス棒
に巻き付けた。ガラス棒を８０％エタノール水溶液に浸
漬した後、所定量のＴＥ緩衝液に溶解した。

Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　　Ｃｌｏｎｉｎｇ記載の方法に従
い、染色体ＤＮＡを制限酵素ＢａｍＨＩにより部分的に
切断した。１２０μｇの染色体ＤＮＡを含む１２００．
ｕｌのＢａｍＨＩ用緩衝液（１０ｍＭトリス、７ｍＭ　
　ＭｇＣＬ２．　１００ｍＭ　　ＮａＣ１，２ｍＭメル
カプトエタノール、０．０１％ウシ血清アルブミン、ｐ
［Ｉ８．０）に１４単位のＢａｍＨＩを加え３７°Ｃで
２時間反応させた。反応路Ｙｆ＆、６８°Ｃで１０分間
加熱し、エタノール沈澱でＤＮＡを回収後、５０μｍの
ＴＥ緩衝液に再溶解した。超遠心分離用チューブ（日立
４ＰＡチユーブ）に４０．　３０．　２０．　　および
１０％のショ糖溶液（ＬＭ　Ｍａｃｌ、２０ｍ！　トリ
ス、５ｍＭＥＤＴＡ；　　ｐＨ８，０）を各１ｍｌ、次
いで上記ＤＮＡ溶液全量を重層し、分離用超遠心機（日
立５ＣＰ７０Ｈ；　スウィングローターＲＰＳ５６Ｔ）
で３２．００Ｏｒｐｍ２０時間遠心分離した。遠心終了
後、密度勾配フラクショネーター（日立ＤＧＦ−Ｕ）に
より分子量分画し、エタノール沈澱によってＤＮＡを回
収しか。各両分を所定量のＴＥ緩衝液に溶解し、アガロ
ース・ゲルを気泳動でその分子量分布を調べ、５−１０
ＫｂのＤＮＡ断片を含む画分を組換え体ＤＮＡの作成に
供した。

２、　　　−　　　＝”　　　ＢＲ３２２プラスミドｐ
ＢＲ３２２の調製は、Ｂｉｒｎｂｏｉｍ　＆　　Ｄｏｌ
ｙの方法（Ｔ、Ｍａｎｉａｔｉｓ、　　ｅｔ　　ａｌ、
　　、Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　　Ｃｌｏｎｉｎｇ、９０）
に従って行った。

ｐＢＲ３２２を持つ大腸菌Ｃ６００株の形質転換体を１
００μｇ　／　ｍ　１のアンピシリンを含む４００ｍ１
のＬＢ培地で一晩培養した。培養液から菌体を集菌し、
４　ｍ　ｇ　／　ｍ　ｌのリゾチームを含む４ｍＭのグ
ルコース溶液（５０ｍＭグルコース、２５ｍ）ｎリス、
　　１０ｍＭ　　ＥＤＴＡＢ　　ｐＥ［８，０）　　に
懸濁して室温で反応させた。８ｍＭのアルカリＳＤＳ溶
液（０，２Ｎ　ＮａＯＨ，１％５ＤＳ）および６ｍＭの
酢酸カリウム溶液（５Ｍ酢醸カリウム；ｐ［［４，８）
を順次添加して穏やかに混和してから氷水中に５分装置
いた。１５．ＯＯＯｒｐｍで２０分間遠心して沈澱を除
去した佳、１０．８ｍＭのイソプロピルアルコールを添
加して水中に１０分間静置し、１５．ＯＯＯｒｐｍで２
０分間遠心して上澄みを除去した。８０％エタノール水
溶液を添加して再度遠心した後、減圧下で乾燥した。

ＴＥＩＩ衝液１０ｍＭを加えて沈澱ベレツトを静かに溶
解してから１０ｍｇ／ｍｌエチジウム・ブロマイド１ｍ
Ｌ！ｆｉ加し、これに１０．５　ｇの塩化セシウムを加
えて静かに溶解した。この溶液を１２・　ＯＯＯｒｐｍ
で５分間遠心して沈澱を除去した後、分離用超遠心機（
ローターＲＰＶ４５Ｔ）を用いて４５．ＯＯＯｒｐｍで
１６〜２０時間遠心分離した。

紫外線照射下で閉環状ＤＮＡを含む両分１ｍｌを注射器
で抜き取り、ＮａＣ１飽和イソプロピルアルコールで少
なくとも５回処理してエチジウム・ブロマイドを抽出除
去した。

ＴＥ緩衝液２ｍｌ、エタノール６、ｍ　１を順次加え、
−２０℃で１０分間冷却後１，５００Ｏｒｐｍで２０分
間遠心し、析出・沈澱させた。８０％エタノール水溶液
で洗浄後減圧下に乾燥して４００μｌのＴＥ緩衝液に溶
解した。

３、組換え体ＤＮＡの作製 ■ベ　−　ＮＡ　　　ラｔ プラスミドＤＮＡｐＢＲ３２２１μｇを含む制限酵素Ｂ
ａｍＨＩ用反応緩衝液１４μｌに１２単位のＢａｍ）（
Ｉを添加し、３７℃で１８時間消化反応させた。エタノ
ール沈澱による回収後、アルカリフォスファターゼ（ベ
ーリンガー・マンハイム社製ＣＩＰ）用緩衝液（５０ｍ
）！）リス、０．１ｍＭ　ＥＤＴＡ：　　ｐｆ［８，０
）１９０．ｕｌに溶解し、１００単位／μｌのＣＩＰＩ
Ｏμｍを添加して１時間反応させた。フェノール抽出に
よりＣ工Ｐを失活させた後エタノール沈澱によりＤＮＡ
を回収した。

■染色体ＤＮＡのＢａｍＨＩ部分消化物と混合し、Ｔ４
ＤＮＡリガーゼを含む反応液を加え、１５℃で３０分間
反応させた。得られた反応混合物を形質転換に供した。

４、　形質転換及び遺伝子ライブラリーの作製■Ｃｏｎ
　　ｅｔｅ　　ｔ　　　ｅ 宿主菌、大腸Ｖｉｃ６００株を５０ｍ１のＬＢ培地に接
種し、３７°Ｃで２時間４５分間培養した。

集菌後直ちに１０ｍＭの冷却したＣｏｍｐｅｔｅｎｔｔ
ＦＩ整用績衝液（５０ｍＭ　ＣａＣｌ２，１０ｍＭＲｂ
Ｃ１２，０，１Ｍ　　ＭＯＰＳ；　　ｐ［Ｉ６．５）に
懸濁し、氷中３０分間静置した。遠心によって上澄みを
除去後２　、５　ｍ　ｌの同一緩衝液に再懸濁し、水中
で３０分間以上静置した。

■五且五１ 供試ＤＮＡを含む微量遠心チューブに１００μ］、の形
質転換用緩衝液（１０％ポリエチレングリコール（分子
３１１０００）、１ｍＭ　ＥＤＴＡ、１ｍＭＭ０ＰＳＢ
　ｐ［１７，２）、２００μｍのＣｏｍｐｅｔｅｎｔ　
　ｃｅｌｌを採取し、混合接水中に３０分間静置した。

３７℃の水浴で２分間加温したｍ　０　、８　ｍ　ｌの
ＬＢ培地を添加し、３７°（４’１時間培養した。

１００μｇ　／　ｍ　１のアンピシリンを含むＬＢ寒天
培地に０．１ｍＭずつ培養液を塗布し、−晩３７゛Ｃで
培養した。

■　　　　−−− 得られたコロニーのテトラサイクリン感受性を゛調べ、
耐性を喪失したコロニーを１００μｇ／ｍｌのアンピシ
リンを含むＬＢ寒天培地に、ビック・アップし、５００
０クローンからなる遺伝子ライブラリーを構築した。任
意にクローンを選択してそのプラスミドを調べ、挿入断
片が存在することを確認した。

目的の遺伝子を獲得した形質転換体を単離するために、
Ｄ−スレオニンの分解活性を指標にして遺伝子ライブラ
リーをスクリーニングした。遺伝子ライブラリーに保存
した形質転換体を、１００μｇ　／　ｍ　１のアンピシ
リンを含む５ｍｌのＬＢ液体培地に接種し、３７°Ｃで
一晩培養した。培養液１ｍｌを微量遠心チューブに集菌
後、凍結乾燥した。

５０ｍＷのＤ−スレオニンを含む反応液（０，Ｏｌｍ）
ｌ　ｐｔ、ｐ、１ｍＸ　ＭｎＣｌ２．０．２Ｍ　　）リ
ス；ｐＨ７，０）を０．５ｍｌ添加し、均一に懸濁して
１８時間３０℃で反応させた。

反応液２μｍをＴＬＣ用シリカゲルプレート（ワコー製
７０ＦＭプレート）にスポットし、ｔ−ブチルアルコー
ル／メチルエチルケトン／アンモニア水／水（１６：１
６：７：６）で展開した。

９０℃で３０分間乾燥後、０．２％のニンヒドリンを含
むアセトン溶液に浸漬して発色させた。標準物質のグリ
シンに相当する位置にスポットを有するクローンを目的
の遺伝子を持つ形質転換体として選択した。

６、ＤＮＡ断片の調製 ０組換えプラスミドの調製 ＤＴＡ活性を獲得した形質転換体から上記の方法に従い
プラスミドを抽出し、ｐＤＴ３００と命名した。

■遺伝子領域の解析 上記プラスミドｐＤＴ３００を制限酵素ＢａｍＨ１で切
断後アガロース・ゲル電気泳動で分析し、プラスミドに
約１５Ｋｂの挿入断片があることを確認した。また、こ
のプラスミドを宿主大腸菌Ｃ６００株に再形質転換して
得た形質転換体が同様にＤＴＡ活性を獲得することから
、ＤＴＡ生産に係わる遺伝子がこのプラスミド上にある
ことを確認した。種々の欠失解析によって、ＤＴＡ生産
に係わる遺伝子が約５ＫｂのＥｃ　ｏＲ夏／Ｓｍａ　Ｉ
断片に含まれることが明らかになり、この断片を持つ組
換えプラスミドｐＤＴ３２０を作成した。

このプラスミドの詳細な解析から、約３．５ＫｂのＳｍ
ａｆ／ＢｇｌＩＩ断片にＤＴＡ遺伝子がコードされてい
た。ＤＴＡ遺伝子を含むＳｍａ　Ｉ／ＢｇｌＩＩ断片の
構造を、代表的な６塩基認識の制限酵素で調べた（第１
図）。

実施例２゜ 以下、キサントモナス属細面由来のＤＴＡ産生遺伝子を
含むＤＮＡ断片を、キサントモナス属細菌内で自律複製
できるベクターＤＮＡ断片に鞘み込んで組換え体ＤＮＡ
を作製した例を具体的に示す。

１、プラスミドｐＢＲ３２８の調製 プラスミドｐＢＲ３２８の調製は、ｐＢＲ３２２と同様
の方法で行った。１１１ｇのｐＢＲ３２８を１２単位の
制限酵素ＥｃｏＲＶ、次いてＢａｍＨｌで順次切断した
。エタノール沈澱で回収後フォスファターゼ（ベーリン
ガー・マンハイム＞ＵｔＣＩＰ）処理により末端の脱リ
ン酸を１１つだ。フェノール／クロロホルム（４：１）
処理によりＣＩＰを不活性化し、これを抽出除去した。

さらに、エタノール沈澱で回収後、減圧下に乾燥した。

２、ＤＮＡ断片の調製 ４μｇのプラスミドｐＤＴ３２０を２４単位の制限酵素
Ｓｍａｔ、次いでＢｇｌ［Ｉて完全消化した。エチジウ
ム◆ブロマイドを含む１％アガロース・ゲル電気泳動で
分離しＤＴＡｉ！伝子を含む約３．６にｂの目的のＳｍ
ａｌ／Ｂｇｌｎ断片を含むゲルを紫外線！！ｉ１１＋１
下で切り出した。常法に従い、ゲル内部からＤＮＡ断片
を抽出・回収した。

３、組換え体ＤＮＡの作製 ＤＴＡを遺伝子を含む約３　、５　ＫｂのＳｍａｌ／Ｂ
ｇｌＩＩ断片とベクターＤＮＡを混合してＴ４ＤＮＡリ
ガーゼで連結した。常法に従い、大腸菌Ｃ６００株のＣ
ｏｍｐｅｔｅｎｔ　　ｃｅｌｌに形質転換し、アンピシ
リンに耐性でテトラサイクリン耐性を喪失したクローン
を１株選択した。選択したクローンがＤＴＡ活性とクロ
ラムフェニコール耐性を獲得していることを確認した。

前記の方法に従い、アルカリ・リシス法によりプラスミ
ドを単離・＠製した。大ｌｉ苗Ｃ６００株のＣｏｍｐｅ
ｔｅｎｔ　　ｃｅｌｌに再形質転喚して得た形質転換体
がＤＴＡ活性とクロラムフェニコール耐性を獲得したこ
とから、プラスミド上に目的の遺伝子がコードされてい
ることを確認した。

また、制限酵素により組換えプラスミドの構造を調へ、
得られたプラスミドが目的の構造を保持していることを
確認した。このプラスミドの構造を第２図に示す。尚、
上記形質転換体大腸菌Ｃ６００（ｐＤＴ６４Ｂ）は、工
業技術院微生物工業技術研究所に、微工研菌寄第１１０
４９号（ＦＥＲＭＰ−１１０４９）として寄託されてい
る。

実施例３゜ 以下、組換え体ＤＮＡをキサントモナス属細菌に移入し
てＤＴＡ産生株を育種した例を具体的に示す。

ｌ、キサントモナス属細菌の形質転換 宿主菌、キサントモナス・シトリ−ＩＦＯ３３１１、を
５０ｍ１のＬＢ培地に接種し、３７°Ｃで２時間４５分
培養した。集菌後直ちに１０ｍ１のＣｏｍｐｅｔｅｎｔ
調製用Ｍｉ簡液（５０ｍｌＩＣａＣ１２，１０ｍ）Ｉ　
ＲｂＣｌ□、０．ＩＭ　ＭＯＰＳ。

ｐ［［６，５）に懸濁し、氷中３０分間静置した。遠心
によって上澄みを除去後２．５ｍｌの同一緩衝液に再懸
濁し、水中で３０分間以上静置した。

２、キサントモナス属細菌の形質転換 １μｇのｐＤＴ６４８を含む微量遠心チューブに１００
μｍの形質転換用緩衝液（１０％ポリエチレングリコー
ル（分子量１０００）、１ｍＭＥＤＴＡ、１ｍ）Ｉ　Ｍ
ＯＰＳ；　　ｐ［１７，２）、２００μｌのＣｏｍｐｅ
ｔｅｎｔ　　ｃｅｌｌを採取し、混合後水中に３０分間
静置した。３７°Ｃの水浴で２分間加温した後、０．８
ｍｌのＬＢ培地を溢加し、３７℃で１時間培養した。

５０μｇ　／　ｍ　１のクロラムフェニコールを含むＬ
Ｂ寒天培地に０．１ｍｌずつ培養液を塗布し、−昼夜３
７℃で培養した。

得られたクロラムフェニコール耐性株が目的のプラスミ
ドを保持していることを確認し、このうち１株をＤＴＡ
活性測定に供した。また、このようにして得られた形質
転換体であるキサントモナス・シトリ−ＩＦＯ３３１１
（ＰＤＴ６４８）は工業技術院微生物工業技術研究所に
、微工研菌寄第１０９７９号（ＦＥＲＭＰ−１０９７９
）として寄託されている。

３、ＤＴＡ産生株の活性測定 形質転換体を５０Ｍｇ／ｍｌのクロラムフェニコールを
含むＬＢ培地１００ｍ１に接種し、３７°Ｃで一晩培養
した。集菌後、活性測定用緩衝液（０，０１ｍＭ　ＰＬ
Ｐ、　　５ｍＭ　ＭｎＣ１ａ　　Ｈ４Ｈ２０，０，０１
Ｍ　　トリスｉ　　ｐＨ７，０）で洗浄し凍結乾燥した
。凍結乾燥菌体４０ｍｇを同緩衝液１ｍｌに懸濁し、さ
らに０．００７８％になるまで希釈した。

微量遠心チューブに０．２ｍｌ採取し、３０“Ｃの水浴
で保温した。あらかじめ保温しておいた基質溶液（５０
ｍＭＤ−スレオニン、２ｍ）１ＭｎＣ１２−４Ｈ２０，
０，ＯＬｍＭ　ＰＬＰ、０．２Ｍ　　トリス１ｐ［［７
，０）０．２ｍｌを加えた。

３０”Ｃで２時間反応させた後、０．４ｍｌのＩＮ塩酸
を加え反応を停止させた。遠心後上澄み液を０．２２μ
のメンブランフィルタ−で濾過し、ＨＰＬＣにより生成
グリシン濃度を定量した。

ｐＤＴ６４８を持つキサントモナス・シトリ−ＩＦＯ３
３１１の形質転換体のＤＴＡ活性を、宿主及び遺伝子供
与体と比較して第１表に示す。

第１表 キサントモナス・シトリ−０ ＩＦＯ３３１１ キサントモナス・オリゼー　　　　　　　３□ＯＩＡＭ
１６５７ キサントモナス・シトリ−０ ＩＦＯ３３１１（Ｉ）ＢＲ３２８） ＤＫ−ＸＣ３３１１（ｐＤＴ６４８）　　４９．９実施
例４゜ 以下、キサントモナス属細菌由来のＤＴＡ産生遺伝子を
含むＤＮＡ断片を、キサントモナス属細菌内で自律複製
できるベクターＤＮＡ断片に組み込んで作成した組換え
体ＤＮＡをキサントモナス属細面に移入して育種したＤ
ＴＡ高生産株を用いてＤ−スレオニンを製造した例を具
体的に示す。

１、形質転換体の１１製 実施例３で育種したＤＴＡ高生産性の形質転換体を５０
μｇ／ｍｌのクロラムフェニコールを含むＬＢ培地５０
０ｍ１に接種し、３７℃で一晩培養した。集菌後、０．
９％食塩水を加えて洗浄し凍結乾燥した。

２、Ｄ−スレオニンの合成反応 アセトアルデヒド５０ｍＭ、グリシン　５０ｍＭ、及び
０．１ｍＷのＰＬＰ及び１０ｍ）ｌ　　メルカプトエタ
ノールを含むｐＨ８，０の０．１Ｍトリス塩酸緩衝液５
００ｍ１よりなる基質溶液に１証乾燥菌体１ｇを加え３
０°Ｃで４０時間反応させた。反応終了後、ＤＮＡ供与
体であるキサントモナス・オリゼーＩＡＭ１６５７と比
較して、溶液中のＤ−スレオニンを定量したところ第２
表に示す結果を得た。

第２表 菌株名 −Ｔｈｒ ＤＫ−ＸＣ３３１１（ｐＤＴ６４８） キサントモナス・オリゼー ＩＡＭ１６５７ キサントモナス・シトリ− ＵＦＯ３３１１（ｐＢＲ３２８） キサントモナス・シトリ− ＩＦＯ３３１１ １，２１ ０，０２４ ３、Ｄ−スレオニンの単離精製 反応液をＨ６型のＤｏｗｅｘ　　５０Ｗ　Ｘ８　５００
ｍ１を充填したカラムに通液し、水洗（ｉｏ、２Ｎアン
モニアで溶離してスレオニン区分とグリシン区分に分離
した。スレオニン区分を濃縮後活性炭で脱色し、脱色液
ｌ：エタノールを添加して結晶を得た。この結晶につい
てＮＭＲ１赤外線吸収スペクトル、元素分析、゛及び比
旋光度を測定して、この結晶がＤ−スレオニンであるこ
とを確認した。

また、ストレプトコッカス・ハエカリスＵＦＯ３１８１
を用いたバイオ・アッセイ法により、反応液中にはＬ一
体がまったく含まれていないことを確認した。

発明の効果 ＤＴＡ産生遺伝子を含むＤＮＡ断片を填離することによ
り、該断片を宿主細胞、特にキサントモナス属細菌内で
、自律複製できるベクターに組み送入　そして作製した
組換え体ＤＮＡを、宿主細胞、特にキサントモナス属細
菌に移入して、得られる形質転換体のＤＴＡ活性を強化
することができる。その結果、ＤＴＡを用いてＤ−アミ
ノ酸類を製造する場合のその物質の生産性を大きく改善
することができる。

【図面の簡単な説明】

第１図は、組換えプラスミドｐＤＴ３２０からのＤＴＡ
遺伝子を含むＳｍａＩ／Ｂｇｌｌｌ断片の構造を制限酵
素による認識部位で表したものであ第２図は、プラスミ
ドｐＤＴ６４８の構築過程を示すと共にそのプラスミド
ｐＤＴ６４８の構造を制限酵素による認識部位及び代表
的なマーカーでもって表したものである。

Claims (17)

【特許請求の範囲】
1. （１）Ｄ−スレオニンアルドラーゼの合成に関与する遺
   伝情報を担うものであることを特徴とするＤＮＡ。
2. （２）該ＤＮＡがキサントモナス属細菌に由来するもの
   であることを特徴とする請求項１に記載のＤＮＡ。
3. （３）該ＤＮＡがＤ−スレオニンアルドラーゼをコード
   している遺伝子であることを特徴とする請求項２に記載
   のＤＮＡ。
4. （４）該ＤＮＡがＤ−スレオニンアルドラーゼをコード
   している遺伝子に加え、その遺伝子の制御領域を含有し
   ているものであることを特徴とする請求項２に記載のＤ
   ＮＡ。
5. （５）Ｄ−スレオニンアルドラーゼの合成に関与する遺
   伝子情報を担うＤＮＡとベクターＤＮＡとを結合せしめ
   てなる組換え体ＤＮＡ。
6. （６）該ベクターＤＮＡが宿主細胞内で自律複製できる
   ものであることを特徴とする請求項５に記載の組換え体
   ＤＮＡ。
7. （７）該ベクターＤＮＡが、大腸菌、キサントモナス属
   細菌、アセトバクター属細菌、シュードモナス属細菌、
   グルコノバクター属細菌、アゾトバクター属細菌、リゾ
   ビウム属細菌、アルカリゲネス属細菌、クレプシエラ属
   細菌、サルモネラ属細菌、及びセラチア属細菌から選ば
   れた宿主細胞内で自律複製できるものであることを特徴
   とする請求項５に記載の組換え体ＤＮＡ。
8. （８）該Ｄ−スレオニンアルドラーゼの合成に関与する
   遺伝情報を担うＤＮＡが、請求項２〜４のいずれか一つ
   であることを特徴とする請求項５〜７のいずれか一つに
   記載の組換え体ＤＮＡ。
9. （９）Ｄ−スレオニンアルドラーゼの合成に関与する遺
   伝子を担うＤＮＡとベクターＤＮＡとを結合せしめてな
   る組換え体ＤＮＡを保有せしめた形質転換体。
10. （１０）該形質転換体が、宿主細胞としてＤ−スレオニ
    ンアルドラーゼの合成に関与する遺伝子を担うＤＮＡと
    ベクターＤＮＡとを結合せしめてなる組換え体ＤＮＡが
    自律複製できると共にＤ−スレオニンアルドラーゼの合
    成に関与する遺伝子が発現できるものを使用して得られ
    たものであることを特徴とする請求項９に記載の形質転
    換体。
11. （１１）該形質転換体が、宿主細胞として大腸菌、キサ
    ントモナス属細菌、アセトバクター属細菌、シュードモ
    ナス属細菌、グルコノバクター属細菌、アゾトバクター
    属細菌、リゾビウム属細菌、アルカリゲネス属細菌、ク
    レプシエラ属細菌、サルモネラ属細菌、及びセラチア属
    細菌から選ばれたものを使用して得られたものであるこ
    とを特徴とする請求項９または１０に記載の形質転換体
    。
12. （１２）該Ｄ−スレオニンアルドラーゼの合成に関与す
    る遺伝情報を担うＤＮＡが請求項２〜４のいずれか一つ
    であることを特徴とする請求項９〜１１のいずれか一つ
    に記載の形質転換体。
13. （１３）Ｄ−スレオニンアルドラーゼの合成に関与する
    遺伝情報を担うＤＮＡとベクターＤＮＡとを結合せしめ
    てなる組換え体ＤＮＡを保有せしめた形質転換体を培地
    中で培養し、その培養物から単離することを特徴とする
    Ｄ−スレオニンアルドラーゼの製造法。
14. （１４）該形質転換体が請求項１２に記載のものである
    ことを特徴とする請求項１３に記載の製造法
15. （１５）Ｄ−スレオニンアルドラーゼの合成に関与する
    遺伝情報を担うＤＮＡとベクターＤＮＡとを結合せしめ
    てなる組換え体ＤＮＡを保有せしめた形質転換体を培養
    し、その培養物より採取された組換えＤ−スレオニンア
    ルドラーゼをグリシン及びアルデヒド化合物に作用せし
    めることを特徴とするＤ−β−ヒドロキシアミノ酸の製
    造法。
16. （１６）Ｄ−スレオニンアルドラーゼの合成に関与する
    遺伝情報を担うＤＮＡとベクターＤＮＡとを結合せしめ
    てなる組換え体ＤＮＡを保有せしめた形質転換体をグリ
    シン及びアルデヒド化合物と接触せしめ、生成したＤ−
    β−ヒドロキシアミノ酸を採取することを特徴とするＤ
    −β−ヒドロキシアミノ酸の製造法。
17. （１７）該アルデヒド化合物が、脂肪族アルデヒド、置
    換脂肪族アルデヒド、脂環式アルデヒド、芳香族アルデ
    ヒド及び複素環式アルデヒドから選ばれたものであるこ
    とを特徴とする請求項１５または１６に記載の方法。